NL8002094A - Diagnostische methode. - Google Patents
Diagnostische methode. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8002094A NL8002094A NL8002094A NL8002094A NL8002094A NL 8002094 A NL8002094 A NL 8002094A NL 8002094 A NL8002094 A NL 8002094A NL 8002094 A NL8002094 A NL 8002094A NL 8002094 A NL8002094 A NL 8002094A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- cancer
- concentration
- protein
- value
- serum
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57411—Specifically defined cancers of cervix
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6875—Nucleoproteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
- G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
- G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
Description
e " ·—
V
- ί VO 338
Titel: Diagnostische methode.
De uitvinding heeft betrekking op een diagnostische proef-methode voor het detecteren van kwaadaardige neoplasma’s.
Er bestaat een duidelijke behoefte aan nieuwe methoden voor het detecteren van kanker. In vele gevallen zou een vroegtijdige diag-5 nose van kanker de kansen op een volledig terugdringen van de ziekte sterk vergroten.
In de literatuur zijn verschillende pogingen beschreven cm de aanwezigheid van tumor-specifieke componenten, zoals hormonen en anti-genen in het bloed van kankerpatiënten aan te tonen. Dergelijke pogingen 10 zijn echter grotendeels zonder succes gebleven en tot op heden is een practische niet-indringende diagnostische procedure gebaseerd op het gehalte van een tumor-specifieke serumccmponent een elusor doel gebleven .
Onlangs zijn DM-bindende eiwitten gevonden in serum van pa-15 tiënten met neoplasisch, systemische lupus erythematosus en andere inflammatore aandoeningen (zie b.v. FEBS Letters 92_ (2): 211-213 (19T8); ·<·;--
Europ. J. Biochem. 71:1-8 (1976); Amer. J. Med. 6j5: ^37-^5 (1978)).
Daarbij is echter niet voorzien in een geschikte analyseprocedure voor dergelijke serumeiwitten, welke procedure noodzakelijk zou zijn voor 20 een·.· practische diagnostische methode.Bovendien Ui jken de eerderbe-sehreven serumeiwitten niet de mate van selectiviteit te -vertonen die gewenst is bij een kankeronderzoeksmethode.
Het inhibitorserumeiwit dat volgens de. uitvinding wordt toegepast, wordt beschreven in The Pharmacologists (Abs. ) 20(3): 238 25 (1978). Deze korte samenvatting bevat echter geen aanwijzing dat het eiwit met andere gehalten aanwezig is in patiënten met kanker dan in patiënten zonder kanker.
De uitvinding verschaft een algemeen toepasbare diagnostische proefmethode voor het detecteren van kwaadaardige neoplasma’s in 30 de mens. Meer in het bijzonder verschaft de uitvinding een diagnostische methode cm het bestaan van kwaadaardige neoplasma's aan te tonen door menselijke serummonsters te analyseren op de aanwezigheid van een specifiek DHA-bindend eiwit. De methode kan worden gebruikt om kwaadaardige aandoeningen in een vroeg stadium te detecteren en als indi-35 . cator voor het voortschrijden van de aandoening in een kankerpatiënt 8 0 0 2 0 04 -2- die een behandeling ondergaat.
De methode volgens de uitvinding is gebaseerd op de vondst dat een bepaald DM-bindend eiwit (verder aangeduid als inhibitoreiwit X) in aanzienlijk kleinere concentraties in een serum van patiënten met 5 kanker aanwezig is dan in dat van patiënten zonder kanker. Door een gevoelige analyse op dit serumeivit te verschaffen, maakt de uitvinding een snelle, niet indringende en nauwkeurige methode voor het detecteren van de aanwezigheid van kanker mogelijk.
De aanwezigheid van een bepaald DNA-bindend eiwit in menselijk 10 serum werd door de uitvinders ontdekt tijdens een onderzoek naar de door blecmycine geïnduceerde afbraak van IM-2 DM'-(Pseudomonas bacteriofaag covalent gesloten cirkelvormig DM). Waarneming van de remming van deze afbraak door menselijk serum leidde tot een bestudering van de aard van de remming en pogingen cm de inhibitorverbinding te 15 identificeren.
De hypothese van de uitvinders dat de remming van de Bi-2 DM-afbraakreactie veroorzaakt werd door een serumeiwit, werd bevestigd doordat behandeling met pronase tot verlorengaan van de remmende werking leidde. Behandeling met DNAase I of pancreatische RNAase had geen in-20 vloed op de remmende werking van het serum. Honden- en kalverensera waren niet remmend, evenmin als menselijk albumine en immunoglobu-linen.
