DE3027105A1 - Verfahren zur herstellung eines die proliferation und differenzierung menschlicher granulopoetischer stammzellen stimulierenden faktors - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines die proliferation und differenzierung menschlicher granulopoetischer stammzellen stimulierenden faktorsInfo
- Publication number
- DE3027105A1 DE3027105A1 DE19803027105 DE3027105A DE3027105A1 DE 3027105 A1 DE3027105 A1 DE 3027105A1 DE 19803027105 DE19803027105 DE 19803027105 DE 3027105 A DE3027105 A DE 3027105A DE 3027105 A1 DE3027105 A1 DE 3027105A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- medium
- glycoprotein
- csf
- human
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulopoetischer
Stammzellen stimulierenden Faktors, nachstehend als Colony stimulating factor (CSF) bezeichnet. Dieser
Faktor ist ein Arzneistoff, der zur Behandlung von Granulo-
10 zytopenie beim Menschen eingesetzt werden kann.
Es ist bekannt, daß CSF eine Schlüsselfunktion bei der Granulopoesis und der Bildung von Monozyten und/oder Makrophagen
in vivo/ CSF wirkt im menschlichen Körper auf die Blutstammzellen, welche die Mutterzellen für die Granulozyten,
Monozyten und Makrophagen darstellen; vgl. D.Metcalf, Experimental Haematology, Bd. 1 (1973), S. 185 bis 201. Der
Vorschlag der Verwendung von CSF als Arzneistoff zur Behandlung von Granulozytopenie stammt von T. Fumimaro, Igaku
no Ayumi (Progress in Medical Science), Bd. 95, Nr. 2 (1975), S. 41 bis 50. Bisher wurde jedoch CSF als Arzneistoff nicht
eingesetzt, weil der Mechanismus der Bildung von Granulozyten, Monozyten und Makrophagen in vivo kompliziert ist,
das Verhalten von CSF dabei noch teilweise unbekannt ist und es schwierig war, große Mengen CSF in pharmakologisch annehmbarer
Qualtität herzustellen.
CSF kann auch als Diagnostikum verwendet werden. Es ist bekannt, daß die Bestimmung der Anzahl von auf CSF-reagierenden
Zellen in Knochenmarkzellen von erheblicher Bedeutung für die Prognose von Patienten ist, die an myelogener Leukämie
leiden; vgl. Nakao und Takaku, Proliferation and Differantiation "of Blood Cells - Fundamental and Clinical Aspects,
S. 29, Verlag Kagaku Hyoron-sha Co., Japan, 1975. CSF eignet sich als Reagens (Bezugsstimulator)für diesen Zweck.
Ebenso wie im vorstehenden Fall der Verwendung als Arznei-
L J
030067/0763
stoff ist CSF auch zur Diagnose bis jetzt nicht eingesetzt worden, weil es schwierig war, größere Mengen mit ausreichender
Qualität für diagnostische Zwecke herzustellen.
Zur Herstellung von CSF, das unmittelbar auf die Stammzellen wirkt, sind verschiedene Verfahren bekannt, beispielsweise
die Züchtung von Leukozyten aus menschlichem peripherem Blut (G.B. Price u. Mitarb., Biochemical Journal,
Bd. 148 (1975), S. 209 bis 217), menschlichen Plazentazellen ( vgl. A.W. Burges u. Mitarb., Blood, Bd. 49, Nr. 4
(1977), S. 573 bis 583) oder bestimmten Krebszellen, die CSF bilden (vgl. N*0sawa u. Mitarb., Acta Hematologica
Japonica, Bd. 42, Nr. 2 (1979), S. 237). Möglicherweise sind von den vorstehend beschriebenen Verfahren die Verfahren von
Price u. Mitarb, und Burges u. Mitarb, zur Herstellung von
CSF für pharmazeutische Zwecke geeignet. Die üblichen Verfahren unter Verwendung von Leukozyten oder menschlichen
Plazentazellen sind jedoch lediglich Labormethoden zur Gewinnung kleiner Mengen CSF, und sie sind zur technischen Her-20
stellung von CSF ungeeignet. Weiterhin muß zur Herstellung von CSF nach dem bekannten Verfahren das Medium zur Züchtung
der Zellen Serum enthalten. In Abwesenheit von Serum wird nämlich kein CSF gebildet. In der Regel wird Rinderserum
oder fetales Kälberserum verwendet. Zur Vermeidung von Neben-25
Wirkungen (Sensibilisierung und anaphylaktischer Schock)
durch diese Fremdproteine in den Medien ist es erforderlich, die Proteine nach der Vermehrung der Zellen abzutrennen oder
menschliches Serum zu verwenden. Die Abtrennung dieser Proteine aus dem gebildeten CSF im Medium ist umständlich und
30
schwierig, und die Verwendung von menschlichem Serum ist teuer.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von CSF zu entwickeln, das in techni-35
schem Umfang durchführbar ist und CSF liefert, das sich zur
Behandlung von Granulozytopenie in der Humanmedizin ohne
030067/0763
Nebenwirkungen und als Reagens zur Diagnose von myelogener Leukämie eignet. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung
gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
5
Das aus menschlichem Urin isolierte, erfindungsgemäß verwendete
Glykoprotein, welches die Bildung von menschlichen Granulozyten stimuliert (nachstehend als Glykoprotein H
bezeichnet),ist in der DE-OS 2 910 745 beschrieben. Ein GIykoprotein,
welches die Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten stimuliert, nachstehend als Glykoprotein M bezeichnet,
das aus menschlichem Urin isoliert wird, ist als ein Sialinsäure enthaltendes Glykoprotein beschrieben;
vgl. Stanley und Metcalf, Australien Journal of Experimental Biological Medical Science, Bd. 47 (1969), S. 467 bis 483,
Stanley u. Mitarb., Federation Proceedings, Bd. 34, Nr. 13 (1975), S. 2272 - 2278 und Laukel et al., Journal of
Cellular Physiology, Bd. 94 (1978), S. 21 bis 30.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete synthetische
Zellkulturmedium kann ein übliches synthetisches Medium für Gewebekulturen oder Zellkulturen sein, beispielsweise
McCoy's 5A-Medium ( T.A. McCoy, M. Maxwell und P.F. Kruse,
Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Bd. 100 (1959), S. 115
bis 118), Nährgemisch HAMF-10 (R.G. Harn, Exp. Cell Res.,
Bd. 29, S. 515 bis 526), RPMI-1640 (vgl. S. Iwakata, J.T.
Grace Jr., N.Y.J.of Med., Bd. 64 (1964), S. 2279 bis 2282)
oder ein durch Aminosäur'en ergänztes Eagle's MEM Medium
(vgl. H. Eagle, Science Bd. 130 (1959), S. 432. 30
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend näher beschrieben
.
(1) Isolierung der Monozyten und Makrophagen 35
Mittels einer heparinisierten Spritze wird venöses Blut von
L . J
030087/0783
gesunden Versuchspersonen entnommen, in ein steriles
Reagensglas abgefüllt und 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsschritte
werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Nach 5 dem Stehen wird die obere Leukozyten enthaltende Schicht
abgetrennt, einmal mit einem synthetischen Gewebe-Kulturmedium gewaschen und danach einer Dichte-Gradientenzentrifugation
unterworfen (vgl. T. Mahmood und W.A. Robinson, Blood, Bd. 51, Nr. 5 (1978), S. 879 bis 887),
um die Leukozytenschicht in eine Schicht zu fraktionieren, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten sowie eine weitere
Cranulozyten enthaltende Schicht/ Die erstgenannte Schicht wird isoliert. Es wird eine Zellfraktion erhalten,
die in einem synthetischen Gewebekulturmedium suspendiert wird. Nachstehend wird dieses Gewebekulturmedium kurz als
Medium bezeichnet. Die Zellsuspension wird zentrifugiert und der erhaltene überstand verworfen. Die erhaltenen
sedimentierten Zellen werden mit dem gleichen Medium mindestens zweimal gewaschen. Hierauf werden die gewaschenen
Zellen in einem geringen Volumen des gleichen Mediums suspendiert. Ein Teil der erhaltenen Suspension wird entnommen
und die Zahl der Zellen mittels eines automatischen Blutzellenzählgeräts bestimmt. Das Zahlenverhältnis von
Monozyten und Makrophagen zu Lymphozyten wird unter dem Mikroskop an einem Ausstrich bestimmt, der nach Wright-Giemsa
gefärbt ist. Die Zellensuspension wird in einer Petrischale aus Glas oder Kunststoff so verteilt, daß die
Zahl der Inokula (Monozyten und Makrophagen) dem vorgeschriebenen Wert entspricht, vorzugsweise 10 bis 10 pro
Petrischale. Sodann wird ein synthetisches Gewebekulturmedium
zugegeben, das mit 5 bis 20 Volumprozent Serum ergänzt ist. Hierauf läßt man die Petrischale 2 Stunden
an feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid bei 370C stehen.
Während dieser Zeit verankern sich die Monozyten und Makro-
phagen an der Bodenfläche der Petrischale, während die
Lymphozyten im Medium suspendiert bleiben. Das Medium wird
L J
030087/0783
sodann verworfen und die Petrischale wird mehrmals mit einem Medium ohne Serum oder mit physiologischer Kochsalzlösung
gewaschen. Nach dieser Behandlung ist der größte Teil der Lymphozyten abgetrennt, während die Monozyten und Makrophagen
am Boden der Petrischale haften. Die mikroskopische Untersuchung ergibt, daß mindestens 95 % der Zellen, die am Boden
der Petrischale haften, Monozyten und Makrophagen sind, und
5 7
ihre Zahl 10 bis 10 pro Petrischale beträgt.
ihre Zahl 10 bis 10 pro Petrischale beträgt.
(2) Züchtung bzw. Vermehrung der Monozyten und Makrophagen
Die Petrischale mit den Monozyten und Makrophagen wird mit einem synthetischen Medium versetzt, das gegebenenfalls mit
Serum ergänzt ist und das mindestens 0,1 ug/ml Medium Glykoprotein
(H) oder eine Glykoprotein (H) enthaltende Fraktion oder mindestens 500 Einheiten/ml Medium Glykoprotein (M)
oder eine Glykoprotein (M) enthaltende Fraktion enthält. Die Einsaatdichte der Monozyten und Makrophagen beträgt mindestens
10 /ml Medium. Das beimpfte Medium wird 1 bis 7 Tage bei 37°C an feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid inkubiert.
Dabei wird CSF in das Medium abgegeben. Das verwendete synthetische
Medium ist das vorstehend erwähnte Gewebekulturmedium.
Die optimalen Bedingungen zur Herstellung von CSF nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hinsichtlich Züchtungsdauer,
Menge des zugesetzten Glykoproteins, Einsaatdichte, Menge des zugesetzten Serums und Art des verwendeten Mediums werden
nachstehend in den Ausführungsbeispielen noch näher beschrieben.
