DE3013837A1 - Diagnostische methode - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE J. REITSTÖTTER W. KINZEBACH

PROF. DR. DR. DIPL. INO. DR. PHIL. DIPL. CHEM.

W. BUNTE Ü9B8-1976) K. P. HÖLLER

DR. ING. DR. RBR. NAT. DIPL. CHEM.

TBLBFONl (089) 8760 TBLBXl B21B208 ISAR D

BAUERSTRASSB 82, 80O0 MÜNCHEN

München, 10. April 1980 M/21

BRISTOL-MYERS COMPANY Park Avenue

New York, N.Y. 10022 U. S. A.

Diagnostische Methode

POSTANSCHRIFT I POBTP¹ACH 7Θ0, D -8000 MÜNCHEN

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Die Erfindung betrifft eine diagnostische Testmethode für die Entdeckung von malignen Neoplasmen.

Neue Methoden für die Entdeckung von Krebs werden dringend benötigt. In vielen Fällen würde die frühzeitige Diagnose von Krebs die Chancen für eine vollständige Remission der Krankheit bedeutend verbessern.

In der Literatur werden frühere Versuche beschrieben, die zeigen sollen, ob tumorspezifische Bestandteile wie Hormone und Antigene im Blut des Krebspatienten vorhanden sind. Solche Versuche verliefen jedoch größtenteils nicht erfolgreich und ein praktisches, nicht eingreifendes diagnostisches Verfahren, das auf dem Gehalt eines tumorspezifischen Serumbestandteiles beruht, blieb bis heute ein schwer zu erreichendes Ziel.

Kürzlich wurden in dem Serum von Patienten mit Neoplasie, systemischem ' ILupus erythematosus und anderen Entzündungskrankheiten DNA-bindende Proteine gefunden /"siehe z. B. FEBS Letters 92(2) :211-213 (1978); Europ. J. Biochem. 71:1-8 (1976); Amer. J. Med. 65:437-445 (1978)J. Jedoch wurde kein geeignetes Analyseverfahren für solche Serumproteine bereitgestellt, das für eine praktische diagnostische Methode notwendig : wäre. Zudem scheinen die zuvor beschriebenen Serumproteine nicht! den Selektivitätsgrad zu besitzen, der für eine Krebs-Untersuchungsmethode wünschenswert wäre.

Das in der vorliegenden Erfindung benutzte Inhibitor Serumprotein ist in The Pharmacologists (Abs.) 20 (3):238 (1978) offenbart. Jedoch ist im Abstract kein Hinweis darauf zu finden daß das Protein bei Patienten, die Krebs haben, in einem anderen Gehalt vorliegt, als bei Patienten, die keinen Krebs haben.

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Die vorliegende Erfindung stellt eine generell anwendbare diagnostische Testmethode für die Entdeckung von malignen Neoplasmen bei Menschen bereit, insbesondere stellt die Erfindung eine diagnostische Methode, die anzeigt, ob bösartige Neoplasmen vorhanden sind, bereit, indem menschliche Serumproben auf das Vorhandensein eines spezifischen DNA-bindenden Proteins untersucht werden. Die Methode ist als Früherkennung von malignen Krankheiten und als Indikator, wieweit die Krankheit bei dem im Behandlung befindlichen Patienten fortgeschritten ist, geeignet.

Die vorliegende Methode basiert auf der Feststellung, da3 ein gewi3es DNA-bindendes Protein (im folgenden als Inhibitor Protein X bezeichnet) im Serum des Krebspatienten in signifikant geringeren Konzentrationen als beim krebsfreien Patienten vorliegt. Indem eine empfindliche Analyse für dieses Serumprotein ; bereitgestellt wird, ermöglicht die vorliegende Erfindung eine schnelle, nicht eingreifende und genaue Methode zur Entdeckung von Krebs. '