Het inhibitoreiwit werd onder niet-denaturerende omstandigheden gezuiverd onder toepassing van moleculaire filters, dialyse en Sephadex-25 kolcmchramatografie. De zuivering van het eiwit werd aanzienlijk verbeterd door het eiwit aan DM te binden, het DNA-eiwitcamplex te isoleren van het niet gebonden eiwit en het eiwit vervolgens van het DM los te maken door te behandelen met ureum. Zuivering door SDS-poly-aerylaminegel-electroforese en isoëlectrisch focusseren leidt naar 30 schatting tot een meer dan 2000-voudige zuivering. Isoëlectrische focusseringsgeleleetroforese toont aan dat de inhibitor een eiwit is met een molecuulgewicht van ongeveer 6Π.ΟΟΟ dalton en een pi van 5,9*
Dit eiwit is hier als onderwerp van onderzoek aangeduid als inhibitor-eiwit X.
35 Het inhibitoreiwit X oefent zijn remmende werking uit door zich 800 2 0 94 £ -3- te verbinden met het DM. De DNA-binding is aangetoond met behulp van agarosegelelectroforese, isolering van het DNA-eiwitcomplex, fluoreseen-tieafschrikken en circulair dichroïsmeonderzoeken.
Bij het onderzoeken van de aard van het inhibitoreiwit X, werd 5 geheel onverwachts gevonden, dat er een aanzienlijk verschil in het gehalte van dit eiwit in het serum van patiënten met kanker en dat in het serum van patiënten zonder kanker bestond. Gebaseerd qp deze belangrijke vondst hebben de uitvinders gezocht naar een gevoelige en snelle analyse van de aanwezigheid van inhibitoreiwit X in menselijk serum.
10 IM-2 DNA is eerder gebruikt in een spectrofotofluorcmetrische analyse voor het bepalen van de bleomycine biochemische activiteit (Cancer Res. 38: 3322-3326 (1978)). Het werkingsmechanisme van blecmycine blijkt verbonden te zijn met zijn vermogen om DNA af te breken, en de afname van de binding van ethidiumbranide (2,7-diamino-10-ethyl-9-15 fenyl-fenanthridiniumbromide) aan PM-2 DNA, geïnduceerd door bleomycine, zoals bepaald door fluorescentiespectrcmetrie, kan derhalve worden gebruikt om de blecmycineactiviteit te analyseren.
Inhibitoreiwit X blijkt, zoals boven‘is aangegeven, te werken als inhibitor van de door blecmycine geïnduceerde afbraak van IM-2 DNA.
20 Daarcm kan de eerder voor het meten van de blecmycineactiviteit gebruikte fluorametrische analysemethode ook worden gebruikt cm de concentratie van inhibitoreiwit X in menselijk serum te analyseren. Het gehalte van inhibitoreiwit X kan vervolgens worden gebruikt cm de waarschijnlijkheid van kanker in de onderzochte patiënt te voorspellen.
25 De uitvinding verschaft derhalve een werkwijze voor het detecteren van kanker bij de mens, welke de volgende trappen crnvat: a) het nemen van een bloedmonster van een op kanker te onderzoeken patiënt; b) het vaststellen van de concentratie van inhibitoreiwit X in dit 30 monster; en c) het vergelijken van deze concentratie zoals in trap b) bepaald, met de inhibitoreiwit X-concentratienorm, die verbonden is aan-het serum van patiënten die geen kanker hebben, waarbij een aanzienlijke vermindering van de inhibitoreiwit X-concen- 35 tratie t.o.v. de concentratienorm een indicatie voor de waar- 800 2 0 94 —it— schijnlijkheid van kanker vomit.
De bijzondersanalyseprocedure die in trap b) wordt gebruikt cm de seruminhibitoreivit X-concentratie te bepalen, is niet kritisch, en de uitvinding berust ruim gezien op de vondst dat de inhibitoreivit X-5 concentratie (hoe ook bepaald) als diagnoseinstrument kan worden gebruikt voor een grote verscheidenheid van menselijke kankers.
Een voordelig gebleken analyseprocedure is de EM-2 DM fluorescen-tieanalyse, die beschreven is in Cancer Res. J3Ö: 3322-3326 (1976). Het gebruik van deze analyse is gebaseerd op de remmende werking van inhi-10 bitoreivit X op de bekende door blecmycine geïnduceerde afbraak van de PM-2 DM-reactie. Wanneer deze analyse wordt gebruikt, wordt de inhi-bitoreiwit X^concentratie bij voorkeur uitgedrukt als een IC^-waarde waarbij IC^Q gedefinieerd is als de concentratie van het inhibitoreivit X, die vereist is cm 50% remming te krijgen van de door blecmycine ge-15 induceerde afbraak van PM-2 DM. Deze IC^Q-waarde kan vervolgens worden vergeleken met de genomineerde IC ^-vaarde, die verbonden is het met serum van patiënten die geen kanker hebben, en een aanzienlijke verhoging van de IC ^-waarde t.o.v. de genomineerde waarde zal een indicatie vormen voor de waarschijnlijkheid van kanker.
20 De details van de PM-2 DM fluorescentieanalyse op inhibitor- eivit X zijn als volgt:
Men bereidt eerst een mengsel van een serummonster (b.v. een 50 microlitermonster) van een te onderzoeken patiënt met een oplossing van blecmycine, B4-2 DM en 2-mercaptoëthanol in een buff er oplos sing met een 25 pH van 9*5· Een 50 microliter serummonster wordt typisch gemengd met
k50 microliter van een oplossing die 35 mM blecmycine, 8,3^iM EM-2 DNA
en 25 mM 2-mercaptoethanol in een natriumboraatbuffer met een pH van 9,5 (O,015 M NaCl : 0,05 M natriumboraat) omvat.
Het bovenstaand vermelde mengsel -wordt vervolgens gedurende 30 30 minuten bij 37°C geïncubeerd.
Een oplossing van ethidiumbrcmide in een denatureringsbuffer met 3 . .
een pH van 12,1 wordt vervolgens bereid door 0,1 cm van een ethidium-
O
brcmideoplossing (22 /ug ethidiumbrcmide per cm van de denaturerings-
' O
buffer met pH 12,l) toe te voegen aan 0,9 cm van de denaturerings-35 buffer met een pH van 12,1. Een geschikte denatureringsbuffer crnvat 800 2 0 94 -5- 0,09 Μ Na-PO^ : 0,01 Μ EDTA : 0,01 Μ NaCl, ingesteld op een pH van 12,1 3 ....
met 0,15 M NaOÏÏ. Aan 1 cm van deze ethxdxumbra&xdeoplossxng wordt een deel (b. v. 100 microliter) van het "bovenstaand vermelde, geïncubeerde serummengsel toegevoegd.
5 De fluorescentie van het ethidiumbramide : ïM-2 DNA-mengsel wordt bepaald met een spectrofotofluorcmeter bij een 530 nm excitatie en een 590 nm emissie. Een boven de ondergrond uitkomende fluorescentie wordt veroorzaakt door ethidiumbrcmidebinding aan ΓΜ-2 DNA, waardoor een verandering in fluorescentie t.o.v. een vergelijkingsreactie (identiek 10 aan het te onderzoeken monster behalve dat het geen bleomycine bevat) kwantificering mogelijk maakt van de mate waarin de door bleomycine geïnduceerde afbraak van Bi-2 DNA optreedt. Uit de fluorescentiewaarden kan de procentuele remming van de FM-2 DNA-afbraak, veroorzaakt door de aanwezigheid van inhibitoreiwit X in het serum, gemakkelijk worden 15 vastgesteld.
De concentratie van inhibitoreiwit X in het serummonster wordt vervolgens bepaald met de bekende Lowry (folin/fenolreagens )methode, beschreven in J. Biol. Chem. 193 : 265-275 (1951)» bepaald.
Door de procentuele remming van de IM-2 DNA afbraak uit te 20 zetten tegen het logaritme van de concentratie van inhbitoreiwit X, kan de IC^-waarde voor het betreffende serummonster gemakkelijk worden bepaald.
Wanneer eenmaal de IC^0-waarde voor een bepaalde patiënt berekend is, kan deze waarde direct worden gebruikt voor het voor-25 spellen van de waarschijnlijkheid van kanker in deze patiënt. Uitgebreide onderzoeken bij gezonde (kankervrije) patiënten en patiënten met een grote verscheidenheid aan kwaadaardige necplasma's hebben aangetoond dat inhibitoreiwit X in aanzienlijk kleinere hoeveelheden worden aangetroffen in het serum van patiënten met kanker. De IC^-30 waarde voor kankerpatiënten is derhalve aanzienlijk groter dan de genormeerde waarde voor gezonden individuen. Dit duidelijk onderscheid in IC,-n-waarden verschaft een eenvoudige en nauwkeurige basis voor het pu bepalen van de aanwezigheid van kanker en vormt de kern van de uitvinding.
35 De exacte IC^Q-waarde die uit bloedmonsters van kankervrije 80 0 2 0 94 -6- patiënten is verkregen, varieert enigszins van individu tot individu.
In tot op heden onderzochte patiënten is de gemiddelde IC,-Q--waarde voor kankervrije patiënten 90,2 - 11,0 ^üg/cnr gebleken (significant op het 0,001-niveau). De hoogste IC^Q-waarde die voor een gezonde patiënt 5 is opgetekend, is 120^ig/cm^.
In kankerpatiënten varieerden de verkregen IC^-waarden met het type kanker, maar in alle gevallen was tot op heden de vaarde aanzienlijk hoger dan verkregen is hij kankervrije individuen. De laagste IC^-vaarde voor een kankerpatiënt tot op heden vas 270/ug/cm^. In het algemeen 10 vormt echter een IC^g-waarde hoven ongeveer 200 een indicatie voor een hoge vaarschijnlijkheid dat de patiënt een of ander type kwaadaardig neoplasma heeft.
De verkwijze volgens de uitvinding is met succes toegepast voor het detecteren van een grote verscheidenheid aan kankertypen en is 15 naar men aanneemt algemeen toepasbaar voor kankerdiagnose. Als specifieke voorbeelden van gedetecteerde tumortypen kunnen vorden genoemd testiculair carcinoma, lymfoma, leukemie, adenocarcinoma van de borst, kleine cellen adenocarcinoma van de long, grote cellen adenocarcinoma van de long, adenocarcinoma van het colon en melanoma, om slechts een 20 aantal te noemen. De methode blijkt eveneens specifiek te zijn voor kankerdiagnose omdat kankervrije patiënten met verschillende typen niet neoplastische aandoeningen niet de verhoogde IC^Q-waarden vertoonden, die verbonden zijn aan de aanwezigheid van kanker.
De bovenstaand beschreven fluorescentieanalyse voor inhibitor-25 eiwit X volgens de uitvinding is gebaseerd op een intrinsièke eigenschap van dit materiaal: inhibitie van door blecmycine geïnduceerde afbraak van FM-2 DM. De volgens deze methode bepaalde serumgehalten van het eiwit zijn gecorreleerd aan de aanwezigheid of afwezigheid van kwaadaardige aandoeningen. De beschikbaarheid van een gezuiverd inhibitor-30 X maakt mogelijk dat verschillende andere bekende methoden op het gebied van de biochemie en clinische chemie voor zijn meting worden toegepast. Prominente methoden hiervan zijn immunologische methoden zoals radio-immunoanalyse, f luoroimmunoanalyse, en zymlmmun o analyse (>b.v. ELISA), spinimmuncanalyse, chemiluminescente immunoanalyse, fluorescentie-35 polarisatieimmunoanalyse, nefelometrische analyse, geldiffusiemethoden 800 2 0 94 -7- en klassieke methoden^ zoals hemagglutinatie en ccmponentfixatie.
Voorts kunnen andere functionele eigenschappen van inhibitoreivit X worden "benut voor zijn meting in "biologische vloeistoffen. Met het molecuul verbonden katalytische verschijnselen kunnen in spectrofoto-5 metrische of speetrofluorcmetrische kinetische of eindpuntanalyses worden gemeten. Ook kunnen scheidingstechnieken op de vloeistof in kwestie worden uitgeoefend, en kunnen verschillende detectiemethoden worden gebruikt cm het eiwit kwantitatief te bepalen, waaronder spectrale of densitometrische methoden en immunologische methoden. Omdat 10 specifieke meting van de inhibi'toreiwit X-concentratie door de voorgaande methoden wordt verkregen, volgt hieruit dat de door dergelijke methoden bepaalde serumgehalten van het eiwit correleren met de aanwezigheid of afwezigheid van kwaadaardige aandoeningen.
Het'inhibitoreiwit X werd volgens de volgende procedures ge- 15 zuiverd.
Gedeeltelijke zuivering - Procedure A
Inhibitoreivit X werd gedeeltelijk gezuiverd door Sephadex-
O
kolcmchrcmatografie. Men bracht 1 cmJ menselijk serum op een Sephadex G-75 kolan {88 x 2 cm) en elueerde vervolgens in een natriumfosfaat-
O
20 buffer (0,07 M, pH 6,8) met een stroomsnelheid van 6-8 cm /uur bij kamertemperatuur. De inhibitor bevond zich in het lege volume dat ver- . . .3 zameld werd, gelyofilxseerd werd hersuspendeerd in 1 cm HgO, werd gedialyseerd tegen 20 volumes HgO gedurende 2k uur bij U°C, en vervolgens op een Sephadex G-200 kolcm. werd gebracht, die in dezelfde buf-25 fer was geëquilibreerd,
Elutie van de Sephadex G-200 kolom gaf drie pieken die bij 280 nm absorbeerden. Piek III, die bij 7,7$ van de totale hoeveelheid ge— eluèèrd’ eiwit behoorde, bevatte inhibitoreiwit X. Dit werd zoals bovenstaand beschreven, behandeld en vervolgens opnieuw op een Sephadex G-200 30 kolcm gebracht. Elutie werd bewerkt met de bovenstaand beschreven fos- . 3 faatbuffer. Fracties van 3 cm van elke kolom werden verzameld met een fractiecollector (Gilson Medical Electronics, Inc., Middleton, Wis) en de elutiepatronen werden verkregen door de absorbantie bij 280 nm met een spectrofotometer te meten. De eiwitconcentraties werden be-35 paald met behulp van de Lowry-methode.
80 0 2094 8-
Zuivering - Procedure B
De zuivering van het inhibitoreiwit werd uitgevoerd door moleculaire filtratie met Amicon-fliters, dialyse en Sephadex gelkolom- 3 .
chrcmatografie. Men centrifugeerde menselijke sera van 1-5 cm m 5 conische Amicon-filterbuizen (Amicon, Lexington, Mass.) gedurende 10 minuten met 5000 g hij U°C, Het retentaat, dat na de centrifugatie in de filterkegel achterbleef, werd hersuspendeerd in gedeloniseerd water tot het oorspronkelijke volume van de sera. Gelijke hoeveelheden van het retentaat en het filtraat werden op hun remmende werking onder-10 zocht. Het actieve retentaat werd gedialyseerd in een cellulosebuis tegen 20 volumes gedeloniseerd water bij ^°C gedurende 2k uur. Het retentaat en dialysaat werden gelyofiliseerd en opnieuw in gedeloniseerd water gesuspendeerd. De resultaten van analyses van de twee fracties toonden dat de remmende werking in het retentaat werd uitge-15 oef end. Men bracht 1 cm retentaat aan'op een 60 x-5 cm Sephadex G-50 kolom en elueerde met 0,07 M natriumfosfaatbuffer met een pH van 6,8 met een stroomsnelheid van 30 cm^/uur bij U°C. Het kolcmeluaat (5 cm per buis) werd met een Buchler Fractcmette Alpha 200 (Searle, Fort Lee, H.J.) fractiecollector verzameld. De 280 nm absorbantie 20 van elke fractie werd met een spectrofotcmeter gemeten en de buizen werden overeenkomstig de absorbantiepieken samengevoegd. De samengevoegde fracties werden gelyofiliseerd, gedialyseerd en onderzocht op remmende werking, zoals bovenstaand beschreven is. Het "actieve” materiaal, dat zich in de lege volumefractie bevond, werd op Se-25 phadex G-75 en G-100 kolommen gebracht en op dezelfde wijze naar de G-50 kolom geelueerd. De remmende werking werd aangetroffen in de lege volumefracties van beide kolommen. Het "actieve" materiaal dat in de lege volumefractie van de Sephadex G-200' kolom was ver-' zameld, werd met 0,07 M natriumfosfaatbuffer met een pH van 6,8 bij 30 kamertemperatuur geelueerd met een stroomsnelheid van 6-8 cm /uur.
O
De fracties werden verzameld (3 cm /buis) met een Gilson microfractie-collector (Gilson, Middleton, Wis.')· Het kolcmeluaat werd op basis van het 280 nm absorbantieprofiel gefractioneerd door de buizen onder elke absorbantiepiek samen te voegen. Elke fractie werd vervolgens gelyo-35 filiseerd, gedialyseerd en onderzocht qp remmende werking, zoals boven- 800 2 0 94 -9- staand is beschreven. De remmende verhing verd in fractie III aangetroffen. Het materiaal in fractie III verd cpnieuv op de Sephadex G-20 kolcm gebracht en onder dezelfde omstandigheden geëlueerd. Fractie III van de Sephadex G-200 kolom, velke inhibitor eivit X bevatte, 5 representeerde een meer dan 1000-voudige zuivering.
De EM-2 DNA-fluorescentieanalyseprocedure voor inhibitoreivit X vordt onderstaand nader toegelicht:
Bepaling van IC^Q voor inhibitoreivit X.
De bepaling van het IC^q (de concentratie eivit die vereist 10 is cm een 50% remming van de PM-2 DNA-afbraak te krijgen) voor inhibitoreivit X in menselijke sera verd in tvee trappen uitgevoerd: 1. De eivitconcentratie in het serum verd bepaald met behulp van de Lovry-methode.
2. Het gebruik van de FM-2 DNA fluorescentieanalyse voor bleomycine 15 cm een dosis responsiekrcmme voor de serumeivitinhibitor te ver krijgen. De IC^Q-vaarden verden afgeleid uit grafieken vaarin de procentuele remming van de DNA-afbraak is uitgezet tegen de
N
eivitconcentraties op log-probxtgrafleken.
Procedures: 20 I. Lowry-reactie.
A. Bereiding van voorraadoplossingen:
Oplossing A. 2% NagCO^ in 0,1 N NaOH.
Oplossing B. 1% CuS0^.5H20 in H^O.
Oplossing C. 2% Na+K+ tartraat in HgO.
25 Oplossing D. 2 N Folin-Ciocalteau fenölreagens.
B. Bereiding van reagensoplossingen.
Reagens oplossing 1: Meng 1 volume van voorraadoplos sing B met 1 volume voorraadoplos sing C.
Reagensoplossing 2: Mèmg 50 volumen van voorraadoplossing A met 30 1 volume reagensoplossing 1.
Reagensoplossing 3: Meng 1 volume voorraadoplossing D met . 1 volume HgO.
C. Reacties.
1. Verdun de sera 1:10 met ÏÏ^O.
35 2. Breng 10 microliter van de verdunde sera over in een 13 x 100 mm glazen proefbuis en voeg 290 microliter HgO toe.
800 2 0 94 3 -10- 3. Voeg 1 cm reagensoplossing 2 toe, meng goed, en menheer gedurende 10 minuten "bij kamertemperatuur.
h. Voeg 100 microliter van reagensoplossing 3 toe, meng goed, en in-cubeer gedurende 30 minuten tij kamertemperatuur.
5 5· Gebruik een spectrofotometer om de absorbsntie bij 750 nm te meten.
6. Bepaal· ide eiwitconcentratie uit de BSA standaardkramme.
D. Runderserumalbumine (BSA) standaardkramme.
1. Bereid een reeks verdunningen van BSA (n.l. 25, 50,'75s 100, 150 3 3 10 Mg/cm ) in een eindvolume van 0,3 cm.
2. Voer de reacties uit, gegeven onder C, beginnende bij trap C (toevoeging van reagensoplossing 2).
3. Zet de absorbantie bij 750 nm uit tegen de BSA-concentraties.
II. De eiwitinhibitoranalyse.
15 A. Voer reeksen verdunningen van het serum eiwit uit, op basis van de door de Lowry-reactie vastgestelde serum eivitconcentraties. Maak de verdunningen in een constant volume van een natrium-boraatbuffer (0,05 M, pH 9S5)· B. Voeg de monsters van serum eiwit (50 ul volume) toe aan lOyul 20 bleomycine (3^,5 nanamol) aanwezig in een glazen proefbuis'' (13 x 100 mm).
C. Voeg 390 pl van een natriumboraatbuffer (0,05 M, pH 9»5), die 25 mM 2-mercaptoëthanol bevat', toe.
D. Voeg 50 ul PM-2 DM toe (8,3 x 10~6M in 0,15 M HaCl).
25 E. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37°C.
F. Breng drievoudige delen (100 yul) over in glazen proefbuizen (13 x 100 mm) die 0,9 cm^ lia^PO^ (0,09 M, pH 12,1), 0,01 M EDEA en 0. 01.M ïïaCl bevatten; roer goed.
G. Voeg 100 ^ul ethidiumbremide (55 »7 x 10”^ M) in de ïïa^PO^-buffer 30 pH 12,1 toe. Roer goed.
H. Vergelijkingsproeven: 1. Natriumboraat (0,5 M, pH 9,5), dat 2-mercaptoëthanol bevat, zonder bleomycine of eiwitten.
2. Eiwit zonder bleomycine of PM-2 DM.
35 3. Eiwit zonder bleomycine.
80 0 2 0 94 -11- k. ïïatriumboraat (0,05 M, pH 9,5), dat 2-mercaptoëthanol bevat, als bianco-monster.
I. Spectrofotofluorametrie (Amine o-Bo-wm an).
Breng het monster over in een 1 cm quartz cuvette en meet de 5 fluorescentie bij een 530 nm excitatie en een 590 nm emissie.
8 0 0 2 0 94
Claims (3)
1. Werkwijze voor het detecteren van kanker hij de mens, omvattende de volgende trappen: a) het nemen van een bloedmonster van een op kanker te onderzoeken patiënt; 5 b) het vaststellen van de inhibitoreivit X-concentratie in dit monster; . en c) het vergelijken van deze in trap b) vastgestelde concentratie met de inhibitoreivit X-concentratienorm, die verbonden is met het serum van patiënten die geen kanker hebben, waarbij een aanzienlijke afna-10 me van de inhibitoreivit X-concentratie t.o.v. de concentratienorm een indicatie voor de waarschijnlijkheid van kanker vormt.
2. Werkwijze voor het detecteren van kanker bij de mens, welke de volgende trappen omvat: a) het nemen van een bloedmonster van een op kanker te onderzoeken 15 patiënt; b) het vaststellen van de concentratie van inhibitoreivit X in dit monster, welke vereist is cm een 50% remming voor de door bleo-mycine geïnduceerde afbraak van EM-2 DNA te verkrijgen; en c) het vergelijken van deze IC^-vaarde als bepaald in trap b), met 20 de genammeerde IC^Q-vaarde, welke verbonden is met het serum van patiënten die geen kanker hebben, waarbij een aanzienlijk verhoging van de IC,-n-waarde''t .o.v. de genommeer de waarde een indicatie voor pü de waarschijnlijkheid van kanker vonnt.
3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de bepaling 25 van de IC^Q-vaarde in trap b) volgens de volgende trappen geschiedt: 1. het bereiden van een mengsel vaihet bloedmonster met een oplossing van bleomycine, Bl-2 DM en 2-mercaptoëthanol in een buffer met een pH van 9,5; 2. het incüberen van het mengsel van trap l) gedurende 30 minuten 30 bij een temperatuur van 3T°C; 3. het toevoegen van een gedeelte van het mengsel van trap 2) aan een mengsel van ethidiumbramide in een denatureringsbuffer met een pïï van 12,1; It) het bepalen van de fluorescentie van het ethidiumbramide :R4-2 DM 35 mengsel van trap 3) met een spectrofotofluorcmeter bij een 530 nm 800 2 0 94 > -13- excitatie en een 950 nm emissie; 5)het "bepalen van de procentuele remming van de door blecmycine geïnduceerde EM-2 DM-afbraak uit de fluorescentieverandering van het monster t.o.v. een vergelijkingsmonster dat geen "blecmycine 5 bevat; 6 )hèt bepalen van de concentratie van inhibitoreiwit X volgens de Lowry-methode; en T )het bepalen uit de in trappen 5) en 6) verkregen waarden van de concentratie van inhibitoreivit X5 vereist om 50% remming van de 10 door blecmycine geïnduceerde EM-2 DM-afbraak te verkrijgen. 800 2 0 94
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2873279A | 1979-04-10 | 1979-04-10 | |
| US2873279 | 1979-04-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8002094A true NL8002094A (nl) | 1980-10-14 |
Family
ID=21845111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8002094A NL8002094A (nl) | 1979-04-10 | 1980-04-09 | Diagnostische methode. |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS55143441A (nl) |
| KR (1) | KR830002502A (nl) |
| AR (1) | AR222700A1 (nl) |
| AT (1) | AT365343B (nl) |
| AU (1) | AU536522B2 (nl) |
| BE (1) | BE882669A (nl) |
| CH (1) | CH644453A5 (nl) |
| DE (1) | DE3013837A1 (nl) |
| DK (1) | DK149980A (nl) |
| ES (1) | ES8103380A1 (nl) |
| FI (1) | FI801078A (nl) |
| FR (1) | FR2454099A1 (nl) |
| GB (1) | GB2047712B (nl) |
| GR (1) | GR67692B (nl) |
| HU (1) | HU183122B (nl) |
| IE (1) | IE49981B1 (nl) |
| IL (1) | IL59772A (nl) |
| IT (1) | IT1143135B (nl) |
| LU (1) | LU82345A1 (nl) |
| NL (1) | NL8002094A (nl) |
| NO (1) | NO801018L (nl) |
| PH (1) | PH15637A (nl) |
| SE (1) | SE8002602L (nl) |
| ZA (1) | ZA802141B (nl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3524644A1 (de) * | 1985-07-10 | 1987-01-15 | Heyl Chem Pharm | Undulin und dessen peptidfragmente, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung |
-
1980
- 1980-03-28 PH PH23825A patent/PH15637A/en unknown
- 1980-04-03 FI FI801078A patent/FI801078A/fi not_active Application Discontinuation
- 1980-04-03 SE SE8002602A patent/SE8002602L/ not_active Application Discontinuation
- 1980-04-03 IE IE693/80A patent/IE49981B1/en unknown
- 1980-04-03 AU AU57193/80A patent/AU536522B2/en not_active Ceased
- 1980-04-04 FR FR8007691A patent/FR2454099A1/fr active Granted
- 1980-04-04 BE BE0/200139A patent/BE882669A/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-04-04 IL IL59772A patent/IL59772A/xx unknown
- 1980-04-07 JP JP4475080A patent/JPS55143441A/ja active Pending
- 1980-04-08 LU LU82345A patent/LU82345A1/fr unknown
- 1980-04-08 DK DK149980A patent/DK149980A/da not_active IP Right Cessation
- 1980-04-09 NO NO801018A patent/NO801018L/no unknown
- 1980-04-09 IT IT48370/80A patent/IT1143135B/it active
- 1980-04-09 NL NL8002094A patent/NL8002094A/nl not_active Application Discontinuation
- 1980-04-09 ES ES490396A patent/ES8103380A1/es not_active Expired
- 1980-04-10 CH CH277880A patent/CH644453A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-04-10 HU HU80871A patent/HU183122B/hu unknown
- 1980-04-10 ZA ZA00802141A patent/ZA802141B/xx unknown
- 1980-04-10 GR GR61652A patent/GR67692B/el unknown
- 1980-04-10 AR AR280624A patent/AR222700A1/es active
- 1980-04-10 KR KR1019800001518A patent/KR830002502A/ko unknown