30
30
Zur Herstellung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird erfindungsgemäß
ein Medium verwendet, das durch menschliches Serum ergänzt ist, oder es wird ein serumfreies Medium verwendet,
um Sensibilisierung und anaphylaktischen Schock ^ durch Fremdproteine zu vermeiden. Zur Herstellung von CÖF
für diagnostische Zwecke kann andererseits ein Medium ver-
030087/0783
-8- 30271
wendet werden, das durch Rinderserum oder fetales Kälberserum
ergänzt ist. Ferner ist es möglich, auch Kulturflaschen anstelle von Petrischalen zu verwenden. Schließlich
können die vermehrten Monozyten und Makrophagen auch wieder-
5 holt verwendet werden.
(3) Glykoproteine
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Glykoproteine
werden aus menschlichem Urin isoliert. Sie stimulieren die Bildung menschlicher Granulozyten oder Mäusemakrophagen und
Granulozyten. Es kann auch eine Fraktion verwendet werden,
die diese Glykoproteine enthält.
Daß zur Stimulierung der Bildung menschlicher Granulozyten geeignete Glykoprotein kann nach der JP-OS 140 707/79 und
der entsprechenden DE-OS 2 910 745 gewonnen werden. Das Verfahren ist nachstehend erläutert.
Frischer Urin von gesunden Versuchspersonen wird mit verdünnter
Säure oder Base auf einen pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8 eingestellt und zur Abtrennung von Verunreinigungen
zentrifugiert. Der erhaltene Oberstand wird mit einem Silicium enthaltenden Adsorptionsmittel, beispielsweise
Kieselgel, Kieselgel-Magnesiumsilikat, Diatomeenerde, Quarzglas oder Bentonit, behandelt, und die adsorbierten Bestandteile
werden mit einer alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von mindestens 9 eluiert. Die zum Eluieren verwendete
alkalische Lösung ist nicht kritisch. Vorzugsweise wird
30 eine wäßrige Lösung von Ammoniak oder Natriumhydroxid in
einer Konzentration von 0,3 bis 1,5 molar verwendet. Das erhaltene
Eluat wird auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und mit einem Neutralsalz, beispielsweise Ammoniumsulfat,bis
zu einer Sättigung von 70 % versetzt, um die aktive Substanz auszusalzen. Es wird eine das Glykoprotein enthaltende Rohfraktion
gewonnen.
L J
030087/0783
Γ ~l
Die erhaltene Rohfraktion wird in einer geringen Menge einer alkalischen Lösung gelöst, durch Ultrafiltration von niedermolekularen
Substanzen mit einem Molekulargewicht bis
höchstens 10 000 befreit und sodann zur Abtrennung der in der 5
Lösung enthaltenen Verunreinigungen mit einem Kationenaustauscher behandelt, beispielsweise mit Carboxymethyldextran,
Carboxymethylcellulose oder Phosphorcellulose. Vor dieser Behandlung mit dem Kationenaustauscher werden sowohl die das
Glykoprotein enthaltende Rohfraktion als auch der Ionenaustauscher mit einer vorzugsweise 0,01 bis 0,15 molaren Pufferlösung
auf einen pH-Wert von 6 bis 8 äquilibriert, damit die Behandlung mit dem Austauscher bei nahezu neutralem pH-Wert
durchgeführt werden kann. Der größte Teil des Glykoproteins wird vom Ionenaustauscher nicht adsorbiert. Nach dem Konzentrieren
des Eluats wird das Konzentrat mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 8 äquilibriert und in einen
Anionenaustauscher, beispielsweise DEAE-Cellulose gegeben,
der mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, um das
Glykoprotein an dem Anionenaustauscher zu adsorbieren.
Hieraus wird das adsorbierte Glykoprotein mittels einer linearen Konzentrationsgradientenlösung einer 0,1 bis 0,3 molaren
Salzlösung, beispielsweise einer Natriumchloridlösung, eluiert. Das Glykoprotein wird bei einer Salzkonzentration
von mindestens 0,1 molar eluiert, jedoch ist eine genaue Ab-25
trennung schwierig. Die Eluatfraktionen bei 0,1 bis 0,3 molarer Salzkonzentration werden vereinigt. Erforderlichenfalls wird
die vereinigte Fraktion entsalzt und konzentriert. Diese Fraktion wird als Fraktion A bezeichnet. Die Fraktion A kann als
solche im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Die
30
Glykoproteinfraktion kann auch durch Adsorption an einem
Anionenauustauscher und stufenweises Eluieren mit einer 0,1 bis 0,3 molaren Salzlösung gereinigt werden, bevor man diese
Fraktion der Eluierung mit einem linearen Konzentrationsgradienten unterwirft.
35
35
0300S7/0763
Zur weiteren Reinigung wird die Fraktion A der Gelchromatographie an einem stark vernetzten Polymergel mit einem Wasseraufnahmewert von 10 bis 20 ml/g, beispielsweise Sephadex
G-150 oder Biogel P-100/ unterworfen. Die aktiven Substanzen
werden mit einem 0,05 bis 0,1 molarem Salzpuffer entwickelt
und Fraktionen mit einem relativen Ausflußwert von 1,11 bis
1,60, vorzugsweise 1,11 bis 1,45, werden gesammelt, entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Diese Fraktion wird
als Fraktion B bezeichnet.
Die auf diese Weise erhaltene Fraktion B kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Das relative
Ausflußvolumen ist das Verhältnis Ve : Vo, wobei Ve das
erforderliche Volumen des Lösungsmittels ist, um die Substanz in der Säule zu eluieren, und Vo das Leervolumen der Gelsäule
darstellt.
• Zur weiteren Reinigung wird das erhaltene Präparat in einer
verdünnten Pufferlösung mit einem Salzgehalt von 1,0 bis 2,0 molar, beispielsweise einer Phosphatpafferlösung vom pH-Wert
6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0 gelöst, die 1,0 bis 2,0 molar an Natriumchlorid ist.Die Lösung wird der Affinitätschromatographie
an einem Zucker-affinen Adsorptionsmittel, beispielsweise Concanavalin A - Sepharose 4 B, unterworfen,
das mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Das an der Affinitätssäule adsorbierte Glykoprotein wird
mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eluiert, die 1,0 bis 2,0 molar an
Salz ist und die 20 bis 100 mMol eines Saccharide, beispielsweise a-Methyl-D-glukosid, enthält. Die das Glykoprotein enthaltenden
Fraktionen werden vereinigt, erforderlichenfalls entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Diese Fraktion
kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
0300δ7/07δ3
Zur weiteren Reinigung wird die erhaltene Fraktion der präparativen
Zonenelektrophorese unterworfen. Als Trägermedium wird beispielsweise ein Polyacrylamidgel oder Agargel vom
pH-Wert 7,0 bis 9,0 verwendet. Es wird eine hochgereinigte
Glykoproteinfraktion aus dem Trägermedium durch Eluieren mit einer kalten verdünnten Salzlösung erhalten. Diese Fraktion
wird entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Dieses gereinigte Glykoprotein kann ebenfalls im erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Glykoprotein, das die Bildung von Mäusegranulozyten und Makrophagen stimuliert,
ist ebenfalls in den vorstehend erwähnten Druckschriften beschrieben. Die präparativen Verfahren von Stanley und
Metcalf, Stanley und Mitarb, und Laukel u. Mitarb, sind nachstehend
in den Beispielen 6, 5 und 7 im einzelnen beschrieben.
Die biologische Aktivität der Glykoproteinpräparate gegenüber Knochenmarkzellen der Maus wird auf die nachstehend beschriebene
Weise bestimmt und in Einheiten ausgedrückt. 1 ml McCoy's 5A Medium, ergänzt mit 20 % fötalem Kälberserum,
0,3 % Agar und 1 χ 10 Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C 57 B1/6J, wird mit 0,1 ml des zu bestimmenden Glykoproteins
bzw. einer Glykoproteinfraktion versetzt. Das auf diese Weise hergestellte, das Glykoprotein enthaltende Medium
wird in eine Petrischale aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 35 mm gegeben und 7 Tage bei 370C an feuchter Luft mit
5 % Kohlendioxid inkubiert. Danach wird die Zahl der einzelnen Kolonien, die jeweils mindestens 50 Zellen enthalten,
unter dem Mikroskop bestimmt. Die biologische Aktivität einer Probe, die eine Kolonie bildet, entspricht einer Einheit.
Zur Bestimmung des Reinigungsgrades einer Glykoproteinprobe wird die spezifische Aktivität nach folgender Gleichung
35 berechnet:
030067/0763
Einheit der Probe Spezifische Aktivität =
Menge des Glycoproteins C oder der Glykoproteinfrak-
tion in mg.
Die spezifische Aktivität nimmt mit fortschreitender Reinigung zu. Das dem Medium zugesetzte Glykoprotein bzw. die
Glykoproteinfraktion kann ein gereinigtes Präparat mit ho-
her spezifischer Aktivität sein. Vorzugsweise wird ein
Präparat mit niedrigerer Aktivität
eingesetzt, das während der Reinigung erhalten wird.
Das Glykoprotein (H) wird dem Medium in einer Menge von mindestens 0,1 μg/ vorzugsweise 10 bis 100 μg/ml Medium
zugesetzt, während das Glykoprotein (M) dem Medium in einer Menge von mindestens 500 Einheiten, vorzugsweise mindestens
1000 Einheiten pro ml Medium zugegeben wird.
(4) Gewinnung der aktiven Substanz aus dem Medium
Das CSF enthaltende Medium wird von der Petrischale entfernt
und 5 bis 10 Minuten bei 1000 bis 2000 g zentrifugiert. Es
wird ein Überstand erhalten, der hochaktives CSP enthält.
25
Dieser Überstand eignet sich zur Herstellung eines Reagens
oder eines Bezugsreagens zur Bestimmung der Bildung von Kolonien menschlicher granulopoetischer Stammzellen. Zu diesem
Zweck wird die Aktivität des Überstandes derart einge-30
stellt, das 0,1 ml des Überstandes eine CSF-Aktivität aufweist, die zur Bildung von mindestens 100 menschlichen
Granulozytenkolonien ausreicht. Die Lösung wird durch ein Membranfilter filtriert, aseptisch in ein Gefäß abgefüllt und
luftdicht verschlossen. Es wird ein flüssiges Reagens erhal-
ten. Ein Reagens in Pulverform kann durch Gefriertrocknen des erhaltenen sterilen Filtrats unter aseptischen Bedingungen
hergestellt werden.
L ■ -J
0300S7/0763
Γ
Für pharmazeutische Zwecke wird das unter Verwendung eines serumfreien Mediums erhaltene konditionierte Medium oder
ein durch menschliches Serum ergänztes Medium gegen Wasser dialysiert und durch Membranfiltration sterilisiert. Erfor-
derlichenfalls wird das Filtrat konzentriert, aseptisch in
ein Gefäß abgefüllt und luftdicht verschlossen. Es wird ein Präparat in flüssiger Form erhalten. Zur Herstellung von
Präparaten in Pulverform wird die dialysierte Lösung durch Membranfiltration sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen
gefriergetrocknet.
Zur weiteren Reinigung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird der vorstehend erwähnte Überstand in eine hochmolekulare Fraktion
(Molekulargewicht oberhalb 5000 oder 10 000) und eine niedermolekulare Fraktion (Molekulargewicht unter 5000 oder
10 000) mittels einer Ultrafiltrationsmembran ( Molekulargewichtschnitt
5 000 oder 10 000) getrennt. Beide Fraktionen enthalten zwar CSF, doch liegen in der hochmolekularen Fraktion
mindestens 90 % des CSF vor.
