PT2146209E - Marcadores neurodegenerativos para a doença de alzheimer - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MARCADORES NEURODEGENERATIVOS PARA A DOENÇA DE ALZHEIMER" A presente invenção refere-se a métodos para detecção da doença de Alzheimer compreendendo o passo de medição da concentração de 3-hidroxiquinurenina. Além disso, a presente invenção refere-se à utilização do referido valor como marcadores prognósticos para a detecção da doença de Alzheimer. A depressão é uma das principais doenças psiquiátricas com uma incidência global de 12,3%, com 14,1% para mulheres e 8,6% para homens na Europa (Copeland J. R., Beekman A. T., Dewey M. E., Hooijer C., 1999, Depression in Europe. Geographical distribution among older people. Br. J. Psychiatry, 174:312 321). Na comunidade e entre trabalhadores, há casos de depressão não diagnosticada. Na América, em qualquer momento, 1 em 20 trabalhadores pode sofrer de depressão e se for deixada por tratar, a depressão leva a um decréscimo da produtividade e um aumento dos dias de baixa. De acordo com a National Mental Health Association, os trabalhadores americanos faltaram ao trabalho cerca de três milhões de dias anualmente devido a depressão não tratada e isso é mais do que os trabalhadores utilizaram para outras doenças físicas, tais como diabetes, hipertensão e artrite (Burns H., Charleston Regional Business Journal, Abril de 2004).

Para resolver os problemas com a depressão não diagnosticada ou sub-diagnosticada na comunidade, enfermeiros de cuidados domiciliários foram encarregados de realizar 1 entrevistas utilizando um formato estruturado, tais como o teste PRIME-MD ou o teste PDI-29, os quais são efectuados para avaliar o estado psicológico de uma pessoa. A sensibilidade do PRIME-MD é de 41,7% e a especificidade é de 83% enquanto que o teste PDI-29 que é considerado como um teste melhor atinge a sensibilidade de 73,6% e a especificidade é de 59% (Preville M., Cote G., Boyer R., Hebert R. (2004). Detection of depression and anxiety disorders by home care nurses. Aging Ment. Health; 8(5): 400-409) . Há teorias relativas aos papéis de neuroquímicos na depressão. O grupo de neuroquímicos que se verificou ser importante na patofisiologia da depressão foi a monoamina e foi proposta desde os anos 60 (Coppen A., 1969, Defects in monoamine metabolism and their possible importance in the pathogenesis of depressive syndrome. Psychiatr. Neural Neurochir; 72(2): 173-180). Além disso, verificou-se que o triptofano potenciava o efeito de inibidores de monoamina oxidase, os antidepressivos (Coppen A. e Noguera R., 1970, L-tryptophane in depression. Lancet; 1(7656):1111). Alguns anos mais tarde, foi proposto o papel da serotonina (5HT) na patogénese de doenças afectivas (Coppen A. e Wook K., 1982, 5-Hydroxytryptamine in the pathogenesis of affective disorders. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 34: 249-258). A doença de Alzheimer (AD) é a doença neurodegenerativa mais frequente do cérebro humano. Especialmente em fases precoces da AD, é importante, mas difícil, diferenciar entre depressão acompanhada por diminuição cognitiva subjectiva (a chamada pseudodemência ou síndrome demencial da depressão) e AD (Tekin, S. e Cummings, J. L. (2001). Depression in dementia. Neurologist 7, 252-259). A prevalência de depressão varia entre 2 15 e 50% em doentes com AD (Rovner, B. W., Broadhead, J., Spencer, M., Carson, K. e Folstein, M. F. (1989). Depression and Alzheimer's disease. Am. J. Psychiatry 146, 350-353; Migliorelli, R., Teson, A., Sabe, L., Petracchi M., Leiguarda R. e Starkstein, S. E. (1995). Prevalence and correlates of dysthymia and major depression among patients with Alzheimer's disease. Am. J. Psychiatry 152, 37-44) e vários autores sugeriram que os sintomas depressivos são parte da fase preclinica da AD (Berger, A.-K., Fratiglioni, L., Forsell, Y., Winblad, B. e Backman, L. (1999) . The occurrence of depressive symptoms in the preclinical phase of AD: a population-based study. Neurology 53, 1998-2002; Visser, P. J., Verhey, F. R., Ponds, R. W., Kester, A. e Jolles, J. (2000). Distinction between preclinical Alzheimer's disease and depression. J. Am. Geriatr. Soc. 48, 479-484) . A serotonina é um neuroquimico que é necessário ao cérebro para o bom humor e aos factores de crescimento do cérebro e que é sintetizada a partir de triptofano. O triptofano é um aminoácido proveniente dos alimentos e da reserva de aminoácidos do organismo. O triptofano é parcialmente degradado por uma enzima, indoleamina 2,3-dioxigenase, que está presente nos pulmões, leucócitos, placenta e cérebro (Heyes Μ. P., Satio K., Markey S. P., 1992, Human macrophages convert L-tryptophan into the neurotoxin quinolinic acid. Biochem. J., 283(3):633-635; Mellor A. L. e Munn D. H., 1999, Tryptophan catabolism and T-cell tolerance: immunosuppression by starvation. Immunol. Today, 20(10):469-473) e parcialmente degradado pela triptofano dioxigenase no fígado. A via catabólica do triptofano ou via da quinurenina através da indoleamina-2,3-digoxigenase existe tanto no sangue como no cérebro e 6 0% das quinureninas do cérebro provêm do sangue periférico (Gal E. M., Sherman A. D., 1980, 3 L-Kynurenine: synthesis and possible regulatory function in brain. Neurochem. Res., 5(3): 223-239).

Quando o triptofano é degradado através da via da quinurenina, o produto seguinte é a quinurenina que é o primeiro metabolito do triptofano (Bender D. A., 1989, The kynurenine pathway of tryptophan metabolism: In T. W. Stone (ed.) Quinolinic acid and kynurenines. Boca Raton FL: CRC Press: 3-38). Esta quinurenina é novamente degradada em duas vias: (1) neuroprotectora, do ácido quinurénico e (2) neurodegenerativa da 3-hidroxiquinurenina (3-HK), ácido hidroxi-antranílico e ácido quinolínico (Chiarugi A., Calvani M., Meli E., Traggiai E., Moroni F., 2001, Synthesis and release of neurotoxic kynurenine metabolites by human monocyte derived macrophages. J. Neuroimmunol., 120(1-2):190-198). Normalmente, a formação de ácido quinolínico é mais rápida e o ácido quinurénico tem um papel protector contraproducente contra o ácido quinolínico (Perkins MN e Stone TW, 1982, An iontophoretic investigation of the action of convulsant kynurenins and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Res., 247(1) :184-187) . Com base nas provas acima referidas, foi proposta uma hipótese de que o desequilíbrio nas vias neurodegenerativa e neuroprotectora leva uma pessoa a um estado de depressão crónico (Myint A. M. e Kim Y. K., 2003, Cytokine-serotonine interaction through IDO: neurodegeneration hypothesis of depression. Medicai Hypothesis, 61(5-6):519-525).

Embora os cientistas na área da neurociência tentassem encontrar o factor etiológico da depressão major, não foi encontrado um só factor e a depressão é considerada como uma doença causada por factores genéticos ou congénitos e ambientais, tais como stress psicológico e certas doenças 4 crónicas como o cancro. Além disso, foram pesquisados marcadores diagnósticos bioquímicos mas não foi encontrado nenhum biomarcador eficiente.

Neste contexto, Wada et al., [Concentrations of multiple neurochemicals in the cerebrospinal fluid of patients with senile dementia and the relationship to alpha 1-antichymotrysin], Japanese Journal of Geriatrics, 30(1), 1993, p. 46-53) descrevem as concentrações de vários neuroquímicos no fluido cerebroespinal lombar de doentes que sofrem de demência senil, bem como a sua relação com os níveis de alfa 1-antiquimiotripsina. Além disso, Amirkhani et al., Quantitation of tryptophan, kynurenine and kynurenic acid in human plasma by capillary liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography B, 780(2), 2002, p. 381-387) descrevem a quantificação de triptofano, quinurenina e ácido quinurénico para a avaliação de doenças neurológicas. Além disso, Zhou et al., (Zhou, J.-N. et al. , Early neuropathological Alzheimer's changes in aged individuais are accompanied by decreased cerebrospinal fluid melatonin leveis, Journal of Pineal Research, 35(2), 2003, p. 125-130) descrevem uma correlação entre os níveis de melatonina no fluido cerebroespinal e a ocorrência de doença de Alzheimer. Além disso, Widner et al., (Widner, B. et al., Tryptophan degradation and immune activation in Alzheimer's disease, Journal of Neural Transmission, 107(3), p. 343-353) descrevem uma correlação entre activação imune, degradação de triptofano e a ocorrência de doença de Alzheimer. Além disso, Heyes et al., (Heyes, Μ. P. et al., Quinolinic Acid and Kynurenine Pathway Metabolism in Inflammatory and Non-inflammatory Neurological Disease, Brain, 115(5), 1992, p. 1249-1273) descrevem o comportamento metabólico do ácido quinolínico e as vias da quinurenina em várias doenças 5 neurológicas. Finalmente, o documento EP 1050758 AI descreve um método para diagnóstico de uma doença neurodegenerativa ou neuropsiquiátrica compreendendo a determinação dos niveis de neurotrofina-3.

