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Beschreibung
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Die Erfindung betrifft bestimmte Antigene und Antigen-Konjugate mit
immunstimulierenden Adjuvanzien, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Anwendung
in der Immunotherapie. Die erfindungsgemäßen Antigene bzw. Antigen-Konjugate sind
insbesondere geeignet zur Erzeugung hoher Titer von auf die betreffenden Antigene
spezifischen Antikörpern und die Verwendung dieser Antigenkonjugate ist insbesondere
gerichtet auf die immunotherapeutische Behandlung von Krebs.
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Immunität ist ein Alltagswort für eine spezielle Art der Abwehr, die
der Körper besitzt und durch die er infektiöse Körper prüfen und zerstören kann,
selbst wenn diese bereits in das Körpergewebe eingedrungen sind.
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Wenn ein Mensch oder ein Tier gegen eine Krankheit immun wird, beruht
diese Immunität größtenteils auf der Entwicklung von Substanzen im Körper, die fähig
sind, die für die Krankheit ursächlichen Körper zu zerstören oder zu inaktivieren,
falls sie zu einem späteren Zeitpunkt Zutritt zu dem Körper gewinnen sollten. Diese
Substanzen sind als Antikörper oder Immunkörper bekannt und werden durch den Körper
als Reaktion auf einen spezifischen Reiz erzeugt. Mikroben und ihre Produkte innerhalb
des Körpers können die Kòrperzellen zur Antikörperproduktion
anregen.
Weitere Substanzen, die die gleiche Wirkung haben können, sind rote Blutkörperchen
und das Serum von anderen Tieren und andere Proteine. Diese Substanzen werden zusammenfassend
als Antigene bezeichnet und sind in der Regel hochmolekulare Eiweißsubstanzen, in
einigen Fällen können jedoch auch komplexe Kohlenhydrate (Polysaccharide) als Antigene
wirken.
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Antigene sind Substanzen, die die Bildung von Antikörpern im Innern
eines Tieres stimulieren und sichtbar mit jenen Antikörpern reagieren. Sie besitzen
im allgemeinen ein Molekulargewicht von 10000 oder mehr. Typische Antigene können
nach der folgenden Liste, die keinen Anspruch auf Vollständigkeit erhebt (eine ausführliche
Beschreibung findet sich in P.L.Carpenter, Immunology and Serology, 2. Auflage 1968),
wie folgt klassifiziert werden: (1) Protein-Antigene, beispielsweise Caeruloplasmin
und Serumalbumin; (2) bakterielle Antigene, beispielsweise Teichoinsäuren, Flagellaten-Antigene,
kapselförmige Polysaccharide und extracelluläre bakterielle Produkte sowie Toxine;
(3) Blutgruppenantigene, beispielsweise Glycoproteine und Glycolipide; (4) Viren,
beispielsweise Viren des Tieres, der Pflanzen und bakterielle Viren;
(5)
konjugierte und synthetische Antigene, z. B. ProteinfHapten-Konjugate und synthetische
Polypeptide; und (6) Nukleinsäuren, z. B. Ribonucleinsäure und Desoxyribonukleinsäure.
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Die Immunität kann natürlichen Ursprungs oder erworben sein, und im
letzteren Fall kann sie auf natürlichem Wege oder künstlich erworben sein. Künstliche
Immunität kann bekannterweise entweder passiv, d.h. hervorgerufen durch Injektion
eines Antiserums (prophylaktisch, therapeutisch), oder aktiv sein, wie durch Impfung
mit beispielsweise lebenden oder toten Organismen.
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Verfahren zur Immunisierung sind wichtig zur Verhinderung verschiedener
Krankheiten einschließlich Viruserkrankungen.
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Es ist auch sehr wahrscheinlich, daß Viren verschiedener Arten von
Tumoren und Krebsgeschwulsten, insbesondere bei niederen Tieren wie Kaninchen, Mäusen,
Küken und Hamstern, erzeugen. Verschiedene Forscher, darunter auch der Anmelder,
haben aktiv versucht, Mittel zu finden, die in der Krebs-Immunotherapie wirksam
sein könnten.
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Es wird in diesem Zusammenhang auf V.V.Likhite, "Clinical Cancer Immunotherapy:
Experience in Breast and Lung Cancer" in Immunocancerology in Solid Tumors, Herausgeber
M. Martin
und L. Dionne, Seiten 135 bis 141 (Stratton, 1976) sowie
von dem gleichen Autor "Rejection of Tumor Metastases in Fisher 344 Rats Following
Administration of Killed Corynebacterium parvumt, Cancer Immunology and Immunotherapy,
(1977), Band 2, Seiten 173 bis 178.