20
20
Ein pharmazeutisches Präparat kann durch Konzentrieren der niedermolekularen Fraktion unter vermindertem Druck hergestellt
werden. Das Konzentrat der hochmolekularen Fraktion
wird in einer 0,01 bis 0,1 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 25
6,0 bis 8,0 gelöst und mit einem Anionenaustauscherharz, beispielsweise
DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex behandelt, die mit dieser Pufferlösung äquilibriert worden
sind. Das CSF wird am Austauscherharz adsorbiert und sodann
mit einer 0,1 bis 0,3 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0 eluiert. Es wird ein gereinigtes Produkt erhalten.
Das erhaltene Eluat kann durch Konzentrieren und anschließende
Molekularsieb-Chromatographie durch Gelfiltration weiter gereinigt werden. Als Gel für die Gelfiltration kommen beispielsweise
Sephadex G 150, Biogel P-100 und Ultragel AcA-44 in Frage.
L -J
030067/0783
Γ "Ί
Bei der Herstellung von CSF in einem serumfreien Medium kann die Behandlung mit einem Anionenaustauscherharz entfallen,
und die Reinigung erfolgt unmittelbar durch Gelchromatographie. Eine geeignete Entwickler-Pufferlösung bei der GeI-Chromatographie
ist eine 0,01 bis O,3 molare Pufferlösung vom
pH-Wert 6,0 bis 8,0. Die bei der Gelfiltration erhaltenen CSF-aktiven Fraktionen werden vereinigt und konzentriert,
entsalzt und gefriergetrocknet. Es wird ein gereinigtes CSF-
Präparat erhalten. 10
Die auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen gereinigten CSF-Präparate werden durch Immunelektrophorose unter Verwendung
von menschlichem Antiserum und Rinderantiserum auf verunreinigende Proteine untersucht. Spuren an menschlichen
Globulin-ähnlichen Proteinen und Serumalbumin und Globulinähnlichen
Proteinen, die vermutlich aus dem fetalem Kälberserum stammen, werden in CSF-Präparaten gefunden, die aus
einem durch fetales Kälberserum ergänztem Medium stammen. Da praktisch keine derartigen Eiweißkörper in CSF-Präpara-
ten feststellbar sind, die in dem serumfreien Medium hergestellt wurden, können diese Präparate unmittelbar als Arzneistoffe
verwendet werden, da sie keine Nebenwirkungen verursachen.
Zur Injektion können die flüssigen Präparate als solche verwendet werden, während die pulverförmigen Präparate in sterilem
pyrogenfreiem Wasser, steriler physiologischer Kochsalzlösung oder ähnlichen Lösungen zunächst gelöst werden müssen.
Diese- Präparate können Patienten zur Behandlung von Granulozyto-30
penie "gegeben werden. Die Tagesdosis beträgt mindestens 77,8
mg/kg Körpergewicht.
L J
030057/0763
1 Versuchsbeispiel 1
Bestimmung der Inkubationszeit
(1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen und Herstellung des Glykoproteins
Monozyten und Makrophagen werden auf die nachstehend in Beispiel 1 (1) beschriebene Weise isoliert. Die bei dem
Experiment verwendeten Glykoproteine werden auf die nach-
1^ stehend in Beispiel 1 (2) und Beispiel5(2) beschriebene
Weise hergestellt. Das gemäß Beispiel 1 (2) hergestellte Glykoprotein (H) war ein stark gereinigtes Produkt der
letzten Reinigungsstufe, während das gemäß Beispiel 5 (2) hergestellte Glykoprotein (M) ein Produkt von Standard-
^ reinheit (spezifische Aktivität 180 000) war.
(2) Inkubation der Monozyten und Makrophagen
Zwei Medien mit jeweils 100 ug/ml Glykoprotein (H) und
2^ 2 glykoproteinfreie Medien werden hergestellt. Für die
Medien wird serumfreies llcCoy's 5A-Medium sowie ergänztes
McCoy's 5A-Medium mit 20 % fetalem Kälberserum verwendet.
Jede Petrischale, die am Boden haftende Monozyten und
Makrophagen enthält, wird mit jeweils einem der vier genannten Medien in einer Menge von 10 Monozyten und Makrophagen
pro ml Medium versetzt. Jedes Medium wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (3) inkubiert. Vor der Inkubation
sowie nach Inkubationszeiten von 1, 3, 5 und 7 Tagen
werden vorbestimmte Volumina des Mediums jeder Petrischale
entnommen.
Das vorstehend beschriebene Verfahren wird wiederholt, jedoch wird das Glykoprotein (M) in einer Menge von 1000 Einheiten/ml
Medium anstelle des Glykoproteins (H) verwendet.
030067/0763
Γ Π
(3) Bestimmung von CSF im konditioniertem Medium
Die CSF-Aktivität jedes konditionierten Mediums wird anhand
der Bildung von Kolonien menschlicher Knochenmarkzellen g
bestimmt. Das Knochenmark wird vom Brustbein (Sternum)
einer gesunden Versuchsperson mittels einer heparinisierten Spritze nach Sternumpunktur entnommen. Sodann wird das entnommene
Knochenmark 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert, um
das buffy coat zu isolieren. Das buffy coat wird mit 10
McCoy's 5A Medium gewaschen, in McCoy's 5A Medium, das 20 %
Serum enthält, suspendiert, in einer Petrischale ausgebreitet und mit mehreren mg/ml Medium pulverisiertem und sterilisiertem
Carbonyleisen versetzt. Danach wird die Petrischale
1 bis 2 Stunden bei 37 C in einen Inkubator eingestellt. Danach werden die phagozytischen Zellen, die die Carbony1-eisenteilchen
phagozytierten, am Boden der Petrischale mittels eines Magneten fixiert und die überstehende Zellsuspension
wird isoliert. Die suspendierten Zellen sind nicht anhaftende, nicht phagozytierende Knochenmarkzellen, die zur Bestim-20
mung der CSF-Aktivität benutzt werden. Diese Knochenmarkzellen
werden durch Zentrifugieren gewaschen und in einem kleinen Volumen des Mediums suspendiert. Die Zahl der kernhaltigen
Zellen in der Suspension wird nach Behandlung mit Essigsäure-Gentianaviolett-Farbstoff gezählt.
Die nicht anhaftenden, nicht phagozytxerenden kernhaltigen Zellen werden in McCoy's 5A Medium übertragen, das 0,3 % Agar
und 20 % fetales Kälberserum enthält. Die Einsaatdichte beträgt 2 χ 10 Zellen pro ml Medium. Nach Zugabe des konditionierten
Mediums in einer Menge von 0,1 ml/ml Medium wird das beimpfte Medium 10 Tage bei 37°C an feuchter, 5 % Kohlendioxid
enthaltender Luft inkubiert. Nach der Inkubation wird die Zahl der Kolonien unter den entstandenen Zellaggregaten
unter einem Mikroskop gezählt. Der Ausdruck Kolonie bedeutet hier ein Zellagg3?egat, das mindestens 40 Zellen enthält. Die
CSF-Aktivität wird ausgedrückt durch die Anzahl der Kolonien.
L J
030067/0783
~ι
- 17 -
Sie ist ein Maß für die Bildung von CSF. Die Ergebnisse
sind in Tabelle I zusammengefaßt.
sind in Tabelle I zusammengefaßt.
10
20
Züchtungs bedingungen |
CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro konditioniertes Medium |
ohne Glyko protein |
0,1 ml | ohne Glyko protein |
Inkubations dauer , Tage |
Medium mit 20 % fetalem Kälberserum |
0 | serumfreies Medium | 0 |
mit Glyko protein |
3 jf 1 | mit Glyko protein |
0 | |
Glykoprotein (H) vor der Inkubation |
O | 24 + 3 | 0 | 1 jf 1 |
1 | 13 + 3 | 23 jf 1 | 2 + 1 | 0 |
3 | 116 + 4 | 16 + 4 | 25 + 2 | 0 |
5 | 117 jf 3 | O | 20 + 1 | 0 |
7 | 98 + 1 | 6 jf 4 | 18 + 1 | 0 |
Glykoprotein (M) vor der Inkubation |
O | 29 + 8 | 0 | 3 jf 1 |
1 | 20 + 8 | 30 jf 4 | O | 4 + 1 |
3 | 89 + 6 | 16 jf 2 | 35 + 4 | 2 +_ 1 |
5 | 86 jf 3 | 30 jf 6 | ||
7 | 69 jf 4 | 23 + 4 |
Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß durch Zusatz des Glykoproteins
die CSF-Bildung am dritten Tag der Inkubation ihr Maximum erreicht. Bei dem 20 % fetales Kälberserum enthaltenden
Medium ist die CSF*Bildung deutlich höher in Gegenwart des Glycoproteins als in Abwesenheit des Glykoproteins
(übliches Verfahren). Im serumfreien Medium wird CSF nach
Zusatz des Glykoproteins gebildet, während CSF in Abwesenheit des Glykoproteins kaum entsteht.
Zusatz des Glykoproteins gebildet, während CSF in Abwesenheit des Glykoproteins kaum entsteht.
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß bei der Herstellung von CSF durch Züchtung und Vermehrung von Monozyten und
Makrophagen in vitro die Glykoproteine die Bildung von CSF
030087/0783
1 stimulieren, unabhängig davon, ob das Medium Serum enthält.
Es wurde ferner festgestellt, daß die Inkubationsdauer 3 bis 7 Tage, vorzugsweise 3 Tage beträgt. Wenn keine
Monozyten und Makrophagen eingeimpft werden., kann keine CSF-/
Aktivität im konditionierten Medium beobachtet werden, unabhängig davon, ob das Glucoprotein vorliegt.
Versuchsbeispiel 2 Versuche mit unterschiedlichen Mengen Glykoprotein.