ι Bei der Untersuchung des Bleomycin-induzierten Abbaus von PM-2 ι DNA (Pseudomonas Bacteriophage kovalent geschlossene circulare DMA) wurde gefunden, daß ein bestimmtes DNA-bindendes Protein im ' menschlichen Serum vorliegt. Die Beobachtung, daß dieser Abbau ; durch menschliches Serum gehemmt wird, führte zu Untersuchungen ! über die Natur der Hemmung und zu Versuchen, die Inhibitorver- ; bindung zu identifizieren. i

Die Annahme, daß die Hemmung der PM-2 DNA Abbaureaktion auf I einem Serumprotein beruht, wurde durch Behandlung mit Pronase ι bestätigt, die zum Verlust der Hemmungsaktivität führte. Die Behandlung mit DNAase I oder pankreatischer RNAase ergab keine Auswirkung auf die Hemmungsaktivität des Serums. Sera von Hunden und Kälbern sowie menschliches Albumin und Immunoglobuline wirkten nicht hemmend.

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Das Inhibitorprotein wurde unter nichtdenaturierenden Bedingungen
mit Hilfe von Molekularfiltern, Dialyse und Sephadexsäulen-Chromatographie gereinigt. Die Reinigung des Proteins wurde
durch Binden des Proteins an DNA, Isolierung des DNA-Proteinkomplexes von dem ungebundenen Protein und dann durch Abdissoziierung des Proteins von der DNA durch Behandlung mit Harnstoff wesentlich verbessert. Man nimmt an, da3 die Reinigung
durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und isoelektrische
Fokussierung zu einer mehr als 2.000-fachen Reinigung führt.
Isoelektrisch focusierende. Gel-Elektrophorese deutet darauf hin, daß der Inhibitor aus einem Protein besteht, der ein Molekular- ! gewicht von etwa 64.000 Dalton und einen ρΓ von 5.9 besitzt.
Dieses Protein wird hier als Inhibitorprotein X bezeichnet.

Das Inhibitorprotein X zeigt seine hemmende Wirkung, indem es an , DNA gebunden wird. Die Bindung an DNA wurde durch Agarosegel-Elektrophorese, Isolierung des DNA-Proteinkomplexes, Fluoreszenz-Quenching und Zirkular-Dichroismus-Untersuchungen gezeigt. :

Als die Natur des Inhibitorproteins X untersucht wurde, wurde ; überraschend gefunden, daß ein signifikanter Unterschied bezug- , lieh des Gehalts dieses Proteins in dem Serum von 'Crebspatienten [ und in dem Serum von krebsfreien Patienten bestand. Basierend , auf dieser wichtigen Feststellung wurde eine empfindliche und
schnelle Gehaltsbestimmung für das Vorliegen des Inhibitorproteins XJ im menschlichen Serum entwickelt. i

PM-2 DNA ist früher in einer spektrophotof1uorometrischen Untersuchung für die Bestimmung der biochemischen Aktivität von ί Bleomycin benutzt wurden /Cancer Res. 3^:3322-3326. (1978)J.
Der Wirkungsmechanismus von Bleomycin scheint mit seiner Fähig- j keit zum Abbau von DNA verwandt zu sein, und die durch Bleomycin;

induzierte und mittels Fluoreszenzspektrometrie bestimmte Ver- j minderung der Bindung von Ethidiumbromid (2,7-Diamino-10-äthyl - ', 9-phenyl -phenanthrid'iniumbromid) an PM-2 DNA kann somit zur Bestimmung der Bleomycinaktivität benutzt werden^

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Es wurde, wie zuvor beschrieben, gefunden, daß das Inhibitor Protein X als Inhibitor des Bleomycin-indizierten Abbaus von PM-2 DNA fungiert. Angesichts dieser Tatsache kann die zuvor zur Messung der Bleomycin-Aktivität benutzte fluorometrische Analyse auch als Analyse für die Konzentration an Inhibitor Protein X im menschlichen Serum benutzt werden. Der -Gehalt an Inhibitor Protein X kann dann dazu verwandt werden, um die Wahrscheinlichkeit von Krebs bei dem untersuchten Patienten vorherzusagen.

Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Krebsdiagnoseverfahren beim Menschen bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) in einer Blutprobe eines auf Krebs zu untersuchenden Patienten die Konzentration an Inhibitor Protein X bestimmt und

(b) . die in Stufe (a) bestimmte Konzentration mit | der Inhibitor Protein X-Normkonzentration des Serums von I krebsfreien Patienten vergleicht, wobei eine signifikante Verminderung der Inhibitor Protein X-Konzentration bezüglich der Norm-Konzentration die Wahrscheinlichkeit von Krebs anzeigt.

Das in Stufe (a) zur Bestimmung der Serum Inhibitor Protein X-Konzentration benutzte besondere Analyseverfahren ist nicht kritisch und die Erfindung findet ihre weite "Anwendung in der Feststellung, daß die Inhibitor Protein X-Konzentration (wie immer auch bestimmt) als ein diagnostisches Mittel für eine große Anzahl von menschlichen Krebserkrankungen benutzt werden kann.

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Ein vorteilhaftes Analyseverfahren besteht in der PM-2 DNA Fluoreszenzanalyse , beschrieben in Cancer Res. 38:3322-3326 (1976). Die Verwendung dieser Analyse basiert auf der hemmenden Wirkung des Inhibitor Proteins X auf die gut bekannte, Bleomycin-induzierte Abbaureaktion von PM-2 DNA. Wenn diese Analyse verwendet wird, wird die Inhibitor Protein X-Konzentration geeigneterweise als ein ICg^-Wert angezeigt, worin IC₅₀ als die Konzentration an Inhibitor Protein X definiert wird, die erforderlich ist, um den Bleomycin-induzierten Abbau von PM-2 DNA um 50 % zu hemmen. Dieser IC_5Q-Wert kann dann mit dem Norm-ICrg-Wert, der im Serum von krebsfreien Patienten gefunden wird, verglichen werden, und eine signifikante Erhöhung des IC_5Q-Wertes gegenüber dem Normwert wird die Wahrscheinlichkeit von Krebs anzeigen.

Die Einzelheiten für die PM-2 DNA Fluoreszenzanalyse für das Inhibitor Protein X sind die folgenden:

Zuerst wird eine Mischung aus einerSerumprobe (z.B. einer 50 μ! :

Probe) eines zu untersuchenden Patienten und einer Lösung :

von Bleomycin, PM-2 DNA und 2-Mercaptoäthanol in einem pH 9,5 i

Puffer hergestellt. Typischerweise wird eine 50 μ! Serumprobe j mit 450 μΐ einer Lösung, die 35 nM Bleomycin, 8,3 μΜ PM-2 DNA

und 25mM 2-Mercaptoäthanol in einem pH 9,5 Natriumboratpuffer \

(0,015 M NaCl : 0,05 M Natriumborat) enthält, gemischt. j

Die obige Mischung wird dann für 30 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert.

Eine Lösung von Ethidiumbromid in einem pH 12_S1 Denaturierungspuffer wird dann hergestellt,, indem 0 ₉1 ml einer Ethidiumbromid-1 lösung (22 μg Ethidiumbromid pro ml pH 12₃1 Denaturierungspuffer) zu 0,9 ml eines pH 12,1 Denaturierungspuffersgegeben werden. Ein geeigneter Denaturierungspuffer umfaßt 0_s09 M Na₃PO₄: 0₉01 M EDTA : 0,01 M NaCl, eingestellt auf pH 12,1 mit 0,15 M j NaOH. Zu 1 ml dieser Ethidiumbromidlösung wird ein Aliquot (z. B. 100 μ! ) dieser oben zubereiteten inicubierten Serumsmischung gegeben.