Assim, o problema subjacente à presente invenção é proporcionar um novo método para a detecção da doença de Alzheimer utilizando marcadores bioquímicos de baixo peso molecular. A solução para o problema técnico acima referido é conseguida pelas formas de realização caracterizadas nas reivindicações.

Em particular, a presente invenção refere-se a um método para detecção da doença de Alzheimer compreendendo o passo de medir a concentração de 3-hidroxiquinurenina numa amostra de plasma sanguíneo obtida do indivíduo que está a ser examinado e avaliação da doença de Alzheimer. O termo "produto de degradação do triptofano" como aqui utilizado também inclui triptofano. A amostra de plasma sanguíneo pode ser obtida por qualquer método conhecido na técnica. Numa forma de realização preferida da presente invenção é recolhida de manhã cedo uma amostra de sangue de um doente, num tubo heparinizado após jejum de um dia para o outro. A amostra de plasma sanguíneo é obtida por centrifugação do referido tubo heparinizado que resulta na separação da fracção do plasma sanguíneo que forma o sobrenadante. Numa forma de realização mais preferida, o plasma sanguíneo é congelado, de um modo muito preferido, a -70 °C, antes de se medir a concentração de, pelo menos, um produto de degradação in vivo do triptofano. 6

Em vez de plasma sanguíneo, também podem ser utilizadas na presente invenção quaisquer outras fontes de fluidos corporais, tais como sangue total, soro e urina. Estes fluidos corporais podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica. A medição da concentração de triptofano e/ou 3-hidroxiquinurenina num fluido corporal, tal como uma amostra de plasma sanguíneo, pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica. Numa forma de realização preferida, a medição da concentração dos analitos, especialmente os produtos de degradação de triptofano, é realizada utilizando a Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho, numa forma de realização mais preferida, utilizando um detector UV e/ou um detector de fluorescência e/ou um imunoensaio e/ou um ensaio de ligação de um ligando. Numa forma de realização preferida, os analitos são determinados por um ensaio de ligação de um ligando, por exemplo, um imunoensaio baseado em anticorpos ou um ensaio de ligação a receptores ou um imunoensaio baseado na ligação a enzimas ou versões competitivas de um ou mais desses ensaios.

Noutra forma de realização da presente invenção, as amostras são, por exemplo, substancialmente desproteinizadas (são retiradas todas as proteínas) antes da medição da concentração de 3-hidroxiquinurenina.

Noutra forma de realização da presente invenção, depois de determinada a concentração de 3-hidroxiquinurenina numa amostra de sangue, a razão ("razão neurodegenerativa") pode ser determinada dividindo o valor da concentração de 3-hidroxiquinurenina pelo valor da concentração de triptofano (valor de 3-hidroxiquinurenina/valor de triptofano). 7

Noutra forma de realização preferida da presente invenção, um indivíduo que tem doença de Alzheimer é caracterizado por uma razão determinada por divisão do valor da concentração de 3-hidroxiquinurenina pelo valor da concentração de triptofano na amostra de plasma sanguíneo. Por exemplo, se a razão for cerca de dois ou superior, desde que os analitos sejam expressos na mesma unidade, isto é considerado como uma indicação de doença de Alzheimer. 0 mesmo aplica-se à razão determinada dividindo o valor da concentração de 3-hidroxiquinurenina multiplicado pelo factor 1000 pelo valor da concentração de triptofano no plasma sanguíneo; i. e., 3-HK é multiplicado pelo factor 1000, desde que os analitos estejam expressos na mesma unidade (3-HK x 1000/TRP).

Qualquer fórmula matemática conhecida na técnica que utilize, e. g. , triptofano e 3-hidroxiquinurenina como valores de entrada e dê o mesmo resultado de interpretação pode ser utilizada de acordo com a presente invenção.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se à utilização da razão determinada por divisão do valor da concentração de 3-hidroxiquinurenina pelo valor da concentração de triptofano numa amostra de plasma sanguíneo como um marcador prognóstico para a detecção da doença de Alzheimer.

Os termos "marcador prognóstico" ou "marcador biológico" como aqui utilizados significam que o factor utilizado como um marcador biológico ou prognóstico, de um modo preferido a razão determinada por divisão do valor da concentração de 3-hidroxiquinurenina pelo valor da concentração de triptofano é indicador em relação à questão de se um indivíduo tem doença de 8

Alzheimer ou não.

As figuras mostram: A Figura 1 mostra a frequência das concentrações de ácido quinurénico em nanomole/litro obtida como no Exemplo 1. A Figura 2 mostra a frequência da razão neuroprotectora (KAKYN) obtida como no Exemplo 1. A Figura 3 mostra a frequência do índice neuroprotector (PROi) obtido como no Exemplo 1. A Figura 4 mostra uma curva característica de Operação de Recepção ROC para o ácido quinurénico (KA) obtida como no Exemplo 1. A Figura 5 mostra a curva ROC para a razão neuroprotectora (KAKYN) obtida como no Exemplo 1. A Figura 6 mostra a curva ROC para o índice neuroprotector (PROi) obtida como no Exemplo 1. A Figura 7 mostra razões entre níveis séricos de 3-HK e TRP em doentes com doença de Alzheimer (AD), doentes com depressão major (MD) e pessoas saudáveis com diminuição cognitiva subjectiva (SCI). 0 teste de Kruskal-Wallis mostrou uma diferença significativa entre os três grupos investigados, e o teste de Mann-Whitney confirmou uma diferença significativa entre doentes com AD e os dois grupos de comparação. A Tabela 1 mostra os resultados do Exemplo 1 (Género; 9 Μ = masculino, F = feminino; Idade (anos); TYR (tirosina em micromole/litro); VAL (valina em micromole/litro) ; TRP (triptofano em micromole/litro); PHE (fenilalanina em micromole/litro); ILE (isoleucina em micromole/litro); LEU (leucina em micromole/litro); Kyn (Quinurenina em micromole/litro); KA (Ácido quinurénico em nanomole/litro); TRPi (índice de triptofano = 100 x triptofano/{TYR + VAL + PHE + ILE + LEU}); KYN/TRP (índice de degradação do triptofano = valor da quinurenina valor/valor do triptofano); KAKYN (Razão neuroprotectora = 1000 x Valor do ácido quinurénico (micromole/litro)/Valor da quinurenina (micromole/litro)); PROi (índice neuroprotector = 1000000 valor do ácido quinurénico (micromole/litro) x valor do ácido quinurénico (micromole/litro)/valor da quinurenina (micromole/litro))) A Tabela 2 mostra características dos grupos de doentes e indivíduos de controlo. AD = Doentes com doença de Alzheimer; MD = Doentes com depressão major; SCI: Pessoas saudáveis com diminuição cognitiva subjectiva; MMSE = Mini-Exame Cognitivo Mental. A Tabela 3 mostra fases móveis e condições de gradiente. Solvente A: acetato de sódio 50 mM, pH 4,8; solvente B: acetato de sódio 50 mM, pH 3,56; solvente C: 100% de acetonitrilo; solvente D: 100% de metanol. A Tabela 4 mostra níveis séricos de triptofano (TRP), quinurenina (KYN), ácido quinurénico (KYNA) e 3-hidroxiquinurenina (3-HK) em doentes com doença de Alzheimer (AD) , doentes com depressão major (MD) e pessoas saudáveis com diminuição cognitiva subjectiva (SCI). Foi utilizado um teste de Kruskal-Wallis não paramétrico para testar diferenças entre os 10 três grupos investigados. As diferenças significativas relativas aos níveis de 3-HK e à razão 3-HK/TRP foram confirmadas pelo teste de Mann-Whitney. A presente invenção vai agora ser adicionalmente ilustrada nos exemplos seguintes sem ficar a eles limitada.

Exemplos

Exemplo 1 de Referência: Determinação do índice neuroprotector,_razão_neuroprotectora_e_concentrações plasmáticas de quinurenina em plasma sanguíneo humano

Indivíduos

Foi recrutado um total de 48 doentes deprimidos (idade de 44,277 ± 11,42 anos) que não tinham tomado fármacos no momento da admissão no departamento psiquiátrico do hospital geral. Foi recrutado como controlo um total de 95 pessoas saudáveis normais (idade de 31,63 ± 8,5 anos) que vieram ao mesmo hospital geral para inspecções regulares durante o mesmo período de tempo. Obteve-se consentimento informado de todos os indivíduos.

Todos os doentes foram entrevistados por um psiquiatra qualificado e foi-lhes diagnosticada depressão major de acordo com os critérios do DSM-IV (American Psychiatric Association, 1994, Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders -Quarta Edição (DSM IV) . Am. Psy. Asso. Washington DC) . Foram excluídos todos os doentes com co-morbidade de outras doenças psiquiátricas, incluindo alcoolismo e outras doenças agudas ou crónicas. A presença de outras doenças foi verificada 11 clinicamente e bioquimicamente.