Durch Zusatz der Glykoproteine (H) und (M) wie im Versuchsbeispiel
1 zu McCoy's 5A Medium, ergänzt mit 20 % fetalem Kälberserum sowie serumfreien McCoy's 5A Medium werden
Medien hergestellt. Im Fall des Glykoproteins (H) werden
15 0,1 ,1,0, 10,0 bzw. 100 μg/ml Medium zugegeben. Im Fall
des Glykoproteins (M) werden 100 , 500 , 1000 üzw. 2000 Einheiten/ml Medium zugegeben. Jedes Medium wird schließlich
in die Petrischale gegeben, die an ihrem Boden anhaftende Monozyten und Makrophagen enthält. Sodann werden die Petri-
schalen 3 Tage in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 inkubiert. Die CSF-Aktivität jedes konditionierten Mediums
wird wie im Versuchsbeispiel 1 bestimmt, um die CSF-BiI-dung
festzustellen. Zum Vergleich werden Proben verwendet, die durch Inkubieren jedes Mediums ohne Zusatz von Glykoprotein
erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
L J
030067/0783
Zl
10 15 20
- 19 Tabelle II
zugesetztes Glyko | CSF-Aktivität (Zahl | der Kolonien) | serumfreies |
protein | pro 0,1 ml konditioniertes Medium | Medium | |
Medium mit 20 % | |||
fetalem Kälber | |||
serum | 1 +_ 1 | ||
Glykoprotein (H) | 9 + 1 | ||
0 (Vergleich) | 24 + 3 | 25 + 2 | |
0,1 | 51+2 | 53 + 3 | |
1,0 | 116 + 4 | 80 + 4 | |
10,0 | 166 + 10 | ||
100,0 | 170 + 8 | ||
Glykoprotein (M) | 2 +_ 1 | ||
(Einheiten/ml) | 6 + 3 | ||
0 (Vergleich) | 21 +_ 6 | 13 + 6 | |
100 | 28 + 3 | 49 + 6 | |
500 | 96 + 10 | 85 +_ 8 | |
1000 | 129 + 8 | ||
2000 | 170 + 6 |
25 30
Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß mit zunehmenden Mengen an Glykoprotein die CSF-Bildung ansteigt. Aus diesen Ergebnissen
sowie den in Tabelle I mitgeteilten Ergebnissen (nach dreitägiger Inkubation) ist ersichtlich, daß die CSF-Bildung
durch die Gegenwart von 0,1 μg Glykoprotein (H) oder
500 Einheiten Glykoprotein (M) pro 1 ml Medium deutlich erhöht ist. Im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt daher die
Menge des zugesetzten Glykoproteins pro 1 ml Medium mindestens 0,1 μg, vorzugsweise 10 bis 100 μg bei Verwendung
von Glykoprotein (H) und mindestens 500 Einheiten, vorzugsweise mindestens 1000 Einheiten Glykoprotein (M).
35
030087/0783
~ι
- 20 -
Versuchsbeispiel 3
Versuche mit unterschiedlicher Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen
Das Versuchsbeispiel 1 wird wiederholt. Es wird eine Reihe von konditionieren Medien erhalten, jedoch beträgt die Ein-
3 4 saatdichte an Monozyten und Makrophagen O,10 ,1O ,10
bzw. 10 /ml. 1 [ig Glykoprotein (H) bzw. 500 Einheiten Glykoprotein
(M) werden zu 1 ml McCoy's 5A-Medium gegeben, das mit 20 % fetalem Kälberserum ergänzt ist, bzw. zu 1 ml serumfreiem
McCoy's 5a Medium. Die Inkubationsdauer beträgt 3 Tage. Die erhaltenen konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität
untersucht, um die Bildung von CSF in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 zu bestimmen. Die Versuchsergebnisse
sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Einsaatdichte | CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium |
serumfreies Medium |
Medium mit Glyko protein (H) 0 103 104 105 106 |
Medium mit 20 % fe talem Kälberserum |
0 0 6 +_ 1 25 +_ 2 69 J1 5 0 0 8 - + 4 31 +_ 3 74 + 2 |
Medium mit Glyko protein (M) 0 103 104 105 106 |
0 13 + 1 20 +_ 2 116 _+ 4 185 J1 7 |
|
0 19 + 6 29 +_ 10 98 + 6 169 + 9 |
030067/0753
Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß in jedem Fall große Mengen CSF gebildet werden, wenn die Einsaatdichte mindestens
10 Zellen/ml beträgt. Im erfindungsgemäßen Verfahren
beträgt daher die Einsaatdichte mindestens 10 Monozyten
5 und Makrophagen pro 1 ml Medium.
Versuchsbeispiel 4
CSF-Produktion in verschiedenen Medien
CSF-Produktion in verschiedenen Medien
Hinsichtlich der CSF-Produktion werden vier verschiedene handelsübliche
Gewebekulturmedien oder Zellkulturmedien miteinander verglichen. Als Medien werden McCoy's 5A Medium, Nährgemisch
HAMF-10, RPMI-1640 und Eagle's MEM Medium ergänzt mit
Aminosäuren verwendet. Jedes dieser Medien, die nicht durch Serum ergänzt sind, wird mit 1,0 μg/ml Glykoprotein (H) bzw.
500 Einheiten/ml Glykoprotein (M) versetzt. Die erhaltenen Medien werden 3 Tage in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel
1 inkubiert. Hierauf werden die erhaltenen konditionierten Medien in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 auf
CSF-Bildung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.
Medium | CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium |
mit Glykoprotein (M) |
McCoy's 5 A HAMF - 10 RPMI - 1640 MEM |
mit Glykoprotein • (H) |
83 + 6 76+8 81 +_ 1 46+5 |
69 +_ 5 71+3 75 + 3 48 + 1 |
Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß sämtliche vier Medien für das erfindungsgemä-ße Verfahren geeignet sind. Die CSF-Bildung
ist im MEM Medium etwas niedriger als in den anderen Medien.
030087/0783
ΓΙ
- 22 -
Versuchsbeispiel 5
Versuche mit Medium mit unterschiedlichen Mengen Serum
10
25 30
Auf die gleiche Weise wie in Versuchsbeispiel 1 werden konditionierte
Medien hergestellt, McCoy's 5 A Medium wird mit 0 , 5 , 10 , 20 oder 30 % .menschlichem Serum oder fetalem
Kälberserum versetzt. Beide Seren werden 30 Minuten auf 58°C erhitzt. Sodann werden 1 μg/ml Medium des Glykoproteins (H)
bzw. 500 Einheiten/ml Medium Glykoprotein (M) zugesetzt. Die
Einsaatdichte der Monozyten Makrophagen in jedes Medium beträgt 10 /ml und die Inkubationsdauer 3 Tage. Die erhaltenen
konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung
von CSF zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.
35
CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium |
mit fetalem Kälberserum |
|
Zugesetztes Serum | mit menschlichem Serum |
|
Medium mit Glyko- protein (H) |
25 + 2 | |
0 | 25 + 2 | 43 + 1 |
5 | 55 + 1 | 98 + 3 |
10 | 120 + 5 | 116 + 4 |
20 | 150 + 3 | 108 + 2 |
30 | 141 + 2 | |
Medium mit Glyko- protein (M) |
21+8 | |
0 | 21 +8 | 51 + 4 |
5 | 49+6 | 89 + 2 |
10 | 109 + 5 | 102 + .6 |
20 | 124 + 7 | 92. + 5 |
30 | 123 +_ 8 | |
0300S7/07S3
-23- 3Q271051
Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß mit zunehmender Menge an Serum die Bildung von CSF ansteigt. Erfindungsgemäß kann
CSF in einem serumfreien Medium gebildet werden, doch kann das Medium mit Rinderserum oder fetalem Kälberserum versetzt
werden, um größere Mengen CSF für diagnostische Zwecke herzustellen. Die wirksame Menge an zugesetztem Serum beträgt
mindestens 5 %, vorzugsweise mindestens 10 %.
Versuchsbeispiel 6
Versuche mit einer Glykoprotein-Fraktion und einer hochgereinigten
Fraktion.
In den Versuchsbeispielen 1 bis 5 wird gereinigtes Glykoprotein
als aktive Substanz mit einer stimulierenden Wirkung bei der Bildung menschlicher Granulozyten (Fall I) und
andererseits Glykoprotein von Standardreinheit (spezifische
Aktivität 180 000) als aktive Substanz mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten
(Fall II) verwendet. Im vorliegenden Versuchsbeispiel soll gezeigt werden, daß im erfindungsgemäßen Verfahren ein halbgereinigtes
Präparat anstelle des gereinigten Glykoproteins im Fall I und eine weniger gereinigte Fraktion sowie ein
hochgereinigtes Präparat anstelle des Glykoproteins von
Standardreinheit im Fall II verwendet werden kann. 25
Die verwendeten glykoproteinhaltigen Fraktionen entsprechend Fall I sind die Fraktionen A und B, deren Herstellung nachstehend
in Beispiel 1 beschrieben ist. Diese Fraktionen werden zu serumfreiem McCoy's 5 A Medium in Mengen von 0 ,
0,5 , 1,0 , 5,0 bzw. 10 mg/ml entsprechend 0 , 8,3 , 16,6,
83,3 bzw. 166,6 μg/ml Medium ausgedrückt als aktives Glykoprotein
in der Fraktion und in Mengen von 0 , 41, 7 , 83,4 , 417 und 834 μg/ml Medium ausgedrückt als aktives Glykoprotein
in der Fraktion B zugesetzt. Die Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen in jedes Medium beträgt 10 /ml und die Inkubationsdauer
3 Tage. Es werden konditionierte Medien durch
L J
030067/0763
Γ -24- 30271Q51
Inkubieren unter sonst gleichen Bedingungen wie im Versuchsbeispiel 1 erhalten.
Da die Fraktionen A und B menschliches Serumalbumin enthalten, das im-Urin vorliegt, werden Vergleichsproben durch Zusatz
von menschlichem Serumalbumin zu McCoy's 5 A Medium
in einer Menge entsprechend der Menge zugesetzt, die auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten Medien enthalten
ist. Die Inkubationsbedingungen sind die gleichen, ^ wie sie vorstehend beschrieben sind.
Jedes konditionierte Medium wird auf CSP-Aktivität in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung
von CSF nachzuweisen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI ^ zusammengefaßt.
Wie im Fall II ist das Glykoproteinpräparat im vorliegenden
Versuchsbeispiel die Fraktion C (spezifische Aktivität
21 000), die Fraktion D (spezifische Aktivität 54 000) soon
wie das hochgereinigte Präparat (spezifische Aktivität
1 240 000), dessen Herstellung in Beispiel 5 beschrieben ist. Die konditionierten Medien werden auf die vorstehend im
Zusammenhang mit Fall I beschriebene Weise hergestellt, jedoch werden die Fraktionen C und D sowie das hochgereinigte
Präparat ( vgl. Beispiel 5) den Medien jeweils in Mengen von 0 , 100 , 500 , 1000 und 2000 Einheiten/ml Medium anstelle
der beschriebenen Mengen der Fraktionen A und B (vgl. Beispiel 1) zugesetzt. Die Vergleichsversuche mit menschlichem
Serumalbumin entfallen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI
zusammengefaßt..
030087/0783
- 25 Tabelle VI
Zugesetzte Menge | CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium |
Fraktion B | Vergleich |
Glykpprotein von Beispiel 1 (mg/ml) |
Fraktion A | 0 59 + 1 114 + 1 103 +_ 3 98 + 4 |
0 4 +■ 1 6 + 2 14 + 2 26 +_ 1 |
O 0,5 1,0 5,0 10,0 |
0 6O + 1 121 + 1 170 +_ 3 148 + 2 |
Fraktion D | Hochgerei nigtes Prä parat |
Glykoprotein von Beispiel 5 (Einheiten/ml) |
Fraktion C | 2 + 1 10 +_ 4 37 + 4 66 + 5 113 + 6 |
2 +_ 1 5I2 10+3 21 + 4 44 +_ 9 |
0 100 50O looo 20OO |
2 + 1 8 J1 2 36 + 6 74 J1 5 122 + 8 |
Einfluß des Reinheitsgrades des Glykoproteins mit stimulierender Wirkung
auf die Bildung menschlicher Granulozyten.