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Als Antwort auf eine Injektion von Antigenen produziert der Körper
eines Tieres spezifische Antikörper, die mit den Antigenen reagieren und sie neutralisieren.
Antikörper werden klassifiziert als Proteine mit der Löslichkeit von Globulinen
und der elektrophoretischen Beweglichkeit von g~Globulinen. Das Molekulargewicht
von t-Globulinen, die auch Immunglobuline genannt werden, liegt zwischen 160 000
und 1 Mill. Man hat diese Immunglobuline (Ig) ensprechend ihrem Molekulargewicht
in 5 Klassen unterteilt, nämlich in Ig G, Ig A, Ig D, Ig E und Ig M. Die Ig G-Klasse
bzw. -Gruppe kommt im Serum am häufigsten vor und ist durch ein Molekulargewicht
von 160 000 charakterisiert.
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Die am seltensten vorkommende Ig M-Klasse ist durch ein Molekulargewicht
von 1 Mill. charakterisiert.
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Manchmal ist es erforderlich, daß im Blut eines Menschen momentan
ein großer Vorrat an Antikörpern auftritt, um eine bereits im Körper befindliche
überwältigende Infektion zu bekämpfen. Infolge dessen muß der Patient rasch erzeugte
Antikörper
erhalten, und es sind verschiedene Wege zur Herstellung und Gewinnung von Antigenen
und Antikörpern bekannt, beispielsweise aus den US-Patentschriften 3 652 761 und
3 843 344.
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Aus US-PS 3 652 761 ist eine chemische Zusammensetzung mit Immuneigenschaften
bekannt, die aus einem chemisch an einen anorganischen Träger gebundenen Antigen
oder Antikörper besteht. Da das Antigen oder der Antikörper unlöslich wird, wenn
es bzw. er so gekoppelt wird, ergibt dies nach Meinung dieser Patentschrift einen
besseren Weg zur Gewinnung eines reineren Antigens oder Antikörpers.
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Die US-PS 3 843 444, die auf den Anmelder zurückgeht, beschreibt einen
Weg zum Konzentrieren, Trennen und Gewinnen von makromolekularen Substanzen mit
einer gegenseitigen Anziehungskraft, insbesondere von biologischen Stoffen wie Antikörpern
und Antigenen. Vorliegende Erfindung macht von der Erkenntnis Gebrauch, daß für
einander spezifische Antigene und Antikörper von gegenüberliegenden Oberflächen
dünner semipermeabler Teile bevorzugt angezogen werden.
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Die bekannten Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Antigenen
und Antikörpern zeigen, obwohl sie bis
zu einem gewissen Grade
zufriedenstellend arbeiten, doch bestimmte Nachteile. Ein wesentlicher Nachteil
einiger bekannter Systeme ergibt sich aus der Tatsache, daß Antigene und Antikörper
sich gegenseitig anziehen. Diese Anziehung wirkt sich bei der Reinigung und Gewinnung
von Antikörpern störend aus. Das gewonnene Produkt war in -vielen Fällen auf einen
Bruchteil, beispielsweise auf 5 bis 20 %, der ursprünglichen physiologischen Wirksamkeit
reduziert.
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Erhält ein Tier wiederholte Injektionen eines bestimmten Antigens,
dann macht die induzierte spezifische Antikörperreaktion in dem wirtstier auf das
injizierte Antigen nur eine relativ geringe Menge, gewöhnlich weniger als 1%, der
Serumglobulinmenge aus. Die quantitative Reaktion ist außerdem nicht über die Fähigkeiten
des Wirtstieres hinaus verbessert worden.
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Es besteht daher ein Bedarf nicht nur für ein Verfahren zur Herstellung
größerer Mengen an Antikörpern innerhalb eines biologischen Systems, sondern auch
für verbesserte Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern, ohne daß dies mit einem
beträchtlichen Verlust an Aktivität verbunden ist.
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Die vorstehend genannten Nachteile werden durch vorliegende Erfindung
im wesentlichen überwunden durch die Bereitstel-
lung bestimmter
Antigene und Antigenkonjugate, die geeignet sind zur Erzeugung höherer Titer spezifischer
Antikörper, als sie bislang erhalten werden konnten. Die Antigene gemäß der Erfindung
sind außerdem in der diagnostischen Medizin, der analytischen Biochemie und in der
Immunotherapie vorteilhaft anzuwenden.