Todos os controlos foram verificados quanto a estarem isentos de doenças agudas e crónicas da mesma forma que os doentes. A entrevista foi feita por um psiquiatra qualificado para confirmar se estavam isentos de doenças psiquiátricas e relacionadas.

Recolha de amostras

Um total de 10 mL de amostras de sangue após jejum de um dia para o outro foi colhido de manhã cedo em tubos heparinizados e as amostras de plasma foram recolhidas e armazenadas a -70 °C para análise em data posterior. Para os doentes, foram feitas outras amostragens no momento da alta.

Análise das amostras e dos dados

As amostras foram analisadas quanto a (1) triptofano (μιηοΙ/L) , (2) aminoácidos competitivos: tirosina, valina, fenilalanina, isoleucina, leucina, taurina, ácido a-amino-n-butírico e metionina (μπιοΙ/L) , (3) quinurenina (μπιοΙ/L) , ácido hidroxi-antranilico (nmol/L) e (4) ácido quirénico (nmol/L), utilizando Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho utilizando um detector de UV e detectores de fluorescência (Herve C., Beyne P., Jamault H., Delacoux E., 1996,

Determination of tryptophan and its kynurenine pathway metabolites in human serum by high-performance liquid chromatography. J. Chromatography B: Biomedical applications; (675):157-161). 12

Foram calculados o índice de triptofano (TRPi) que representa a disponibilidade de triptofano no sangue (100 x valor do triptofano/soma dos valores dos aminoácidos competitivos), índice de degradação do triptofano (KYN/TRP) que representa a degradação do triptofano (valor da quinurenina/valor do triptofano) e a razão neuroprotectora (KAKYN) (valor de ácido quinurénico/valor de quinurenina) e , 2 índice neuroprotector (PROi) (valor do ácido quinurénico /valor da quinurenina) que representa a força da neuroprotecção contra o efeito excitotóxico quinolínico (Tabela 1). A análise estatística foi feita utilizando o SPSS versão 11.0.

Resultados (1) Ao serem admitidos, os índice do triptofano nos doentes eram significativamente mas não fortemente mais baixos (p<0,05) do que nos controlos normais (9,99 ± 0,26 vs 10,88 ± 0,14). (2) Ao serem admitidos, os índices de degradação do triptofano nos doentes eram significativamente mas não fortemente mais baixos (p<0,04) do que nos controlos normais (0,03 ± 0,002 vs 0,05 ± 0,02). (3) Ao serem admitidos, o ácido hidroxi-antranílico (um passo antes da formação de ácido quinolínico no catabolismo) que indica o efeito tóxico nos neurónios mostrou não 13 haver diferenças (p = 0,1) entre doentes (25,265 ± 2,437) e controlos normais (25,182 ± 0,768). (4) Ao serem admitidos, as concentrações plasmáticas de ácido quinurénico nos doentes eram significativamente e fortemente mais baixas (p<0,0001) do que os controlos normais (24,29 ± 1,18 vs 35,96 ± 1,37) (Figura 1). (5) A análise da curva ROC mostrou que o valor do ácido quinurénico 29,3 nmol/L é o ponto de corte entre deprimido e normal com sensibilidade de 80,9% e especificidade de 75% (Figura 4). (6) Ao serem admitidos, a razão neuroprotectora nos doentes era significativamente e fortemente mais baixa (p<0,0001) do que os controlos normais (14,08 ± 0,64 vs 19,36 ± 0,61) (Figura 2). (7) A análise da curva ROC mostrou que o indice neuroprotector 16,3 é o ponto de corte entre deprimido e normal com sensibilidade de 75,5% e especificidade de 65% (Figura 5). (8) Ao serem admitidos, o indice neuroprotector nos doentes era significativamente mais baixo (p<0,04) do que em controlos normais (358,77 ± 52,93 vs 757,7 ± 86,22) (Figura 3) . (9) A análise da curva ROC mostrou que o indice neuroprotector 473 é o ponto de corte entre deprimido e normal com sensibilidade de 78,7% e especificidade de 14 77,6% (Figura 6). (10) A análise univariada mostrou que os três marcadores acima referidos não eram influenciados pela idade ou género.

Conclusão razão neuroprotectora e quinurénico são marcadores diferenciar entre pessoas O índice neuroprotector, concentrações plasmáticas de ácido biológicos a ser utilizados para normais e deprimidas.

Exemplo 2 de Referência: Determinação de quinurenina e ácido quinurénico utilizando Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho 1. Introdução:

Medição combinada de quinurenina e ácido quinurénico por HPLC com padrão externo. A quinurenina é detectada por UV e o ácido quinurénico pela sua fluorescência aumentada num solvente de eluição contendo Zn. 2. Preparaçao da amostra:

As amostras (soro, sangue total, plasma) precisam de ser desproteinizadas.

Adicionar 20 pL de ácido perclórico a 180 yL de amostra. 15

Deixar durante 10 minutos, depois centrifugar durante 5 minutos a 14000 g. Os 100 pL do sobrenadante são transferidos para um frasco de injecção Gilson, tapado e centrifugado durante 5 minutos a 6000 g. 3. Instrumentação: sistema 2 de configuração 3.1 Bomba de HPLC Gilson 305 3.2 Auto-injector Gilson 231: verificar o reservatório do diluidor: 20% de ACN/AD. Ficheiro do programa 1. TEMPO DE ANÁLISE = 4 minutos NÚMERO DE AMOSTRAS = número de injecções

VOLUME DE INJECÇÃO = 40 pL 3.3 Detector de fluorescência Shimadzu 10A(xl): Excitação: 334 nm

Emissão: 388 nm SENSIBILIDADE: 1 GANHO: 3 3.4 Detector Gilson 117:

Comprimento de onda: 365 nm Sensibilidade 1: 0,01 Sensibilidade 2: 0,1 Largura minima do pico: 8 s 16 3.5 Software Unipoint da Gilson;

Ficheiro do Método: KYNS2.GCT.

Ficheiro de paragem: ST0PKA2.GCT

Ficheiro de Análise: KAS2.GAN e KYNS2.G 4. Cromatografia:

Coluna: Chromolith Performance 4,6 x 100 mm com uma pré-coluna Chromolith.

Tampão: Acetato de Zn 250 mM em AD (27,4 g em 500 mL). 0 pH é levado a 5,8 com ácido acético e completado até um volume de 455 mL com água numa proveta. A esta adiciona-se 45 mL de ACN (para cromatografia de gradiente). 0 solvente é desgaseifiçado por ultrassonicação durante 20 minutos. 5. Preparaçao de padrões: 5.1 0 padrão mãe de quinurenina é preparado por pesagem de 20 mg de quinurenina (PM 208,2) e dissolução em água num balão volumétrico de 100 mL. O padrão é armazenado como alíquotas de 1 mL em tubos Eppendorf a - 20 °C. 5.2 0 padrão mãe de ácido quinurénico é preparado por pesagem de 20 mg de ácido quinurénico (PM 189,2) e dissolução em EtOH com 1 mL de HC1 12 N num balão volumétrico de 100 mL. O padrão é armazenado a -20 °C. 17 5.3 Padrão de trabalho:

Diluir os padrões-mãe até concentrações de 5 μΜ para a quinurenina (500 pL) e 100 nM para o ácido quinurénico (10,0 pL) em AD (até 100 mL) . Estáveis durante um dia à temperatura ambiente. 6. Reagentes:

Ácido perclórico (2,4 M): 7 mL de ácido perclórico + 13 mL de AD. 7. Controlo de qualidade:

Plasma isento de fármacos comercial (TRP, KYN, KA) 8. Procedimento:

Preparar solventes, reagentes, descongelar a Solução Padrão de Trabalho e o Plasma de Controlo.