Die CSF-Bildung in einem Medium, dem die Fraktion A oder B
zugesetzt wird/ ist höher als im Vergleichsmedium. Dies zeigt, daß das Glykoprotein die CSF-Bildung anregt. Im Vergleich
mit dem in Tabelle II gezeigten Beispiel, bei dem 10 μg/ml Glykoprotein dem serumfreien Medium zugesetzt wurden,
ist in dem in Tabelle VI gezeigten Beispiel die CSF-Bildung höher. In diesem Beispiel wurden 0,5 mg/ml der Fraktion A
(8,3 μg/ml GIy oprotein) zugesetzt. Dies ist eine geringe
Menge Glykoprotein. Dies scheint auf dem Einfluß von Serumalbumin und anderen unbekannten Bestandteilen des menschliehen
Urins zu beruhen, die der Fraktion A vorliegen.
030067/0783
Wenn man das Medium mit zugesetzter Fraktion A mit dem Medium mit zugesetzter Fraktion B hinsichtlich der CSF-Bildung
vergleicht, ist ersichtlich, daß bei einer zugesetzten Menge von 0,5 oder 1,0 mg/ml beide Fraktionen etwa vergleichbar
sind, daß jedoch bei höheren Konzentrationen der Fraktion B die CSF-Bildung niedriger ist. Dies beruht vermutlich
darauf, daß der Gehalt an menschlichem Serumalbumin aus Urin in der Fraktion A größer ist als in der Fraktion B
und der Zusatz der Fraktion B in Mengen von mehr als 5 mg/ml
10 eine zu starke Zugabe von Glykoprotein bewirkt. Unter Berücksichtigung
aller dieser Ergebnisse bestehen Gründe zu der Annahme, daß unter das Serumalbumin, das im menschlichen
Urin enthalten ist, und das Glykoprotein eine synergistische Wirkung bei der Bildung von CSF ausüben, und daß
15 eine maximale CSF-Bildung erhalten wird, wenn das Medium mit etwa 100 μg/ml Glykoprotein versetzt wird.
Bei Verwendung des Glykoproteins mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten
20 (Fall II) ist aus Tabelle VI folgendes ersichtlich:
Die CSF-Bildung nimmt etwa proportional der Menge an dem Medium zugesetztem Glykoprotein zu. Im Vergleich mit den in
Tabelle II gezeigten Ergebnissen unter Verwendung eines serumfreien Mediums ist die CSF-Bildung im vorliegenden Versuch
höher, wenn die Fraktion C oder D verwendet wird, obwohl die Menge des dem Medium zugesetzten Glykoproteins die
gleiche ist wie im vorhergehenden Fall. Dies beruht anscheinend auf dem Einfluß unter anderem des Serumalbumins,
das in den Fraktionen C und D enthalten ist, die aus menschlichem Urin stammen. Aus den Ergebnissen, die bei Verwendung
von hochgereinigtem Glykoprotein erhalten werden, ist ersichtlich, daß zwar die CSF-Produktion mit zunehmender Menge
an Glykoprotein ansteigt, der Anstieg jedoch geringer ist als bei Verwendung der Fraktionen C und B und dem Präparat von
Standardreinheit (Tabelle II). Aus den vorstehenden Ergebnissen kann man schließen, daß in serumfreien Medien das Serum-
030ÖS7/0783
Γ Π
albumin und andere Substanzen aus menschlichem Urin die gleiche Rolle spielen, wie das Serum im Hinblick auf die
CSF-Produktion.
In jedem Falle ist es deshalb im erfindungsgemäßen Verfahren
vorteilhaft, dem Medium ein rohes Glykoprotein anstelle eines gereinigten Glycoproteins zuzusetzen. Bei Verwendung
eines rohen Glykoproteinpräparats wird es in einer Menge von mindestens 0,1 μg/ml Medium im Fall I oder in einer
Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium im Fall II eingesetzt.
Versuchsbeispiel 7
Bestimmung der wirksamen Dosis und der akuten Toxizität von CSF
Die wirksame Dosis und die akute Toxizität (LD1. ) des erfindungsgemäß
hergestellten CSF werden an Tieren folgendermaßen bestimmt.
Ein Gemäß Beispiel 3 hergestelltes konditioniertes Medium wird durch Membranfiltration sterilisiert und sodann durch
eine Ultrafiltrationsmembran (molekulare Trenngrenze : 10 000) filtriert, hierauf konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet.
Es wird CSF in Pulverform erhalten. Nach der im Versuchsbeispiel 1 beschriebenen Bestimmungsmethode
beträgt die Zahl der Koloniebildung bei menschlichen Knochenmarkzellen 45OO/mg. Zum Vergleich wird der Versuch mit
Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C3H/He wiederholt. Die Zahl der Koloniebildung mit Knochenmarkzellen der Maus
beträgt 7000/mg.
80 sechs Wochen alte männliche Mäuse des Stammes C3H/He mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g werden willkürlieh
in 16 Untergruppen von jeweils 5 Tieren unterteilt. Die Untergruppen werden willkürlich zusammengestellt, und es
030087/0763
' werden vier Gruppen von jeweils vier Untergruppen gebildet.
Das auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellte CSF wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Es
° werden drei Lösungen mit 1 mg/0,1 ml (für die Gruppe I),
2 mg/0,1 ml (für die Gruppe II) und 4 mg/0,1 ml (für die Gruppe III) hergestellt. Die Mäuse werden subkutan mit der
Lösung in einer Tagesdosis von 0,1 ml/Maus an fünf aufeinanderfolgenden Tagen gespritzt. Nach 1,3,7 und 11 Tagen
nach Beginn der Verabreichung werden Blutproben aus fünf Mäusen einer Untergruppe jeder Gruppe entnommen (die Untergruppen,
denen Blut entnommen wurde, wurden für den weiteren Versuch nicht mehr verwendet). Die Zahl der Leukozyten in
den periphären Blutgefäßen wird mittels eines automatischen Blutzellenzählgerätes bestimmt. Die Zahl der Granulozyten
wird unter dem Mikroskop nach Wright-Giemsa gezahlt, um die Zunahme der Zahl der Leukozyten und Granulozyten nach CSF-Gabe
zu bestimmen. Eine Gruppe (Gruppe I), der 0,1 ml sterile physiologische Kochsalzlösung ohne CSF gegeben wurde, wird
in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben behandelt und
als Kontrollgruppe verwendet. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.
L -J
030067/0783
ro cn
I | (Vergleich) | 20 | Granulo- zyten |
Leuko zyten |
4 | II | Leuko zyten |
5 | III | IV | Granulo- zyten |
to | |
Gruppe | Leuko zyten |
7 | 14+7 | 53 jf | 9 | Granulo- zyten |
51 jf | 10 | Granulo- zyten |
Leuko zyten |
20+5 | ||
Nr. Versuchsdauer, Tage |
55 + | %B | 12 + 8 | 63 + | 8 | 13 jf 8 | 98 + | 8 | 16 jf 4 | 59+8 | 60 jf 8 | ||
1 | 59 + | 8 | 12 jf 4 | 74 jf | 9 | 18 + 4 | 140 + | 14 | 40 + 10 | 123 jf 6 | 102 + 14 | ||
3 | 41I, | 15 jf 6 | 102 + | 28 jf 6 | 185 + | 60 jf 9 | 201 jf 5 | 121 + 21 | |||||
7 | 58 + | 45 + 10 | 75 + 13 | 260 + 19 | |||||||||
11 | |||||||||||||
Anmerkung: 1. Die Zahlenwerte bedeuten die Zahl der Blutzellen pro 1 mm3 Blut χ
-2
2. Die angegebenen Werte sind die Durchschnittswerte von jeweils 5 Mäusen.
NJ
ÜiJ
Im Vergleich zur Kontrollgruppe I zeigt die Gruppe II nach
CSF-Gabe eine nahezu zweifache Zunahme der Zahl der Leukozyten und eine nahezu dreifache Zunahme der Zahl der Granulozyten
11 Tage nach Versuchsbeginn (6 Tage nach Beendigung der Gabe). Im Vergleich mit der Gruppe I zeigt die Gruppe IV eine
etwa 4,5-fache Zunahme der Zahl der LeuKOzyten und eine etwa 8-fache Zunahme der Zahl der Granulozyten. Aus den vorstehenden
Ergebnissen ist ersichtlich, daß die wirksame Tagesdosis bei Mäusen etwa 50 mg/kg Körpergewicht beträgt. Da die
koloniebildende Aktivität des verwendeten CSF in im vorstehend
beschriebenen Versuch um einen Faktor von 1,556 höher ist im Falle von Knochenmarkzellen der Maus als im Falle von menschlichen
Knochenmarkζellen entspricht die wirksame Dosis bei einem Patienten mit Granulozytopenie, die bei menschlichen
15 Knochenmarkzellen eine Wirkung zeigt, die dem Effekt bei
Mäusen entspricht, etwa einer Tagesdosis von 77,8 mg/kg Körpergewicht.
Die akute Toxizität wird unter Verwendung des gleichen CSF untersucht, wie in dem vorstehend beschriebenen
Test zur Bestimmung der Dosis und an Mäusen des gleichen Stammes (6 bis 8 Wochen alt, durchschnittliches Körpergewicht
20,4 g). Es werden keine Todesfälle beobachtet bei einer Versuchsgruppe von 5 männlichen und 5 weiblichen Mäusen,
denen 4,0 g CSF/ kg Körpergewicht gegeben wurden. Dementsprechend ist die akute Toxizität so gering, daß sie nach dem
vorstehend beschriebenen Versuch nicht bestimmt werden kann.
Beispiel 1 (1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen
200 ml Blut aus peripheren Gefäßen von gesunden Versuchspersonen
werden in einem Gefäß aufgefangen, das 1000 Einheiten Heparin enthält. Der Inhalt des Gefäßes wird durch vorsichtiges
Bewegen vermischt. Hierauf wird das heparinisierte Blut in einen sterilen Glaszylinder mit einem Durchmesser
von 20 mm und einem Fassungsvermögen von 200 ml verbracht und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird die
L J
030087/0783
obere, die Leukozyten enthaltende Schicht vorsichtig mit abpipettiert, mit serumfreiem McCoy's 5 A Medium auf das
Doppelte des ursprünglichen Volumens verdünnt und 15 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.
Die sedimentierten Leukozyten werden in 20 ml McCoy's 5 A
Medium suspendiert und die Suspension wird über eine Natriummetrizoatlösung (Dichte 1,077) in einem Zentrifugenrohr
beschichtet und 30 Minuten bei 400 g zentrifugiert. Die weiße Schicht, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten
^ am Boden der oberen Schicht enthält, wird mit einer Pipette aufgenommen, mit McCoy's 5 A Medium gewaschen und 10 Minuten
bei 1500 g zentrifugiert. Der überstand wird verworfen. Diese
Behandlung wird noch zweimal wiederholt. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen werden in 20 ml McCoy's 5 A Medium suspendiert.
