ES2346467T3 - Marcadores neurodegenerativos para la depresion. - Google Patents
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Abstract
Método para detectar la depresión que comprende las etapas de medir la concentración de al menos un producto de degradación del triptófano in vivo seleccionado de entre el grupo consistente en 3-hidroxiquinurenina, ácido quinurénico y quinurenina, en un fluido corporal seleccionado de entre el grupo consistente en sangre total, suero, plasma, orina, saliva y fluido cerebroespinal (CSP), obtenidos de un individuo, y al menos una de las siguientes etapas (a) a (c): (a) determinar la relación neuroprotectora dividiendo el valor de la concentración del ácido quinurénico entre el valor de la concentración de quinurenina en dicho fluido corporal; (b) determinar el índice de neuroprotección dividiendo el valor al cuadrado de la concentración del ácido quinurénico entre el valor de la concentración de quinurenina en dicho fluido corporal; (c) determinar la relación dividiendo el valor de la concentración de 3-hidroxiquinurenina entre el valor de la concentración del ácido quinurénico en dicho fluido corporal; y evaluar la depresión.
Description
Marcadores neurodegenerativos para la
depresión.
La presente invención se refiere a métodos para
detectar la depresión, los cuales comprenden las etapas de medir la
concentración de al menos un producto de la degradación del
triptófano in vivo. Además, la presente invención se refiere
a la utilización de dichos valores como marcadores predictivos para
la detección de la depresión.
La depresión es un trastorno psiquiátrico mayor
con una incidencia global del 12,3%, un 14,1% para las mujeres y un
8,6% para los hombres, en Europa (Copeland JR, Beekman AT, Dewey ME,
Hooijer C, 1999, Depression in Europe. Geographical distribution
among older people, Br. J. Psychiatry; 174:312-321).
En la sociedad y entre los trabajadores existen casos de depresión
no diagnosticada. En América, en cualquier momento, 1 de cada 20
empleados puede sufrir una depresión y, si no se trata, ésta
conduce a una disminución de la productividad y a un aumento de
bajas por enfermedad. Según la National Mental Health Association,
los empleados americanos no trabajan durante tres millones de días
al año debido a depresiones no tratadas, lo cual representa más días
utilizados por los empleados en ello que para otras enfermedades
físicas tales como diabetes, hipertensión sanguínea y artritis
(Burns H, Charleston Regional Business Journal, abril, 2004).
Para resolver estos problemas de depresión no
diagnosticada o subdiagnosticada en la sociedad, se encarga a
enfermeras domiciliarias que realicen entrevistas utilizando un
formato estructurado, tal como el test PRIME-MD o
PDI-29, ambos con el objetivo de evaluar el estado
psicológico de una persona. La sensibilidad al
PRIME-MD es del 41,7% y la especificidad es del
83%, mientras que la prueba PDI-29, que se considera
mejor, alcanza una sensibilidad del 73,6% y una especificidad del
59% (Preville M, Cote G, Boyer R, Hebert R (2004), Detection of
depression and anxiety disorders by home care nurses, Aging Ment.
Health; 8(5):400-409).
Existen diversas teorías al respecto del papel
de los productos neuroquímicos en la depresión. Un grupo de
productos neuroquímicos que reveló ser importante en la
patofisiología de la depresión fue el de las monoaminas, propuesto
a partir de los años 60 (Coppen A, 1969, Defects in monoamine
metabolism and their possible importance in the pathogenesis of
depressive syndrome, Psychiatr. Neural Neurochir; 72(2):
173-180). Además, se descubrió que el triptófano
producía un efecto añadido a los inhibidores de la
monoamina-oxidasa, los antidepresivos (Coppen A y
Noguera R, 1970, L-tryptophan in depression, Lancet;
1(7656):1111). Unos años más tarde, se propuso el papel de
la serotonina (5HT) en la patogénesis de trastornos afectivos
(Coppen A y Wook K, 1982, 5-Hydroxytryptamine in
the pathogenesis of effective disorders, Adv. Biochem.
Psychopharmacol. 34:249-258).
La enfermedad de Alzheimer (AD) es el trastorno
neurodegenerativo más frecuente del cerebro humano. Especialmente
en etapas tempranas del AD, es importante pero difícil diferenciar
entre la depresión acompañada de deterioro cognitivo subjetivo
(denominada pseudodemencia o síndrome de demencia depresiva) y la AD
(Tekin, S. y Cummings, J.L. (2001), Depression in dementia,
Neurologist 7, 252-259). La prevalencia de la
depresión oscila entre el 15 y el 50% en pacientes con AD (Rovner,
B.W., Broadhead, J., Spencer, M., Carson, K., y Folstein, M.F.
(1989), Depression and Alzheimer's disease, Am. J. Psychiatry 146,
350-353; Migliorelli, R., Teson, A., Sabe, L.,
Petracchi, M., Leiguarda, R., y Starkstein, S.E. (1995), Prevalence
and correlates of dysthymia and major depression among patients
with Alzheimer's disease, Am. J. Psychiatry 152,
37-44) y varios autores sugirieron que los síntomas
depresivos forman parte de la fase preclínica del AD (Berger, A.K.,
Fratiglioni, L., Forsell, Y., Winblad, B., y Backman, L. (1999),
The occurence of depressive symptoms in the preclinical phase of AD:
a population-based study, Neurology 53,
1998-2002; Visser, P.J., Verhey, F.R., Ponds, R.W.,
Kester, A., y Jolles, J. (2000), Distinction between preclinical
Alzheimer's disease and depression, J. Am. Geriatr. Soc. 48,
479-484).
La serotonina es un neuroquímico necesario para
el cerebro para conseguir un adecuado estado de ánimo y los
factores de crecimiento cerebrales, y se sintetiza a partir del
triptófano. El triptófano es un aminoácido procedente de los
alimentos y del conjunto de aminoácidos del cuerpo. El triptófano
está parcialmente degradado por una enzima, la
indolamina-2,3-dioxigenasa, que está
presente en los pulmones, glóbulos blancos, placenta y cerebro
(Heyes MP, Satio K, Markey SP, 1992, Human macrophages convert
L-tryptophan into the neuroxin quinolinic acid,
Biochem. J.; 283(3):633-635; Mellor AL y Munn
DH, 1999, Tryptophan catabolism and T-cell
tolerance: immunosuppression by starvation, Immunol. Today;
20(10): 469-473) y parcialmente degradado por
la triptófano-dioxigenasa en el hígado. La vía
catabólica del triptófano o la vía de la quinurenina a través de la
indolamina-2,3-dioxigenasa existen
ambas en la sangre y en el cerebro y un 60% de las quinureninas del
cerebro proceden de la sangre periférica (Gal Em, Sherman AD, 1980,
L-Kynurenine: synthesis and possible regulatory
function in brain, Neurochem Res; 5(3):
223-239).
Cuando el triptófano es degradado a través de la
vía de la quinurenina, el producto siguiente es quinurenina, que es
el primer metabolito del triptófano (Bender DA, 1989, The kynurenine
pathway of tryptophan metabolism: In TW Stone (ed.), Quinolinic
Acid and kynurenines. Boca Raton FL: CRC Press:
3-38). Esta quinurenina se divide de nuevo en dos
vías: (1) ácido quinurénico, neuroprotector y (2)
3-hidroxiquinurenina, neurodegenerativa
(3-HK), ácido hidroxiantranílico y ácido quinolínico
(Chiarugi A, Calvani M, Meli E, Traggiai E, Moroni F, 2001,
Synthesis and release of neurotoxic kynurenine metabolites by human
monocyte derived macrophages, J. Neuroimmunol;
120(1-2):190-198).