Estabilizar a coluna Verificar as ligações Detector de fluorescência - Preparação das amostras

Adaptar o Ficheiro de Funcionamento ao número de injecções de padrões, amostras e controlos. - Programar o auto-injector - Iniciar o ensaio - Desligar o sistema. 18 9. Valores normais: 9.1 Clin. Chem. 44:4, 858-62 (1992) : KYN: 1,98 gama (média) 1,86-2,10 μΜ n = 72 9.2 J. Chrom. B, 675 (1996), 157-61 n = 35 KYN: 1,35 0,7 - 3,0 μΜ

KA: 23 6-54 nM

n = 20M+20F 9.3 Anal. Bioch. KYN: 2,21 172, 518-25 (1988 1,30 - 3,32 μΜ 9.4 Estudo Roseneck (projecto 11/01) KYN: 1,66 1,04 - 2,28 μΜ n = 36

Exemplo 3: Determinação de triptofano e aminoácidos competitivos utilizando Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho 1. Introdução:

Medição simultânea de: Tirosina (TYR), Valina (VAL), Triptofano (TRY), Fenilalanina (PHE), Isoleucina (ILE), Leucina (LEU) Outros aminoácidos que eluem: Taurina (TAU), Ácido α-amino-n-butírico (ABA), Etanolamina, Metionina (MET) 19 2. Preparaçao das amostras: São diluídos 25 pL de amostra com 25 pL de Solução de Padrão Interno (IS) num Frasco de amostras Gilson. 3. Instrumentação: 3.1 Sistema 1 da Gilson 3.2 ASTED:

Instalar uma curva de injecção de 20 pL e bloco dialisador. Utilizar Solução Principal para o Diluidor 0 e Solução Dialisadora para o Diluidor 1. Colocar Tampão Borato nas posições dos frascos A e B do Suporte 50. Colocar reagente de derivatização OPA na posição C. 3.3 Detector de Fluorescência Shimadzu RF-A:

Excitação: 330 Emissão: 450 SENSIBILIDADE: 1 GANHO: 2 3.4 Software Unipoint de Gilson:

Método de controlo: AZP Método de análise: AZP 20 4. Cromatografia:

Coluna: Econospher C18, 3 μπι, 4,7 x 50 mm

Solvente A: 57,2 g de Na2HP04.12H20 ou 22,6 g de Na2HP04. anidro são dissolvidos em 400 mL de água por agitação e aquecimento suave. 0 pH é levado a 6,5 com ácido fosfórico e completado até um volume de 1840 mL com água numa proveta. A esta adiciona-se 160 mL de acetonitrilo para cromatografia.

Solvente B: 420 de água/280 de ACN/320 de MeOH (todos Spectrograde).

Ambos os solventes são desgaseifiçados por ultrassonicação durante 20 minutos. 5. Preparaçao de padrões: - Padrões de aminoácidos individuais são preparados por pesagem de 100 mg de cada composto e dissolução em água num balão volumétrico de 100 mL. - Solução Padrão de trabalho: 5 mL dos seguintes padrões de aminoácidos individuais são dissolvidos em 250 mL de água num balão volumétrico: TYR, VAL, TRY, PHE, ILE, LEU. - Solução Padrões de Verificação: o mesmo que a Solução Padrão de Trabalho mas com estes compostos adicionais: TAU, ABA, MET. Esta solução não é utilizada com frequência para normalização mas para verificar o cromatograma. 21 - Ambos os padrões são guardados como alíquotas de 1 mL em tubos Eppendorf a -20 °C. - Concentrações reais da solução de trabalho (em microM): ver Tabela de Picos 6. Reagentes: 6.1 Solvente Principal (1 semana) : 8,6 g de NaCl são dissolvidos em 1 L de água. Adiciona-se 500 μ]1ι de Triton X 100. Misturar bem e ultrassonicar durante 10 minutos. 6.2 Solução de diálise (1 semana): KH2PO4 0,2 M com NaN3 (a ponta de uma espátula) 6.3 Solução Mãe de Padrão Interno: 100 mg de Norvalina são dissolvidos em 100 mL de água. Aliquotas de 1,5 mL são armazenadas em tubos Eppendorf a -20 °C (2 anos). 6.4 Padrão Interno (IS) : 1 mL de Solução-Mãe de Padrão

Interno é diluído com 20 mL de Na2~EDTA a 2 g/L (Kestranal 2S) num frasco de cintilações (1 mês). 6.5 Tampão borato: 3,1 g de ácido bórico são dissolvidos em 400 mL de água, levados a pH 9,5 com NaOH conc. e diluídos até 500 mL (1 mês). 6.6 OPA: 500 mg de dialdeído ortoftálico (OPA) são dissolvidos por ultrassonicação curta em 10 mL de metanol de 22 qualidade para espectroscopia num balão Erlenmeyer de 100 mL. Adiciona-se 90 mL de tampão borato e 500 pL de mercaptoetanol. Este reagente é estável durante 1 mês mas adiciona-se 50 pL de mercaptoetanol de 2 em 2 dias. 7. Controlo de qualidade:

Uma reserva de plasma EDTA é armazenada em tubos Eppendorf a -20 °C. 8. Desligar o sistema:

- Lavar a coluna com solvente B - Iniciar o ASTED com água 9. Procedimento:

Preparar solventes, reagentes, IS, descongelar a Solução Padrão de Trabalho e o Plasma de Controlo. - Estabilizar a coluna passando gradiente por 3 vezes: primeiro ligar a bomba 1, bomba 2, (eventualmente as bombas de iniciador com a coluna desligada), Qata Master, Diluidores, ASTED, impressora, écran do computador, computador. Seleccionar o método AZP2 e fazer correr três vezes (escolher "Continuar"). Verificar o gradiente, pelo menos, uma vez com e sem preparação da amostra. 23 - Preparar o ASTED para diálise (se a configuração for alterada primeiro fazer correr o FICHEIRO 181): colocar reagentes e solventes, Iniciar. Fazer correr o Ficheiro 150 (TEMPO DE ELUIÇÃO = 50) - Detector de fluorescência - Começar a estabilizar a coluna - verificar as ligações - programar o ASTED para a amostra de verificação (Padrão de Trabalho) - Se a amostra de verificação não estiver OK, tentar solucionar e começar de novo.

Em caso de dúvida, fazer correr o Padrão de Controlo e/ou o Plasma de Controlo de Qualidade. - Preparação da amostra - adaptar o Programa Gilson de acordo com o número de injecções de padrões, amostras e controlos. - Programar o ASTED. - Iniciar o ensaio. - Desligar o sistema. 24

Exemplo 4 de Referência: Determinação de Ácido Hidroxi-Antranílico utilizando Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho 1. Introdução: KYN pode ser detectada por UV e HAA pela sua fluorescência. 2. Preparação da amostra:

As amostras (soro, sangue total com EDTA, plasma EDTA, plasma heparinizado ou tratado com citrato) são primeiro centrifugadas a 4000 g para retirar as partículas. Precisam de ser desproteinizadas.

Adicionar 20 pL de ácido perclórico (6,3) a 180 pL de amostra.

Deixar durante 5 minutos, depois, centrifugar durante 5 minutos a 14000 g. Em seguida 100 pL do sobrenadante são transferidos para um frasco de injecção Gilson, capsulado e centrifugado durante 5 minutos a 6000 g. 3. Instrumentação:

Sistema 2 de Configuração 3.1 Bomba de HPLC Gilson 305. 25 3.2 Auto-injector Gilson 234:

Verificar reservatório do diluidor: 20% de ACN/AD. Ficheiro do programa 3. TEMPO DE ANÁLISE = 12 minutos, número de amostras = número de injecções, VOLUME DE INJECÇÃO = 45 pL . 3.3 Detector de fluorescência Shimadzu 10A(xl):

Excitação: 316 nm,

Emissão: 420 nm, SENSIBILIDADE: 1, GANHO: 3. 3.5 Software Unipoint da Gilson:

Ficheiro do Método: HAAS2.GCT,

Ficheiro de paragem: STOPSYS2.GCT,

Ficheiro de Análise: HAAS2.GAN e HAAS2.GAN. 4. Cromatografia:

Coluna: Prevail Select C18 3μ 4,6 x 100 mm (Alltech 99302) .

Tampão: Ácido acético 20 mM (1,2 mL em 900 mL) é levado a pH 5,8 com KOH e completado até um volume de 1000 mL com água numa proveta graduada. A esta são adicionados 20 mL de MeOH (para cromatografia com gradiente). O solvente é desgaseifiçado por ultrassonicação durante 10 minutos. 26 5. Preparaçao de padrões: 5.2 0 padrão-mãe de ácido hidroxi-antranílico é preparado pesando 20 mg de ácido antranilico (PM) e dissolvendo com acetato citrato 40 mM pH 4,5 num balão volumétrico de 100 mL. O padrão é armazenado a -80. 5.3 Padrão de trabalho: Diluir os padrões-mãe até uma concentração de 100 nM para o ácido hidroxi-antranilico (10,0 pL) em AD (até 100 mL). 6. Reagentes: 6.3 Ácido perclórico (2,4 M) : 7 mL de ácido perclórico +

13 mL de AD 6.4 Solução de trabalho de padrão interno: diluição 5X de 6.4 em 6.3) 7. Procedimento: - Preparar solventes, reagentes, descongelar Solução Padrão de Trabalho e Plasma de Controlo, - Estabilizar a coluna, - Verificar as ligações, 27

Detector de fluorescência - Preparação da amostra, - adaptar o Ficheiro de Funcionamento ao número de injecções de padrões, amostras e controlos. - Programar o auto-injector - Iniciar o ensaio, - Desligar o sistema. 8. Valores normais: 8.1 J. Chrom. B, 675 (1996), 157-61: soro KYN: 1,35 0,7 - 3,0 μΜ n = 35

HAA: 79 15 - 209 nM

Exemplo 5: Determinação de Níveis Séricos Elevados de 3-Hidroxiguinurenina na Doença de Alzheimer Métodos

Doentes e indivíduos de controlo

Foram investigados os níveis séricos de TRP, KYN, KYNA e 3-HK em 20 doentes com o diagnóstico de doença de Alzheimer (AD) clinicamente provável, 20 doentes com depressão major (MD) tardia e 20 indivíduos idosos saudáveis com queixas de memória 28 subjectiva (SCI) em quem foi excluída uma doença neurodegenerativa por exame médico e testes neuropsicológicos.