Ein Teil wird zur Zählung der Zellen mit einem automatischen Blutzellenzählgerät verwendet. Es wird ein Ausstrich
der Suspension hergestellt, mit Wright-Giemsa Farbstoff gefärbt, und die Zahl der Lymphozyten sowie die Zahl
der Monozyten und Makrophagen wird morphologisch bestimmt,
um das Zellenverhältnis festzustellen. Der Anteil der Monozyten
und Makrophagen beträgt 25,5 %.
Jeweils 5 ml der erhaltenen Suspension werden in vier Petrischalen
mit einem Durchmesser von 15 cm gegeben. Sodann wer-
den 30 ml McCoy 's 5 A Medium zugesetzt, das mit 10 % fetalem Kälberserum ergänzt ist. Danach werden die Petrischalen
2 Stunden bei 370C an feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid
stehengelassen. Hierauf wird das Medium abgegossen, und es
werden 3O ml McCoy's 5 A Medium zugesetzt. Nach ziemlich kräf-
tigern Schütteln wird das Medium zur Abtrennung der Lymphozyten verworfen. Der Anteil der verbleibenden Monozyten und
Makrophagen wird auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt. In jeder Petrischale beträgt der Anteil 95 %.
030067/0763
1 (2) Herstellung des Glykoproteins
Das Glykoprotein wird nach der JP-OS 140 707/79 und der
entsprechenden DE-OS 2 910 745 hergestellt. 5
400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen^ werden
mit lOprozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 8 eingestellt
und bei 00C und 15 000 g zentrifugiert. Unlösliche
Substanzen werden sedimentiert. Der Überstand wird mit
lOprozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 10 χ 80 cm gegeben,
die mit Kieselgel gefüllt ist. Die am Kieselgel adsorbierten Bestandteile werden mit 40 Liter 5prozentiger wäßriger
Ammoniaklösung eluiert. Das erhaltene Eluat wird mit 1 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, mit
pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt und 15 bis 18 Stunden bei O0C stehengelassen. Sodann
wird die entstandene Fällung abfiltriert.
Die erhaltene Fällung wird in 2 Liter 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung gelöst, in einen Dialyseschlauch gegeben und
gegen 0,05 molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gründlich
dialysiert. Danach wird die dialysierte Lösung, d.h.
das Retentat, mit der genannten Pufferlösung auf 10 Liter
aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 4 χ 40 cm gegeben, die mit CM-Sephadex C-50 Ionenaustauscher gefüllt
ist. Dieser Austauscher ist vorher mit 0,05 molarer Phosphatpufferlösung äquilibriert worden. Die Verunreinigungen werden
durch Adsorption am Ionenaustauscher entfernt. Das Eluat
wird gesammelt.
10 Liter des erhaltenen Eluats werden unter Verwendung eines "Diaflow" Hohlfaser-Konzentrators (Typ DC-30) konzentriert.
Das Konzentrat wird sodann 15 bis 18 Stunden bei 50C gegen
35
eine 0,1 molare.tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert.
Die dialysierte Lösung, d.h. das Retentat, wird mit
030067/0763
Γ -33- 3027
der gleichen Pufferlösung auf 1 Liter aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0 χ 40 cm gegeben, die
mit DEAE-Cellulose gefüllt ist. Diese Celululose ist vorher
mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden. Nach dem Waschen mit 0,1 molarer cis-HCl-Pufferlösung werden die adsorbierten
Bestandteile mit 0,1 molarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,3 molar an Natriumchlorid
ist. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung
vom pH-Wert 7,0 dialysiert.
Die erhaltene dialysierte Lösung wird erneut auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0 χ 40 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose
gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Sodann wird die Säule mit einer
linearen Konzentrationsgradientenlösung von Natriumchlorid (Chloridionenkonzentrationsgradient 0,1 bis 0,3 molar)
eluiert. Es werden die Fraktionen aufgefangen, die bei Chloridionen Konzentrationen von 0,15 bis 0,25 molar eluiert
werden. Die Fraktionen werden vereinigt und mit pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt.
Die entstandene Fällung wird abfiltriert, in einer kleinen Menge 0,1 molarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst
und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird als Fraktion A bezeichnet.
20 ml der erhaltenen dialysierten Lösung werden an einer mit Sephadex G-150 gefüllten Säule mit den Abmessungen 4,0 χ 60 cm
entwickelt. Die Säule ist vorher mit 0,1 molarer tris-HCl-Puf ferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden. Die Fraktionen,
die einem relativen Ausflußwert von 1,11 bis 1,45 entsprechen, werden aufgefangen. Die Fraktionen werden vereinigt
und gegen destilliertes Wasser gründlich dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet.
Es werden etwa 500 mg eines Pulvers erhalten, das als Frak-
35 tion B bezeichnet wird.
030067/0783
200 mg des erhaltenen Pulvers werden in einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst, die 1,0 molar
an Natriumchlorid ist. Die Lösung wird auf eine 100 ml fassende Säule gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4 B
gefüllt, und die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die Säule wird gründlich mit einer
0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 1,0 molar an Natriumchlorid ist. Sodann wird die Säule
mit einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 50 millimolar an a-Methyl-D-glukosid und
1,0 molar an Natriumchlorid ist. Das Eluat wird gegen destilliertes
Wasser dialysiert» Die dialysierte Lösung wird sodann gefriergetrocknet.
Etwa 50 mg des erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers werden in 1 ml einer 0,125 molaren tris-Glycin-Pufferlösung vom
pH-Wert 5,8 gelöst, die 10 % Glycerin enthält. Die Lösung wird bei 10 Milliampere unter Kühlung in einer präparativen
Elektrophoresevorrichtung der Elektrophorese unterworfen. 20
Es wird ein 8prozentiges Acrylamidgel mit den Abmessungen
20 χ 25 mm vom pH-Wert 8,9 verwendet. Die Fraktion mit einer
relativen Beweglichkeit von 0,46 wird mit einer 0,025 molaren tris-Glycin-Pufferlösung vom pH-Wert 8,3 eluiert und
sodann gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. Es werden etwa
10 mg Glykoprotein erhalten. Beim wiederholen des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden etwa 30 mg Glykoprotein erhalten.
(3) Züchtung der Monozyten und Makrophagen
Das auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene Glykoprotein wird zu 30 ml eines McCoy's 5 A Medium gegeben, das
35 20 % fetales Kälberserum enthält, und zwar in einer Menge
von 100 μg/ml Medium. 30 ml des erhaltenen Mediums werden in
L J
030067/0763
302710?
jeweils eine Petrischale gegossen, die anhaftende Makrophagen und Monozyten enthält, wie dies vorstehend unter Ziffer
(1) des Beispiels beschrieben ist. Die Populationsdichte der Monozyten und Makrophagen in dem Medium beträgt 1O /ml.
Das hergestellte Medium wird 3 Tage bei 37 C an feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Es wird ein CSF-enthaltendes
konditioniertes Medium erhalten.
(4) Reinigung von CSF in dem konditionierten Medium 10
Die Medien aus den Petrischalen werden 10 Minuten bei 2 C und 2000 g zentrifugiert. Es werden etwa 120 ml eines klaren
Überstandes erhalten, der mittels einer Ultrafiltrationsmembran
mit einer molekularen Trenngrenze von 10 000 konzentriert wird. Das erhaltene Konzentrat wird mit 100 ml
einer O,O5 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,2 versetzt
und erneut auf 5 ml konzentriert.
Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0 χ 60 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und
die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Sodann wird das CSF mit
einer linearen Gradientenkonzentration von Kochsalz (0 bis etwa 3 molar) eluiert. Die aktive Substanz enthaltenden
Fraktionen werden vereinigt und mittels der vorstehend genannten Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Hierauf wird die
konzentrierte Lösung auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0 χ 90 cm gegeben, die mit Sephadex G-150 gefüllt ist und
die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Sodann wird die Säule
mit der gleichen Pufferlösung entwickelt. Es werden diejenigen Fraktionen aufgefangen, die einem Molekulargewicht von
65 000 bis 90 000 sowie die Fraktionen, die einem Molekulargewicht von 30 000 bis 60 000 entsprechen. Diese Fraktionen
werden vereinigt und mittels der Ultrafiltrationsmembran
konzentriert. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit
L J
030067/0763
r -se- 30271 θ"έ
destilliertem Wasser versetzt, entsalzt und konzentriert. Es werden etwa 5 ml einer Lösung erhalten, die gereinigtes
CSF enthält. Diese Lösung besitzt eine Aktivität, bestimmt gemäß Versuchsbeispiel 1, entsprechend der Bildung
von 41 000 Kolonien menschliche Granulozyten/ml.
Beispiel 2
Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und
10 zur Herstellung des gereinigten Glykoproteins behandelt. Es
wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz des gereinigten Glykoproteins zu serumfreien McCoy's 5 A Medium in einer
Menge von 100 μg/ml Medium hergestellt worden ist. Es werden
etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in
ähnlicher Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung
zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 16 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.
20 in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und
Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und zur Herstellung der glykoproteinhaltigen Fraktion (Fraktion
A) behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz dieser Fraktion zu serumfreiem McCoy's 5 A Medium in
25 einer Menge von 5 mg (83,3 mg Glykoprotein)/ml Medium hergestellt
worden ist. Es werden etwa 120 ml eines konditionierten
Mediums erhalten. Dieses konditionierte Mediuni wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte
Lösung wird unter vermindertem Druck bei niedriger Tempera-
30 tür konzentriert. Es werden etwa 5 ml einer CSF-enthaltenden
Lösung erhalten. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 36 700 menschlichen Granulozytenkolonien/
ml Lösung.
Beispiel 4
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und
L -I
030067/0783
Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut abgetrennt und
zur Herstellung der glykoproteinhaltigen Fraktion (Fraktion B) behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz
dieser Fraktion zu McCoy's 5 A Medium, das 10 % menschliches Serum enthält, in einer Menge von 1 mg (83,3 μg Glykoprotein)/ml
Medium hergestellt worden ist. Es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher
Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung hat eine Aktivität entsprechend der Bildung von 43 200 menschlichen Granulozytenkolonien/ml
Lösung.
Beispiel 5 (1) Herstellung des Glykoproteins.
Nach der Methode von Stanley u. Mitarb. a.a.O., werden Glykoprotein
und glykoproteinhaltige Fraktionen folgendermaßen hergestellt:
400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen werden gegen Wasser durch eine ültrafiltrationsmembran dialysiert.
Die dialysierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 2 χ 15 cm gegeben,
die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, und die vorher mit
einer 0,03 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4
äquilibriert worden ist. Die aktiven Substanzen werden an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Hierauf werden die aktiven
Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung
gewaschen, die 0,04 molar an Natriumchlorid ist. Sodann werden die aktiven Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren
tris-HCL-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,15 molar an Natriumchlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen destilliertes
Wasser dialysiert. Es wird die Fraktion C erhalten.
Die erhaltene dialysierte Lösung wird mit Calciumphosphatgel in einer Menge von 58 ml Gel/g Protein versetzt. Die aktiven
Substanzen werden am Gel adsorbiert. Sodann wird das Calciumphosphatgel abfiltriert, zweimal mit 20 Liter einer 0,005 mo-
030087/0763
Γ - 38 - 30271
1 laren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gewaschen und
mit 5 Liter einer 0,025 molaren Phosphatpufferlösung eluiert.