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Im einzelnen betrifft die Erfindung Antigene, die aus bestimmten getöteten
Mikroorganismen oder einem Pflanzenextrakt bestehen und die, wenn sie chemisch an
andere Antigene gekoppelt werden, wie ein immunstimulierendes Adjuvans wirken, indem
sie Antikörperreaktionen mit hohem Titer induzieren, die spezifisch für das Antigen-
Konjugat sind. Diese sekundären Antigene können eine physiologische Substanz sein,
beispielsweise ein Virus oder Tumorzellen, wobei im letzteren Falle das Antigen-
Konjugat wie ein chemotherapeutisches Produkt wirkt.
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Obwohl sämtliche Antigene, die mit vorliegender Erfindung vorgeschlagen
werden, bei der Herstellung hoher Titer von spezifischen Antikörpern eingesetzt
werden können, kann mit besonderem Vorteil eine verschiedenartige Reaktion in dem
biologischen Wirtssystem erhalten werden je nach dem besonderen Antigen, das eingesetzt
wird. Mit der Erfindung werden, was sehr wesentlich ist, bei Verwendung
eines
neuen Stammes von Listeria monocytogenes als primäres Antigen Mittel zur Verfügung
gestellt, durch die spezifische hochmolekulare Antikörper Ig M, die für das eingesetzte
primäre Antigen spezifisch sind, hergestellt werden können, wenn das Antigen in
ein Tier injiziert wrd. Diese Antikörper können durch ziemlich einfache Verfahren
gewonnen werden, die eine rasche Trennung infolge der diesen hochmolekularen Antikörpern
innewohnenden Ei.genschaften ermöglicht, wobei es besonders wichtig ist, daß dies
ohne eine ins Gewicht fallende Schädigung ihrer physiologischen Eigenschaften möglich
ist.
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Die spezifischen Ig M-Antikörper gemäß der Erfindung können demnach
abgetrennt werden und, da die Ig M-Antikörper Pentamere der Ig G-Antikörper sind,
in diese mit Hilfe von physiologisch mild wirkenden Reduktionsmitteln überführt
werden, ohne daß dabei ein beträchtlicher Verlust ihrer spezifischen Aktivität eintritt.
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Die spezifischen Ig M-Antikörper gemäß der Erfindung können darüberhinaus
in besonders vorteilhafter Weise für diagnostische Applikationen markiert oder mit
einem zur Vitalfärbung geeigneten Farbstoff gekennzeichnet werden. Dies erlaubt
die Benutzung eines konventionellen Lichtmikroskops anstelle eines Fluoreszenzmikroskops.
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Darüberhinaus können Ig M-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung
mit chemotherapeutischen Mitteln wie Antikörpern und gegen Krebs wirksamen Arzneimitteln
gekoppelt werden zur Behandlung von spezifischen, krankheitverursachenden Mitteln
(gegenüber denen bereits Antikörper gebildet wurden). Bakterien, Viren, Tumorzellen
und andere infektiöse Mittel können mit dem die Immunität verstärkenden Mittel kombiniert
werden, wobei solche Kombinationen als therapeutische Produkte eingesetzt werden
können.
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Mit den erfindungsgemäß eingesetzten neuen Stämmen von Corynebacterium
parvum und Corynebacterium paragranulosum können nicht nur hohe Titer von Ig G induziert,
sondern in vorteilhafter Weise auch Macrophagensysteme angegriffen werden.
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Die weiteren erfindungsgemäß vorgeschlagenen Antigene auf der Basis
eines neuen Stammes von Bordetella pertussis bzw. auf der Basis eines Pflanzenextraktes
der Pflanzenspecies Rhus induzieren hohe Titer von Ig E.
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Tochterkulturen der neu entdeckten Bakterienstämme Bordetella pertussis
akka, Listeria monocytogenes akka, Corynebacterium parvum akka und Corynebacterium
paragranulosum,
die erfindungsgemäß verwendet werden, sind hinterlegt
worden und können auf Antrag erhalten werden von der Hinterlegungsstelle Northern
Regional Research Laboratories, Agricultural Research Services, U.S. Department
of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. Ihre Eingangsnummern in dieser Hinterlegungsstelle
sind entsprechend der Reihenfolge, in der sie vorstehend aufgeführt wurden, NRRL
B-11 232; NRRL B-11 233; NRRL B-11 234; NRRL B-11 235.