Para as características dos indivíduos, ver Tabela 2. 0 diagnóstico clínico de AD provável é feito de acordo com os critérios do National Institute of Neurological and Communicative Diseases and Stroke/Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (McKhann G., Drachman D., Folstein M., Katzman R., Price D. e Stadlan E.M. (1984). Clinicai diagnosis of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease. Neurology 34, 939-944.). 0 diagnóstico de depressão major é feito de acordo com os critérios do ICD-10 e DSM-IV (American Psychiatric Association (1994). Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition Text Revision. (Washington, DC: American Psychiatric Association)). A duração média da doença no grupo de AD é de 2,20 anos (0-5 anos) . Todos os doentes de AD estão sem tratamento antidemencial e presentemente não têm tratamento com NSAID (Fármacos Anti-Inflamatórios Não Esteroidais). Um dos doentes de AD tinha uma história anterior de depressão major remissiva recorrente, mas é admitido no hospital sem quaisquer sintomas depressivos e sem medicação antidepressiva. Ao serem admitidos, três dos doentes de MD são tratados com inibidores selectivos da reabsorção de serotonina, um com um antidepressivo triciclico e um com uma combinação de antidepressivos; os restantes doentes de MD estão sem medicação antidepressiva no momento da amostragem do sangue. Um indivíduo SCI sofre de um episódio depressivo fraco e é tratado com reboxetina, enquanto que outro indivíduo SCI está a tomar NSAID esporadicamente devido a espondiloartrite anquilosante. 29 Há uma diferença significativa entre grupos quanto à idade 2 (teste de Kruskal-Wallis X = 18,223, p <0,001), género 2 (X = 6,667, p =0,036) e pontuaçao do Exame Cognitivo Mini-Mental

(MMSE) (X2 = 31,944, p <0,001, ver Tabela 2) . Os doentes com AD são mais velhos do que os doentes com MD (teste de Mann-Whitney Z = -2,654, p =0,008) e indivíduos SCI (Z = -3,998, p <0,001) e os doentes com MD são mais velhos do que os indivíduos SCI (Z = -2,072, p =0,038).

As amostras de soro são recolhidas em tubos com vácuo sem aditivos adicionais. Após 0,5 horas de coagulação, as amostras são centrifugadas e o sobrenadante é dividido em alíquotas em tubos Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) e imediatamente congelado a -80 °C.

Análises laboratoriais

Foi implementado um método de cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) com gradiente com detecção por ultravioleta (UV) e fluorescência.

Produtos químicos

Os reagentes para extracção em fase sólida e cromatografia são adquiridos a Merck (Darmstadt, Alemanha) com grau de pureza para cromatografia líquida de gradiente. A água ultra pura é produzida por um sistema Milli-Q da Millipore (Millipore, Milford, MS). São utilizadas cápsulas de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) (Sigma, St. Louis, MO) para produzir 30 PBS 0,05 M. Triptofano, quinurenina, ácido quinurénico e 3-hidroxiquinurenina são adquiridos com grau de pureza elevado a Sigma (St. Louis, MO).

Os calibradores e controlos são estabelecidos por adição de concentrações definidas dos analitos a uma solução de PBS 0,05 M. As concentrações seguintes são utilizadas para calibração com cinco pontos: TRP: 0,313, 0,625, 1,25, 2,5, 5,0, 10,0, 20,0 pg/mL; KYN: 12,5, 25, 0, 50,0, 100, 200, 400, 800 ng/mL; KYNA: 4,688, 9,375, 18,75, 37,5, 75,0, 150, 300 ng/mL; 3-HK: 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 0, 50,0, 100 ng/mL.

Extracçao das amostras

Os analitos são extraídos de amostras e calibradores/controlos utilizando cartuchos de extracção Waters Oásis MCX de 1 cc (30 mg) (Waters, Milford, MS) como se segue (todas as extracções são realizadas com um sistema de vácuo múltiplo manual): (1) o cartucho é pré-condicionado por lavagem com 1 mL de metanol seguido por 1 mL de água; (2) 1 mL de amostra e 100 pL de H3PO4 1 M são aplicados no cartucho e passados através da aplicação de um vácuo ligeiro (2 minutos); (3) o cartucho é lavado com 1 mL de HC1 0,1 M seguido por 1 mL de metanol a 100%; e, finalmente, (4) os analitos são eluídos por lavagem do cartucho com 1,5 mL de acetonitrilo contendo NaOH a 6%. O eluente é depois evaporado sob azoto até à secura e reconstituído com 150 pL de PBS 0,1 Μ. A amostra/calibrador/controlo reconstituída é, depois, transferida para um frasco de micro-injecção (Waters). 31

Equipamento de HPLC e condiçoes cromatográficas

As análises sao realizadas num cromatógrafo Waters 2695 ligado a um detector de UV Modelo Waters 2487 dual-λ e um detector de fluorescência 2475.

Para a determinação de KYN, KYNA e 3-HK, 100 pL das amostras são carregados numa coluna Supersphere 60 RP-select B, C8 de 250 mm x 4 mm (Merck, Darmstadt, Alemanha) . Devido à concentração relativamente mais elevada, é realizada uma segunda injecção com um volume de 10 pL para a determinação de TRP. De modo a assegurar resolução óptima dos picos nos cromatogramas e consequente separação eficiente dos analitos num tempo razoavelmente curto (30 minutos), a eluição é realizada no modo de gradiente utilizando uma fase móvel que consiste numa mistura de acetato de sódio 0,050 M (solvente A: pH 4,80; solvente B: pH 3,65), acetonitrilo (solvente C) e metanol (solvente D) em diferentes proporções (ver Tabela 3). O caudal é regulado a 0,80 mL/minuto, a temperatura da coluna é regulada a 35,0 °C, enquanto que as amostras são arrefecidas a 4,0 °C. O TRP é medido por detecção de fluorescência (λθχ: 300 nm; Àem: 350 nm) , KYN (365 nm) , KYNA (330 nm) e 3-HK (365 nm) são medidos por detecção no UV. O tempo aproximado do ensaio desde a injecção até à detecção dos compostos é cerca de 20,4 minutos para o TRP, 13,4 minutos para a KYN, 22,5 minutos para o KYNA e 7,0 minutos para a 3-HK.

Os dados são processados utilizando o software EMPOWER para Windows 2000 (Waters). As concentrações são determinadas 32 através da comparação das alturas dos picos dos analitos individuais com as alturas dos picos das respectivas curvas de calibração.

Estatísticas A análise estatística é realizada com SPSS (versão 12.0.1; SPSS, Chicago, Illinois) com processos não paramétricos (teste de Kruskal-Wallis-teste de Mann-Whitney-coeficiente de correlação de Spearman-Rank). O nível de significância é estabelecido a p <0,050. Para controlar a significância entre efeitos de grupos para diferenças de idade, é utilizado um modelo linear com diagnóstico como factor independente e idade como co-variável. Uma vez que as variáveis resultantes não são normalmente distribuídas por inspecção visual dos residuais de regressão e os testes de Kolmogorov-Smirnov (p <0,05), utiliza-se a reamostragem aplicada a um modelo de regressão múltipla com diagnóstico e idade como variáveis indicadoras independentes para um teste de significância sem distribuição.

Especificamente, o modelo de regressão múltipla para cada par de diagnósticos com base em 999 amostras é computado iterativamente. Para avaliar se um marcador que mostra diferenças significativas entre os grupos de AD e de comparação também pode ser útil como um teste diagnóstico potencial, é determinada a sensibilidade do marcador quando a especificidade é definida como > 80% e a especificidade quando a sensibilidade é definida como > 80% utilizando análise ROC. O nível de 80% é escolhido com base nos critérios de consenso para um biomarcador clinicamente útil na AD (The Ronald and Nancy Reagan Research Institute of the Alzheimer's Association and the National

Institute on Aging Working Group (1998). Consensus report of the 33

Working Group on: "Molecular and Biochemical Markers of Alzheimer's Disease". The Ronald and Nancy Reagan Research Institute of the Alzheimer's Association and the National Institute on Aging Working Group. Neurobiol. Aging 19, 109-116.)