Normalmente, la formación de ácido quinolínico es más rápida y el
ácido quinurénico tiene un papel protector contractivo contra el
ácido quinolínico (Perkins MN y Stone TW, 1982, An iontophoretic
investigation of the action of convulsant kynurenines and their
interaction with the endogenous excitant quinolinic acid, Brain
Res.; 247(1):184-187). En base a estas
evidencias, se propuso la hipótesis de que el desequilibrio en las
vías neuroprotectoras neurodegenerativas llevan a una persona a una
estado de depresión crónica (Myint AM y Kim YK, 2003,
Cytokine-serotonin interaction through IDO: a
neurodegeneration hypothesis of depression, Medical Hypothesis;
61(5-6): 519-525).
Además, Wada y col. (Japanese Journal of
Geriatrics, 30(1), enero 1993, pp. 46-53)
describen las concentraciones de múltiples neuroquímicos en el
fluido cerebroespinal lumbar de pacientes con y sin demencia
senil.
También, Amirkhani y col. (Journal of
Chromatography B, 780(2), noviembre 2002, pp.
381-387) describen la cuantificación del
triptófano, de la quinurenina y del ácido quinurénico en plasma
humano mediante una espectrometría de masas en tándem con una
ionización por electropulverización-cromatografía
líquida capilar.
Además, Fevre-Montagne (Presse
Médicale, 14(31), septiembre 1985, pp.
1659-1663) describe la fisiología de la hormona
melatonina de la epífisis.
También, Sjöström (Advances in Biochemical
Psychopharmacology, 11, 1974, pp. 369-375) describe
la utilización de la medida de metabolitos de monoamina ácida en el
fluido cerebroespinal en el diagnóstico de la psicosis
maniaco-depresiva.
Además, Anderson y col. (Journal of Affective
Disorders, 20(3), 1990, pp. 185-192)
describen una disminución de la concentración de triptófano en
plasma en la depresión mayor y su relación con la melancolía y la
pérdida de peso.
Maes y col. encontraron que la quinurenina en
plasma y el cociente entre quinurenina y triptófano eran
notablemente más pronunciados en mujeres cuyas marcas de ansiedad y
depresión habían aumentado notablemente en el puerperio (Maes, M.,
y col., Life Sciences 71 (2002), pp. 1837-1848).
Además, Widner y col. (Journal of Neural
Transmission, 107(3), marzo 2000, pp.
343-353) describe la degradación del triptófano y
la activación inmune en la enfermedad de Alzheimer.
Perret y col. (Revue Médicale de la Suisse
Romande, 120(2), febrero 2000, pp. 153-157)
describen los niveles de triptófano en plasma en la depresión
resistente al tratamiento.
Finalmente, Heyes y col., (Brain: A Journal of
Neurology, 115(5), octubre 1992, pp.
1249-1273) describen el ácido quinolínico y el
metabolismo de la vía de la quinurenina en la enfermedad neurológica
inflamatoria y no inflamatoria.
En la técnica, se ha diagnosticado la depresión
por medio de marcadores proteicos tales como los que se describen
en la WO 02/057790.
Aunque los científicos del campo de la
neurociencia han intentado descubrir los factores etiológicos de la
depresión mayor, no se descubrió ningún factor único y la depresión
se considera como una enfermedad causada por factores tanto
genéticos o congénitos como ambientales, tales como estrés
psicológico y ciertas enfermedades crónicas como el cáncer. Además,
se han investigado los marcadores bioquímicos de diagnóstico, pero
no se ha descubierto ningún biomarcador eficaz.
Por tanto, el problema que subyace en la
presente invención consiste en proporcionar un nuevo método para
detectar la depresión por medio de marcadores bioquímicos de bajo
peso molecular.
La solución al problema técnico anterior se
obtiene de acuerdo con las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
En particular, la presente invención se refiere
a un método para detectar la depresión que comprende la etapa de
medir la concentración de al menos uno de los siguientes productos
de degradación del triptófano in vivo,
3-hidroxiquinurenina, ácido quinurénico y/o
quinurenina, en una muestra de plasma sanguíneo obtenido del
individuo que se está reconociendo y evaluar su condición
psiquiátrica.
La muestra de plasma sanguíneo se puede obtener
por cualquier método conocido en la técnica. En una realización
preferente de la presente invención, se recoge una muestra de sangre
de un paciente pronto por la mañana, en ayunas, en un tubo
heparinizado. El plasma sanguíneo se obtiene centrifugando dicho
tubo heparinizado, lo que resulta en una separación de la fracción
plasmática que forma el sobrenadante. En una realización
especialmente preferente, se congela el plasma, en particular a
-70ºC, antes de medir la concentración de al menos un producto de
degradación del triptófano in vivo. En lugar de plasma
sanguíneo, se puede utilizar en la presente invención cualquier
otra fuente de fluidos corporales, tales como sangre total, suero,
orina, saliva y fluido cerebroespinal (CSF). Estos fluidos
corporales se pueden obtener por medio de métodos conocidos en la
técnica.
En una realización preferente de la presente
invención, el método anterior comprende además la etapa de medir la
concentración de quinurenina en la muestra de plasma sanguíneo.
En otra realización preferente de la presente
invención, el método anterior comprende además la etapa de medir la
concentración de 3-hidroxiquinurenina en la muestra
de plasma sanguíneo.
La medida de la concentración de triptófano y/o
de sus productos de degradación tales como
3-hidroxiquinurenina y/o ácido quinurénico y/o
quinurenina en un fluido corporal, por ejemplo en una muestra de
plasma sanguíneo, se puede llevar a cabo por cualquier método
conocido en la técnica. En una realización preferente de la presente
invención, la medida de la concentración de analitos, especialmente
de los productos de degradación del triptófano, se lleva a cabo
mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución, en una
realización especialmente preferente mediante un detector UV y/o un
detector fluorescente, y/o mediante un inmunoensayo y/o un ensayo de
unión al ligando. En una realización preferente de la presente
invención, los analitos se determinan mediante un ensayo de unión
al ligando, por ejemplo un inmunoensayo basado en anticuerpos o un
ensayo de unión al receptor o un ensayo de unión a la enzima o
versiones competitivas de uno o más de estos ensayos.
En otra realización de la presente invención,
las muestras por ejemplo son sustancialmente desproteinadas (se
eliminan todas las proteínas) antes de medir la concentración de al
menos uno de los siguientes productos de degradación del triptófano
in vivo: 3-hidroxiquinurenina, ácido
quinurénico y/o quinurenina.
Después de medir las concentraciones de ácido
quinurénico y quinurenina en una muestra de sangre, se puede
determinar la relación neuroprotectora dividiendo el valor de la
concentración del ácido quinurénico entre el valor de la
concentración de quinurenina en dicha muestra de plasma sanguíneo
(valor ácido quinurénico/valor quinurenina).