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Die Fluoreszenz der Ethidiumbromid: PM-2 DNA-Mischung wird auf einem Fluoreszenzspektrophotometer bei 530 nm Anregung und 590 nm Emission! gemessen. Eine Fluoreszenz, die größer ist als der Untergrund, wird durch Ethidiumbromid, das an PM-2 DNA gebunden ist, verursacht, so daß eine Veränderung der Fluoreszenz bezogen auf eine Kontrol1 reaktion (identisch mit der Testprobe, außer das sie kein Bleomycin enthält) es ermöglicht, daß das Ausmaß des ^: Bleomycin-induzierten Abbaus von PM-2 DNA quantifiziert wird. Aus den Fluoreszenzwerten kann die durch die Gegenwart des ^! Inhibitor Proteins X in dem Serum hervorgerufene prozentuale Hemmunh des PM-2 DNA Abbaus leicht bestimmt werden. '

i Danach wird die Konzentration an Inhibitor Protein X in der j Blutprobe durch die konventionelle Lowry (FoI in Phenol Reagenz) i Methode bestimmt, wie beschrieben in J. Bio! . Chem. \ 193^:265-275 (1951). |

Indem die prozentuale-Hemmung des PM-2 DNA Abbaus gegen den ; Logarithmus der Konzentration an Inhibitor Protein X aufgetragen j wird, kann der IC₅₀-Wert für eine bestimmte Serumsprobe schnell bestimmt werden.

Wenn einmal der ICgg-Wert für einen bestimmten Patienten berechnet worden ist, kann dieser Wert direkt dazu benutzt werden, die Wahrscheinlichkeit von Krebs bei diesem Patienten vorherzusagen. Ausgedehnte Untersuchungen an gesunden <krebsfreien) Patienten und Patienten, die verschiedene Arten von malignen Neoplasmen besaßen, haben gezeigt, daß das Inhibitor Protein X in dem Serum von Krebspatienten in signifikant geringeren Mengen vorhanden ist. Daher wird bei Krebspatienten ein signifikant erhöhter, bezogen auf den Normwert für gesunde Individuen, IC^q-Wert gefunden. Diese klare Unterscheidung in den ICgQ-Werten stellt somit eine einfache und genaue Basis für die Entdeckung des Voriiegens von Krebs bereit, und ist das Herzstück der vorliegenden Erfindung.

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Der aus den Blutproben von krebsfreien Patienten erhaltene,
genaue ICg^-Wert variiert zu einem gewi3en Grad mit dem einzel
nen Individuum. Bei den bis dato getesteten Patienten wurde
ein mittlerer ICg_Q-Wert für krebsfreie Patienten von 90,2 +
11.0 Mg/ml gefunden. (Signifikant bei einem 0,001 Gehalt).
Der höchste für einen gesunden Patient berichtete IC₅Q-Wert
betrug 120

Die bei Krebspatienten erhaltenen IC₅₍,-Werte variieren mit dem : Typ der Krebserkrankung, jedoch war bis dato bei allen Fällen
der Wert signifikant höher als derjenige, der bei krebsfreien ;

Individuen erhalten wurde. Der niedrigste IC_5Q-Wert für einen '

Krebspatienten betrug bis dato 270 pg/ml . Jedoch'zeigt im all- i

' gemeinen ein ICgQ-Wert über ungefähr 100 eine große Wahrschein- !

lichkeit an, daß der Patient ein bösartiges Neoplasma irgend- ! ' einer Art besitzt.