Resultados

Os níveis séricos médios de triptofano (TRP), quinurenina (KYN), ácido quinurénico (KYNA) e 3-hidroxiquinurenina (3-HK) em doentes com doença de Alzheimer (AD), doentes com depressão major (MD) e pessoas saudáveis com diminuição cognitiva subjectiva (SCI) estão apresentados na Tabela 4. Há uma diferença não significativa de níveis de TRP entre os três 2 grupos (Kruskal-Wallis: X = 5,507; p =0,064) com os doentes com AD a apresentar níveis mais baixos de TRP do que as pessoas saudáveis de controlo (Mann-Whitney Z = - 2,288; p =0,022). Os níveis séricos de KYN (X2 = 1,536; p = 0,464) e KYNA (X2 = 0,033; p = 0,984) não são diferentes entre os grupos. Em contraste, os níveis de 3-HK são significativamente diferentes entre os três 2 grupos (X = 20,281; p<,0001), com níveis séricos de 3-HK maiores em doentes com AD em comparação com os doentes com depressão major (Z = -3,571; p <0,001) e os controlos SCI (Z = -4,139; p <0,0001). Em contraste, os níveis séricos de 3-HK não diferiam entre doentes com MD e controlos SCI (Z = -,541 ; p =0,602). Uma vez que a disponibilidade do aminoácido essencial TRP é um factor limitante da produção dos seus metabolitos, também é calculada a razão entre os níveis de 3-HK e TRP. Mais uma vez, há uma diferença altamente significativa entre os grupos 2 (X = 21,911 ; p <0, 0001) com uma razao (3-HK/TRP) média muito 34 mais elevada em doentes com AD do que em doentes com MD (Z = -3,517; p <0,001) e controlos saudáveis (Z = -4, 436; p <0,0001), mas sem diferença entre os dois grupos de comparação (Z = -0,757; p = 0,449). Consequentemente, a razão entre 3-HK neurotóxica e KYNA neuroprotector está significativamente 2 aumentada em doentes com AD (X = 18,016, p =0, 0001; AD vs MD: Z = - 3,219, p = 0,001; AD VS SCI: Z = -4, 003, p = 0, 00002; MD vs SCI: Z = -0,649, p = 0,529).

Quando a significância entre diferenças de grupos em 3-HK e 3-HK/TRP são controladas quanto à idade utilizando reamostragem para determinação da distribuição de amostragem, os níveis de 3-HK são significativamente diferentes entre doentes com AD e controlos SCI (coeficiente de correlação parcial -0,42, p <0,05) e entre doentes com AD e MD (coeficiente de correlação parcial -0,35, p <0,05). A razão de 3-HK para TRP é significativamente diferente entre doentes com AD e controlos SCI (coeficiente de correlação parcial -0,47, p <0,05), mas não entre doentes com AD e MD (coeficiente de correlação parcial -0,2).

Utilizando análise ROC do grupo AD comparado com o grupo MD e SCI combinados, para 3-HK a sensibilidade é 75% quando a especificidade é definida como 85% e a especificidade é 70% quando a sensibilidade é definida como 90%. Para a razão de 3-HK para TRP a sensibilidade é 80% quando a especificidade é definida como 82,5% e a especificidade é 77,5% quando a sensibilidade é definida como 85%. 35

Tabela 1 (1/7) 3 6

Grupo Género Idade TYR val W PHE ILE LEU Kyn KA IRPI ΚΪΝ/TRP KAKYN Pffii Doença M 68 87,14 263,7 55,31 96,47 66,66 129,95 2,99 31,84 8,59 0,0540 10,67 339,61 Doença M 44 79,93 376,89 88,94 87,77 137,2 226,64 2,51 29,33 9,79 0,0282 11,71 343,30 Doença F 35 92,87 260,05 62,23 co co C5^ 96,06 156,65 2,06 24,96 9,04 0,0331 12,11 302,29 Doença M 31 63,29 230,9 62,43 68,38 76,53 125,46 1,85 17,87 11,06 0,0296 9,66 172,63 Doença F 52 63,12 246,49 84,73 81,67 82,9 141,06 1,49 14,34 13,77 0,0176 9,62 137,98 Doença F 68 105,1 376,3 101,54 110,33 140,93 198,4 1,90 26,81 10,91 0,0188 14,08 377,39 Doença M 20 68,26 300,6 89,45 110,23 96,08 192,06 1,80 33,71 11,66 0,0201 18,70 630,54 Doença F 34 57,66 210,25 47,97 69,85 89,7 125 1,63 11,60 8,68 0,0339 7,13 82,70 Doença M 61 57,29 241,99 58 65,2 78,73 117 1,33 13,79 10,35 0,0229 10,38 143,18 Doença F 67 52,67 251,93 59,7 76,58 74,52 128,63 1,93 28,16 10,22 0,0324 14,56 409,90 Doença F 30 66,08 245,14 75,71 94,63 83,71 154,31 1,43 16,71 11,76 0,0189 11,68 195,18 Doença M 40 48,34 193,21 53,76 61,03 55,14 94,44 1,52 24,85 11,89 0,0283 16,35 406,26 Doença F 23 62 317 51,3 80 80 191 1,44 21,87 7,03 0,0281 15,19 332,15 Doença M 46 90,82 318,26 104,36 102,49 106,22 188,57 2,46 21,47 12,94 0,0236 8,73 187,38 Doença M 33 72,31 418,11 86,75 104,43 112,24 195,43 3,94 56,29 9,61 0,0454 14,29 804,20 Doença F 51 52,06 215,4 54,45 74,58 92,56 134,33 1,81 35,54 9,57 0,0332 19,64 697,84 Doença F 50 106,3 357,06 84,05 95,28 127,88 204,96 1,82 35,21 9,43 0,0217 19,35 681,18 Doença M 20 72,26 343,18 85,84 96,24 128,5 220,42 1,91 25,86 9,97 0,0222 13,54 350,12 Doença M 37 53,39 257,99 64,99 64,92 86,14 143,17 2,91 19,80 10,73 0,0448 6,80 134,58 Doença F 52 80,22 267,89 77,55 83,11 90,69 169,15 1,85 14,81 11,22 0,0239 8,01 118,56 Doença F 61 78,16 237,18 49,78 103,12 95 135,81 1,98 25,47 7,67 0,0398 12,86 327,64 Doença F 41 71,59 309,87 54,17 114,52 97,29 216,86 1,06 27,26 6,69 0,0196 25,72 701,04

Tabela 1 (2/7)

Grupo Género Idade IYR val TRP PHE ILE I£U Kyn KA TRPI Kffl/IEP KAKYN PROí Doença M 39 79,65 278,68 66,04 89,76 98,05 183,32 1,92 28,56 9,05 0,0291 14,88 424,83 Doença M 45 54,56 295,44 42,61 oo 123,37 208,21 1,20 25,59 5,60 0,0282 21,33 545,71 Doença M 36 59,25 276,07 61,44 79,84 82,34 155,45 1,46 26,28 9,41 0,0238 18,00 473,04 Doença F 38 96,4 306 79,9 94,2 93,2 166 1,42 19,00 10,57 0,0178 13,38 254,23 Doença F 35 53,12 188,28 46,91 56,48 57,41 101,99 0,75 15,94 10,26 0,0160 21,25 338,78 Doença M 20 71,83 276,7 88,19 93,49 78,02 178,17 1,77 36,26 12,63 0,0201 20,49 742,82 Doença M 32 82,7 306,59 57,24 86,81 101,51 198,25 1,72 24,70 7,38 0,0300 14,36 354,70 Doença F 21 62,45 232,87 69,74 88,74 75,78 154,07 2,14 20,09 11,36 0,0307 9,39 188,60 Doença M 63 65,45 344,26 57,84 N3 OO 127,58 223,23 2,25 31,35 6,78 0,0389 13,93 436,81 Doença M 67 66,36 282,86 59,19 82,04 72,61 152,41 2,06 26,97 9,02 0,0348 13,09 353,10 Doença F 40 63,58 244,54 70,29 72,7 72,23 141,26 1,01 20,36 11,83 0,0144 20,16 410,43 Doença M 60 69,79 316,34 35,02 85 106,15 187,38 1,22 24,47 4,58 0,0348 20,06 490,80 Doença F 42 64,29 243,52 60,87 69,42 72,54 142,77 1,42 23,05 10,27 0,0233 16,23 374,16 Doença M 41 60,03 225,76 48,89 66,74 69,3 123,49 2,01 22,78 8,97 0,0411 11,33 258,17 Doença M 42 66,65 270,91 72,22 74,28 92,07 169,43 1,79 31,10 10,73 0,0248 17,37 540,34 Doença F 60 64,52 227,57 50,73 60,26 71,34 113,87 1,79 21,82 9,44 0,0353 12,19 265,98 Doença M 52 47,94 207,97 52,33 65,94 114,84 57,91 1,84 19,90 10,58 0,0352 10,82 215,22 Doença M 49 64,68 283,25 62,09 59,75 79,29 148,15 1,39 17,80 9,78 0,0224 12,81 227,94 Doença M 66 50,5 207,19 38,14 62,38 65,21 117,37 1,35 10,78 7,59 0,0354 7,99 86,08 Doença F 48 70,79 313,1 74,21 67,66 85,85 154,31 1,71 24,61 10,73 0,0230 14,39 354,18 Doença F 43 70,55 210,41 70,69 78,76 65,47 123,65 1,63 26,04 12,88 0,0231 15,98 416,00 Doença M 43 42,96 204,91 55,37 55,74 76,35 125,37 1,88 13,61 10,96 0,0340 7,24 98,53