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Dementsprechend betrifft vorliegende Erfindung Antigene, die zur Erzeugung
relativ hoher Titer von auf diese Antigene spezischen Antikörpern geeignet sind.
Das erfindungsgemäße Antigen ist dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt ist aus
der Gruppe abgetöteter Bakterien der Bakterienstämme Listeria monocytogenes akka,
Bordetella pertussis akka, Corynebacterium parvum akka und Corynebacterium paragranulosum
sowie einem Pflanzenextrakt aus der Pflanzenspecies Rhus.
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Andere Antigene, d.h. sekundäre Antigene, können durch chemische Kopplung
an die obengenannten primären Antigene sensibilisiert werden, damit sie dieselbe
starke Antikörperreaktion hervorrufen. In dieser Beziehung fungieren die primären
Antigene als ein die Immunreaktion potenzierendes Mittel oder, wie sie auch genannt
werden können, als ein immunstimulierendes Adjuvans.
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Die sekundären Antigene können allgemein bekannte Antigene sein, erfindungsgemäß
werden jedoch mit besonderem Vorteil als sekundäre Antigene physiologische Substanzen
wie Viren, Hormone, Bakterien und Tumorzellen gewählt. Hierbei wird die Tatsache
ausgenutzt, daß die primären Antigene fähig sind, als immuntherapeutische Mittel
zu wirken. Wenn ein sekundäres Antigen, wie 1. B. eine lebende Tumorzelle, an ein
primäres Antigen gekoppelt wird, z. B. an den neuen Stamm von Bordetella pertussis
akka, dann erhält man ein chemotherapeutisches Produkt, das nach Injektion in einem
Tier, das diesen Tumor hat, eine Reaktion induziert, die zum Ausstoß des Tumors
führt. Wenn in ähnlicher Weise erfindungsgemäß in einen Antigen-Konjugat ein Virus
mit einem die Immunreaktion potenzierenden Agens gebunden wird, dann wird durch
die Injektion eines solchen Konjugats in ein Wirtstier die Virusinfektion durch
Stimulierung der Abwehrkräfte des Wirtsorganismus gegen diese spezifische Virusinfektion
bekämpft.
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Eine Bindung des sekundären Antigens an das primäre Antigen kann mit
Hilfe verschiedener chemischer Mittel, die zwei reaktionsfähige Stellen aufweisen
erfolgen, beispielsweise mit Bis-diazobenzidin, Glutaraldehyd, m-Xyloldiisocyanat,
Dijodacetat sowie Toluol-2,4-diisocyanat. Das letztgenannte Kopplungsmittel wird
aus verschiedenen Gründen
bevorzugt. Insbesondere reagieren alle
NCO-Gruppen sofort mit freien Aminogruppen. Jedoch bleibt nur die NCO-Gruppe am
4. C-Atom bei 40C aktiv, und dies ist ein besonders erwünschtes Merkmal bei der
Verwendung von Toluol-2,4-diisocyanat. So ermöglicht seine Verwendung als Kopplungsmittel
zuerst eine Kopplung des abgetöteten Bakterienstammes oder des Pflanzenextraktes
an das C-Atom in 4-Stellung und danach eine Kopplung eines zweiten Antigens an das
C-Atom in 2-Stellung. Falls gewünscht, kann das sogenannte "sekundäre Antigen" auch
zuerst an das C-Atom in 4Stellung gebunden werden, wonach dann das die Immunreaktion
stimulierende Adjuvans (oder das primäre Antigen) an das C-Atom in 2-Stellung gekoppelt
wird.
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Obwohl die Fähigkeit, als therapeutisches Mittel zu wirken, eine allgemeine
Eigenschaft der erfindungsgemäßen Mikroorganismen-Antigene ist, unterscheidet sich
jedes der primären Antigene etwas von den anderen durch seine induzierte Antikörperreaktion.
Nichtsdestoweniger wird allgemein ein hoher Titer erreicht, wobei manchmal im Serum
des Wirtstieres -unerwartet hohe Mengen bis zu 6 g-% erreicht werden.
