LU82345A1 - Methode de detection du cancer - Google Patents

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Description

; D. 51.100
8 0-¾ Λ *rt GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG
du 8......avril.....19.8ç>________________ Monsieur le Ministre ____ , öSsäb de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes
Titre delivre : ........................................
cÿvWÎM Service de la Propriété Industrielle
LUXEMBOURG
Demande de Brevet d’invention I. Requête ....La....soa±êfcé...,.&ifc£..ï BRISTOL.-M.y.EES.....COMEÂN.X.i! ........................(1) ....â....liEKr.YQBK./......N.#.y «......1.0.022/.....Efcatsrünis.....d^êrigue*.....représentée......................
, par Monsieur Jacques.....de Muyser*......agissant en qualité de inan-..........(2) .....dâ.tai.r.e.................'.........................................................................................................................................................................................................................................
dépose ce .... tolfc._..a^ ............................................................................(3) à........15............. .... heures, au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, à Luxembourg : 1, la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant : > ....."Méthode.....de.....détection du cancer"................................................................................................................................{4) ........................................
.......................................................................................................................................................................................................................................................................................(5) 2. la délégation de pouvoir, datée de ÎÏ.EW“. Y.QBÆv.................................... le .4. avril 198o.................
3. la description en langue.........française..................................de l’invention en deux exemplaires ; 4.......././............... ... planches de dessin, en deux exemplaires ; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le ......8.....avril 198o...................................................................................................................................................................................................................
revendique pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (6)..................brevet..................................................déPosée(s/dn (7) aux Etats-Unis d1 Amérique.................
le......lo... avril.....19.79__________(No......028.732)____________ (8) r au nom de S inventeurs............................................................................................................................................................................................(9) élit domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg .....................................
......25/.....blïïr~Rôvâl ....................................................................................... (i0) sollicite la délivrance d>m brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes
Ektiκτηrationnées, — avec ajournement de cette délivrance à .......5......................................mois.
mandaj|airè..............δ...........V V
Π. Procès-verbal de Dépôt
La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Industrielle à Luxembourg, en date du : 8 avril 198o ........··.. Pr. le Ministre à..........15. heures λ de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, / p-d.
P *·. ; . g '· } |>-7 ί , s # / D. 51.100
REVENDICATION DE LA PRIORITE
de la demande de brevet / / &\ Aux ETATS-UNIS D'AMERIQUE Du lo AVRIL 1979 Mémoire Descriptif déposé à l’appui d’une demande de
BREVET D’INVENTION
au
Luxembourg
au nom de : BRISTOL-MYERS COMPANY
Λ p0tir : "Méthode de détection du cancer".
*
La présente invention concerne une méthode diagnostique d’essai pour la détection de tumeurs malignes.
Des méthodes nouvelles sont sans aucun doute nécessaires pour la détection du cancer. Dans de nombreux 5 cas, le diagnostic précoce du cancer multiplierait grandement les chances de rémission complète de la maladie.
La littérature décrit les tentatives qui ont été faites pour démontrer la présence de composants spécifiques des tumeurs tels que des hormones et des antigènes dans le 10 sang de patients atteints de cancer. Toutefois, ces tentatives ont largement échoué et une méthode diagnostique pratique, non agressive, basée sur le taux d’un composant spécifique de la tumeur dans le sérum est un but qui n’a pas pu être atteint jusqu'à présent.
15 Récemment, la présence de protéines fixant l’ADN
a été mise en évidence dans le sérum de patients atteints de néoplasies, de lupus érythémateux systémique et d’autres troubles inflammatoires (voir, par exemple, FEBS Letters 92(2) : 211-213 (1978) j Europ J. Biochem. 71 ï 1-8 (1976) ; 20 Amer. J. Med. 65 : 437-445 (1978)]. Cependant, aucune méthode analytique correcte, qui serait nécessaire pour un f diagnostic pratique, n’a été proposée pour la recherche de ces protéines sériques. En outre, les protéines du sérum décrites dans l’art antérieur n’ont pas paru présenter le 25 degré désiré de sélectivité dans une méthode de dépistage du cancer.
La protéine sérique inhibitrice utilisée dans la présente invention est décrite dans The Pharmacologists -(Abs.) 20 (3) : 238 (1978). Toutefois, le sommaire ne donne 30 aucune indication sur la présence de la protéine à des taux différents chez des patients atteints de cancer, comparativement à des patients non cancéreux.