Die erfindungsgemäße Methode wurde erfolgreich benutzt, um eine · j große Anzahl von Krebsarten zu entdecken. Es wird somit ange- ! nommen, daß sie allgemein anwendbar ist für die Krebsdiagnose. j '. Als spezielle Beispiele für entdeckte Krebsarten können ge- j nannt werden: Hodenkarzinom, Lymphom, Leukämie, Adenokarzinom j der Brust, kleines Zellenadenokarzinom der Lunge, großes Zellen- I adenokarzinom der Lunge, Adenokarzinom der Wirbelsäule und
^: Melanom, um nur einige zu nennen. Die Methode scheint auch
! spezifisch für die Krebsdiagnose zu sein, da krebsfreie Patien-' ten, die verschiedene Arten von nicht-neoplastischen Krankheiten
besaßens keine erhöhten IC_5Q-Werte aufwiesen.

j Die oben beschriebene Fluoreszenzanalyse für das Inhibitor Protein X der vorliegenden Erfindung basiert auf der dieser Sub- ; stanz innenwohnenden Eigenschaft: Hemmung des Bleomycin-induzier- , ten Abbaus von PM-2 DNA. Der durch diese Methode bestimmte
: Gehalt dieses Proteins im Blut, wurde in der vorliegenden Erfin-
> dung mit der Gegenwart oder Abwesenheit einer bösartigen Krank- ! heit in Beziehung gesetzt. Da ein gereinigtes Inhibitor Protein-X

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verfügbar ist, können zu seiner Bestimmung eine Vielzahl von anderen Methoden, die in der Technik der Biochemie und der klinischen Chemie bekannt sind, eingesetzt werden. Führend unter diesen immunologischen Methoden sind die Radioimmunoanalyse, Fluoroimmunoanalyse, Enzymimmunoanalyse (z. B. ELISA),Spinimmunoanalyse , Chemilumineszenzimmunoanalyse, Fluoreszenzpolarisationsimmunoanalyse, nephelometrische Analyse, Geldiffusionsmethoden und klassische Methoden wie Blutkörperchen-Agglutination und Komplementbindung. Außerdem können andere funktionale Eigenschaften des Inhibitor Proteins X für seine Bestimmung in biologischen Fluiden ausgenutzt werden. Die mit diesem Molekül verbundenen katalytischen Phänomene können in spektrophotometri sch oder spektrofluorometrisch-kinetisehen Analysen oder Endpunktanalysen gemessen werden. Zudem können für das in Frage kommende Fluid Trenntechniken angewendet werden, und eine Vielzahl von Bestimmungsmethoden inklusive Spektral- oder j densitometrischen Methoden und immunologischen Methoden kann benutzt werden, um das Protein quantitativ zu erfassen. Da die ι spezifische Bestimmung der Inhibitor Protein X-Konzentration i nach den vorangegangenen Methoden erfolgt, korreliert der gemäß diesen Methoden bestimmte Serumgehalt des Proteins¹ mit dem Vorliegen oder der Abwesenheit einer bösartigen Er- \ krankung. |

Das Inhibitor Protein X wurde gemäß den folgenden Verfahren ■ gereinigt: :

Teilweise Reinigung - Verfahren A

Das Inhibitor Protein X wurde teilweise durch Sephadexsäulenchromatographie gereinigt. Menschliches Serum (1 ml) wurde auf eine Sephadex G-75-Säule (88 cm χ 2 cm) gegeben und dann mit einem Natriumphosphatpuffer (0,07 M, pH 6,8) bei Zimmertemperatur und einer Flußrate von 6-8 ml pro Stunde eluiert. Der Inhibitor war

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in dem Kolonnenleervolumen (void volume) enthalten, das ge- ; sammelt, nach der Lyophilisation in 1 ml HoO wiederum suspen- '■ diert, bei 4 ⁰C für 24 Stunden gegen 20 Volumina H₂O dialysiert und dann auf eine Sephadex G-200-Kolonne gegeben wurde, die mit demselben Pufferequilibriert war.