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Mit dem Einsatz des neuen Stammes von Listeria monocytogenes wird
erfindungsgemäß nicht nur ein Mittel zur Herstel-
lung großer Mengen
hochmulekularer Antikörper Ig M geschaffen, sondern auch ein Verfahren zur Gewinnung
dieser Antikörper als reine und wirksame antigenspezifische Antikörper. Dies ergibt
sich aus der Tatsache, daß solche Antikörper durch Unlöslichkeit bei niederen Temperaturen,
z. B. bei 40C, charakterisiert sind, wodurch die Abtrennung und Gewinnung eines
gereinigten Produktes aus dem Serum erleichtert wird, wie nachfolgend näher erläutert
wird.
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Das Ig M geht wieder in Lösung, wenn es unter Erwärmen auf 31 0C in
einer physiologischen Pufferlösung suspendiert wird.
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Da die Ig M-Antikörper ihre antigenspezifischen chemischen Immuneigenschaften
beibehalten, sind sie sehr geschätzt für den Einsatz in der diagnostischen und therapeutischen
Immunologie. Die gereinigten Antikörper, d.h. die gewonnenen Antikörper, reagieren
nur mit den Organismen von Listeria monocytogenes oder mit dem gekoppelten Antigen
und dem Organismus gemäß der Erfindung.
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Die Ig M-Antikörper können, falls gewünscht, in jeweils 5 Untereinheiten
von Ig G-Antikörpern zerlegt werden, die die gleichen spezifischen Eigenschaften
wie die Ig M-Antikörper zeigen, wobei man die Zerlegung durch Einwir-
kung
von verschiedenen milden physiologischen Reduktionsmitteln erreicht. Beispiele hierfür
sind Mercaptoethanol und Cystein. Auf diese Weise ist es möglich, höhere Titer von
Ig G-Antikörpern herzustellen, als dies bislang möglich war, und diese Antikörper
in einer gewünschten Reinheit zu erhalten, so daß sie bei verschiedenen immunchemischen
Applikationen eingesetzt werden können, einschließlich Radioimmunoassay.
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Obwohl man bei der Gewinnung von Ig M-Antikörpern deren Unlöslichkeit
bei niedrigen Temperaturen ausnutzen kann, ist dieses Verfahren zur Gewinnung von
Antikörpern nicht das einzige, das angewendet wird. Gemäß konventionellen Techniken
können die roten Blutkörperchen von Schafen verwendet werden. Andere Verfahren zur
Gewinnung von Ig M-Antikörpern umfassen die Säulenchromatographie unter Verwendung
von Sephadex oder Sepharose 6200, wobei man das Ig M-Protein als ersten Gipfel ("Peak")
des eluierten Proteins findet. Diese alternativen Verfahren sind jedoch weniger
bevorzugt, da sie mit einem, wenn auch nicht bedeutsamen Verlust an spezifischer
Aktivität verbunden sind.
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Es wurde ferner überraschend gefunden, daß ein Proteinextrakt aus
dem Kulturmedium, in dem die erfindungsgemäßen Mikroorganismen aufgezogen wurden,
die gleichen Reaktionen wie die Mikroorganismen induziert.
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Nachdem der Mikroorganismenstamm gewonnen ist, wird das Medium mit
(NH4) 2SO4 gesättigt und über Nacht stehen gelassen, damit sich der gebildete Niederschlag
absetzen kann. Danach wird gegen einen Standardpuffer dialysiert und das Dialyseprodukt
als primäres Antigen verwendet.
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Nachfolgend wird anhand von Beispielen, die bestimmte vorteilhafte
Ausführungsformen der Erfindung zeigen, die Erfindung weiter erläutert.
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Die ersten Beispiele betreffen die Isolierung von Mikroorganismen.
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Beispiel 1 Unter Anwendung eines üblichen sterilen Verfahrens wurde
aus einem an Listeriose erkrankten Patienten ein neuer Stamm von Listeria monocytogenes
isoliert und in einem 500 ml-Standard-Kulturmedium (Todd-Hewitt) 24 Stunden lang
in bekannter Weise gezüchtet.
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Anschließend wurde das Kulturmedium ausreichend lange Zeit, beispielsweise
etwa 1 Stunde lang, auf 60 0C erhitzt um die Bakterien abzutöten. Die Abtötung wurde
dadurch bestimmt, daß das Material nach dem Aufbringen auf Blutagarplatten kein
Wachstum zeigte.