Tabela 1 (3/7) 3 8

Grupo Género Idade IYR VAL IRP PHE ILE LEU Kyn KA TRPI ΚΪΝ/ΤΒΡ KAKYN PROi Doença F 43 84,69 212,39 57,9 68,17 55,94 117,44 1,41 23,44 10,75 0,0244 16,62 389,67 Doença F 24 56,28 264,5 66,27 73,73 78,58 167,06 1,42 15,56 10,35 0,0214 10,96 170,50 Doença F 68 73,73 257,95 69,25 78,04 82,88 140,21 2,02 34,10 10,94 0,0292 16,88 575,65 Média 44,277 68,587 270,584 65,242 80,967 89,204 156,172 1,791 24,291 9,894 0,028 14,082 358,76 Desvio médio 11,424 11,28 41,924 12,803 12,545 16,759 30,543 0,3677 5,8735 1,4505 0,0068 3,4879 142,69 Normal M 26 85,92 280,85 66,2 80,74 81,71 155,62 2,60 35,93 9,67 0,0393 13,81 496,23 Normal M 33 63,48 256,2 71,5 84,52 82,38 156,44 1,23 16,66 11,12 0,0171 13,59 226,35 Normal F 38 50,86 257,27 74,66 64,11 76,45 135,14 2,10 55,74 12,79 0,0281 26,54 1479,50 Normal F 25 50,52 226,25 47,26 64,66 60,52 114,16 1,74 32,69 9,16 0,0368 18,79 614,16 Normal F 26 57,18 272,04 69,04 79,9 78,33 141,88 1,74 30,81 10,97 0,0252 17,71 545,55 Normal M 31 77,22 295,32 64,78 86,19 95,89 170,89 1,66 53,85 8,93 0,0256 32,44 1746,88 Normal F 23 75,91 235,17 65,24 60,12 65,54 122,87 1,41 36,05 11,66 0,0216 25,57 921,70 Normal F 24 75,28 306,84 89,74 85,65 104,99 188,73 2,92 48,31 11,78 0,0325 16,54 799,27 Normal F 43 81,76 364,43 82,47 99,37 132,87 217,79 2,64 36,53 9,20 0,0320 13,84 505,47 Normal F 22 66,59 232,12 59,67 72,02 69,32 126,1 1,70 20,62 10,54 0,0285 12,13 250,11 Normal F 39 98,54 389,11 oo oo 85,16 151,75 243,89 1,46 26,57 9,11 0,0165 18,20 483,54 Normal M 32 73,14 223,15 75,48 80,12 73,22 129,57 1,58 22,35 13,03 0,0209 14,15 316,15 Normal F 38 42,31 174,21 53 69,31 54,98 oo vo 1,43 22,51 12,07 0,0270 15,74 354,29 Normal F 14 88,22 238,34 91,17 87,04 66,5 117,3 2,49 61,06 15,26 0,0273 24,52 1497,32 Normal M 60 64,28 289,74 63,71 80,74 85,93 165,58 1,84 23,63 9,28 0,0289 12,84 303,47 Normal M 35 45,61 217,82 48,39 54,85 46,58 94,08 1,51 25,13 10,54 0,0312 16,64 418,22

Tabela 1 (4/7) 3 9

Grupo Género Idade IYR VMi IRP PHE ILE LEU Kyn KA TRPI KYN/IRP KAKYN PROi Nomal M 29 61,03 231,44 63,57 67,57 69,5 104,66 1,44 30,70 11,90 0,0227 21,32 654,51 Noriral M 49 77,08 208,37 73,35 68,73 65,18 121,83 2,05 65,47 13,55 0,0279 31,94 2090, 89 Nomal M 18 70,9 308,78 75,86 78,37 81,05 172,04 1,48 30,15 10,67 0,0195 20,37 614,20 Nomal F 22 49,46 206,08 61,21 61,94 CG CQ LO 116,05 1,42 33,82 12,43 0,0232 23,82 805,49 Nomal M 27 125,39 512,88 136,14 128,46 161,38 272,7 2,34 56,99 11,34 0,0172 24,35 1387,97 Nomal F 21 79,65 340,52 83 76,15 99,53 185,28 1,67 41,63 10,63 0,0201 24,93 1037,76 Nomal M 34 74,22 289,78 84,62 82,71 102,22 175,94 1,22 29,44 11,67 0,0144 24,13 710,42 Nomal M 24 52,4 252 50 57,3 77,2 124 2,14 co co 8,88 0,0429 13,46 388,33 Nomal F 24 70,59 333,52 57,99 70,88 94,83 155,29 2,19 35,85 8,00 0,0378 16,37 586,86 Normal M 32 56,72 252,22 59,14 62,77 71,3 122,58 1,20 12,13 10,46 0,0203 10,11 122,61 Nomal F 22 103,82 319,45 80,37 86,42 125,75 203,7 0,98 25,15 9,58 0,0122 25,66 645,43 Nomal M 31 72,57 210,37 53,19 64,8 58,92 129,02 1,96 25,65 9,93 0,0368 13,09 335,67 Normal F 40 47,52 236,7 58,23 65,74 115,79 72,11 1,73 43,77 10,83 0,0297 25,30 1107,41 Normal M 23 50,62 230,92 57,6 66,21 119,85 81,02 1,75 32,98 10,50 0,0304 18,85 621,53 Normal M 52 56,79 252,36 59,25 67,99 74,41 141,64 1,40 31,97 9,99 0,0236 22,84 730,06 Normal M 24 54,4 250,4 75,91 69,38 75,96 139,54 2,14 30,91 12,87 0,0282 14,44 446,46 Normal M 28 68,96 261,15 79,83 91,84 VD co 148,51 1,83 37,31 12,16 0,0229 20,39 760,68 Normal M 33 62,44 254,3 65,66 79,68 92,25 148,38 1,87 39,17 10,31 0,0285 20,95 820,48 Normal F 26 81,28 299,3 70,25 79,27 100,58 152,51 2,00 38,01 9,85 0,0285 19,00 722,27 Nomal F 21 73,79 387,97 71,24 88,14 131,4 197,62 1,79 36,61 8,11 0,0251 20,45 748,77 Nomal M 27 70,53 289,96 47,2 94,29 92,02 177,07 1,69 46,32 6,52 0,0358 27,41 1269,55 Nomal F 43 75,06 273,9 65,31 79,62 94,29 174,42 1,71 48,33 9,37 0,0262 28,26 1365,96

Tabela 1 (5/1) 4 Ο

Grupo Género Idade IYR VAL TRP PHE ILE LEU Kyn KA TRPI ΚΪΝ/ΙΕΡ KAK1 PROi ΝοπγβΙ F 26 73,25 267,69 66,38 85,83 73,75 162,15 2,11 37,49 10,02 0,0318 17,77 666,11 Nomal F 13 67,48 228,24 oo <=5~^ OO 75,04 60,82 117,82 2,87 55,93 16,35 0,0319 19,49 1089,95 Nomal M 45 73,78 256,3 59,38 74,66 97,42 152,32 1,31 24,92 9,07 0,0221 19,02 474,05 Nomal F 40 69,2 308,36 71,35 77,85 94,6 173,05 1,82 32,54 9,87 0,0255 17,88 581,79 ΝοπγβΙ F 48 47,69 230,78 74,85 81,22 68,3 125,92 1,64 35,70 13,51 0,0219 21,77 777,13 Nomal F 33 76,68 395,14 78,84 105,78 148,92 245,64 2,15 46,40 8,11 0,0273 21,58 1001,38 Nomal M 41 72,17 241,48 60,83 69,24 71,42 117,68 2,07 36,98 10,63 0,0340 17,89 661,67 Nomal F 18 88,52 295,21 74,86 115,75 107,42 176,77 2,29 53,20 9,55 0,0306 23,23 1235,91 Nomal M 21 87,65 342,55 79,53 106,66 116,75 222,82 1,62 37,09 9,07 0,0204 22,90 849,18 Nomal F 26 70,02 260,83 62,68 80,95 81,65 163,44 1,42 18,28 9,54 0,0227 12,87 235,32 Nomal F 19 65,12 342,15 72,42 89,35 104,28 159,65 2,12 36,98 9,52 0,0293 17,44 645,06 Nomal F 37 48,27 208,26 62,53 67,99 62,8 127,45 1,79 21,62 12,15 0,0286 12,08 261,13 Nomal F 50 109,86 365,58 112,91 107,94 98,64 202,86 1,98 31,98 12,76 0,0175 16,18 517,34 Nomal F 26 92 265,49 75,53 79,26 85,52 154,04 2,34 52,98 11,17 0,0309 22,67 1201,25 Nomal F 31 42,1 206 70,4 59,1 59,1 104 1,44 23,91 14,97 0,0205 16,58 396,43 Nomal F 18 71,59 259,86 61,03 67,87 82,68 122,82 1,62 29,86 10,09 0,0265 18,48 551,71 Nomal F 37 82,3 354,52 91,04 91,48 124,62 196,72 1,95 33,09 10,72 0,0214 17,00 562,67 Nomal F 49 78,7 282,09 79,83 76,4 82,1 156,04 4,06 69,31 11,82 0,0508 17,09 1184,49 Nomal F 22 105,24 350,8 89,12 89,9 129,96 216,99 1,58 30,51 9,98 0,0177 19,31 589,14 Nomal M 27 78,65 297,28 80,17 76,28 94,43 147,39 2,40 40,40 11,55 0,0299 16,85 680,78 Nomal M 34 89,01 336,88 87,05 106,2 128,22 229,63 2,01 24,39 9,78 0,0231 12,16 296,49 Nomal M 31 76,95 272,3 97,91 86,12 96,04 169,29 2,05 41,36 13,97 0,0209 20,18 834,46