Die Eluierung der Sephadex G-200-Säüle ergab drei Peaks, die
bei 280 nm absorbierten. Peak III, der 7,7 % des gesamten ' eluierten Proteins ausmachte, enthielt das Inhibitor Protein χι. Dieses wurde wie oben beschrieben behandelt und dann wiederum : auf eine Sephadex G-200-Säule gegeben. Die Eluierung wurde : mit dem oben beschriebenen Phosphatpuffer durchgeführt. Mit ; einem Fraktionensammler (Gilson Medical Electronics, Inc., ^! Middelton, Wis.) wurden Fraktionen (3 ml) von jeder Säule ge- : sammelt, und die Elutionsprofile wurden durch Messung der Absorption bei 280 nm mit einem Spektrophotometer erhalten. Die
Konzentrationen an Protein wurden gemäß der Lowry-Methode bestimmt.

Reinigung - Verfahren B

Reinigung des Inhibitor Proteins erfolgte durch Molekularfiltration mit Amicon-Filtern, Dialyse und Sephadexgel- Säulen
Chromatographie. Die Human-Sera (1-5 ml) wurden in Amiconi Conical Filterröhren (Amicon, Lexington, Mass.) bei 5000 g und
4 ⁰C während 10 Minuten zentrifugiert. Das nach dem Zentrifu- I gieren in dem Filterkonus verbleibende Retentat wurde wiederum ! in so viel entionisiertem Wasser suspendiert, bis das ur- j sprüngliche Volumen der Sera wieder hergestellt war. Aliquots j des Rückstandes und des Filtrats wurden auf die Hemmaktivität [ untersucht. Das aktive Retentat · wurde bei 4 ⁰C während 24 J Stunden in Zellulose-Schlauch gegen 20 Volumina von entionisiertem Wasser dialysiert. Der Rückstand und das Diaylseprodukt wurden lyophilisiert und wieder in entiom'siertem Wasser suspendiert. Die Analyseergebnisse der beiden Fraktionen

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zeigten, daß die Hemmaktivität im Retentat vorhanden war. Das Retentat (1ml) wurde auf eine 60 χ 5 cm Säule von ^; Sephadex G-50 gegeben und mit einem Natriumphosphatpuffer ; (0,07 M, pH 6,8) bei 4 ⁰C und einer Flußrate von 30 ml pro Stunde eluiert. Das Eluat der Säule (5 ml pro Rohr) wurde mit einem Buchler Fractomette Alpha 200 (Searle, Fort Lee, N.J.); Fraktionensammler gesammelt. Die Absorption bei 280 nm jeder Fraktion wurde mit einem Spektrophotometer gemessen und die Röhren wurden entsprechend den Absorptionspeaks vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden lyophilisiert, dialysiert j und auf ihre Hemmaktivität wie oben beschrieben untersucht. , Das in der Kolonnenleervolumen-Fraktion enthaltene "aktive" Material wurde auf Sephadex G-75 und G-100 Säulen gegeben und ähnlich wie bei der G-50 Säule eluiert. Die Hemmaktivität wurde in den KoIonnenleervolumen-Fraktionen beider Kolonnen gefunden. Das "aktive" Material, das in der Kolonnenleervolumen-Fraktion der Sephadex G-200 Säule gesammelt worden war, wurde mit Natriumphosphatpuffer (0,07 M, pH 6,8) bei Raumtemperatur und einer Flußrate von 6-8 ml pro Stunde eluiert.Die Fraktionen wurden mit einem Gilson Mikrofraktionssammler (Gilson, Middleton, Wis.) gesammelt (3ml pro Röhre). Das Säuleneluat wurde auf der Basis des 280 nm Absorptionsprofils fraktioniert, in dem die Röhren mit demselben Absorptionspeak zusammengefaßt wurden. Jede Fraktion wurde dann lyophilisiert, dialysiert und j auf ihre Hemmaktivität wie oben beschrieben getestet. Die Hemmaktivität wurde in der Fraktion III gefunden. Das Material in der Fraktion III wurde wiederum auf eine Sephadex G-200 Säule j gegeben und unter denselben Bedingungen eluiert. Die Fraktion III der Sephadex G-200 Säule , die das Inhibitor Protein X enthält, hat eine mehr als 1000-fache Reinheit. ι

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Das PM-2 DNA Fluoreszenz-Analyseverfahren für das Inhibitorprotein >

X wird im folgenden näher beschrieben: !