La présente invention propose une méthode diagnostique d’essai applicable d’une façon générale à la 35 détection de tumeurs malignes chez des êtres humains. Plus particulièrement, l’invention propose une méthode diagnostique indiquant l’existence de tumeurs malignes par analyse d’échantillons de sérum humain pour détecter la présence * 2 «? d'une protéine spécifique se liant à l'ADN. La méthode est utile pour la détection précoce d'une maladie de nature maligne et comme indicateur de progression de la maladie chez un patient cancéreux en traitement.
5 La méthode de l'invention est basée sur l'obser vation selon laquelle une protéine déterminée se liant à l'ADN (appelée ci-après protéine inhibitrice X) est présente à des concentrations notablement réduites dans le sérum de patients atteints de cancer comparativement à des patients 10 non cancéreux. En offrant une épreuve sensible de recherche de ces protéines sériques, la présente invention permet la détection rapide, non agressive et précise de l'existence d'un cancer.
La présence d'une protéine particulière se liant 15 à l'ADN dans le sérum humain a été mise en évidence parallèlement à la présente invention au cours de travaux de recherche portant sur la dégradation induite par la bléomycine de l'ADN de PM-2 (ADN circulaire fermé par covalence, de bactériophage de Pseudomonas). L'observation de l'inhibition 20 de cette dégradation par le sérum humain.a ouvert la voie à des études sur la nature de l'inhibition et à des tentatives d'identification du composé inhibiteur.
i L’hypothèse de la Demanderesse, selon laquelle l’inhibition de la réaction de dégradation de l'ADN de PM-2 25 est due à une protéine sérique, a été confirmée lorsqu’un traitement à la pronase a entraîné une baisse de l'activité inhibitrice. Un traitement à l'ADNase I ou à l’ARNase pancréatique n'exerce aucun effet sur l'activité inhibitrice du sérum. Des sérums de chiens et de veaux ne se sont pas 30 montrés inhibiteurs, pas plus que ne l'ont été l'albumine et les immunoglobulines humaines.
La protéine inhibitrice a été purifiée dans des conditions non dénaturantes par l'utilisation de filtres moléculaires, par dialyse et par chromatographie sur colonne 35 de "Sephadex". La purification de la protéine a été considérablement améliorée par la liaison de la protéine à l’ADN, l'isolement du complexe ADN-protéine de la protéine non liée puis la dissociation de la protéine de l'ADN par traitement à 3 < - l'urée. La purification par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide et par précipitation au point iso-électrique est considérée comme donnant un degré de pureté plus de 2000 fois supérieur. L'électrophorèse sur gel avec précipi-5 tation iso-électrique indique que l'inhibiteur est une protéine dont le poids moléculaire s'approche de 64 000 daltons et dont le pi est égal à 5,9* Cette protéine a été provisoirement appelée protéine inhibitrice X dans le présent mémoire.
10 La protéine inhibitrice X exerce son effet inhibiteur en se liant à l'ADN. La liaison à l'ADN a été mise en évidence par l'électrophorèse sur gel d'agarose, l'isolement du complexe ADN-protéine, l'extinction de la fluorescence et des études du dichroîsme circulaire.
15 Dans l'étude de la nature de la protéine inhi bitrice X, on a découvert le fait très inattendu qu'il existe une différence notable entre le taux de cette protéine dans le sérum de patients atteints de cancer et son taux dans le sérum de patients non cancéreux. A partir de cette découverte 20 importante, on a cherché à établir une méthode sensible et rapide de détection de la présence de la protéine inhibitrice ( X dans du sérum humain.
L'ADN de PM-2 a déjà été utilisé dans une méthode spectrofluorométrique pour déterminer l'activité biochimique 25 de la bléomycine (Cancer Res. 38 ï 3322-3326 (1978)). Le mécanisme d'action de la bléomycine semble être en relation avec son aptitude à dégrader l'ADN, et la décroissance de la liaison du bromure d'éthidium (bromure de 2,7-diamino-IO-éthyl-9-phénylphénanthridinium) à l'ADN de PM-2 induite par 30 la bléomycine, comme déterminé par la spectrométrie de la fluorescence, peut donc être utilisée pour doser l'activité en bléomycine.