En una realización preferente de la presente
invención, un individuo con depresión se caracteriza por una
relación neuroprotectora en plasma sanguíneo de 0 a 18, en especial
de 3 a 17 y en particular de 6 a 16,3.
Además, después de medir las concentraciones de
ácido quinurénico y quinurenina en una muestra de sangre, se puede
determinar el índice de neuroprotección dividiendo el cuadrado de la
concentración de ácido quinurénico entre la concentración de
quinurenina en dicha muestra de plasma sanguíneo (valor ácido
quinurénico^{2}/valor quinurenina).
En una realización preferente de la presente
invención, un individuo con depresión se caracteriza por un índice
de neuroprotección en plasma sanguíneo de 0 a 700, en especial de
100 a 600 y en particular de 200 a 473.
En otra realización de la presente invención,
después de medir las concentraciones de ácido quinurénico y de
3-hidroxiquinurenina en una muestra de sangre, la
relación ("relación de neurodegeneración") se puede determinar
dividiendo el valor de la concentración de
3-hidroxiquinurenina entre el valor de la
concentración del ácido quinurénico o del triptófano (valor
3-hidroxiquinurenina/valor ácido quinurénico o valor
hidroxiquinurenina/valor triptófano).
En una realización preferente de la presente
invención, la relación determinada por la división de la
concentración de 3-hidroxiquinurenina entre la
concentración del ácido quinurénico aumenta significativamente
cuando se compara con la de individuos sanos.
En otra realización preferente de la presente
invención, un individuo con depresión se caracteriza por una
relación determinada mediante la división del valor de la
concentración de 3-hidroxiquinurenina entre el valor
de la concentración de ácido quinurénico en plasma sanguíneo. Por
ejemplo, si la relación es de aproximadamente dos o más, siempre
que los analitos se den en la misma unidad, se considera una
indicación de depresión. Lo mismo se aplica a la relación
determinada por la división del valor de la concentración de
3-hidroxiquinurenina multiplicado por el factor
1.000 entre el valor de la concentración de triptófano en plasma
sanguíneo; es decir, 3-HK se multiplica por el
factor 1.000, siempre que los analitos se den en la misma unidad
(3-HK x 1.000/TRP).
De acuerdo con la presente invención, se puede
utilizar cualquier fórmula matemática conocida en la técnica que
utilice por ejemplo triptófano,
3-hidroxiquinurenina, quinurenina y ácido
quinurénico como valores de entrada y dé el mismo resultado de
interpretación.
La presente invención se refiere además a un
método para detectar la depresión, el cual comprende la etapa de
combinar al menos dos valores seleccionados de entre el grupo
consistente en concentración de ácido quinurénico, relación
neuroprotectora, relación determinada por la división del valor de
la concentración de 3-hidroxiquinurenina entre el
valor de la concentración de ácido quinurénico y el índice de
neuroprotección de una muestra de plasma sanguíneo con el fin de
mejorar la especificidad y/o sensibilidad de detección de la
depresión.
Los métodos para detectar la depresión que
comprenden la medida de al menos uno de otro(s)
marcador(es) neurodegenerativos, neuroprotectores o
neurotróficos en combinación con la medida de la concentración de al
menos uno de dichos productos de degradación del triptófano in
vivo también forman parte de la presente invención.
Además, la presente invención se refiere a (i)
la utilización de una relación neuroprotectora determinada por la
división entre el valor de la concentración de ácido quinurénico y
el valor de la concentración de quinurenina en una muestra de
plasma sanguíneo como marcador predictivo para la detección de la
depresión y/o (ii) la utilización de una relación determinada por
la división del valor de la concentración de
3-hidroxiquinurenina entre el valor de la
concentración de ácido quinurénico para la detección de la
depresión, y/o (iii) la utilización de un índice de neuroprotección
determinado por la división del valor al cuadrado de la
concentración de ácido quinurénico entre el valor de la
concentración de quinurenina en una muestra de plasma sanguíneo como
marcador predictivo para la detección de la depresión.
La presente invención se refiere asimismo a la
utilización de una combinación de al menos dos valores seleccionados
de entre el grupo consistente en la concentración de ácido
quinurénico, la relación neuroprotectora, la relación determinada
por la división del valor de la concentración de
3-hidroxiquinurenina entre el valor de la
concentración de ácido quinurénico y el índice de neuroprotección
de un plasma sanguíneo como marcadores predictivos para la
detección de la depresión.
La presente invención también se refiere a la
utilización de la combinación de concentración de ácido quinurénico,
la relación neuroprotectora, la relación determinada por la
división del valor de la concentración de
3-hidroxiquinurenina entre el valor de la
concentración de ácido quinurénico, el índice de neuroprotección de
un plasma sanguíneo y/o al menos uno de otro(s)
marcador(es) neuroprotectores, neurodegenerativos o
neurotróficos como marcadores predictivos para la detección de la
depresión.
Los términos "marcador predictivo" o
"marcador biológico" tal como se emplean aquí significan que el
factor utilizado como marcador biológico o predictivo,
preferentemente la concentración de ácido quinurénico en plasma
sanguíneo, la relación neuroprotectora, la relación determinada por
la división del valor de la concentración de
3-hidroxiquinurenina entre el valor de la
concentración de ácido quinurénico, el índice de neuroprotección, o
una combinación de los mismos, es indicativo de si un individuo
padece una depresión.
La presente invención se puede utilizar bajo la
forma de un kit para detectar una condición psiquiátrica que
contiene medios para detectar la concentración de un producto de
degeneración del triptófano en un fluido corporal tal como sangre
total, suero, plasma, orina, saliva y CSF.
En una realización preferente, el kit contiene
medios para detectar la concentración de ácido quinurénico y/o
quinurenina y/o 3-hidroxiquinurenina y/o triptófano
en dicha muestra de plasma sanguíneo.
La presente invención se puede utilizar para
intervenciones terapéuticas que cambien cualquiera de los
biomarcadores mencionados anteriormente.
Las figuras muestran:
Figura 1: frecuencia de las concentraciones de
ácido quinurénico en nanomoles/litro tal como se obtiene en el
Ejemplo 1.
Figura 2: frecuencia de la relación
neuroprotectora (KAKYN) tal como se obtiene en el Ejemplo 1.
Figura 3: frecuencia del índice de
neuroprotección (PROi) tal como se obtiene en el Ejemplo 1.
Figura 4: curva Característica de Operación del
Receptor (ROC) para el ácido quinurénico (KA) tal como se obtiene
en el Ejemplo 1.
Figura 5: curva ROC para la relación
neuroprotectora (KAKYN) tal como se obtiene en el Ejemplo 1.
Figura 6: curva ROC para el índice de
neuroprotección (PROi) tal como se obtiene en el Ejemplo 1.
Figura 7: relaciones entre los niveles en suero
de 3-HK y TRP en pacientes con enfermedad de
Alzheimer (AD), pacientes con depresión mayor (MD) y personas sanas
con deterioro cognitivo subjetivo (SCI). La prueba de
Kruskal-Wallis reveló una diferencia significativa
entre los tres grupos investigados y la prueba de
Mann-Whitney confirmó la diferencia significativa
entre pacientes con AD y los dos grupos de comparación.