Bestimmung des IC₅₀ für das Inhibitor Protein X ^;

Die Bestimmung des IC™ (die erforderliche Konzentration an _:

Protein, die eine 50 %-Hemmunn des PM-2 DNA Abbaus bewirkt) ·

für das Inhibitorprotein X in Human- Sera wird in zwei Stufen

durchgeführt: '

1. Die Proteinkonzentration im Serum wird durch die Lowry Methode bestimmt.

2. Der Einsatz der PM-2 DNA Fluoreszenzanalyse für Bleomycin ergibt eine Dosis-Ergebniskurve für den Serum Protein Inhibitor. Die ICj-Q-Werte werden aus Diagrammen abgeleitet, bei denen die prozentuale Hemmung des DNA Abbaus gegen die Protein-Konzentrationen auf logarithmischem probit Papier (onlog probit graphs) aufgetragen sind.

Verfahren:

i I. Lowry Reaktion. [

A. Herstellung der Vorratslösungen: Lösung A. 2 % Na₂CO₃In 0,1 N NaOH. Lösung B. 1 % CuSO₄. 5H₂O in H₂O. Lösung C. Natrium,Kaiiumtartrat in H₂O Lösung D. 2N FoIin-Ciocalteau Phenol Reagenz.

B. Herstellung der Reagenzlösungen.

Reagenzlösung 1. Man mische 1 Volumenanteil der Vorratslösung B mit 1 Volumenanteil der Vorratslösung C.

Reagenzlösung 2. Man mische 50 Volumina der Vorratslösung A mit 1 Volumina der Reagenzlösung 1.

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Reagenzlösung 3. Man mische 1 Volumina der Vorratslösung

D mit 1 Volumina H₂O.

C. Umsetzungen

1. Man verdünne die Sera 1:10 mit H₂O.

2. Man gebe 10 μΐ der verdünnten Sera in ein 13 χ 100 mm Glasteströhrchen und füge 290 μ! H₂O hinzu.

3. Man füge 1 ml der Reagenzlösung 2 hinzu, mische gut und inkubiere 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

4. Man füge 100 μ! der Reagenzlösung 3 hinzu, mische gut und inkubiere 30 Minuten lang beim Raumtemperatur.

5. Man benutze ein Spektrophotometer für die Messung der Absorption bei 750 nm.

6. Man bestimme die Proteinkonzentration aus der BSA Standardkurve.

D. Bovine Serum Albumin (BSA) Standardkurve.

1. Man stelle Serienverdünnungen von BSA (z.B. 25, 50,

75, 100, 150 μg/m^) in einem Endvolumen von 0,3 ml her.,

2. Man führe die in Section C gegebenen, beginnend bei ₍ Stufe C, Umsetzungen durch (Hinzufügen der Reagenz- ! lösung 2). i

3. Man trage die Absorption bei 750 nm gegen die BSA- j konzentrationen auf.

II. Die Protein Inhibitor Analyse ;

A. Führe Serienverdünnung des Serumproteins auf der Basis der durch die Lowry Reaktion bestimmten Serumprotein- ! konzentrationen durch. Stelle Verdünnungen in einem konstanten Volumen von Natriumboratpuffer (0,05 M, pH 9,5) her.

B. Füge die Proben an Serumprotein ( 50 μΐ Volumen) zu 10 μΐ

Bleomycin (34,5 Nanomole), die in einem Glasteströhrchen (13 χ 100 mm) enthalten sind.

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C. Füge 390 μ] Natriumboratpuffer (0,05 M, pH 9,5) hinzu, der 25 mM 2-Mercaptoäthanol enthält.