Comme indiqué ci-dessus, on a observé que la protéine inhibitrice X agit comme inhibiteur de la dégrada-35 tion de l'ADN de PM-2 sous l'effet de la bléomycine. Pour cette raison, l'épreuve fluorométrique utilisée dans l'art antérieur pour mesurer l'activité de la bléomycine peut aussi être utilisée pour déterminer la concentration de la protéine 1 . 4
S
inhibitrice X dans du sérum humain. Le taux de protéine inhibitrice X peut alors être utilisé pour prédire la probabilité de cancer chez le patient examiné.
La présente invention propose donc une méthode de 5 détection du cancer chez des êtres humains, qui comprend les étapes suivantes ï (a) prélèvement d’un échantillon de sang à un patient examiné pour la recherche du cancer ; 10 (b) détermination de la concentration de la protéine inhibitrice X dans cet échantil lon ; et (c) comparaison de la concentration déterminée dans l’étape (b) avec la concentration en 15 protéine inhibitrice X normale correspondant au sérum de patients non cancéreux, une réduction notable de la concentration en protéine inhibitrice X par rapport à la concentration normale étant un indice de proba-20 bilité de cancer.
La méthode particulière de titrage utilisée dans l’étape (b) pour déterminer la concentration en protéine i inhibitrice X dans le sérum n’est pas déterminante, et l'invention, dans son sens le plus large, réside dans le fait 25 établi que la concentration en protéine inhibitrice X (quel que soit son mode de détermination) peut être utilisée comme moyen de diagnostic pour une grande variété de cancers chez 1’homme.
Une méthode de titrage qui s'est révélée 30 avantageuse est la méthode fluorométrique à l’ADN de PM-2 décrite dans Cancer Res. 38 : 3322-3326 (1976). L’utilisation de cette méthode est basée sur l’effet inhibiteur ’ qu'exerce la protéine inhibitrice X sur la dégradation bien connue, induite par la bléomycine, de la réaction de l’ADM de 35 PM-2. Lorsqu’on a recours à cette méthode analytique, il est avantageux d'exprimer la concentration en protéine inhibitrice X par une valeur CI™ définie comme étant la pu concentration en protéine inhibitrice X nécessaire pour 5 inhiber 50 % de la dégradation de 1’ADN de PM-2 induite par la bléomycine. Cette valeur CI^q peut ensuite être comparée à la valeur CI^q normale correspondant au sérum de patients non cancéreux, et une élévation importante de la valeur CI^q par 5 rapport à la valeur normale est l'indice d'un cancer probable.
Des détails sur la méthode de dosage par fluorescence de l'ADN de PM-2 de la protéine inhibitrice X sont donnés ci-dessous : 10 On prépare d'abord un mélange d'un échantillon de sérum (par exemple un échantillon de 50 y£) d'un patient à examiner avec une solution de bléomycine, d'ADN de PM-2 et de 2-mercapto-éthanol dans un tampon à pH 9>5- Normalement, un échantillon de 50 y5, de sérum est mélangé avec 450 y d'une 15 solution renfermant 35 nanomoles de bléomycine, 8,3 micromoles d'ADN de PM-2 et 25 millimoles de 2-mercapto- éthanol dans un tampon au borate de sodium de pH 9,5 (NaCl 0,015 M : borate de sodium 0,05 M).
On fait ensuite incuber le mélange ci-dessus à 20 37°C pendant 30 minutes.
Une solution de bromure d'éthidium dans un tampon de dénaturation de pH 12,1 est ensuite préparée par addition de 0,1 ml d'une solution de bromure d'éthidium (22 yg de bromure d'éthidium par ml de tampon de dénaturation de pH
25 12,1) à 0,9 ml de tampon de dénaturation de pH 12,1. Un tampon convenable de dénaturation est un tampon Na^PO^ 0,09M : EDTA 0,01M î NaCl 0,01M, de pH ajusté à 12,1 par addition de NaOH 0,15M. On ajoute à 1 ml de cette solution de bromure d'éthidium une portion aliquote (par exemple 100 yl) 30 du mélange à base de sérum incubé, préparé comme indiqué ci-dessus.
La fluorescence du mélange de bromure d'éthidium et d'ADN de PM-2 est déterminée au moyen d’un spectrophoto-fluoromètre pour une excitation de 530 nm et une émission de 35 590 nm. Une fluorescence supérieure au fond est due à la liaison du bromure d'éthidium à l'ADN de PM-2, et une variation de fluorescence par rapport à une réaction témoin (identique à l'échantillon à analyser, mais ne renfermant pas * 6 de bléomycine) permet d’exprimer quantitativement le degré de dégradation de l’ADN de PM-2 sous l’influence de la bléomycine. D’après les valeurs de fluorescence, on peut déterminer aisément le pourcentage d’inhibition de la dégra-5 dation de l’ADN de PM-2 due à la présence de la protéine inhibitrice X dans le sérum.