La Tabla 1 muestra los resultados del Ejemplo 1
(Género; M = Masculino, F = Femenino; Edad (años); TYR (tirosina en
micromol/litro); VAL (valina en micromol/litro); TRP (triptófano en
micromol/litro); PHE (fenilalanina en micromol/ litro); ILE
(isoleucina en micromol/litro); LEU (leucina en micromol/litro); Kyn
(Quinurenina en micromol/litro); KA (ácido quinurénico en
nanomol/litro); TRPi (índice de triptófano = 100 x triptófano/{TYR +
VAL + PHE + ILE + LEU}); KYN/TRP (índice de degradación del
triptófano = valor de quinurenina/valor de triptófano); KAKYN
(relación neuroprotectora = 1.000 x valor del ácido quinurénico
(micromol/litro)/valor de la quinurenina (micromol/litro)); PROi
(Índice de neuroprotección = 1.000.000 valor del ácido quinurénico
(micromol/litro) x valor del ácido quinurénico
(micromol/litro)/valor de la quinurenina (micromol/litro)).
La Tabla 2 muestra las características del grupo
de pacientes y de los sujetos de control. AD = Pacientes con
enfermedad de Alzheimer; MD = Pacientes con depresión mayor; SCI =
Personas sanas con deterioro cognitivo subjetivo; MMSE = Examen del
Estado Mini-Mental.
La Tabla 3 muestra las fases móviles y las
condiciones de gradiente. Disolvente A: acetato de sodio 50 mM, pH
4,8; disolvente B: acetato de sodio 50 mM, pH 3,56; disolvente C:
acetonitrilo al 100%; disolvente D: metanol al 100%.
La Tabla 4 muestra los niveles en suero de
triptófano (TRP), quinurenina (KYN), ácido quinurénico (KYNA) y
3-hidroxiquinurenina (3-HK) en
pacientes con la enfermedad de Alzheimer (AD), en pacientes con
depresión mayor (MD), y en personas sanas con deterioro cognitivo
subjetivo (SCI). La prueba no-paramétrica de
Kruskal-Wallis se utilizó para buscar las
diferencias entre los tres grupos investigados. Las diferencias
significativas con respecto a los niveles de 3-HK y
la relación 3-HK/TRP fueron confirmadas por la
prueba de Mann-Whitney.
Ahora se ilustra además la presente invención en
los siguientes ejemplos sin que esté limitada por los mismos.
Se reclutó un total de 48 pacientes con
depresión (edad de 44,277 \pm 11,42 años) que no habían sido
tratados con medicamentos anteriormente en el momento de su ingreso
en el servicio psiquiátrico del hospital general. Se reclutaron
como controles un total de 95 personas sanas normales (edad de 31,63
\pm 8,5 años) que acudieron al mismo hospital general para un
chequeo habitual en el mismo período de tiempo. Todos los sujetos
dieron su consentimiento informado.
Todos los pacientes fueron entrevistados por un
psiquiatra cualificado y su diagnóstico fue de depresión mayor
según los criterios DSM-IV (American Psychiatric
Association, 1994, Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders - Fourth Edition (DSM-IV), Am. Psy. Asso.
Washington DC). Se excluyeron todos aquellos pacientes con
comorbidez de otros trastornos psiquiátricos, incluyendo alcoholismo
y otras enfermedades agudas o crónicas. La presencia de otras
enfermedades se comprobó tanto clínica como bioquímicamente.
Se comprobó en todos los controles que no tenían
enfermedades crónicas y agudas de la misma forma que con los
pacientes. La entrevista fue realizada por un psiquiatra cualificado
para confirmar que no tenían trastornos psiquiátricos ni
asociados.
Se recogió un total de 10 ml de muestras de
sangre pronto por la mañana en ayunas en tubos heparinizados y las
muestras de plasma se recogieron y almacenaron a -70ºC para su
análisis en una fecha posterior. Para los pacientes se realizaron
otros muestreos en el momento de la descarga.
Las muestras se analizaron para (1) triptófano
(\mumol/l), (2) aminoácidos competidores: tirosina, valina,
fenilalanina, isoleucina, leucina, taurina, ácido
\alpha-amino-n-butírico
y metionina (\mumol/l), (3) quinurenina (\mumol/l), ácido
hidroxiantranílico (nmol/l) y (4) ácido quirénico (nmol/l), por
Cromatografía Líquida de Alta Resolución utilizando un detector UV
y detectores fluorescentes (Herve C, Beyne P, Jamault h, Delacoux
E, 1996, Determination of tryptophan and its kynurenine pathway
metabolites in human serum by high-performance
liquid chromatography, J. Chromatography B: Biomedical applications;
(675):157-161).
Se calcularon: el índice de triptófano (TRPi),
que representa la disponibilidad de triptófano en la sangre (100 x
valor de triptófano/suma de los valores de los aminoácidos
competidores), el índice de degradación del triptófano (KYN/TRP),
que representa la degradación del triptófano (valor de la
quinurenina/valor del triptófano), la relación neuroprotectora
(KAKYN) (valor del ácido quinurénico/valor de la quinurenina) y el
índice de neuroprotección (PROi) (valor del ácido
quinurénico^{2}/valor de la quinurenina), que representa la
resistencia de la neuroprotección contra el efecto excitotóxico del
ácido quinolínico (Tabla 1).
Se realizó el análisis estadístico por medio de
SPSS, versión 11.0.
- (1)
- A su ingreso, los índices de triptófano en los pacientes fueron significativamente pero no mucho más bajos (p < 0,05) que los controles sanos (9,99 \pm 0,26 frente a 10,88 \pm 0,14).
- (2)
- A su ingreso, los índices de degradación del triptófano en los pacientes fueron significativamente pero no mucho más bajos (p < 0,04) que los controles sanos (0,03 \pm 0,002 frente a 0,05 \pm 0,02).
- (3)
- A su ingreso, el ácido hidroxiantranílico (una etapa antes de la formación del ácido quinolínico en el catabolismo) que indica el efecto tóxico sobre las neuronas no mostró ninguna diferencia (p = 0,1) entre los pacientes (25,265 \pm 2,437) y los controles sanos (25,182 \pm 0,768).
\newpage
- (4)
- A su ingreso, las concentraciones de ácido quinurénico en plasma de los pacientes fueron significativamente y mucho más bajas (p < 0,0001) que en los controles sanos (24,29 \pm 1,18 frente a 35,96 \pm 1,37) (Figura 1).
- (5)
- El análisis de la curva ROC mostró que el valor del ácido quinurénico de 29,3 nmol/l es el punto de corte entre personas deprimidas y personas sanas con una sensibilidad del 80,9% y una especificidad del 75% (Figura 4).
- (6)
- A su ingreso, la relación neuroprotectora en los pacientes fue significativamente y mucho más baja (p < 0,0001) que en los controles sanos (14,08 \pm 0,64 frente a 19,36 \pm 0,61) (Figura 2).
- (7)
- El análisis de la curva ROC mostró que el índice de neuroprotección 16,3 es el punto de corte entre personas deprimidas y personas sanas con una sensibilidad del 75,5% y una especificidad del 65% (Figura 5).
- (8)
- A su ingreso, el índice de neuroprotección en los pacientes fue significativamente más bajo (p < 0,04) que los controles sanos (358,77 \pm 52,93 frente a 757,7 \pm 86,22) (Figura 3).