Das Eluat wird 10 Minuten bei 12 000 g zentrifugiert. Der
erhaltene überstand wird gegen destilliertes Wasser dialysiert.
Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingedampft. Das erhaltene Konzentrat
wird mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung
äquilibriert, auf eine Säule mit den Abmessungen 2,5 χ 90 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher
mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Sodann wird mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung eluiert,
die Natriumchlorid in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,15 molar enthält. Die glykoproteinhaltigen Fraktionen
werden aufgefangen und mittels einer Ultrafiltrations-
15 membran konzentriert. (Fraktion D).
Das erhaltene Konzentrat wird der Gelfiltration an einer Säule mit den Abmessungen 2,5 χ 110 cm unterworfen, die mit
Biogel P-100 gefüllt ist, das vorher mit einer 0,03 molaren tris-HCl-Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es werden
230 mg Glykoprotein erhalten (Produkt von Standardreinheit).
100 mg dieses Produktes werden in einer 0,1 molaren Acetatpufferlösung
vom pH-Wert 6,0 gelöst, die 1,0 molar NaCl,
0,001 molar MgCl3, 0,001 molar MnCl3 und 0,001 molar CaCl3
ist. Die Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 36 χ 1,0 cm gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4 B gefüllt
ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es wird mit einer 0,1 molaren cx-Methyl-D-
30 glukosidlösung eluiert. Es werden 8 mg Glykoprotein (hochgereinigtes
Produkt) erhalten.
Die biologische Aktivität gegenüber Knochenmarkzellen der Maus der GIykoproteinpräparate unterschiedlicher Reinheit
35 werden nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.
030067/0763
302710"B
Probe | spezifische Aktivität |
halbgereinigtes Produkt Fraktion A Fraktion B Produkt von Standardreinheit hochgereinigtes Produkt |
21 000 54 000 180 000 1 240 000 |
(2) Züchtung von Monozyten und Makrophagen und Reinigung
von CSF im konditionierten Medium
20
Die Verfahren von Beispiel 1(3) und 1 (4) werden wiederholt,
jedoch werden 1000 Einheiten/ ml Medium des Glycoproteins
von Standardreinheit anstelle des hochgereinigten Glykoproteins verwendet. Es werden etwa 5 ml einer gereinigten
CSF-haltigen Lösung erhalten, die eine Aktivität entsprechend der Bildung von 35 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml
Lösung besitzt.
25 30
Beispiel 6
Beispiel 5 wird wiederholt, und es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung erhalten. Es wird jedoch
ein Glykoprotein verwendet, das nach der Methode von
Stanley und Metcalf, a.a.O. anstelle der Methode von Stanley u. Mitarb, hergestellt worden ist. Die gereinigtes CSF enthaltende
Lösung in diesem Beispiel zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 9800 menschlichen Granulozytenkolonien/ml
der Lösung.
35
20 Liter menschlicher Urin wird gegen Leitungswasser bei Raumtemperatur während 8 bis 12 Stunden dialysiert. Sodann
wird die dialysierte Lösung mit 75 g DEAE-Cellulose versetzt,
die mit Wasser und 100 ml einer 1,0 molaren tris-HCl-Pufferlösung
vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist.
030067/0763
Das erhaltene Gemisch wird gründlich vermischt, damit sich
das Glykoprotein an der DEAE-CeIlulose adsorbiert. Nach der
Abtrennung des Überstandes wird die DEAE-Cellulose dreimal
mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0
gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das adsorbierte Glykoprotein mit 300 ml einer 0,1 molaren
tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,5 molar
an Natriumchlorid ist. Dieses Verfahren wird sechsmal wiederholt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei 40 C
konzentriert und gegen eine 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf
eine Säule mit dem Abmessungen 2,3 χ 44 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit einer 0,1 molaren
tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Das Glykoprotein wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert.
Danach wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Hierauf
wird das adsorbierte Glykoprotein nach der Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten-Eluierungsmethode
mit einem Gradien-
ten von 0,1 bis 0,5 molar Natriumchlorid im gleichen Puffer
eluiert. Das Eluat wird gegen Wasser dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft
und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material
wird in einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 25
7,0 gelöst und auf eine Säule mit den Abmessungen 2,3 χ 150 cm
gegeben, die mit Sephadex G-150 gefüllt ist und die mit der
gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es wird die Glykoproteinfraktion aufgefangen. Diese Fraktion wird dialysiert
und gefriergetrocknet. Es werden etwa 12 mg eines PuI-30
vers mit einer spezifischen Aktivität von etwa 36 000 bei
Knochenmarkzeilen der Maus erhalten.
Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem
Blut auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise abgetrennt. Es wird eine Glykoprotein enthaltende Fraktion auf
030067/0763
Γ - 41 - 3Q27105
die nachstehend beschriebene Weise nach der Methode von Laukel u. Mitarb., a.a.O. hergestellt und zu serumfreiem
McCoy's 5 A Medium in einer Menge von 2 000 Einheiten/ml gegeben. Unter Verwendung dieses Mediums wird die Züchtung
in ähnlicher Weise wie im Beispiel 5 durchgeführt. Es werden 120 ml eines kondxtionierten Mediums erhalten. Dieses
Medium wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck bei
niedriger Temperatur auf etwa 5 ml konzentriert. Es wird ^ eine CSF enthaltende Lösung erhalten, die eine Aktivität entsprechend
der Bildung von 29 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml
Lösung aufweist.
50 Liter menschlicher Urin werden gegen laufendes Leitungswasser mittels einer Ultrafiltrationsmembran (CL 100)
dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 10 χ 30 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose
gefüllt ist, die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,3 äquilibriert worden
ist. Das Glykoprotein wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert.
Danach wird die Säule mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Puf ferlösung vom pH-Wert 7,3 gewaschen, die 0,05 molar an
Natriumchlorid ist. Hierauf wird das Glykoprotein mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,3 molar an Natrium-
Chlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,05 molare
tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0 dialysiert, die 0,5
molar an NaCl, 2 millimolar an CaCl- und 2 millimolar an
MgCl2 ist. Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine
Säule mit den Abmessungen 2,6 χ 40 cm gegeben, die mit
Konkanavalin A-Sepharose 4B gefüllt ist, die vorher mit der
gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Das am Säuleninhalt adsorbierte Glykoprotein wird mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen. Hierauf wird das Glykoprotein mit der
gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,15 molar an a-Methyl-35
D-mannosit ist. Das erhaltene Eluat wird durch Ultrafiltration konzentriert. Es werden etwa 7 ml einer Fraktion erhal-
L J
030087/0763
Γ -42- 3Q2710S
1 ten, die 6 mg Glykoprotein in 1 ml enthält. Die spezifische
Aktivität dieser Fraktion beträgt etwa 20 000 bei Knochenmarkzellen der Maus.
5 Beispiel 8
Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem
Blut gemäß Beispiel 1 abgetrennt. Es wird eine glykoproteinhaltige Fraktion (Fraktion D) in gleicher Weise wie in Beispiel
5 hergestellt und zu McCoy's 5 A Medium gegeben, das 10 % menschliches Serum enthält. Die Fraktion D wird in
einer Menge von 2 000 Einheiten/ml Medium zugegeben. Unter Verwendung dieses Mediums werden etwa 5 ml einer gereinigtes
CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten, wie in Beispiel 5. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend
der Bildung von 24 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.
L J
030067/0763
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung eines die Proliferation und
Differenzierung menschlicher granulopoetischer Stammzellen stimulierenden Faktors, dadurch gekennzeichnet,
daß man Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut in eine» Gewebekulturmedium vermehrt, das
ein Glykoprotein aus menschlichem Urin enthält, welches
die Bildung von menschlichen Granulozyten oder Mäusemakrophagen und Granulozyten stimuliert, und den gebildeten Faktor
aus der Kulturflüssigkeit isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermehrung der Monozyten und Makrophagen in Gegenwart
von Serum durchführt.
L J
030067/0763
Γ ~Ί
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Serum menschliches Serum verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, man
daß/das Serum in einer Menge von mindestens 5 %, bezogen
auf das Volumen des Mediums verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Glykoprotein, welches die Bildung von menschlichen
Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 0,1 μg/ml Medium verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Glykoprotein, welches die Bildung von Mäusemakrophagen
und Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Glykoprotein ein teilweise gereinigtes Material
verwendet, das noch Harnproteine enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Monozyten und Makrophagen, die in das Gewebekulturmedium
überimoft werden, mindestens 10 /ml beträgt.