La concentration de la protéine inhibitrice X dans l’échantillon de sérum est ensuite déterminée par la méthode classique de Lowry (réactif phénolique de Polin), 10 comme décrit dans J. Biol. Chem. 193 : 265-275 (1951).
La représentation graphique du pourcentage d’inhibition de la dégradation de l’ADN de PM-2 en fonction du logarithme de la concentration de la protéine inhibitrice X permet de déterminer aisément la valeur CI^q pour 15 l’échantillon particulier de sérum.
Une fois que la valeur CI^q a été calculée pour un patient donné, cette valeur peut être utilisée directement pour prédire la probabilité de cancer chez ce patient. Des études approfondies effectuées sur des patients sains (non 20 cancéreux) et des patients atteints d’une grande variété de tumeurs malignes ont montré que la protéine inhibitrice X se rencontre en quantités notablement plus faibles dans le sérum de patients atteints d’un cancer. Par conséquent, la valeur CI5Q pour des patients cancéreux se montre notablement élevée 25 par rapport à la valeur normale correspondant à des sujets sains. Cette nette différentiation des valeurs CI^q offre une base simple et précise de détection de la présence du cancer et forme l’objet principal de la présente invention.
La valeur CI^q précise obtenue à partir d’échan-30 tillons de sang de patients non cancéreux varie à un certain degré avec le sujet particulier. Chez les patients examinés jusqu’à ce jour, la valeur CI5Q moyenne pour des sujets non cancéreux a été trouvée égale à 90,2 + 11,0 yg/ml (seuil de signification : 0,001). La plus forte valeur de CI^q observée 35 pour un patient sain a été de 120 yg/ml.
Chez des patients cancéreux, les valeurs CI^q obtenues varient avec le type de cancer impliqué, mais dans tous les cas connus jusqu’à présent, la valeur a été «* 7 nettement supérieure à celles qui ont été obtenues pour des « sujets non cancéreux. La valeur CI^q la plus faible connue jusqu’à ce jour pour un patient cancéreux a été de 270 yg/ml. Toutefois, en général, une valeur CI^q supérieure à environ 5 200 indique que le patient a de fortes chances d’être atteint d’une tumeur maligne d’un type ou d'un autre.
La méthode de la présente invention a été utilisée avec succès pour détecter une grande variété de types de cancer et on considère donc qu'elle s’applique d'une 10 manière générale au diagnostic du cancer. Comme exemples particuliers de types de tumeurs détectés, on peut mentionner le cancer du testicule, le lymphome, la leucémie, l’adénocarcinome du sein, l'adénocarcinome des petites et grandes cellules du poumon, l’adénocarcinome du colon et le mélanome, 15 pour n'en citer que quelques-uns. La méthode de l’invention paraît également être spécifique du diagnostic du cancer, étant donné que des patients non cancéreux atteints de diverses sortes de maladies non néoplastiques n’ont pas présenté de valeurs CI^q élevées associées à la présence du 20 cancer.
L’épreuve de fluorescence décrite ci-dessus pour la recherche de la protéine inhibitrice X selon la présente 1 invention est basée sur une propriété intrinsèque dé cette substance, à savoir l’inhibition de la dégradation de l’ADN 25 de PM-2 induite par la bléomycine. Des taux de cette protéine dans le sérum, déterminés par cette méthode, ont été mis en corrélation avec la présence ou l’absence d’une affection maligne dans la présente invention. Le fait de disposer d’une protéine inhibitrice X purifiée permet d'utiliser pour son 30 dosage une diversité d'autres méthodes connues dans le domaine de la biochimie et de la chimie clinique. Parmi ces méthodes, on remarque principalement des méthodes immunologiques telles que l'épreuve radio-immunologique, l'épreuve fluoro-immunologique, l'épreuve immunologique enzymatique 35 (par exemple ELISA), l’épreuve immunologique des spins, l’épreuve immunologique de chimioluminescence, l'épreuve immunologique par polarisation de la fluorescence, l’épreuve néphélométrique, des méthodes de diffusion sur gel et des 8 méthodes classiques telles que l’hémagglutination et la fixation du complément. En outre, d’autres propriétés fonctionnelles de la protéine inhibitrice X peuvent être exploitées pour son dosage dans des liquides biologiques. Des 5 phénomènes catalytiques associés à la molécule peuvent être mesurés dans des épreuves spectrophotométriques ou spec-trofluorométriques cinétiques ou basées sur un point de virage. En outre, une technologie de séparation peut être appliquée au liquide en question, et diverses méthodes de 10 détection peuvent être utilisées pour doser quantitativement la protéine, par exemple des méthodes spectrales ou densitométriques et des méthodes immunologiques. Attendu que les méthodes ci-dessus permettent de déterminer spécifiquement la concentration en protéine inhibitrice X, il s’ensuit que 15 des taux sériques de la protéine déterminés par de telles méthodes sont en corrélation avec la présence ou l’absence d’une affection maligne.