- (9)
- El análisis de la curva ROC mostró que el índice de neuroprotección 473 es el punto de corte entre personas deprimidas y personas sanas con una sensibilidad del 78,7% y una especificidad del 77,6% (Figura 6).
- (10)
- El análisis univariado demostró que la edad o el género no influía en los tres marcadores anteriores.
El índice de neuroprotección, la relación
neuroprotectora y las concentraciones de ácido quinurénico en plasma
son marcadores biológicos a utilizar para diferenciar entre
personas sanas y personas deprimidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Medición combinada de la quinurenina y del ácido
quinurénico por HPLC con estandarización externa. La quinurenina es
detectada por UV y el ácido quinurénico por su fluorescencia
intensificada en un disolvente de elución que contiene Zn.
Hace falta desproteinar las muestras (suero,
sangre total, plasma).
Se añaden 20 \mul de ácido perclórico a 180
\mul de muestra.
Se deja en reposo durante 10 minutos, luego se
centrifuga durante 5 minutos a 14.000 g. Se trasladan 100 \mul de
sobrenadante a un vial de inyección Gilson, se tapa y se centrifuga
durante 5 minutos a 6.000 g.
- 3.1.
- Bomba de HPLC Gilson 305
- 3.2.
- Autoinyector Gilson 231
- \quad
- Comprobar el depósito del diluidor: 20% ACN/AD
- \quad
- Fichero de programa 1
- \quad
- TIEMPO ANAL. = 4 minutos
- \quad
- NÚMERO DE MUESTRA = número de inyecciones
- \quad
- VOLUMEN DE INYECCIÓN = 40 \mul
- 3.3.
- Detector de fluorescencia Shimadzu 10A(xl)
- \quad
- Excitación: 334 nm
- \quad
- Emisión: 388 nm
- \quad
- SENS: 1
- \quad
- AUMENTO: 3
- 3.4.
- Detector Gilson 117
- \quad
- Longitud de onda: 365 nm
- \quad
- Sensibilidad 1: 0,01
- \quad
- Sensibilidad 2: 0,1
- \quad
- Ancho mín. del pico: 8 segundos
- 3.5.
- Software Gilson Unipoint
- \quad
- Fichero de método: KYNS2.GCT.
- \quad
- Fichero de parada: STOPKA2.GCT
- \quad
- Fichero de análisis: KAS2.GAN y KYNS2.G
Columna: Chromolith Performance 4,6 x 100 mm con
un cartucho de seguridad Chromolith.
Tampón: 250 mM acetato de Zn en AD (27,4 g en
500 ml). El pH se lleva a 5,8 con ácido acético y se elabora a un
volumen de 455 ml con agua en un cilindro medidor. Se añaden 45 ml
de ACN (para gradiente de cromatografía). Se desgasifica el
disolvente por ultrasonicación durante 20 minutos.
5.1. Se prepara el estándar stock de quinurenina
pesando 20 mg de quinurenina (MW 208,2) y disolviendo en agua en un
matraz medidor de 100 ml. El estándar se almacena en partes
alícuotas de 1 ml en tubos Eppendorf a -20ºC.
5.2. Se prepara el estándar stock de ácido
quinurénico pesando 20 mg de ácido quinurénico (MW 189,2) y
disolviendo en EtOH con 1 ml de HCl 12N en un matraz medidor de 100
ml. Se almacena el estándar a -20ºC.
5.3. Estándar de trabajo
Estándares stock de diluto hasta concentraciones
5 \muM para la quinurenina (500 \mul) y 100 nM para el ácido
quinurénico (10,0 \mul) en AD (hasta 100 ml). Estable durante un
día a temperatura ambiente.
Ácido perclórico (2,4M): 7 ml de ácido
perclórico + 13 ml de AD.
Plasma comercial exento de medicamento (TRP,
KYN, KA).
- Preparar disolventes, reactivos, Estándar de
Trabajo descongelado.
- Solución y Plasma de Control.
- Estabilizar la columna
- Comprobar la instalación de redes de
tuberías
- Detector de fluorescencia
- Preparación de muestras
- Adaptar el Archivo de Operación al número de
inyecciones de estándar, muestras y controles.
- Autoinyector del programa - Arrancar
- Parada del sistema
- 9.1.
- Clin Chem 44:4, 858-62 (1992):
KYN: 1,98 | rango (media) 1,86-2,10 \muM | n = 72 |
- 9.2.
- J Chrom B, 675 (1996), 157-61:
KYN: 1,35 | 0,7-3,0 \muM | n = 35 | |
KA. 23 | 6-54 nM |
- 9.3.
- Anal Bioch 172, 518-25 (1988):
KYN: 2,21 | 1,30-3,32 \muM | n = 20M + 20F |
- 9.4.
- Roseneck studie (proyecto 11/01)
KYN: 1,66 | 1,04-2,28 \muM | n = 36 |
\vskip1.000000\baselineskip
Medición simultánea de: Tirosina (TYR), Valina
(VAL), Triptófano (TRY), Fenilalanina (PHE), Isoleucina (ILE),
Leucina (LEU).
Otros aminoácidos que se eluyen: Taurina (TAU),
Ácido
\alpha-amino-n-butírico
(ABA), Etanolamina, Metionina (MET).
Se diluyen 25 \mul de la muestra con 25 \mul
de la solución Estándar Interna (IS) en un matraz de Muestras
Gilson.
- 3.1.
- Sistema 1 Gilson
- 3.2.
- ASTED
Instalar el bucle de inyección de 20 \mul y el
bloque de diálisis. Utilizar la solución Prime para el Diluidor 0 y
la Solución Dializadora para el Diluidor 1. Colocar el Tampón de
Borato en el vial en las posiciones A y B de Rack 50. Colocar el
reactivo de derivatización OPA en la posición C.
- 3.3.
- Detector de fluorescencia Shimadzu RF-A
- \quad
- Excitación: 330
- \quad
- Emisión: 450
- \quad
- SENS: 1
- \quad
- AUMENTO: 2
- 3.4.
- Software Gilson Unipoint
- \quad
- Método de control: AZP
- \quad
- Método de análisis: AZP
Columna: Econospher C18, 3 \mum, 4,7 x 50
mm.
Disolvente A: 57,2 g de
Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O ó 22,69 de Na_{2}HPO_{4}.anh.
Se disuelve en 400 ml de agua con agitación y calentamiento suave.
El pH se lleva a 6,5 con ácido fosfórico y se elabora a un volumen
de 1.840 ml con agua en un cilindro medidor. Se añaden 160 ml de
acetonitrilo para la cromatografía.
Disolvente B: 420 de agua/280 de ACN/320 de MeOH
(todo de Spectrograde). Ambos disolventes se desgasifican por
ultrasonicación durante 20 minutos.
- Se preparan por separado estándares de
aminoácidos pesando 100 mg de cada compuesto y disolviendo en agua
en un matraz medidor de 100 ml.
- Solución Estándar de trabajo: se disuelven 5
ml de los siguientes estándares de aminoácidos individuales en 250
ml de agua en un matraz medidor: TYR, VAL, TRY, PHE, ILE, LEU.
- Comprobar la Solución Estándar: lo mismo que
con la Solución Estándar de Trabajo pero con estos compuestos
adicionales: TAU, ABA, MET. Esta solución no se utiliza para la
estandarización sino para comprobar el cromatograma.