Tabela 1 (6/7)

Grupo Género Idade TYR VAL TRP PHE ILE LEU Kyn KA TRPI ΚΪΝ/ΤΒΡ KAKYN PROÍ Normal M 26 98,99 356,51 83,67 90,85 139,19 217,67 1,56 37,37 9,26 0,0186 23,96 895,20 Normal F 32 66,15 298,79 85,58 66,99 100,93 165,82 1,73 33,47 12,25 0,0202 19,35 647,54 Normal M 37 63,65 247,58 80,1 82,73 64,41 134,1 1,66 30,32 13,52 0,0207 18,27 553,80 Normal F 26 74,7 274,84 73,85 95,5 98,19 154,64 1,95 54,55 10,58 0,0264 27,97 1526,00 Normal M 43 63,45 242,48 63,4 63,36 75,36 126,95 1,96 39,45 11,09 0,0310 20,08 792,06 Normal M 39 48,92 246,31 68,5 68,91 67,12 130,77 1,88 30,30 12,19 0,0274 16,12 488,35 Normal M 31 102,3 337,23 79,85 88,71 109,58 184,2 2,15 23,19 9,71 0,0269 10,79 250,13 Normal M 29 65,05 294,12 78,39 80,25 87,29 159,73 1,88 61,03 11,42 0,0240 32,46 1981,20 Normal F 46 86,14 291,2 56,99 78,41 84,89 145,01 2,23 59,94 8,31 0,0391 26,88 1611,12 Normal M 19 65,77 316,33 80,69 72,82 115,68 175,47 2,55 33,29 10,82 0,0316 13,05 434,60 Normal F 23 67,44 286,77 66,49 61,21 69,58 126,92 1,65 22,22 10,87 0,0248 13,47 299,23 Normal F 19 57,39 248,82 55,97 70,29 63,96 135,13 2,38 68,78 9,72 0,0425 28,90 1987,68 Normal F 34 49,96 171,17 51,75 75,47 52,99 97,59 1,52 27,51 11,57 0,0294 18,10 497,89 Normal M 26 86,4 188 52,7 74,8 54,1 117 1,69 34,72 10,13 0,0321 20,54 713,30 Normal F 33 46,46 203,96 59,74 66,81 62,2 108,33 1,27 30,27 12,25 0,0213 23,83 721,47 Normal F 30 48,56 186,41 51,33 50,63 48,96 78,35 2,17 32,99 12,43 0,0423 15,21 501,95 Normal M 28 62,42 189,75 60,42 80,6 59,2 03 GO C3^ 1,73 58,87 12,31 0,0286 34,03 2003,28 Normal F 32 54,7 266,7 65,5 64,5 83,1 138,8 2,03 26,47 10,77 0,0310 13,04 345,15 Normal F 23 43,1 220,9 56,9 89,9 60,2 114,9 1,92 83,79 10,76 0,0337 43,64 3656,65 Normal M 31 51,0 257,1 58,2 75,9 78,2 139,1 1,54 18,87 9,69 0,0264 12,25 231,22 Normal M 47 71,14 317,02 75,23 85,47 95 182,33 1,94 48,08 10,02 0,0258 24,78 1191,59 Normal M 33 61,89 334,76 70,1 66,31 98,9 174,95 1,94 30,19 9,51 0,0277 15,56 469,81

Tabela 1 (7/7)

Grupo Género Idade TYR val TRP PHE ILE LEU Kyn KA TRPI ΚΪΝ/TRP KAK1 PROi Normal M 67 73,12 287,99 87,47 82,46 98,67 159,65 1,37 20,10 12,46 0,0157 14,67 294,90 Normal M 21 69,26 294,2 77,84 67,53 90,06 161,12 1,82 35,00 11,41 0,0234 19,23 673,08 Normal M 24 84,05 275,82 73,74 71,44 84,53 155,9 2,22 26,46 10,98 0,0301 11,92 315,37 Normal M 20 69,79 359,13 79,53 105,21 111,28 203,68 1,90 33,78 9,37 0,0239 17,78 600,57 Normal F 53 72,71 221,39 69,4 101,25 66,02 129,85 2,16 22,44 11,74 0,0311 10,40 233,49 Normal M 34 76,2 298,56 71,03 85,26 90,65 155,15 1,91 34,31 10,06 0,0269 17,96 616,32 Normal M 20 79,68 306,32 73,96 92,73 87,98 170,59 1,91 D—> o-"* co 10,03 0,0258 14,13 381,11 Normal F 20 55,33 212,5 60,85 67,5 56,86 131,09 1,63 25,51 11,63 0,0268 15,65 399,24 Normal F 41 52,09 185,33 72,79 67,14 55,3 87,19 1,57 27,74 16,28 0,0216 17,67 490,13 Normal M 69 47,92 220,64 71,21 70,24 65,09 111,4 2,30 44,41 13,82 0,0323 19,30 857,32 Normal M 42 50,25 200,96 58,8 83,13 56,8 108,07 1,23 18,01 11,78 0,0208 14,69 264,54 Normal M 35 63,85 218,86 LO CG vo vo 73 70,92 118,73 1,62 25,81 12,26 0,0242 15,97 412,16 Normal F 21 64,88 248,28 76,83 76,07 86,05 144,91 1,51 25,19 12,39 0,0197 16,64 419,18 média 31,632 69,400 273,009 71,090 78,811 86,675 150,345 1,865 35,958 10,971 0,027 19,360 757,701 desvio médio 8,494 12,658 45,118 10,490 10,633 19,504 30,568 0,322 10,086 1,366 0,005 4,500 368,848

Tabela 2

Grupo Idade (anos) Média ± DP (Gama) Género (n) Feminino/Maseulino Pontuaçao do MMSE Média ± DP (Gama) AD (n=2 0) 74,0 ± 7,6 16/4 19,6 ± 6,4 (55-84) (7-28) MD (n=2 0) 67,7 ± 7,2 12/8 27,2 ± 2,0 (57-82) (21-30) SCI (n=2 0) 60,2 ± 10,4 8/12 28,7 ± 1,3 (40-74) (25-30)

Tabela 3

Passo do gradiente Tempo (minutos) % de A % de B % de C % de D 1 0,0 99,0 0,0 0, 0 1,0 2 6,0 98,0 0,0 0, 0 2, 0 3 8,0 90,0 6,0 2, 0 2, 0 4 12,0 80,0 14, 0 3, 0 3, 0 5 18,0 20,0 74, 0 3, 0 3, 0 6 19,0 20,0 74, 0 3, 0 3, 0 7 20,0 95, 0 0,0 2, 0 3, 0 8 22,0 99,0 0,0 0, 0 1,0 9 30,0 99,0 0,0 0, 0 1,0 43

Tabela 4 AD MD SCI Kurskal-Wallis TRP [pg/mL] 10,7 ± 2,1 10,9 ± 2,4 12,6 ± 3,0 x2 = 5,507 p = 0,064 KYN [ng/mL] 550,5 ± 232,6 466,2 ± 120,2 487,3 ± 123,3 X2 =1,536 p = 0,464 KYNA [ng/mL] 11,1 ± 5,6 11,2 ± 6,0 10,8 ± 3,8 X2 =0,033 p = 0,984 3-HK [ng/mL] 32,6 ± 13,0 16,9 ± 17,5 13,3 ± 10,5 X2 = 20,281 p = 0,0001 Razão 3-HK:TRP 3,16 ± 1,54 1,81 ± 2,61 1,11 ± 0,90 X2 = 21,919 P <0,0001

Lisboa, 12 de Dezembro de 2011 44

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES Método para detecção da doença de Alzheimer compreendendo o passo de medição da concentração de 3-hidroxiquinurenina num fluido corporal seleccionado do grupo consistindo em sangue total, soro, plasma e urina, obtido de um indivíduo e avaliação da doença de Alzheimer. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo, ainda, o passo de medição da concentração de triptofano no referido fluido corporal, determinação da razão por divisão do valor da concentração de 3-hidroxiquinurenina x 1000 pelo valor da concentração de triptofano no referido fluido corporal e avaliação da doença de Alzheimer. Método de acordo com reivindicação 2, em que um indivíduo que tem doença de Alzheimer é caracterizado por uma razão que é de dois ou superior. Utilização de uma razão determinada por divisão do valor da concentração de 3-hidroxiquinurenina pelo valor da concentração de triptofano num fluido corporal como um marcador prognóstico para a detecção de doença de Alzheimer. Lisboa, 12 de Dezembro de 2011