La protéine inhibitrice X a été purifiée conformément aux modes opératoires ci-après.
20 Purification partielle - Mode opératoire A .
On purifie partiellement la protéine inhibitrice X par chromatographie sur colonne de "Sephadex". On charge 1 1 ml de sérum humain sur une colonne de "Sephadex G-75" (88 cm x 2 cm), puis on procède à l’élution dans un tampon au 25 phosphate de sodium (0,07 M, pH 6,8) à un débit de 6 à 8 ml par heure, à la température ambiante. L'inhibiteur est contenu dans les volumes de vides qui sont recueillis, lyophilisés, remis en suspension dans 1 ml d’eau, dialysés vis-à-vis de 20 volumes d’eau pendant 24 heures à 4°C, puis 30 chargés sur une colonne de '»Sephadex G-200" équilibrée dans le même tampon.
L’élution de la colonne de "Sephadex G-200" donne trois pics qui absorbent à 280 nm. Le pic III qui représente 7,7 % de la protéine totale éluée contient la protéine 35 inhibitrice X. Cette fraction est traitée de la manière décrite ci-dessus, puis chargée de nouveau sur une colonne de "Sephadex G-200". L’élution est effectuée avec le tampon au phosphate décrit ci-dessus. On recueille des fractions de 9
3 ml de chaque colonne au moyen d'un collecteur de fractions (Gilson Medical Electronics, Inc., Middleton, Wis.), et on trace les courbes d'élution en mesurant l'absorption à 280 nm au moyen d'un spectrophotomètre. Les concentrations en 5 protéine sont déterminées par la méthode de Lowry. Purification - Mode opératoire B
La purification de la protéine inhibitrice est effectuée par filtration moléculaire au moyen de filtres "Amicon", par dialyse et par chromatographie sur colonne de 10 gel de "Sephadex". Les sérums humains (1 à 5 ml) sont centrifugés dans des tubes filtrants coniques "Amicon" (Amicon, Lexington, Mass.) à 5000 x g pendant 10 minutes à 4°C. La portion retenue qui reste dans le cône du filtre après la centrifugation est remise en suspension dans de 15 l'eau désionisée dont le volume est ajusté au volume initial de sérum. Des portions aliquotes du résidu et du filtrat sont soumises à une épreuve d’activité inhibitrice. Le résidu actif est dialysé dans un tube de cellulose vis-à-vis de 20 volumes d'eau désionisée, à 4°C pendant 24 heures. Le 20 résidu et le dialysat sont lyophilisés et remis en suspension dans de l'eau désionisée. Les résultats des épreuves portant sur les deux fractions montrent que l’activité inhibitrice réside dans la portion retenue. Cette portion (1 ml) est chargée sur une colonne de 60 x 5 cm de "Sephadex G-50" et 25 éluée avec un tampon au phosphate de sodium (0,07 M, pH 6,8) à un débit de 30 ml par heure à 4°C. L’éluat de la colonne (5 ml par tube) est recueilli au moyen d’un collecteur de fractions "Buehler Fractomette Alpha 200" (Searle, Fort Lee, . N.J.). L’absorption à 280 nm de chaque fraction est mesurée 30 avec un spectrophotomètre et les tubes sont rassemblés conformément aux pics d'absorption. Les fractions rassemblées sont lyophilisées, dialysées et l'activité inhibitrice est déterminée par la méthode décrite ci-dessus. La substance "active" contenue dans la fraction de volume de 35 vides est chargée sur des colonnes "Sephadex G-75” et "G-100" et éluée de la même manière que la colonne de "G-50". L'activité inhibitrice est trouvée dans les fractions de volume de vides des deux colonnes. La substance "active" qui 10 a été recueillie dans la fraction de volume de vides de la w colonne Sephadex ’»G-200" est éluée avec un tampon au - phosphate de sodium (0,07 M, pH 6,8) à la température ambiante, à un débit de 6 à 8 ml par heure. Les fractions 5 sont recueillies (3 ml par tube) avec un collecteur de micro-fractions "Gilson” (Gilson, Middleton, Wis.). L'éluat de la colonne est fractionné sur la base du profil d’absorption de 280 nm par rassemblement des tubes au-dessous de chaque pic d'absorption. Chaque fraction est ensuite lyophilisée, 10 dialysée et l’activité inhibitrice est déterminée comme décrit ci-dessus. L’activité inhibitrice est trouvée dans la fraction III. La substance contenue dans la fraction III est chargée à nouveau sur la colonne de Sephadex ”G-200" et éluée dans les mêmes conditions. La fraction III de la colonne 15 Sephadex "G-200’’ contenant la protéine inhibitrice X représente un facteur de purification supérieur à 1000.