- Ambos estándares se almacenan en partes
alícuotas de 1 ml en tubos Eppendorf a -20ºC.
- Concentraciones reales de la solución de
trabajo (en microM): véase la Tabla de Picos.
6.1. Disolvente Prime (1 semana): se
disuelven 8,6 g de NaCl en 1 l de agua. Se añaden 500 \mul de
Triton X 100. Se mezcla bien y se somete a ultrasonicación durante
10 minutos.
6.2. Solución de diálisis (1 semana):
0,2M KH_{2}PO_{4} con NaN_{3} (una punta de cuchara).
6.3. Solución Stock Estándar Interna: se
disuelven 100 mg de Norvalina en 100 ml de agua. Se almacenan partes
alícuotas de 1,5 ml en tubos Eppendorf a -20ºC (2 años).
6.4. Estándar Interno (IS): Se diluye 1
ml de Solución Stock Estándar Interna con 20 ml de
N_{2}-EDTA 2 g/l de (Kestranal 2S) en un vial de
escintilación (1 mes).
6.5. Tampón borato: se disuelven 3,1 g de
ácido bórico en 400 ml de agua, se lleva a un pH de 9,5 con NaOH
conc. y se diluye hasta 500 ml (1 mes).
6.6. OPA: se disuelven 500 mg de
dialdehído orto-ftálico (OPA) por ultrasonicación
corta en 10 ml de metanol Spectrograde en un matraz Erlenmeyer de
100 ml. Se añaden 90 ml de Tampón Borato y 500 \mul de
mercaptoetanol. Este reactivo es estable durante 1 mes pero, se
añaden cada dos días 50 \mul de mercaptoetanol.
Se almacena un pool de EDTA en tubos Eppendorf a
-20ºC.
- Enjuagar la columna con disolvente B
- ASTED Prime con agua
- Preparar disolventes, reactivos, IS, Solución
Estándar de Trabajo descongelada y Plasma de Control.
- Estabilizar la columna accionando el gradiente
3 veces: primero accionar la bomba 1, bomba 2, (eventualmente las
bombas Prime con la columna desconectada), Qata Master, Diluidores,
ASTED, impresora, pantalla del ordenador, ordenador. Seleccionar el
método AZP2 y accionar tres veces (cliquear "Continuar").
Comprobar el gradiente al menos una vez con y sin la preparación de
muestreo.
- Preparar ASTED para la diálisis (si se cambia
la configuración, primero accionar FILE 181): colocar los reactivos
y disolventes, Prime, accionar File 150 (TIEMPO DE ELUC. = 50).
- Detector de fluorescencia
- Empezar la estabilización de la columna
- Comprobar la instalación de redes de
tuberías
- Programar ASTED para la muestra de
comprobación (Estándar de Trabajo)
- Si la muestra de comprobación no está OK,
intentar remediarlo y volver a empezar. En caso de duda, accionar
Estándar de Control y/o Plasma de Control de Calidad.
- Preparación de muestras
- Adaptar el Programa Gilson al número de
inyecciones de estándar, muestras y controles.
- Programar ASTED
- Poner en marcha
- Parada del sistema
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede detectar KYN por UV y HAA por su
fluorescencia.
En primer lugar se centrifugan muestras (suero,
sangre total con EDTA, plasma con EDTA, plasma heparinizado o
citrado) a 4.000 g para eliminar los particulados. Hace falta
desproteinarlas.
Se añaden 20 \mul de ácido perclórico (6,3) a
180 \mul de muestra.
Se deja en reposo durante 5 minutos, luego se
centrifuga durante 5 minutos a 14.000 g. Después, se trasladan 100
\mul de sobrenadante a un vial de inyección Gilson, se tapa y se
centrifuga durante 5 minutos a 6.000 g.
Sistema de Configuración 2
- 3.1.
- Bomba de HPLC Gilson 305
- 3.2.
- Autoinyector Gilson 234
- \quad
- Comprobar el depósito del diluidor: 20% ACN/AD
- \quad
- Fichero de programa 3
- \quad
- TIEMPO ANAL. = 12 minutos
- \quad
- Número de muestra = número de inyecciones
- \quad
- VOLUMEN DE INYECCIÓN = 45 \mul
- 3.3.
- Detector de fluorescencia Shimadzu 10A(xl)
- \quad
- Excitación: 316 nm
- \quad
- Emisión: 420 nm
- \quad
- SENS: 1
- \quad
- AUMENTO: 3
- 3.4.
- Software Gilson Unipoint
- \quad
- Fichero del método: HAAS2.GCT,
- \quad
- Fichero de parada: STOPSYS2.GCT,
- \quad
- Fichero de análisis: HAAS2.GAN y HAAS2.GAN
Columna: Prevalece seleccionar C18 3\mu 4,6 x
100 mm (Alltech 99302).
Tampón: 20 mM ácido acético (1,2 ml en 900 ml)
se llevan a un pH de 5,8 con KOH y se elaboran a un volumen de
1.000 ml con agua en un cilindro medidor. Se añaden 20 ml de MeOH
(para gradiente de cromatografía). Se desgasifica el disolvente por
ultrasonicación durante 10 minutos.
5.1. Se prepara el estándar stock de ácido
hidroxiantranílico pesando 20 mg de ácido antranílico (MW) y
disolviendo con 40 mM citrato-acetato, pH 4,5, en
un matraz medidor de 100 ml. Se almacena el estándar a -80ºC.
5.2. Estándar de trabajo: diluir los estándares
stock hasta una concentración de 100 nM para el ácido
hidroxiantranílico (10,0 \mul) en AD (hasta 100 ml).
- 6.1.
- Ácido perclórico (2,4 M): 7 ml de ácido perclórico + 13 ml de AD
- 6.2.
- Solución de trabajo estándar interna: 5X dilución de 6,4 en 6,3.
- Preparar los disolventes, reactivos, Solución
Estándar de Trabajo descongelada y Plasma de Control,
- Estabilizar la columna,
- Comprobar la instalación de redes de
tuberías
- Detector de fluorescencia,
- Preparación de las muestras
- Adaptar el Fichero de Operación al número de
inyecciones de estándar, muestras y controles,
- Programar autoinyector - poner en marcha,
- Parada del sistema.
- 8.1.
- J Chrom B, 675 (1996), 157-61: suero
KYN: 1,35 | 0,7-3,0 \muM | n = 35 | |
HAA: 79 | 15-209 nM |
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigaron los niveles en suero de TRP,
KYN, KYNA y 3-HK en 20 pacientes con diagnóstico
clínico de probable enfermedad de Alzheimer (AD), 20 pacientes con
inicio tardío de depresión mayor (MD) y 20 sujetos mayores sanos
con deterioro de la memoria subjetiva (SCI) en los que se había
descartado trastorno neurodegenerativo por reconocimiento médico y
pruebas neuropsicológicas.
Para las características de los sujetos, véase
la Tabla 2. El diagnóstico clínico de probable AD se realiza de
acuerdo con el National Institute of Neurological and Communicative
Diseases and Stroke/Alzheimer's Disease and Related Disorders
Association criteria (McKhann, G., Drachman, D., Folstein, M.,
Katzman, R., Price, D., y Stadlan, E.M. (1984). Clinical diagnosis
of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA
Work Group under the auspices of Department of Health and Human
Services Task Force on Alzheimer's Disease. Neurology 34,
939-944). El diagnóstico de depresión mayor se
realiza de acuerdo con los criterios de ICD-10 y
DSM-IV (American Psychiatric Association (1994).
Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth
Edition Text Revision. (Washington, DC: American Psychiatric
Association)). La duración media de la enfermedad en el grupo de AD
es de 2,20 años (0-5 años). Todos los pacientes con
AD están sin tratamiento antidemencia y no tienen actualmente ningún
tratamiento con NSAIDs (Medicamentos Antiinflamatorios No
Esteroideos). Uno de los pacientes con AD tenía un historial previo
de depresión mayor de remisión-recaída, pero se le
ingresa en el hospital sin ningún síntoma depresivo y sin
medicación antidepresiva. A su ingreso, tres de los pacientes con MD
están en tratamiento con inhibidores selectivos de la recaptación
de la serotina, uno con un antidepresivo tricíclico y uno con una
combinación de antidepresivos; los demás pacientes con MD están sin
medicación con antidepresivos en el momento del muestreo de sangre.
Un sujeto con SCI sufre de un episodio depresivo suave y está bajo
tratamiento con reboxetina, mientras otro sujeto con SCI está
tomando esporádicamente NSAIDs debido a una espondilartritis
anquilosante.
Existe una diferencia de edad significativa
entre los grupos (prueba de Kruskal-Wallis X^{2} =
18,223, p<0,001), género (X^{2} = 6,667, p = 0,036), y
valoración del Examen del Estado Mini-Mental (MMSE)
(X^{2} = 31,944, p<0,001, véase la Tabla 2). Los pacientes con
AD son mayores que los pacientes con MD (prueba de
Mann-Whitney, Z = -2,654, p = 0,008) y los sujetos
con SCI (Z = -3,998, p<0,001) y los pacientes con MD son mayores
que los sujetos con SCI (Z = -2,072, p = 0,038).
Se recogen muestras de suero en contenedores de
vacío sin más aditivos. Después de 0,5 horas de coagulación, se
centrifugan las muestras y se separa el sobrenadante en partes
alícuotas en tubos Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y se
congelan inmediatamente a -80ºC.
Establecimos un método de cromatografía líquida
con gradiente de alta resolución (HPLC) con detección ultravioleta
(UV) y fluorescencia.
Se compran a Merck (Darmstadt, Alemania) los
reactivos para la extracción en fase sólida y la cromatografía en
un grado gradiente de pureza para la cromatografía líquida. El agua
ultra pura es producida por un sistema Millipore
Milli-Q (Millipore, Miford, MS). Se utilizan
cápsulas de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma, St.
Louis, MO) para generar un PBS 0,05M. Se compran triptófano,
quinurenina, ácido quinurénico y
3-hidroxiquinurenina de alta pureza a Sigma (St.
Louis, MO).
Se establecen los calibradores y controles
mediante la adición de concentraciones definidas de analitos a una
solución de PBS 0,05M. Se utilizan las siguientes concentraciones
para la calibración en cinco puntos: TRP: 0,313; 0,625; 1,25; 2,5;
5,0; 10,0; 20,0 \mug/ml; KYN: 12,5; 25,0; 50,0; 100, 200, 400, 800
ng/ml; KYNA: 4,688; 9,375; 18,75; 37,5; 75,0; 150, 300 ng/ml;
3-HK: 1,563; 3,125; 6,25; 12,5; 25,0; 50,0; 100
ng/ml.
Se extraen los analitos de muestras y
calibradores/controles por medio de cartuchos de extracción Waters
Oasis MCX 1 cc (30 mg) como sigue (todas las extracciones se
realizan con un sistema colector al vacío manual): (1) el cartucho
se preacondiciona mediante enjuague con 1 ml de metanol seguido de 1
ml de agua; (2) la muestra de 1 ml y 100 \mul de H_{3}PO_{4}
1M se aplican al cartucho y se llevan bajo ligero vacío (2 minutos);
(3) se lava el cartucho con 1 ml de HCl 0,1M seguido de 1 ml de
metanol 100%; y finalmente, (4) se eluyen los analitos mediante
enjuague del cartucho con 1,5 ml de acetonitrilo que contiene un 6%
de NaOH. Entonces se evapora el eluyente bajo nitrógeno hasta
sequedad y se reconstituye con 150 \mul de PBS 0,1M. La
muestra/calibrador/control reconstituida se traslada entonces a un
vial de microinyección (Waters).
Se llevan a cabo los análisis en un cromatógrafo
Waters 2695 conectado a un detector UV
dual-\lambda Waters Modelo 2487 y un detector de
fluorescencia 2475.
Para la determinación de KYN, KYNA y
3-HK, se cargan 100 \mul de las muestras en una
columna C8, Supersphere 60 RP-Select B de 250 mm x
4 mm (Merck, Darmstadt, Alemania). Debido a la concentración
relativamente más alta, se realiza una segunda inyección con un
volumen de 10 \mul para la determinación de TRP. Con el fin de
asegurar una resolución óptima de los picos en los cromatogramas y,
por lo tanto, una separación eficaz de los analitos en un tiempo
razonablemente corto (30 minutos), se lleva a cabo la elución en el
modo de gradiente utilizando una fase móvil que se compone de una
mezcla de acetato de sodio 0,050M (disolvente A: pH 4,80;
disolvente B: pH 3,65), acetonitrilo (disolvente C) y metanol
(disolvente D) en distintas proporciones (véase la Tabla 3).
El caudal se fija en 0,80 ml/minuto, la
temperatura de columna se establece en 35,0ºC, mientras se enfrían
las muestras a 4,0ºC. Se mide la TRP por detección de fluorescencia
(\lambdaex: 300 nm; \lambdaem: 350 nm), KYN (365 nm), KYNA (330
nm), y 3-HK (365 nm) se miden por detección de UV.
El tiempo de operación aproximada después de la inyección hasta la
detección de los compuestos es de aproximadamente 20,4 minutos para
TRP, 13,4 minutos para KYN, 22,5 minutos para KYNA y 7,0 minutos
para 3-HK.
Se procesan los datos por medio de EMPOWER para
el software Windows 2000 (Waters). Las concentraciones se
establecen por comparación de las alturas de pico de los analitos
solos con las alturas de pico de las curvas de calibración
respectivas.
El análisis estadístico se realiza con SPSS
(Versión 12.0.1.; SPSS, Chicago, Illinois) con procedimientos no
paramétricos (Prueba de Kruskal-Wallis - Correlación
de Rangos de Spearman). El nivel de significancia se establece en p
< 0,050. Para controlar los efectos de la significancia entre
grupos por la diferencia en edad, se utiliza un modelo lineal con
diagnóstico como edad y factor independiente como covariante. Como
las variables de salida no se distribuyen normalmente por inspección
visual de los residuos de la regresión y las pruebas de Kolmogorov
Smirnov (p<0,05), se aplica un análisis de remuestreo
(bootstrapping) a un modelo de regresión múltiple con diagnóstico y
edad como variables predictoras independientes para una prueba de
significancia sin distribución. Específicamente, se calcula
iterativamente el modelo de regresión múltiple para cada par de
diagnóstico en base a 999 muestras. Para evaluar si un marcador que
muestra diferencias significativas entre los grupos con AD y los
grupos de comparación puede resultar útil también como prueba de
diagnóstico potencial, se determina la sensibilidad del marcador
cuando se fija la especificidad en > 80% y la especificidad
cuando se fija la sensibilidad en > 80% utilizando el análisis
ROC. Se elige el nivel del 80% en base a los criterios de consenso
para un biomarcador clínicamente útil en AD (The Ronald and Nancy
Reagan Research Institute of the Alzheimer's Association and the
National Institute on Aging Working Group (1998), Consensus report
of the Working Group on: "Molecular and Biochemical Markers of
Alzheimer's Disease". The Ronald and Nancy Reagan Research
Institute of the Alzheimer's Association and the National Institute
on Aging Working Group. Neurobiol. Aging 19,
109-116).