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Die Bouillon wurde anschließend 20 Minuten lang in üblicher Weise
bei 3000 g zentrifugiert, um die abgetöteten Bakterienzellen zu ernten, wobei das
Überstehende zur Extraktion von angelagertem aktiven Protein aufbewahrt wurde.
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Die erhaltenen abgetöteten Bakterienzellen wurden anschließend in
50 ml standardisierter Phosphatpufferlösung (PBS, pH-Wert 7,4) suspendiert und diese
Suspension zentrifugiert, wie vorstehend beschrieben, und die Bakterienzellen erneut
geerntet. Das Verfahren wurde zweimal wiederholt, um sicherzustellen, daß die Zellen
rein waren.
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Beispiel 2 Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet
mit dem Unterschied, daß ein neuer Bakterienstamm Bordetella pertussis gezüchtet
wurde, der vorher aus einem an Keuchhusten erkrankten Kind isoliert worden war.
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Beispiel 3 Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde angewandt, um den
neuen Bakterienstamm Corynebacterium parvum akka zu gewinnen, der vorher aus einem
an bösartigem Dickdarmkrebs
(ohne Metastasen) und einer vergrößerten
Milz erkrankten Patienten isoliert worden war. Als Medium wurde eine standardisierte
anaerobe Infusionsboullion aus Herz und Gehirn verwendet. In ähnlicher Weise wurde
der Mikroorganismenstamm Corynebacterium paragranulosum isoliert.
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Beispiel 4 Dieses Beispiel betrifft die Herstellung eines Pflanzenextraktes.
Geschnittene Blätter der Pflanze Rhus wurden mit 95 % Ethanol homogenisiert und
anschließend das Überstehende abzentrifugiert. Der Rückstand wurde getrocknet und
war danach fertig zum Gebrauch.
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Beispiel 5 In diesem Beispiel wird die Herstellung von Antikörpern
unter Verwendung primärer Antigene beschrieben. Die gemäß den Beispielen 1 bis 3
erhaltenen Bakterienstämme und der Pflanzenextrakt gemäß Beispiel 4 wurden getrennt
voneinander in standardisierter PBS-Lösung, pH-Wert 7,4, in üblicher Technik suspendiert
und, getrennt voneinander, über eine Periode von mehreren Wochen in Versuchstiere
injiziert.
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Danach wurde den Tieren Blut abgezapft und in ihm der Antikörper-Titer
bestimmt, der unerwartet hoch war. Die gewonnenen Antikörper waren antigenspezifisch,
abhängig von dem besonderen Antigen, das eingesetzt worden war.
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Unter Verwendung des Stammes Listeria monocytogenes akka wurde Ig
M-Protein hergestellt. Der Stamm Corynebacterium parvum akka ebenso wie Corynebacterium
paragranulosum ergaben Ig G und die Stämme von B. pertussis akka und der Pflanzenextrakt
aus der Pflanze Rhus induzierten Ig E-Antikörper.
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Beispiel 6 In diesem Beispiel wird die Herstellung eines Antigenkonjugats
beschrieben. Die geernteten abgetöteten Bakterienzellen aus Beispiel 1 (Listeria
monocytogenes) wurden erneut in 6 ml standardisierter PBS-Lösung, pH-Wert 8,6, in
einem 25 ml Erlenmeyerkolben suspendiert und der Inhalt 30 Minuten lang bei 40C
gehalten. Eine auf ebenfalls 40C abgekühlte Lösung von Toluol-2,4-diisocyanat (TDIC)
wurde anschließend tropfenweise unter konstantem Rühren innerhalb einer Stunde zugefügt,
wobei der Gesamtzusatz 100 mg betrug. Anschließend ließ man die Lösung 30 Minuten
lang stehen, wobei sich während dieser Zeit das TDIC mit den getöteten Bakterien
paarweise verband.
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Danach wurde die Suspension zentrifugiert (3000 g, 20 Minuten lang)
und das überstehende Material verworfen.
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Das erhaltene Antigen-Konjugat (Bakterien-TDIC) wurde dann in 8 ml
standardisierter PBS-Lösung, pH-Wert 7,4, erneut suspendiert und dann wie vorher
durch Zentrifugieren gewaschen.
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Das gewaschene Antigen-Konjugat wurde erneut in 6 ml.
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standardisierter PBS-Lösung, pH-Wert 7,4, suspendiert und anschließend
500 mg Rinderserumalbumin (50%ige Lösung in standardisiertem PBS, pH-Wert 7,4, vorher
dialysiert nach bekanntem Verfahren) zu der Suspension zugefügt.