D. Füge 50 pl PM-2 DNA (8,3 χ 10-6 M in 0,15 M NaCl) hinzu.

E. Inkubiere bei 37 ⁰C für 30 Minuten.

F. überführe dreifache Aliquots (100μΊ)ιη Glasteströhrchen( 13x100mm) die 0,9 ml Na₃PO₄(O₅Og M, pH 12,1) enthalten, das wiederum 0,01 M EDTA und 0,01 M NaCl enthält. Mische gut.

G. Füge 100 μΐ Ethidiumbromid (55,7 χ 10-6 M) zu dem Na₃P0₄-Puffer hinzu, pH 12,1. Mische gut.

H. Kontrollen:

1. Natriumborat (0,5 M, pH 9,5) 2-Mercaptoäthanol enthaltend ohne Bleomycin oder Proteine.

2. Protein ohne Bleomycin oder PM-2 DNA.

3. Protein ohne Bleomycin.

4. Natriumborat (0,05 M, pH 9,5) eine 2-Mercaptoäthanol blindprobe enthaltend.

I. Spektrophotofluorometrie (Aminco-Bowman) Oberführe die Probe in eine 1 cm Quarzcuvette und messe die Fluoreszenz bei 530 nm Anregung und 590 nm Emission.

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Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE

   .J Krebsdiagnoseverfahren beim Menschen, dadurch gekennzeichnet,'

   daB man ·.

   (a) in einer Blutprobe eines auf Krebs zu untersuchenden j Patienten die Konzentration an Inhibitor Protein X J bestimmt und

   (b) die in Stufe (a) bestimmte Konzentration mit der Inhibitor Protein X-Normkonzentration des Serums von krebsfreien Patienten vergleicht, wobei eine signifikante Verminderung der Inhibitor Protein X-Konzentration bezüglich der Norm-Konzentration die Wahrscheinlichkeit von Krebs anzeigt.
2. 2. Krebsdiagnoseverfahren beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (a) in einer Blutprobe eines auf Krebs zu untersuchenden Patienten die Konzentration an Inhibitor Protein X, die erforderlich ist, um den Bleomycin-induzierten Abbau von PM-2 DNA um 50 % zu hemmen, bestimmt und

   (b) den in Stufe (a) bestimmten ICgQ-Wert mit dem Norm-ICj-0-Wert der im Serum von krebsfreien Patienten gefunden wird, vergleicht, wobei eine signifikante Erhöhung des ICf-Q-Wertes gegenüber dem Normwert die Wahrscheinlichkeit von Krebs anzeigt.

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   ORIGINAL INSPECTED
3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den ICgQ-Wert in Stufe (a) auf folgende Weise bestimmt:

   (1) Herstellung einer Mischung aus einer Blutprobe und einer : Lösung von Bleomycin, PM-2 DNA und 2-Mercaptoäthanol in einem pH 9,5 Puffer;

   (2) Inkubation der Mischung von Stufe (1) bei einer Tempe-I ratur von 37 ⁰C für 30 Minuten;

   . (3) Hinzufügen eines Aliquots der Mischung von Stufe (2) zu einer Mischung von Ethidiumbromid in einem pH 12,1 Denaturierungspuffer;

   (4) Bestimmung der Fluoreszenz der Ethidiumbromid: PM-2 DNA-Mischung aus Stufe (3) mit einem Spektrophotofluorometer

   ^! bei 530 nm Anregung und 590 nm Emission;

   (5) Bestimmung der prozentualen Hemmung des-Bleomycin-induzierten PM-2 DNA Abbaus aus der Veränderung der Fluoreszenz der

   I Probe bezogen auf eine Kontrollprobe, die kein Bleomycin ! enthält;
   ι

   ; (6) Bestimmung der Konzentration an Inhibitor Protein-X gemäß der Lowry-Methode; und

   (7) Bestimmung der Konzentration an Inhibitor Protein X,

   die erforderlich ist, um den Bleomycin-induzierten ^; PM-2 DNA Abbau um 50 % zu hemmen, aus den in Stufen (5) und (6) erhaltenen Werten.

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