La méthode d’analyse par fluorescence de l’ADN de PM-2 pour doser la protéine inhibitrice X est décrite en détail ci-dessous : 20 Détermination de la valeur CI^q pour la protéine inhibitrice X.
La détermination de la valeur CIcn (concentra- t tion de la protéine nécessaire pour inhiber à 50 % la dégradation de l’ADN de PM-2) pour doser la protéine inhibitrice X 25 dans des sérums humains est effectuée en deux étapes : 1. La concentration en protéine dans le sérum est déterminée par la méthode de Lowry.
2. L’utilisation de l’épreuve de fluorescence de l’ADN de PM-2 pour la bléomycine, de manière à obtenir une 30 courbe de réponse à la dose pour l’inhibiteur protéinique du sérum. Les valeurs Cl^g sont déterminées d’après des représentations graphiques logarithmiques en probits de la variation du pourcentage d’inhibition de la dégradation de l’ADN en fonction des concentrations en protéine.
, . ‘ 11 ,· Modes opératoires ; I. Réaction de Lowry * A. Préparation de solutions-mères :
Solution A. Na^CO^ à 2 % dans l’hydroxyde de 5 sodium décinormal.
Solution B. CuS0^.5H20 à 1 % dans l'eau.
Solution C. Tartrate double de sodium et de potassium à 2 % dans l'eau.
Solution D. Réactif phénolique de Folin- 1° Ciocalteau 2N.
B. Préparation de réactifs en solution Réactif en solution 1. Mélanger 1 volume de solution-mère B avec 1 volume de solution-mère C.
15 Réactif en solution 2. Mélanger 50 volumes de solution-mère A avec 1 volume de réactif en solution 1.
Réactif en solution 3. Mélanger 1 volume de solution-mère D avec 1 volume d’eau.
20 C. Réactions 1. Diluer les sérums à 1:10 avec de l’eau.
2. Transférer 10 μΐ des sérums dilués dans un tube à essai en verre de 13 x 100 mm et ajouter 290 μΐ d’eau.
3. Ajouter 1 ml de réactif en solution 2, mélanger correc- 25 tement et laisser incuber à la température ambiante pendant 10 minutes.
4. Ajouter 100 μΐ de réactif en solution 3, agiter correctement et laisser incuber pendant 30 minutes, à la température ambiante..
30 5. Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer l’absorp tion à 750 nm.
6. Déterminer la concentration en protéine d’après la courbe d’étalonnage de la sérum-albumine de boeuf.
D. Courbe d’étalonnage de la sérum-albumine de boeuf (SAB). 35 1. Préparer des dilutions en série de SAB (par exemple 25, 50, 75, 150 pg/ml dans un volume final de 0,3 ml.
2. Conduire les réactions indiquées dans la partie C en partant de l’étape 3 (addition du réactif en solution 2).
, ‘ 12 . 3· Tracer la variation de l’absorption à 750 nm en fonction des concentrations en SAB.
II. Dosage de l’inhibiteur de protéine A. Effectuer des dilutions en série de la protéine 5 sérique, sur la base des concentrations en protéine du sérum déterminées par la réaction de Lowry. Effectuer les dilutions dans un volume constant de tampon . au borate de sodium (0,05 M, pH 9,5).