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Die Mischung wurde auf 37 0C erwärmt und eine Stunde lang gerührt
(mit einem magnetischen Rührer) und dann 30 Minuten lang stehengelassen. Die Suspension
wurde durch Zentrifugieren, wie vorher beschrieben, gewaschen. Mit Hilfe üblicher
Verfahren wurde festgestellt, daß 2 mg Albumin mit 109 Bakterienzellen konjugiert
worden waren. Die erhaltenen Lösungen wurden bis zur Verwendung bei -7O0C aufbewahrt.
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Beispiel 7 In der in Beispiel 6 beschriebenen Weise wurde der gemäß
Beispiel 2 erhaltene Stamm von B. pertussis an Toluol-2,4-diisocyanat gekoppelt,.
allerdings mit dem Unterschied,
daß, da die Bakterien bei tiefer
Temperatur eher mit dem C-Atom der NCO-Gruppe in 4-Stellung koppeln, die Kopplungsreaktion
bei 37 0C durchgeführt wurde, wobei die Bakterien an das C-Atom der NCO-Gruppe in
2-Stellung gekoppelt wurden. Lebende Tumorzellen (T1699-weiblicher Brustdrüsenkrebs,
the Jackson Laboratory, Bal Harbour, Maine, V.St.A.) wurden zuerst an das C-Atom
in 4-Stellung gekoppelt.
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Beispiel 8 0,25 ml der Lösung aus Beispiel 6 wurden jeweils intravenös
in mehreren Versuchskaninchen in wöchentlichen Intervallen 5 Wochen lang injiziert.
Während dieser Zeit produzierten die Kaninchen Antikörper als Reaktion auf die vorliegenden
Antigen-Konjugate.
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Eine Woche nach der letzten Injektion wurde den Kaninchen Blut entnommen
(50 bis 120 ml Blut wurden aus jedem Kaninchen erhalten). Der Antikörper-Titer wurde
nach üblichen Verfahren bestimmt und gefunden, daß er unerwartet hoch war. Die Messungen
wurden nach einer 1:6 Mill.-Verdünnung des Serums abgebrochen.
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Zu diesem Zeitpunkt kann das Blut entweder mit Heparin behandelt werden
oder man läßt es für die weitere Verarbeitung gerinnen (bei 370C).
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Beispiel 9 Dieses Beispiel betrifft die Gewinnung von Antikörpern.
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Die Blutproben aus den Kaninchen gemäß Beispiel 8 ließ man gerinnen
und bewahrte das Serum 24 Stunden bei 4 0C auf. Bei dieser Temperatur fallen die
t-M-Globuline (infolge den ihnen innewohnenden Eigenschaften) aus, worauf sie durch
Zentrifugieren (1000 g, 10 Minuten lang) bei 40C gewonnen wurden, wonach die ausgefällten
t-M-Globuline zweimal durch Zentrifugieren gewaschen wurden, wobei man eine kalte
standardisierte PBS-Lösung, pH-Wert 7,4, verwendete.
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Die erhaltene Fällung wurde anschließend in standardisierter PBS-Lösung,
pH-Wert 7,4, unter Berücksichtigung des ursprünglichen Blutvolumens erneut suspendiert
und diese Suspensionen auf Zimmertemperatur erwärmt, bei der die Fällung löslich
wurde.
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Auf diese Weise wurden 2 bis 7 9 t-M-Globuline getrennt.
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6 mg der gewonnenen Globuline reflektierten etwa 1/250 000 Titer zu
Albumin, was besagt, daß sämtliche gewonnenen Antikörper albuminspezifisch waren.
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Beispiel 10 Das Beispiel betrifft die Auftrennung von t -M-Globulinen
in Untereinheiten. Eine gleiche Volumenmenge des Ig M aus Beispiel 9 wurde zu einer
0,06 molaren Cysteinlösung in standardisiertem PBS, pH-Wert 7,4, zugefügt und diese
Mischung 2 Stunden lang bei 370C bebrütet. Dabei wurden die t -M-Globuline in t-G-Globulin-Untereinheiten
aufgetrennt. Es wurde festgestellt, daß diese # -G-Globuline in der gleichen Weise
mit Albumin reagierten, ohne daß ein Verlust an spezifischer Aktivität auftrat.