L -I
030017/0713
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9235579A JPS5618591A (en) | 1979-07-20 | 1979-07-20 | Production of substance capable of differentiation and multiplication of stem cells of human granulocyte |
JP6462580A JPS56160994A (en) | 1980-05-15 | 1980-05-15 | Preparation of substance capable of differentiating and multiplying human granulocytic stem cell |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3027105A1 true DE3027105A1 (de) | 1981-02-12 |
DE3027105C2 DE3027105C2 (de) | 1988-08-25 |
Family
ID=26405712
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19803027105 Granted DE3027105A1 (de) | 1979-07-20 | 1980-07-17 | Verfahren zur herstellung eines die proliferation und differenzierung menschlicher granulopoetischer stammzellen stimulierenden faktors |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4342828A (de) |
CA (1) | CA1128881A (de) |
CH (1) | CH644520A5 (de) |
DE (1) | DE3027105A1 (de) |
FR (1) | FR2461500A1 (de) |
GB (1) | GB2058081B (de) |
SE (1) | SE451850B (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0211684A2 (de) * | 1985-08-16 | 1987-02-25 | Immunex Corporation | Aktivierung der tumorzerstörenden Aktivität der Makrophagen mittels des Granulozyten-Makrophagen-Kolonien stimulierenden Faktors |
WO2010092571A2 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Short beta-defensin-derived peptides |
EP3011961A1 (de) | 2006-12-21 | 2016-04-27 | Biokine Therapeutics LTD. | 4F-benzoyl-TN14003 für die Mobilisierung von hämotopoietischen Vorläuferzellen im Hinblick auf Transplantation |
Families Citing this family (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6030654B2 (ja) * | 1980-12-31 | 1985-07-17 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒトコロニ−刺激因子の製造方法 |
DE3110611A1 (de) * | 1981-03-18 | 1982-10-07 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | "mitogene der leukozyten und des entzuendungsgewebes:natuerliche leukopoetine zur selektiven anregung der teilung und differenzierung von leukozyten" |
US4432751A (en) * | 1982-03-05 | 1984-02-21 | Baylor College Of Medicine | Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction |
JPS59137417A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-07 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 |
JPS61227526A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
UA29377C2 (uk) * | 1984-09-19 | 2000-11-15 | Новартіс Аг | Спосіб отримання білка з активністю колонієстимулювального фактора гранулоцитів та макрофагів(gm-csf) приматів |
US5422105A (en) * | 1985-02-05 | 1995-06-06 | Cetus Oncology Corporation | Use of recombinant colony stimulating factor 1 |
US5792450A (en) * | 1985-02-05 | 1998-08-11 | Chiron Corporation | Purified human CSF-1 |
US5837229A (en) * | 1985-02-05 | 1998-11-17 | Chiron Corporation | Uses of recombinant colony stimulating factor-1 |
WO1986004607A1 (en) * | 1985-02-05 | 1986-08-14 | Cetus Corporation | Recombinant colony stimulating factor-1 |
US5573930A (en) | 1985-02-05 | 1996-11-12 | Cetus Oncology Corporation | DNA encoding various forms of colony stimulating factor-1 |
US6103224A (en) * | 1985-02-05 | 2000-08-15 | Chiron Corporation | N∇2 CSF-1 (short form) and carboxy truncated fragments thereof |
US5104650A (en) * | 1985-02-05 | 1992-04-14 | Cetus Corporation | Uses of recombinant colony stimulating factor-1 |
US5556620A (en) * | 1985-02-05 | 1996-09-17 | Cetus Oncology Corporation | Use of recombinant colony stimulating factor-1 to enhance wound healing |
US4847201A (en) * | 1985-02-05 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems |
US6156300A (en) * | 1985-02-05 | 2000-12-05 | Chiron Corporation | Point mutants of N∇2 CSF-1 and carboxy truncated fragments thereof |
JPH0753667B2 (ja) * | 1985-08-09 | 1995-06-07 | 新技術開発事業団 | 骨髄移植療法補助剤 |
US5863531A (en) * | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
US5160490A (en) * | 1986-04-18 | 1992-11-03 | Marrow-Tech Incorporated | Three-dimensional cell and tissue culture apparatus |
US5510254A (en) * | 1986-04-18 | 1996-04-23 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three dimensional cell and tissue culture system |
US4721096A (en) * | 1986-04-18 | 1988-01-26 | Marrow-Tech Incorporated | Process for replicating bone marrow in vitro and using the same |
US4963489A (en) * | 1987-04-14 | 1990-10-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
US5032508A (en) * | 1988-09-08 | 1991-07-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
US5266480A (en) * | 1986-04-18 | 1993-11-30 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three-dimensional skin culture system |
US4871350A (en) * | 1986-11-04 | 1989-10-03 | Baylor College Of Medicine | Methods and compositions for preventing secondary cataracts |
US5055291A (en) * | 1986-11-04 | 1991-10-08 | Baylor College Of Medicine | Compositions for preventing secondary cataracts |
JPS63245667A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Ube Ind Ltd | 肥満細胞成長活性を有するヒトil−3産生ヒト細胞および肥満細胞成長活性を有するヒトil−3の製造方法 |
AU625807B2 (en) * | 1987-09-22 | 1992-07-16 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Uses of recombinant colony stimulating factor-1 |
US5190876A (en) * | 1988-12-27 | 1993-03-02 | Emory University | Method of modifying cellular differentiation and function and compositions therefor |
BR9106354A (pt) * | 1990-04-24 | 1993-04-27 | Mark Eisenberg | Equivalente de pele viva composta,seu processo de preparacao; kit de teste,seu processo de preparacao,e processo de testar efeito de substancia sobre a pele |
US5652337A (en) * | 1991-03-11 | 1997-07-29 | Creative Biomolecules, Inc. | OP-3-induced morphogenesis |
US6211146B1 (en) | 1991-03-11 | 2001-04-03 | Curis, Inc. | 60A protein-induced morphogenesis |
CA2104678C (en) | 1991-03-11 | 2002-05-14 | Charles M. Cohen | Protein-induced morphogenesis |
US5460964A (en) * | 1992-04-03 | 1995-10-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for culturing hematopoietic cells |
US5436151A (en) * | 1992-04-03 | 1995-07-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for culturing human hematopoietic stem cells in vitro |
IL110195A (en) * | 1994-07-03 | 2003-10-31 | David Danon | Method and system for cultivating macrophages |
US6498142B1 (en) | 1996-05-06 | 2002-12-24 | Curis, Inc. | Morphogen treatment for chronic renal failure |
EP0980252B1 (de) | 1997-05-05 | 2004-10-06 | Curis, Inc. | Therapien zur behandlung von akutem nierenversagen |
US8435939B2 (en) * | 2000-09-05 | 2013-05-07 | Biokine Therapeutics Ltd. | Polypeptide anti-HIV agent containing the same |
EP2426139B1 (de) | 2002-08-27 | 2014-10-01 | Biokine Therapeutics Ltd. | CXCR4-Antagonisten und Verwendung davon |
US8029985B2 (en) * | 2004-09-01 | 2011-10-04 | Vybion, Inc. | Amplified bioassay |
US9427456B2 (en) | 2009-06-14 | 2016-08-30 | Biokine Therapeutics Ltd. | Peptide therapy for increasing platelet levels |
US9439942B2 (en) | 2012-04-24 | 2016-09-13 | Biokine Therapeutics Ltd. | Peptides and use thereof in the treatment of large cell lung cancer |
JP2018521983A (ja) | 2015-07-16 | 2018-08-09 | バイオカイン セラピューティックス リミテッド | がんを治療するための組成物および方法 |
AU2017222495B2 (en) | 2016-02-23 | 2019-08-08 | Biolinerx Ltd. | Methods of treating acute myeloid leukemia |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2910745A1 (de) * | 1978-03-20 | 1979-10-04 | Green Cross Corp | Glykoproteid aus menschlichem urin, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung bei der bekaempfung von leukozytopenie |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4135975A (en) * | 1977-12-14 | 1979-01-23 | Lichtman Marshall A | Obtaining human cell lines that elaborate colony stimulating activity for marrow cells of man and other species and methods of preparing same |
JPS6030291B2 (ja) * | 1978-03-20 | 1985-07-16 | 森永乳業株式会社 | 人顆粒球の分化増殖を促進するhgi糖蛋白質、hgi糖蛋白質の製造法及びhgi糖蛋白質を含有する白血球減少症治療剤 |
-
1980
- 1980-07-15 US US06/169,107 patent/US4342828A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-07-17 GB GB8023347A patent/GB2058081B/en not_active Expired
- 1980-07-17 CA CA356,422A patent/CA1128881A/en not_active Expired
- 1980-07-17 DE DE19803027105 patent/DE3027105A1/de active Granted
- 1980-07-18 SE SE8005256A patent/SE451850B/sv not_active IP Right Cessation
- 1980-07-18 FR FR8015923A patent/FR2461500A1/fr active Granted
- 1980-07-18 CH CH550580A patent/CH644520A5/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2910745A1 (de) * | 1978-03-20 | 1979-10-04 | Green Cross Corp | Glykoproteid aus menschlichem urin, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung bei der bekaempfung von leukozytopenie |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0211684A2 (de) * | 1985-08-16 | 1987-02-25 | Immunex Corporation | Aktivierung der tumorzerstörenden Aktivität der Makrophagen mittels des Granulozyten-Makrophagen-Kolonien stimulierenden Faktors |
EP0211684A3 (en) * | 1985-08-16 | 1988-06-08 | Immunex Corporation | Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
EP3011961A1 (de) | 2006-12-21 | 2016-04-27 | Biokine Therapeutics LTD. | 4F-benzoyl-TN14003 für die Mobilisierung von hämotopoietischen Vorläuferzellen im Hinblick auf Transplantation |
WO2010092571A2 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Short beta-defensin-derived peptides |
US9155780B2 (en) | 2009-02-11 | 2015-10-13 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Short beta-defensin-derived peptides |
US9567371B2 (en) | 2009-02-11 | 2017-02-14 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Short beta-defensin-derived peptides |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2058081A (en) | 1981-04-08 |
FR2461500A1 (fr) | 1981-02-06 |
SE8005256L (sv) | 1981-01-21 |
CH644520A5 (de) | 1984-08-15 |
SE451850B (sv) | 1987-11-02 |
GB2058081B (en) | 1983-02-09 |
FR2461500B1 (de) | 1984-02-17 |
US4342828A (en) | 1982-08-03 |
DE3027105C2 (de) | 1988-08-25 |
CA1128881A (en) | 1982-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3027105C2 (de) | ||
DE3689246T2 (de) | Physiologisch aktives Polypeptid BUF-3. | |
EP0140134B1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Extraktes | |
DE3402647C2 (de) | Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin | |
AT399095B (de) | Verfahren zur auftrennung von proteinen mittels gradientenelution und vorrichtung zur durchführung des verfahrens | |
DE2752694A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von immunglobulin zur intravenoesen verabreichung | |
DE3612137A1 (de) | Steriles plasmaaustauschmittel | |
DE1949195A1 (de) | Verfahren zur Herstellung deproteinisierter Bluextrakte mit Heilwirkung | |
DE3687097T2 (de) | Therapeutisches mittel zur behandlung haematopoietischer krankheiten. | |
DE3643182A1 (de) | Arzneimittel enthaltend das gewebeprotein pp4, verfahren zur herstellung von pp4 und zu seiner pasteurisierung sowie die verwendung von pp4 | |
DE2645993C2 (de) | ||
DE2441454C3 (de) | Antileukämische proteinhaltige Fraktion und ihre Herstellung | |
EP0602686A2 (de) | Lektinkonzentrate aus Mistelextrakten und entsprechende standardisierte, stabilisierte Mistellektinpräparate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung zur Erhöhung der natürlichen Immunresistenz und/oder in der Tumor-Therapie | |
DE3421789C2 (de) | ||
DE2930604A1 (de) | Doppelstrangige ribonucleinsaeure, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende interferon-induktoren | |
DE3325131C2 (de) | ||
DE69029040T2 (de) | Megakaryocytopoietischer faktor | |
DE2428955C3 (de) | Verfahren zur Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in vivo antikoagulierender und in vitro koagulierender Wirkung aus dem Gift der Schlange Ancistrodon rhodostoma und daraus hergestellte Mittel | |
DE3306944A1 (de) | Fibrinolytisch aktives mittel und verfahren zu seiner herstellung | |
DE68928138T2 (de) | Neuer megakaryokytischer koloniestimulierender faktor und verfahren zur herstellung | |
DE2605576C3 (de) | Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain,,Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papya und Verwendung der isolierten Proteasen zur Herstellung von sterilisierten und Iyophilisirten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten | |
AT392003B (de) | Verfahren zur herstellung eines insbesondere zur wundheilung oder zur behandlung in der geriatrie verwendbaren wirkstoffes aus saeugetierblut durch papainhydrolyse und ein einen solchen wirkstoff enthaltendes praeparat | |
DE69929189T2 (de) | Ein Komplex aus Alpha-Fetoprotein (AFP) und einem polyungesättigten Fettsäurederivat zur Behandlung von Immunschwäche | |
EP1490112A1 (de) | Verfahren und mittel zur herstellung therapeutisch wirksamer blutzusammensetzungen | |
DE69526096T2 (de) | Wachstumsregulator |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: VOSSIUS, V., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. TAUCHNER, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. HEUNEMANN, D., DIPL.-PHYS. DR.RER.NAT. RAUH, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., PAT.-ANWAELTE, 8000 MUENCHEN |
|
8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: TAUCHNER, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. HEUNEMANN, D., DIPL.-PHYS. DR.RER.NAT. RAUH, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., PAT.-ANWAELTE, 8000 MUENCHEN |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |