DE3045288T1 - 1 alpha -hydroxy-25-keto-27-nor-cholecalciferol and processes for preparing same - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE Dr. rer. nai. DILfER LOUIS Dipl.-Phys. CLAUS PDHLAU Dipl.-Ing. FRANZ LOHRENTZ DIpl.-Phys.WOLFGANG SEGETH

KESSLERPLATZ 1 8500 NÜRNBERG 20

lN ALUfUNi KESEAKCÜ 1'¹UUWDA¹I¹IOiM 20

614· North Walnut Street Madison, Wisconsin 53707 /IJSA

Beschreibung

1uc-Hydroxy-25-keto-27-nor-cholecalcifeiOl und Verfahren zu

dessen Herstellung

i'echnisches^Gebiet

Lie Erfindung betrifft eine Verbindung, die durch eine Vitamin D-artige Wirksamkeit charakterisiert ist..

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Derivat von Vitamin D,.

Vitamin D, ist ein wohlbekanntes Mittel zur Steuerung der Calcium- und Phosphor-Homöostase. Es ist bekannt, daß diese Verbindung beim normalen Tier oder Menschen den intestinalen Calciumtransport und die Jinochen-Calcium-Mobilisierung stimuliert und wirksam bei der Verhinderung von Kachitis ist.

Es ist nunmehr auch wohlbekannt, daß das Vitamin D,, um wirksam zu sein, in vivo in seine hydroxylierten i'ormen umgewandelt

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werden muß. Beispielsweise wird das Vitamin zuerst in der Leber unter Bildung von 25-Hydroxyvitamin D, hydroxyliert und wird in der Niere weiter hydroxyliert unter Bildung von 1a,25-Dihydroxyvitamin D^ oder 24,25-Dihydroxyvitamin D₅,. Die 1α-hydroxylierte Form des Vitamins wii'd im allgemeinen als die physiologisch aktive oder hormoneile Form des Vitamins und als verantwortlich dafür angesehen, was als Vitamin D-artige Wirksamkeiten bezeichnet wird, wie die gestei^- gerte intestinale Absorption von Calcium und Phosphat, die Mobilisierung von Knochenmineral und die Zurückhaltung von Calcium in den Nieren,

Hinweise auf verschiedene Vitamin-D-Derivate finden sich in der Patentliteratur und anderer Literatur. Vergleiche beispielsweise die DiJ-Patentschriften 3 565 924, gerichtet auf 25-liydroxycholecalciferol; 3 697 559₎ gerichtet auf 1 ,25-Dihydroxy-cholecalcif erol; 3 741 996, gerichtet auf 1α-Hydroxycholecalciferol; 3'907 843, gerichtet auf lot-IIydroxyergocalciferol; 3 715 374, gerichtet auf 24,25-Dihydroxy-cholecalciferol; 3 739 991 ι gerichtet auf 25,26-Dihydroxy-cholecalciferol; 3 786 062, gerichtet auf 22-Dehydro-25-hydroxycholecalciferol; 3 847 955, gerichtet auf 1,24,25-Trihydroxycholecalciferol; 3 906 014, gerichtet auf 3-Desoxy-ia-hydroxycholecalciferol; 3 069 321, gerichtet auf die Herstellung von verschiedenen Seitenketten-fluorierten Vitamin D₇-Derivaten und »jeitenketten-fluorierten Dihydrotrachysterln^-Analogen.

^SS5^i!^ei5ü£-S_^S£ Erfindung

Es wurde nunmehr ein neues Derivat von Vitamin D^ gefunden, das eine ausgezeichnete Vitamin D-artige Wirksamkeit aufweist und das daher als Ersatz für Vitamin D., in seinen verschiedenen bekannten Anwendungen dienen kann und geeignet ist für die Behandlung verschiedener Erkrankungen wie Üsteomalacie, Osteodystrophie und Hypoparathyroidismus.

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Dieses Derivat ist 1a-Hydroxy-25-oxo-27-nor-cholecalciferol (ia-Hydroxy-25-keto-27-nor-Vitamin D₅.)

Best e_ Aus fuh.ru.n5sf orm_der_Erf indung

Die erfindungsgemäße Verbindung wurde nach, dem in abgekürzter lOrrn im folgenden Schema gezeigten Verfahren hergestellt:

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3Q45288

Dieses Verfahren umfaßt die lim ν end lung von 27-Nor-cholest-5~en-25-on (struktur 1 , Ii = H) in das entsprechende 25-Ketalderivat (2). Ein 3-Acylderivat von 27-Nor-cholest-5~en-25-on (z. B. otruktur 1 mit K = Acetyl oder Benzoyl) ist auch ein geeignetes Ausgangsmaterial für diese lieakt ions stuf e, wobei die Acylgruppe durch Hydrolyse in Base nach der Bildung des 25-Ketals entfernt wird. Das Ketal 2 wird einer Dehydrierung unterzogen unter Bildung des irienons 3» das mit H^Op in Base ep oxydiert wird unter Bildung des 1a,2a-Epoxy-4,6-dien-3-on-derivats 4. Die .Reduktion des letzteren in Metall/Ammoniak-Lösungen (Barton et al.-, J. Am. Chem. Soc. , 2£, 274-8 (1973)) ergibt 25,2.5-Athylendioxy-27-nor-choiest-5-en-1oc,3ß-diol, von dem die AetajLschutzgruppe durch Hydrolyse unter sauren Bedingungen entfernt wird, unter Bildung von 27-Nor-5-cholesten-1a,3ßdiol-25-on (Verbindung 5> mit ±i = H). Die anschließende Acylierung dieses Zwischenprodukts (/vcetylieren, Benzoylieren, usw.) ergibt das 1,3-Diacylderivat (Verbindung 5> worin k = Acyl), das umgewandelt wird in das 5>7-Dienderivat (6, i\ = Acyl) nach verschiedenen bekannten Verfahren, z. B. der Methode von Hunziker und Müllner (HeIv. Chim. Acta, 51_, 70 (1958)) oder über die 7-Keto- und 7-'i'osylhydrozon-Zwischenprodukte (Onisko et al., Bioorganic Chem., 6, 203 (1977))· i'alls gewünscht, können die Acylgruppen in dieser Stufe entfernt werden durch milde Basenhydrolyse (z. B. 10 %ige alkoholische KUH) unter Bildung des entsprechenden 1,3-Dihydroxyderivats. Die Ultraviolettbestrahlung einer Lösung des 5,7-Diens 6 (Ü = Acyl) ergibt das 27-Nor-25-keto-1othydroxy-Prävitamin ü^-diacylat, das zu dem entsprechenden Vitamin D^-Analogen isomerisiert wix'd durch Erwärmen und nach Entfernung der Acylgruppen durch milde basische Hydrolyse das gewünschte 27-Nor-25-keto-1a-hydroxy-vitamin D₅, (Verbindung 7) ergibt.

Ein alternativer präparativer Weg zum 1oc-Hydroxy-25-keto-Vitaminanalogen 7 wird durch das nachstehende Verfahrensschema erläutert.

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Dieses Verfahren umfaßt die Umwandlung des gleichen Ausgangsmaterials (Verbindung 1, worin a Acyl ist, ζ. B. Acetyl oder Benzoyl) in das bekannte 27-Nor-25-ketovitaiain D,-Produkt (Verbindung 8) unter Anwendung beispielsweise der Verfahren von Blunt und DeLuca (Biochemistry, 8, 671 (1969))· Dieses Vitaniinanaloge wird in sein 3-l¹c>sylderivat umgewandelt, welches zu dem 3,5-Oyclovitaminderivat (9) solvolysiert wird, worin Z dem Alkylteil des alkoholischen Lösungsmittels entspricht, das bei der Solvolyse verwendet wird, d.h. Z ist typischerweise Methyl oder Äthyl, kann jedoch auch Wasserstoff sein, wenn die oolvolyse in wäßrigem Medium durchgeführt wird. Dieses Zwischenprodukt wird seinerseits mit Selendioxid oxidiert zu dem la-Hydroxy-cyclovitaminderivat (10) unter Anwendung der Verfahrensweisen von Paaren et al. (Proc. Nat. Acad. Sei. £5_, 2080 (1978)). Die direkte Solvolyse von 10 ergibt nach der Reinigung das loo-Hydroxy-J-O-acylprodukt 11 , (worin die Acylgruppe H dem Acylteil der organischen Carbonsäure entspricht, die für die Solvolyse verwendet wurde, d.h. K ist typischerweise Acetyl oder i'ormyl) und dieses acylierte Zwischenprodukt wird anschließend leicht in milder Base zum 1oc-Hydroxy-25-keto-27-iior-vitamin D_y (Verbindung 7) hydrolysiert.

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Nummern, die die speziellen Produkte identifizieren, auf die in den vorstehenden Verfahrensschemata derart numerierten Verbindungen.

Beispiel 1 . ,

25,25-Athylendioxy-27-nor-cholest-5-en-3ß-ol

Eine Lösung von 3ß-Hydroxy-27-nor-cholest-5-en-25-on-3-acetat (1,K = Acetyl) (1,0 g, 2,33 mTlol) und p-Toluolsulfonsäure (100 mg), gelöst in trockenem Benzol (15Ο ml) enthaltend Äthylenglykol (18 ml) wurde langsam über 8,5 Stunden destilliert. Die Dünnschichtchromatografie (I¹LG) (20 % Aceton/Hexan) zeigte einen Produktfleck (Ef 0,55) und kein verbliebenes Ausgangsmaterial. Die Keaktion wurde gekühlt und Benzol und Wasser

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wurden zugesetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wäßrige Phase wurde mit zusätzlichem Benzol extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden zweimal mit Wasser und einmal mit Salzlösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde entfernt unter Bildung von 25,25-Athylendioxy-27-norcholest-5-en-3ß-ol-3-acetat: HMR (270 MHz).«S 0,67 (s, 18-CIU) 0,93 (d, J = CH₅, 21-CH,) , 1,01 (s, 19-CH₃), 1,28 (s, 26-GH₇), 2,05.' (Acetat-CH,) , 2,91 (Äthylenketal), 4,52 (breites m, Ja-H), 5,27 (m, 6-H).

Das Produkt wurde in Äther (5 ml) und 1m KOH/Methanol_(4 ml) gelöst und bei iiaumteiiiperatur 2 Stunden stehengelassen. TLC (20 % Aceton/Hexan) zeigte das Reaktionsprodukt (Rf 0,23)· üther und Wasser wurden' zugesetzt und die Phasen wurden getrennt. Die wäßrige Phase wurde mit Äther extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden zweimal mit.Wasser und einmal mit Salzlösung gewaschen und über KJ^Q₇. getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Mickstand wurde aus Äther umkristallisiert unter Bildung von 25,25-Äthylendioxy-27-riorcholest-5-en-3ß-ol, Verbindung (2), (0,7 g): Pp. 135-136 C.Weitere 270 mg von (2), die nur einen Fleck bei der 'DLC-Analyse zeigten, wurden aus den Mutterlaugen gewonnen: .NMH. (270 Mz), 0,67 (s, 18-CH₃), 0,93 (d, J = 6,2 H₃, 21-CH₃), 1,01 (s, 19-CH₃), 1,31 (s, 26-CH₃), 3,93 (Äthylenketal), 3,52 (breites m, Jx-R), 5»35 (^m» 6-H).

Beispiel 2 ■ .'

^tu-i ,4,O-trieii-3 >25-diun (3)

Ein Gemisch von (2) (0,046 g, 0,11 mMol) und 2,3-Pichlor-5,6-dicyano-1 ,4-benzochinon (0,08 g, 0,35 mliol) in Dioxan (1 ml) wurde 22 Stunden unter Rückfluß gehalten. Das Heaktionsgemisch wurde gekühlt und filtriert. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde durch eine neutrale Aluminiumoxidsäule (0,5 x 7 cm) .filtriert, eluiert mit Methylenchlorid. Das erhaltene Material wurde an einer präparativen Platte chromatografiert, die mit 15 % Aceton/Hexan, zweimal entwickelt wurde, unter Bildung von zwei Produkten.

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AO

Das Produkt vom ίίί" 0,21 war die gewünschte Verbindung (3) (10 mg): NMIt (60 MHz) 0,78 (ε, 18-GL₇), 0,93 (d, J = 6 Hz, 21-CH₅), 1,18 (s, 19-CIi₅, 1,30 (s, 26-CH^), 3,93 (Äthylenketal), 5,90, 6,05, 6,22 (drei m, Trienprotorien) ; 6,98 (d, J = 10 Hz, l'rienprotonen).

Das Produkt vom -Kf 0,15 wurde identifiziert als 27-Nor-cholest-1,4,6-trien-3,25-dion (9,3 mg); HHR (60 Miz) 0,78 (s, 18-CH₃), 0,93 Cd, J = 6 Hz, 21-CH₅), 1,18 (s, 19-CII₅), 2,1 (s, 26-CH^), 5,90, 6,03, 6,22 (drei ilultipletts, i'rienprotonen) , 6,95 (d, J= 10 Hz, Trien H).

Beispiel 3

25,25-Athylendioxy-1a ,2α-oxido-27-nor-cholest-4,6-dien-3,25-

dion (4). .

Zu einer Lösung von 3 (0,14- g, 0,33 mliol) in Methanol (5 ml) und Benzol (4 ml) wurden 10 % methanolische NaOH (0,04 ml) und 30 % HgOo (0,24 ml) gefügt. Nach 16 Stunden hei Kaumtemperatur wurde das I-ieakt ions gemisch auf -5 °C gekühlt und auf Eis gegossen. Das nach dem Extrahieren der wäßrigen Phase mit Methylenchlorid erhaltene Material wurde an einer präparativen Schicht chromatografiert, die dreimal mit 30 % Aceton/ Hexan entwickelt wurde, unter Bildung von 0,09 g des 1a,2a-Epoxids 4 (Hf 0,66): UV (Hexan L , 279, 288 nm (Schulter);

IHcL-X!

(60 MHz) S 0,78' (s, 18-CH₇), 0,93 (d, J = 5 Hz, 21

1,14 (s, 19-CH₅), 1,25 (s, 26-CH₅), 3,87 (Athylenketal), 3,35 (dd, J =4,5 Hz, 2 Hz, Epoxy H), 3,52 (d, J = 4,5 Hz, Epoxy H), 5,54 Cd,:J = 1,8 Hz), 5,97 Cs).

Beispiel 4

1a,3ß-Dihydroxy-27-norcholest-5-en-;_^J5-on-1 ,3-diacetat (5, Ii = Acetyl).

Zu einer Lösung von Na (0,1 g) in destilliertem flüssigem NH-, (7 ml) bei -33 C, wurde in einer Portion die Verbindung4 (0,09 g, 0,2 mMol) in THF (7 ml) gefügt. Nach 5 Minuten wurde

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NiLOl (0,7 s) in kleinen Portionen während 0,75 Stunden zugesetzt. Las Uli-, wurde verdampft und durch Äther ersetzt. Die ätherische Phase wurde mit Wasser, 1 η JlCl, Wassei·, Salzlösung gewaschen und getrocknet (NapSO^). Der nach dem Verdampfen des Äthers erhaltene Rückstand wurde an einer präparativen Schicht chromatografiert, die zweimal mit 30 W Aceton/Hexan entwickelt wurde, unter Bildung von 25,25-Atliylen-dioxy-27-norcholest-5-en-1a,3ß-diol (0,0125 g, Kf 0,22): NhK (270 KHz), <$ 0,68 (s, 18-CH₃), 0,93 (d, J =6,9 Hz, 21-CH₃), 1,03 (s, 19-CH₃), 1,31 (S-, 26-CH₃), 3,85 (m, 1ß-H), 3,93 (Athylenketal), 3,97 (Septett, J = 5,4 Hz, 3cc-H) , 5,58 (m, 6-H).

Eine Lösung dieses Produkts (12,5 ^rag, 0,028 mMol) und eine katalytische henge von p-Toluolsulfonsäure in Äthanol (2 ml) wurde bei Kaumtempera tür 5 Stunden gerühxt. Die TLC (50 % Aceton/Hexan, entwickelt dreimal) zeigte nur einen i'leck, luf 0,55· Das Äthanol wurde entfernt und hethylenchlorxd wurde zugesetzt. Die organische Phase wurde mit verdünntem NaIiCU^ und Wasser gewaschen und verdampft unter Bildung von 5 (ü = Wasserstoff): NhK (270 IiHz) S 0,68 (s, 18-CH₃), 0,94 (d, J = 6,6 Hz, 21-CH₃), 1,04 (s, 19-CH₃), 2,13 (ε, 26-CH₃), 3,85 (m, "Ia-H), 3,98 (m, 3a-H), 5,60 (m, 6-H); Massenspektrum iii/e (relative Intensität, berechnete hasse) 402,3151 (M⁺» 0,5p, berechnet für ^₂6^H42^Ü3' ⁴°2₇313^), 387,2898 (M⁺-CH₃,

0,07, 387,,2899), 384₇3042 (M⁺-H₂O, 1,00, 384,3028), 366^2922 (M⁺-2 χ H₂O, 0,18, 3.66,2922), 289,2169 (h⁺-öeitenkette, 0,13, 289,2167), 271,2061 (M⁺-H₂0-Seitenkette), 0,13, 271,2061), 253,1957 (M⁺-2 χ H₂ü-Seiter)kette, 0,13, 253_;1957).

Eine Lösung des Diolprodukts in Pyridin (0,5 ml) und Essigsäureanhydrid (0,5 ml) wurde unter Np während 2,5 Stunden auf 90 ⁰C erwärmt. Die Heaktion wurde mit kaltem Wasser und K₂CO^ abgeschreckt. Das Produkt wurde mit Et₂O extrahiert. Die organische Phase wurde mit 1 η HCl, verdünntem NaHCO^, Wasser und Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na₂SO^). Durch Verdampfen dec Äthers erhielt man 12,4 mg 5 (Ii = Acetyl), das bei der 'I¹LC (50 % Aceton/Hexan, iif 0,65) homogen war.

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Beispiel 5

1a,3ß-Dihydroxy-27-nor-cholest-5,7-ci.ien-25-on-1a,3ß-diacetat (6) (K = Acetyl).

Zu 5 (It: = Acetyl) (12,4 mg, 0,025 mliol und NaHCO, (14 mg) in Hexan (0,5 ml) wurde 1 ,3-Dibrom-5,5-<iimethylhydantoin (3,9 mg, 0,013 mllol) gefügt. Nach 20 Minuten Erwärmen bei 80 ⁰C unter Np wurde das Reaktionsgemisch gekühlt und filtriert. Das Hexan wurde verdampft und der Rückstand wurde in trockenem Xylol (0,5 E¹I) und 2,4,6-Trimethylpyridin (50 nl) gelöst und unter üückfluß unter N₀ 90 Minuten erwärmt. Das gekühlte Reaktionsgemisch wurde mit Benzol verdünnt und mit 1 η HCl, verdünntem I¹JaHCO₇, Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde zur Trockene verdampft und der erhaltene Rückstand wurde in Dioxari (0,5 ml), enthaltend p-l'oluolsulfonsäure (1,5 gelöst und 40 Minuten unter N- bei 70 erwärmt. Das nach dem Aufarbeiten erhaltene Material wurde durch TLC, entwickelt zweimal mit 10 % Aceton/Hexan gereinigt unter Bildung des Dien-Macetats 6 (R = Acetyl) (2,9 mg, Rf 0,29); UV (EtOH) λ 293, 281, 271, 262 nm; Massenspektrum m/e (relative Intensität) 484 (M⁺, 0,01), 424 (M⁺-AcOH, 0,08), 364 (M⁺-2 χ AcOH, 1,00), 5^9 (W⁺ - 2 χ AcOH-CH₃, 0,05), 251 (M⁺ - 2 χ AcOH-hieitenkette, 0,10), 118 (0,84).

Beispiel 6
1cx-Hydroxy-27-nor-25-ketovitamin D, (7)

Eine Lösung von 6 (R ■= Acetyl) in 20 % EtOH/Benzol (150 ml) unter Np bei 0 ⁰C wurde 20 Minuten in einem Quarzreaktionsgefäß mit einer 125-W-Hanovia-8A36-Juampe, ausgerüstet mit einem Corex-Filter, bestrahlt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und das gewonnene 1a-Hydro:cy-25-keto-27-norprävitamin-D^-1,3-diacetat wurde in Heptan gelöst und unter Np bei 85 C während 4 Stunden erwärmt unter Bildung von 1a-Hydroxy-25-keto-27-norprävitamin-D^-1,3-diacetat. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde in Äther (0,5 ml) und 0,1 m KOH/MeOH (0,5 ml) gelöst und 2,5 Stunden bei

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A J

iiaumtemperatur stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde entfernt und Äther und V/asser wurden zugesetzt. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen. Das Vitaminanaloge 7 wurde durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) (0,6 χ 25 cm mikroteilchenförmige öiliziumdioxidgelsäule) gereinigt, entwickelt mit 6 % 2-Propanol/Hexan. Die Verbindung 7 eluierte von 151 bis 158 ml· Eine analytische Probe war homogen bei erneuter Injektion in IiPLG: UV (Äthanol) \ 265, λ · 228am,

IuSlX. Hijil

λ ia ^min ^¹?' ^^iasseilsP^ektrum m/e (relative Intensität) . 400,2973 (H⁺, 0,10 berechnet für C₂₄H₄₀U₃, 400,2977), 382,2868 (Fl⁺-H₂O, 0,51, 382,2872), 364,2798^(M⁺ - 2 χ H₃O, 0,39, 364,2766)., 269,1913 (H⁺ - Hgü - Seitenkette, 0,06, 269,1905), 251,1792 (K⁺ - 2 χ H₂ü-öeitenkette, 0,12, 215,1800), 152,0828 (0,36, C₉H₁₁O₂, 152,0837), 13^0735 (1,00, C₉H₁₀O, 134,0732). ■ .

Beispiel 7

Herstellung von 25-Keto-27-norvitamin D-, (Verbindung 8)

Zu einer Lösung von 25-Keto-27-norcholesterin (2,0 g) in 5,0 ml Pyridin wurde 1,0 ml Essigsaureanhydrid gefügt und das Gemisch wurde 4 Stunden auf 50 erwärmt. Das Gemisch wurde anschließend auf gebrochenes Eis gegossen, feste K₀CO₇ wurde zugesetzt und das wäßrige Gemisch wurde mit Äther extrahiert. Die Ätherphasen wurden mit 1 η HCl-Lösung, verdünnter NaHCO,.-Lösung und anschließend mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Verdampfen des Ätherlösungsmittels wurde der .Rückstand an Siliziumdioxidgel (4,5 χ 4 cm Säule) chromatografiert, eluiert mit 600 ml 30 % Äthylacetat in Hexan, unter Bildung von 1,8 g des 3-Äcetatprodukts (Verbindung 1, worin K = Acetyl). Zu 250 mg 25~Keto-27-norcholesterin-3-acetat (1), Ii = Acetyl, gelost in 8,5 ial Hexan und 5,5 ml Benzol wurden festes NaIiCu-, (285 i«g) und II5 mg (1,3-Di^rOm-5,5-dimethylhydantoii: gefügt. Nach dem Erwärmen des Gemische unter Np während 20 Kinuten bei 80 ⁰C wurde es filtriert und der Rückstand wurde gut mit trockenem Benzol gespült. Die

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gesamte !''iltratlöüung wurde verdampft und der Rückstand wurde in 8,5 ml trockenem Xylol aufgenommen, zu dem 2,5 ml s-Collidin gefügt wurden. Dieses Gemisch wurde 1,5 stunden unter Np unter Rückfluß gehalten, anschließend gekühlt, mit Wasser verdünnt und mit Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden gewaschen (1 η IiGl, verdünntes NaIiCO,, H₀O und salzlösung) und getrocknet (Napüü_z), anschließend filtriert und das Lösungsmittel wurde verdampft.

Der Rückstand wurde in 8 ml Dioxan gelöst, 35 mg· p-Toluolsulfonsäure wurden anschließend zugesetzt und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 70 ° erwärmt. V/asser wurde zugesetzt und das Produkt wurde mit Äther extrahiert. Die Ätherphasen wurden gewa'schen (verdünntes 1'IaHCU-Z₅HpO und Salzlösung), über NapSO. getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde verdampft.

YjU dem Rückstand in 5 ml Äther, wurden 3 ml 5 % KOH in Methanol zugefügt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Nach dem Zusatz von Wasser wurde das Gemisch mit .Äther extx'ahiert, die Extrakte wurden gewaschen (HpO und Salzlösung) , getrocknet (NapSO^) und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der Rückstand ergab nach der Chromatografie an .Siliziumdioxidgelplatten (0,75 mm dick), entwickelt mit 25 % Äthylacetat in Chloroform, 88 mg de;; 'gewünschten Produkts, 25-keto-27-nor-7-dehydrocholesterin. Dieses 5>7-Dienprodukt, gelöst in Äther (150 ml) wurde 'unter Np 5 Minuten bei 0 ° bestrahlt unter Vex'wendung einer Hanau-Lampe mit Vycor-ü'ilter. ■ Das Lösungsmittel wurde anschließend verdampft und der Rückstand wurde an Siliziumdioxidgel-Dünnschichtplatten chromatografiert, zweimal entwickelt mit 25 % Äthylacetat/CHCl₅,, unter Bildung des Prävitaminprodukts (25-Keto-27-nor-prävitamin

Dieses Produkt, gelöst in 2 ml CCl., wurde 3>5 Stunden unter N bei 80 ° erwärmt, um die.Isomerisierung zu bewirken. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhielt man 25-Keto-27-nor-vitamin Dv (Verbindung 8).

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13gi.spiel 8

6-l"iethoxy-25-keto-27-¹:ior-3,5-cyclovitainin D₅, (Verbindung 9, Z = Me)

Eine Lösung von 20 mg 25-Ketovitamin 8 in 0,25 ml trockenem Pyridin wurde mit 40 ng ToluolsulfonylChlorid behandelt. Wach 90 Stunden bei 5 wurden Eisschnitzel und 10 % NaHCÜ^-Lösung zugesetzt und das Gemisch wurde in Äther extrahiert.. Die Atherphasen wurden gewaschen (1 η HCl, verdünntes NaIICO-,, Wasser, Salzlösung) und über MgSO^. getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde das 3-tosylierte Produkt (20 mg) in 2_tml trockenem Methanol und 0,3 ml trockenem Benzol gelöst, 100 mg NaKCO-, wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 20 Stunden auf 55 erwärmt. Nach dem Zusatz von HpO wurde das Gemisch mit iither extrahiert, die !therextrakte wurden gewaschen (HpO und Salzlösung), getrocknet (MgSU₀) und verdampft unter Bildung von 20 mg des gewünschten 3»5-Cyclovitaminprodukts 9 (Z = Methyl). .

Beispiel 9

1a-Hydroxy-6-methoxy-25-keto-27-nor-3 ,5-cyclovitamin D-, (10, Z = Me).

Zu 1,9 mg SeO₀ in 0,7 ml trockenem CK₀Cl.., bei 0 ° wurden 10 ul 90 ^c/o t-Butylhydroxyperoxid gefügt und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 0 ° gerührt. Zu diesem Gemisch wurden 20 mg Cyclovitaniinprodulvt 9 (Z = Me) in 0,7 ml Ch₀Cl,, ti.-opfenweise gefügt und die Reaktion konnte in 12 Minuten bei Kaumtemperatur verlaufen. Die Reaktion wurde durch Zusatz von gesättigter NaiiCÜv-Lösung abgeschreckt und das Gemisch wurde mit CiL)C^ extrahiert. Die organischen Extrakte wurden gewaschen (verdünntes NaIiCO,, Wasser, Salzlösung), getrocknet (MgSO^) und das Produkt wurde durch Dun.nschichtchromatOg.vafie (Siliziumdioxidgel, 40 % Athylacetat/IIexan) gereinigt, j.uf diese V/eise erhielt man 5 mg 1a-liydi'oxyc_tyclovitamini)rodukt 1') (Z = Methyl), das durch sein hassenspektrum und Protonen-Nnl-L-Spektrum charakterisiert wurde.

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Die Behandlung der Verbindung. 10 (1 il.j;) mit Essigsäureanhydrid (0,1 ml) in Pyridin (0,1 ml) "bei 55 ° während 1,5 Stunden ergab das entsprecnende 1a-Acetoxyderivat. In gleicher Weise wird das 1cx-Benzoat hergestellt durch Reaktion von 10 mit Benzoylchlorid (in Pyridin bei Räumt eiap er at ur 'während 3 Stunden).

Beispiel 10

iLX-HydiOxy-25-kt't;o-27-noi^>vitamin 1>, (Verbindung 7)

Das 1a-Hydroxy-6-methoxy-25-keto-27-"nor-3,5-cyclovitamin-D^- Produkt (10 mg) wurde in 0,5 ml Eisessig aufgenommen und 15 Minuten bei ^ erwärmt. Gebrochenes Eis und ausreichend NaHCO-, zur Neutralisation des Reaktionsgemische wurden anschließend zugesetzt und dr.s Gemisch wurde mit Äther extrahiert. Die iitherextrakte wurden gewaschen (verdünntes NaHCO,, H^O, Salzlösung), getrocknet (IigSu^_) und verdampft. Der Rückstand, der hauptsächlich das gewünschte 1a-Hydi'Oxy-25-keto-27-norvitaB!in~ Iu-3-acetatprodukt (Verbindung 11, R = Acetyl) und das entsprechende 5,6-trans-Isomere enthielt, wurde anschließend chromatografiert (Hochdruck!¹ lücsigkeitschromatografie unter Verwendung einer 0,62 χ 25 cm Säule von Zorbax-SIL und 2,5 % 2-Propanol in Hexan als Eluierlösungsmittel; Zorbax-SIL ist ein mikroteilchenförmiges Siliziumdioxidgelpräparat, ein Produkt der Dupont und Co., Wilmington, Del.). Das gewünschte cis-Vitaminprodukt 11 (R = Acetyl) eluierte bei 103 ml und nach dem einmaligen Recyclisieren wurde es in reiner i'orm O,'I- mg) erhalten und durch sein Protonen-NI^V1R-Spektrum charakterisiert. Das entsprechende 5₅6-traris-lsomere, 1cc-Hydroxy-25-keto-5,6-trans-27-norvitamin-D^-3-acetat, eluierte bei 112 ml und wurde in reiner ϊ'οηα gewonnen.

Jas so erhaltene 3-Acetatprodukt 11 (R = Acetyl) vmrde in einer Lösung von Äther (0,5 ml) und 0,1 m XOII/MeÜH (0,1 ml) hydrolysiert. Die Hydrolyse war nach 1 Stunde bei Raumtemperatur vollständig, worauf Wasser zugesetzt wurde und das Gemisch mit Äther extrahiert wurde. Die Extrakte wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über ligfciü^. getrocknet und das Lösungsmittel

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wurde verdampft unter Eildung von 2,9 ng 1oc-Hydroxy-25-keto-27-noryitamin D-, (Verbindung 7)» das Ultraviolett-, kernmagnetische Resonanz- und Massenspektren zeigte, die genau mit der Struktur in Einklang standen und mit den Daten übereinstimmten, die für das gleiche Produkt, vorstehend in Beispiel 6 dokumentiert, erhalten wurden.

Die Identifizierungshydrolyse des 3-Acetatderivats des 5>6-trans-Produkts ergab das 1<x-Hydroxy-25-keto-5,6-trans-27-norvitamin D, (DV: K _ 273 nm; Massenspoktrum m/e 400 (M⁺), 152, 134).

Männliche Säuglingsratten (Holtzmari Co., Madison, Wis.) wurden in hängende Drahtkäfige eingesetzt und ad libitum mit einer liiedrigcalcium-, Vitamin-D-Mangel-Diät, wie von Sud a et al. (J. liutr. 100, 1049 (197O)) beschrieben, während 2 bis 3 Wochen voi¹ ihrer Verwendung in den folgenden Versuchen, gefüttert.

Intestinaler C^lciumtransport

Die Katten wurden in sechs Gruppen von jeweils sechs Tieren aufgeteilt und jeder wurde eine einzige Dosis der Testverbindungen, gelöst in 0,05 ml 95 % Äthanol, durch intrajuguläre Injektionen, verabreicht. Die verabreichten Mengen sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. Die Gruppe 1, die Kontroll gruppe, erhielt nur das Lösungsmittel-Vehikel (0,05 ^l 95 % Äthanol). 24 Stunden nach der Injektion der Verbindung wurden die Hatten durch Köpfen getötet und ihre Duodena wurden zur Messung der Aktivität des Galciunitransports nach den Techniken von Martin und DeLuca (Am. J. Physiol. 216, 1351 (1969)) verwendet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.

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45 4 5 Gruppe verabreichte Verbindung GA serosal/ "CA mucosal

(Mittel - SEM)

1 EtOH 2,1 - 0,2

2 12,5 ng 1,25-(UrI)₂D₅ ³ . 4,6 ± 0,2

3 0,5 ^g Verbindung .7 *> 2,3 ± 0,2

4 2,5 ug Verbindung 7 . 3,2 - 0,3

5 12,5 Mg Verbindung 7 3,2 ± 0,4

6 . 25^g Verbindung 7 3,7 ^± 0,3

u 1 ,25-(OH)pD-, = 1 a,25-Dihydi¹oxyvitamin D^

b Verbindung 7 = 1a-Hydroxy-25-keto-27-norvitamin D,

Knochencalciummobilisierung

(Erhöhung der Serum-Calciumlconzentration)

die wie vorstellend gefüttert wurden, x^ui'den in Gruppen von jeweils seciiü 'Tieren aufgeteilt, denen 0,05 ml 95 % Äthanol (die Kontrollgruppen) oder verschiedene Mengen der Testverbindungen (wie in der nachstehenden Tabelle angegeben), gelöst in 0,05 ml 95 % Äthanol.durch intrajuguläre Injektion verabreicht wurden. Die Materialien wurden in einzelnen Dosierungen 6 oder 24 otunden vor der Tötung verabreicht. Die Hatten wurden durch Köpfen nach den angegebenen Zeiten getötet, ihr Blut wurde gesammelt und ζην Erzielung des oerunis zentrifugiert. Ein aliquoter Teil des Berums (0,1 ml) wurde mit 1,9 ml einer 0,1 % Lanthanchloridlösung vermischt und die Cälciumkonzentration im Serum (als ein Anzeichen für die Freisetzung von Knochencalcium als .Reaktion auf die Te st verbindung) wurde mit einem Atomabsorptions-opektrophotometer (Perkin Eimer Model iiu-214) gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.'

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verabreichte Verbindung

	Lierum Ca "	,2	_1_	(mg/100	ml)	± ΰΕΜ
6	Stunden	,5	± 0,1 .	24 ütunden	± 0,2
	Hit bei	,5	± 0,2	Mittel	± 0,2
4	,2	±0,1	3,7	± 0,1
4	,3	± 0,1	4,7	± 0,2
4	± 0,2	3,6	± 0,2
5	3,9
5	4,3

EtOH (Kontrolle) 12,5 ng 1,25-(OH)_?D, 0,500 ug Verbindung 7 2,5 /Ug Verbinduiag 7 12,5yag Verbindung 7 25/Ug Verbindung 7

5,2 ± 0,1

D, = 1 a,25-Mhydroxyvitamin IU b Verbindung 7=1 o-riydroxy-25-keto-27-norvitamin D