Se muestran en la Tabla 4 los niveles medios de
triptófano en suero (TRP), quinurenina (KYN), ácido quinurénico
(KYNA) y 3-hidroxiquinurenina (3-HK)
en pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD), pacientes con
depresión mayor (MD) y personas sanas con deterioro cognitivo
subjetivo (SCI). Existe una diferencia no significativa de niveles
de TRP entre los tres grupos (Kruskal-Wallis:
X^{2} = 5,507; p = 0,064) con los pacientes con AD que muestran
niveles de TRP más bajos que con las personas de control sanas
(Mann-Whitney Z = -2,288; p = 0,022). Los niveles
de KYR en suero (X^{2} = 1,536; p = 0,464) y de KYNA (X^{2} =
0,033; p = 0,984) no son diferentes entre los grupos. En cambio,
los niveles de 3-HK son significativamente
diferentes entre los tres grupos (X^{2} = 20,281; p<0,0001),
con niveles de 3-HK en suero más altos en los
pacientes con AD en comparación con los pacientes de depresión
mayor (Z = 3,571; p<0,001) y los controles con SCI (Z = -4,139;
p<0,0001). Por contraste, los niveles de 3-HK en
suero no difieren entre los pacientes con MD y los controles con
SCI (Z = -0,541; p = 0,602). Como la disponibilidad del aminoácido
esencial TRP es un factor limitativo para la producción de sus
metabolitos, se calcula también la relación entre los niveles de
3-HK y TRP. De nuevo, existe un diferencia muy
significativa entre los grupos (X^{2} = 21,911; p<0,0001) con
una relación media más alta (3-HK/TRP) en los
pacientes con AD que en los pacientes con MD (Z = -3,517;
p<0,001) y los controles sanos (Z = -4,436; p<0,0001), pero
sin diferencia entre los dos grupos de comparación (Z = -0,757; p =
0,449). En consecuencia, la relación entre el 3-HK
neurotóxico y el KYNA neuroprotector aumenta significativamente en
los pacientes con AD (X^{2} = 18,016, p = 0,0001; AD frente a MD:
Z = -3,219, p = 0,001; AD frente a SCI: Z = -4,003, p = 0,00002; MD
frente a SCI: Z = -0,649, p = 0,529).
Cuando las diferencias significativas entre
grupos en 3-HK y 3-HK/TRP se
controlan en cuanto a la edad utilizando el análisis de remuestreo
(bootstrapping) para la determinación de la distribución de
muestreo, los niveles de 3-HK son
significativamente diferentes entre los pacientes con AD y los
controles con SCI (coeficiente de correlación parcial -0,42,
p<0,05) y entre los pacientes con AD y con MD (coeficiente de
correlación parcial -0,35, p<0,05). La relación
entre3-HK y TRP es significativamente diferente
entre los pacientes con AD y los controles con SCI (coeficiente de
correlación parcial -0,47, p<0,05), pero no entre los pacientes
con AD y con MD (coeficiente de correlación parcial -0,2).
Por medio del análisis de ROC del grupo con AD
comparado con el grupo de MD combinado con SCI, para
3-HK la sensibilidad es del 75% cuando la
especificidad se establece en un 85%, y la especificidad es del 70%
cuando la sensibilidad se fija en un 90%. Para la relación entre
3-HK y TRP, la sensibilidad es del 80% cuando la
especificidad se fija en un 82,5%, y la especificidad es del 77,5%
cuando la sensibilidad se establece en un 85%.
TABLA 1
(1/8)
TABLA 1
(2/8)
TABLA 1
(3/8)
TABLA 1
(4/8)
TABLA 1
(5/8)
Claims (9)
1. Método para detectar la depresión que
comprende las etapas de medir la concentración de al menos un
producto de degradación del triptófano in vivo seleccionado
de entre el grupo consistente en
3-hidroxiquinurenina, ácido quinurénico y
quinurenina, en un fluido corporal seleccionado de entre el grupo
consistente en sangre total, suero, plasma, orina, saliva y fluido
cerebroespinal (CSP), obtenidos de un individuo, y al menos una de
las siguientes etapas (a) a (c):
(a) determinar la relación neuroprotectora
dividiendo el valor de la concentración del ácido quinurénico entre
el valor de la concentración de quinurenina en dicho fluido
corporal;
(b) determinar el índice de neuroprotección
dividiendo el valor al cuadrado de la concentración del ácido
quinurénico entre el valor de la concentración de quinurenina en
dicho fluido corporal;
(c) determinar la relación dividiendo el valor
de la concentración de 3-hidroxiquinurenina entre el
valor de la concentración del ácido quinurénico en dicho fluido
corporal;
y evaluar la depresión.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque un individuo que tiene una depresión se
caracteriza por una relación neuroprotectora en el fluido
corporal de 0 a 18.
3. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque un individuo que tiene una depresión se
caracteriza por un índice de neuroprotección de 0 a 700.
4. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque un individuo que tiene una depresión se
caracteriza por una relación determinada en la etapa (c) que
es de dos o superior.
5. Método para detectar la depresión que
comprende la etapa de combinar al menos dos valores seleccionados
de entre el grupo consistente en la concentración de ácido
quinurénico, la relación neuroprotectora, la relación determinada
por la división del valor de la concentración de
3-hidroxiquinurenina entre el valor de la
concentración de ácido quinurénico en un fluido corporal, y el
índice de neuroprotección de un fluido corporal.
6. Utilización de una relación neuroprotectora
determinada por la división del valor de la concentración de ácido
quinurénico entre el valor de la concentración de quinurenina en un
fluido corporal como marcador predictivo para la detección de la
depresión.
7. Utilización de un índice de neuroprotección
determinado por la división del valor de la concentración de ácido
quinurénico al cuadrado entre el valor de la concentración de
quinurenina en un fluido corporal como marcador predictivo para la
detección de la depresión.
8. Utilización de una relación determinada por
la división del valor de la concentración de
3-hidroxiquinurenina entre el valor de la
concentración de ácido quinurénico en un fluido corporal como
marcador predictivo para la detección de la depresión.
9. Utilización de una combinación de al menos
dos valores seleccionados de entre el grupo consistente en la
concentración de ácido quinurénico, la relación neuroprotectora, la
relación determinada por la división del valor de la concentración
de 3-hidroxiquinurenina entre el valor de la
concentración de ácido quinurénico y el índice de neuroprotección
de un fluido corporal como marcadores predictivos para la detección
de la depresión.
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