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Beispiel 11 Dieses Beispiel betrifft die Verwendung von Antigen-Konjugat
als chemotherapeutisches Produkt und befaßt sich mit der immunotherapeutischen Behandlung
von wachsenden Tumoren durch Verabreichung von Injektionen an Mäusen mit dem Antigen-Konjugat
aus Beispiel 7, bestehend aus dem neuen Stamm von Bordetella pertussis, TDIC und
Tumorzellen wobei die Daten in IRCS Medical Science, 4, Seite 565 (1976) vom Anmelder
veröffentlicht worden sind.
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Ungefähr 106 lebende syngenetische weibliche Brustdrüsenkrebszellen
T 1699 (The Jackson Laboratory) wurden subkutan in die seitliche hintere Flanke
von 100 vorher nicht sensibilisierten DBA/2-Mäusen (weibliche Tiere, 5 Wochen alt,
The Jackson Laboratory) transplantiert. 7 Tage später, der Haupttumordurchmesser
betrug 0,2 cm, wurden die Mäuse in 5 Gruppen zu jeweils 20 Tieren eingeteilt.
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Den Mäusen in jeder Gruppe wurden wöchentlich 4 Wochen hintereinander
eine der folgenden Intraperitonealinjektionen verabreicht: (1) standardisierte Phosphatpufferlösung,
pH-Wert 7,4; (2) 106 lebende T 1699-Zellen, gekoppelt mit TDIC an das C-Atom in
4-Stellung; (3) abgetötete Bakterienzellen des neuen Stammes Bordetella pertussis
(5 x 10 Organismen) gemäß der Erfindung; (4) 5 x 107 abgetötete Organismen des neuen
Stammes von Bordetella pertussis und 106 lebende Tumorzellen T 1699; (5) 106 lebende
Tumorzellen T 1699, spezifisch gekoppelt mit 5 x 107 abgetöteten Organismen des
neuen Stammes Bordetella pertussis unter Verwendung von TDIC (wie in Beispiel 7
beschrieben, läßt sich TDIC mit den Tumorzellen an das C-Atom in 4-Stellung
nur
bei 40C zuerst ankoppeln, worauf die Kopplung ° von B. pertussis, das bei 37 C wirksam
ist, an das C-Atom in 2-Stellung erfolgt; falls gewünscht, kann die Kopplung jedoch
auch in umgekehrter Reihenfolge erfolgen).
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Die Mäuse wurden zweimal wöchentlich untersucht und dabei die Durchmesser
von zwei Tumoren an jeder Maus bis zu ihrem Tode bzw. bis zur Beendigung der Untersuchungen
gemessen.
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Nur die Mäuse der Gruppe 5, d.h. die Mäuse, die mit dem chemotherapeutischen
Produkt aus einem Tumorzellen-TDIC-B.pertussis-Konjugat gemäß der Erfindung behandelt
wurden, überlebten. Diese Tiere zeigten in den ersten 8 Tagen, selbst nachdem die
Therapie begonnen hatte, in dem erwarteten Maße ein Tumorwachstum; danach trat jedoch
eine Rückbildung der Tumorgröße und schließlich ein Verschwinden des Tumors in 20
von 20 Mäusen auf. Die betreffenden Mäuse haben danach noch mehr als 18 Monate turmorfrei
überlebt.
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Sämtliche Mäuse der restlichen 4 Gruppen starben an wachsenden Tumoren
und Metastasen (festgestellt durch Autopsie).
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Die Mäuse in den Gruppen 3 und 4, d.h. jene, die mit abgetöteten B.pertussis
allein oder zusammen mit gesonderten Injektionen von T 1699-Tumorzellen behandelt
worden
waren, zeigten überraschenderweise ein beschleunigtes Wachstum
der Tumoren.
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Diese Untersuchungen wurden wiederholt, wobei ähnliche Ergebnisse
erhalten wurden.
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Beispiel 12 Die Immunotherapie des Beispiels 11 wurde wiederholt
mit dem Unterschied, daß anstelle von Tumorzellen T 1699 nunmehr SAD2-Sarcomzellen
und weibliche Brustdrüsenkrebszellen CAD2 syngenetisch an DBA/2 Mäusen und weibliche
Brustdrüsenkrebszellen (Adenocarcinom) R 3230 und 13762 syngenetisch an Fischer
344 Ratten untersucht wurden.
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Es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten mit langfristig tumorfreien
Überlebenden.