Aus den vorstehenden Jäten ist ersichtlich, daß 1<x-Hydroxy-25-keto-27-norvitaniiii D₇ (Verbindung 7) eine ausgeprägte Vitamin D-artige V/irksamkeit entwickelt. Besonders bemerkenswert in diesem Zusammenhang ist der rasche Einsatz der Wirkung (vergleicne die 6-3tunden-Zeitpun;cte der vorstehenden Tabelle), im Vergleich mit dem von 1 ,25-(0H)₀D₇., dem raschest wirksamen bisher bekannten Vitamin-D-j-Derivat.
3

Abgesehen von seiner Verwendbarkeit als biologisch aktives Analoges von Vitamin D₃, ist die erfindungsgemäße Verbindung auch nützlich als synthetisches Zwisclienprodukt für die Herstellung anderer gewünschter Vitamin-D-Verbindungen- Beispielsweise führt die Behandlung dieser ia-Hydroxy-25-keto-Vitaminverbindung mit einem Bethyl-Grignard-Reagens (z. B. OH₇UgBr oder CHJIgI) oder einem Iiethyllithiumreagens, zum 1a,25-Dihydroxyvitamin D₅., dem wirksamsten bekannten Metaboliten von Vitamin D^. Das Z'j-Ketoderivat kann so als Ausgangsmoterial J'ür uine einfache und geradlinige Herstellung dieses hochervn.ui.üchten l'letaboliten dienen. Noch bedeutsajner kann das 25-iietonderivat als Ausgangsmaterial für die oyntiiese von 1 ,25-(OiI),,D₅, in hochradioaktiver

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10

i'OjMii diotLCiι. iju ergibt die Beh; md lung de:; Ketons mit tritiiertem riethyl-Grig:i.ard- oder liethyllitiiium-Iieagens direkt das (26,27-^iI)-I ,25-(0Ii)₀D₇ und mit geeigneten C-narkierten

*" "^ 14

neagentien ergibt die gleiche iceaktion das (26,27- C)-1 ,25-(υΐΐ).,ϋ-.. Nach d Leser Iuethode kann radiomarkiertes 1,25-(UlI)₀D_x mit äußerst hohor tspezifir.cher V/iii-.:.:ai:i]Leit in einer einfachen leicht durchzuführenden Keakt.ionsuLufe hergestellt werden (ζ. B. kann (26,27-^H)-I ,25-(OiI)₀D_x mit spezifischer Wirksamkeit von 80 Ci/nu'iol hergestellt werden). In gleicher Weise wird das i'rideutero- oder ^C-markierte 1,25-(0H)₂D, leicht hergestellt durch Behandeln des Ketons (7) mit den in geeigneter Weise isotopisch markierten Grignard- oder Alkyllithium-lieagentien, die leicht hergestellt werden nach bekannten Ilethoden aus den handelaäblichen isotopisch markierten iie thy !halogeniden, (ζ. Β.

¹ 15
(J"i-i_yl, GIi-, 1, u;;vv'-)·

'b:\ 5,6-trans-VJ I;aj[iin-D_y-Verbixidungoa isomerisiert werden können durch Bestrahlen mit Ultraviolettliclvt zu den entsprechenden 5,6-cis-Isomeren, was auf dem Fachgebiet bekannt ist, ist das nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene. 5»6-trans-1 ccnydroxy-25-keto-27-norvitamin-D₇-produlct brauchbai¹ wegen seiner i'otochemischen Umwandlung in das 5₅G>-ciE-Produli:t.

Iu den Ansprüchen bedeutet der Ausdruck "Niedrigalkyl" eine jilkylgruppe mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoff en, wie Methyl, Äthyl, . isobutyl, sec.-Butyl, L"-Butyl und der Ausdruck "Acyl" bedeutet eine Acylgruppo, wie l'Onayl, Acetyl, Benzoyl oder ■ Nitroben::oyl.

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Claims (8)

1. 3Q45288

   r .·.-<:'"V-A'WKLTE
   Dr rfi.·. nut. Dlci^P. LOUIS Dipl.-Phys. CLAUS POHLAU Dlpl.-lng. FRANZ LCHRENTZ Dlpl.-Phys.WOLFGANG SEGETH

   KESSLERPLATZ 1
   NÜRNBERG 20

   IN AIAJhWI iiEüK/LkOH JiO.UWDA'J'luN 20

   014· Worth vyalnut ütreot hadison, Wisconsin 53707 / UbA

   Patentansprüche

   Sy-nor-Vitamin D-, und Acylate davon.
2. 2. 1^a-Hydroxy-2j?-lEetp-27-ⁱnor-±^>rävitaiuin D^ und Acylate davon.
3. 3. 1a_j,3^-Dihydroxy-27-nor-cholesta-5,7-dien-25-on und Acylate davon.
4. H . 1a ,3|i-Dihyd.roxy-<"'7-iioi'-cho LesL-5-coii-. ¹V-OU und Acylate davon.
5. 5. Verbindungen mit der struktur

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   worin id ausgewählt ist aus Wasserstoff, Hydroxy und U-Acyl und worin Z ausgewählt ist aus Wasserstoff oder Niedrigalkyl. ■
6. 6. Verbindung nach Anspruch 5> worin Ii Wasserstoff ist und Z Methyl ist
7. '/. Verbindung nach Anspruch 5» worin H Hydroxy ist und Z Methyl ist und die Acylate davon.
8. 8. 1a-iiydroxy-2i?-keto-5»'6-trans-27-Worvitamin D und Acylate davon.

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