B. Ajouter les échantillons de protéine sérique (volume de 10 50 μΐ) à 10 μΐ de bléomycine (34,5 nanomoles) contenus dans un tube à essai en verre (13 x 100 mm).
C. Ajouter 390 μΐ de tampon au borate de sodium (0,05 M, pH 9,5) contenant 25 mM de 2-mercapto-éthanol.
D. Ajouter 50 μΐ d’ADN de PM-2 (8,3 x 10"6 M dans du 15 chlorure de sodium 0,15 M).
E. Faire incuber pendant 30 minutes à 37°C.
F. Transférer des portions aliquotes en triple exemplaire (100 μΐ) dans des tubes à essai en verre (13 x 100 mm) contenant 0,9 ml de Na^PO^ (0,09 M, pH 12,1) contenant 20 de l’EDTA 0,01 M et du chlorure de sodium 0,01 M.
Agiter correctement.
G. Ajouter 100 μΐ de bromure d’éthidium (55,7 x 10”^ M) dans le tampon au phosphate trisodique, de pH 12,1. Agiter correctement.
25 H. Témoins : 1. Borate de sodium (0,5 M, pH 9,5) contenant du 2-mercapto-éthanol sans bléomycine ni protéines.
2. Protéine sans bléomycine ni ADN de PM-2.
3. Protéine sans bléomycine.
30 4. Borate de sodium (0,05 H, pH 9,5) contenant un blanc de 2-mercapto-éthanol.
I. Spectrophotofluorométrie (Aminco-Bowman)
Transférer l’échantillon dans une petite cuve de quartz de 1 cm et mesurer la fluorescence pour une excitation 35 de 530 nm et une émission de 590 nm.

Claims (3)

1. Méthode de détection du cancer chez des êtres - humains, caractérisée en ce qu’elle consiste : (a) à prélever un échantillon de sang sur un 5 patient soumis au dépistage du cancer ; (b) à déterminer la concentration en protéine inhibitrice X dans ledit échantillon ; et (e) à comparer la concentration déterminée dans l’étape (b) avec la concentration normale en protéine inhibi-10 trice X associée au sérum de patients non cancéreux, une réduction importante de la concentration en protéine inhibitrice X par rapport à la concentration normale étant l’indice de la probabilité d’un cancer.
2. Méthode de détection du cancer chez des êtres 15 humains, caractérisée en ce qu’elle consiste : (a) à prélever un échantillon de sang sur un patient soumis au dépistage du cancer ; (b) à déterminer dans ledit échantillon la concentration en protéine inhibitrice X nécessaire pour 20 inhiber 50 % de la dégradation de l’ADN de PM-2 induite par la bléomycine j et | (c) à comparer la valeur CI^q déterminée dans l’étape (b) avec la valeur CI^0 normale associée au sérum de patients non cancéreux, une élévation importante de la valeur 25 ClgQ par rapport à la valeur normale étant l’indice de la probabilité d’un cancer.
3- Méthode suivant la revendication 2, caractérisée en ce que la détermination de la valeur CI^0 dans l’étape (b) est effectuée par les étapes suivantes : 30 (1) préparation d’un mélange de l’échantillon sanguin avec une solution de bléomycine, d’ADN de PM-2 et de 2-mercapto-éthanol dans un tampon de pH 9,5 ; (2) incubation du mélange de l’étape (1) pendant 30 minutes à une température de 37°C ; 35 (3) addition d’une portion aliquote du mélange de l’étape (2) à un mélange de bromure d’éthidium dans un tampon de dénaturation de pH 12,1 ; * * 14 . * ’i ' «· (4) détermination de la fluorescence du mélange de bromure d’ethidium et d'ADN de.PM-2 de l’étape (3) avec un =- spectrophotofluoromètre pour une excitation à 530 nm et une émission à 590 nm ; 5 (5) détermination du pourcentage d’inhibition de la dégradation, induite par la bléomycine, de 1’ADN de PM-2 d’après la variation de fluorescence de l’échantillon par rapport à un échantillon témoin ne renfermant pas de bléomycine ; 10 (6) détermination de la concentration en protéine inhibitrice X par la méthode de Lowry ; et (7) détermination, d’après les valeurs obtenues dans les étapes (5) et (6), de la concentration en protéine inhibitrice X nécessaire pour inhiber 50 % de la dégradation, 15 induite par la bléomycine, de 1’ADN de PM-2. !
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