- 1980-04-10 AT AT0195780A patent/AT365343B/de not_active IP Right Cessation
- 1980-04-10 GB GB8011902A patent/GB2047712B/en not_active Expired
- 1980-04-10 DE DE19803013837 patent/DE3013837A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2047712B (en) | 1983-02-23 |
| LU82345A1 (fr) | 1980-12-16 |
| AU5719380A (en) | 1980-10-16 |
| IT8048370A0 (it) | 1980-04-09 |
| DK149980A (da) | 1980-10-11 |
| BE882669A (fr) | 1980-10-06 |
| HU183122B (en) | 1984-04-28 |
| FR2454099A1 (fr) | 1980-11-07 |
| NO801018L (no) | 1980-10-13 |
| ES490396A0 (es) | 1981-02-16 |
| ZA802141B (en) | 1981-04-29 |
| CH644453A5 (fr) | 1984-07-31 |
| AT365343B (de) | 1982-01-11 |
| ES8103380A1 (es) | 1981-02-16 |
| IE800693L (en) | 1980-10-10 |
| IL59772A (en) | 1983-05-15 |
| AR222700A1 (es) | 1981-06-15 |
| SE8002602L (sv) | 1980-12-09 |
| FR2454099B1 (nl) | 1984-01-27 |
| DE3013837A1 (de) | 1980-10-30 |
| FI801078A (fi) | 1980-10-11 |
| IE49981B1 (en) | 1986-01-22 |
| IT1143135B (it) | 1986-10-22 |
| JPS55143441A (en) | 1980-11-08 |
| ATA195780A (de) | 1981-05-15 |
| AU536522B2 (en) | 1984-05-10 |
| IL59772A0 (en) | 1980-06-30 |
| KR830002502A (ko) | 1983-05-30 |
| GB2047712A (en) | 1980-12-03 |
| GR67692B (nl) | 1981-09-07 |
| PH15637A (en) | 1983-03-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Payne et al. | Interpretation of serum total calcium: effects of adjustment for albumin concentration on frequency of abnormal values and on detection of change in the individual. | |
| Buzanovskii | Determination of proteins in blood. Part 1: determination of total protein and albumin | |
| Gordon et al. | Analysis of serum cancer procoagulant activity and its possible use as a tumor marker | |
| Sonnenblick et al. | Paraprotein interference with colorimetry of phosphate in serum of some patients with multiple myeloma. | |
| Molina et al. | S-100 protein serum levels in patients with benign and malignant diseases: false-positive results related to liver and renal function | |
| HU188057B (en) | Analytical process based on reaction of antigene-antibody and reagent for the process | |
| US4270924A (en) | Diagnostic method for detecting cancer | |
| Gelderman et al. | Lactic dehydrogenase isozymes in urine from patients with malignancies of the urinary bladder | |
| Wojcik et al. | Human epididymis protein 4 (HE4) in patients with small-cell lung cancer | |
| Schwartz et al. | Quantitative assay of erythrocyte “free” and zinc-protoporphyrin: Clinical and genetic studies | |
| NL8002094A (nl) | Diagnostische methode. | |
| US5260186A (en) | Provision of density specific blood cells for the structuredness of the cytoplasmic matrix (SCM) test | |
| Glen | Measurement of DNA and RNA in human peripheral blood lymphocytes | |
| Buffone et al. | Characterization and evaluation of immunochemical methods for the measurement of fecal α 1-antitrypsin | |
| Fernandez et al. | A preliminary study of urinary transferrin as a marker for prostatic cancer | |
| Kuriyama et al. | Clinical evaluation of γ‐seminoprotein in prostate cancer | |
| US4424278A (en) | Cancer detection procedure using an acyl carrier protein | |
| Colleen et al. | Carcinoembryonic Antigen in Urine in Patients with Urothelial Carcinoma: An Expression for the Extent of Inflammatory Reaction of the Urinary Tract | |
| JP2553606B2 (ja) | 密度特異血球の分離及び使用方法 | |
| Vider et al. | Carcinoembryonic antigen (CEA) monitoring in the management of radiotherapeutic patients | |
| Anh-Tuan et al. | Detection and quantitation of hepatitis B surface antigen immune complexes (HBsAg-ICs) by an antigen-specific method. II. Circulating immune complexes (CICs) in patients with hepatitis B and asymptomatic HBsAg carriers | |
| CA2232004C (en) | Method for screening for prostate cancer by measuring apolipoprotein d levels in body fluid | |
| CN106187853B (zh) | 一种化合物及其制备方法和应用 | |
| deVere White et al. | Predicting the invasive potential of bladder carcinoma | |
| Schleich et al. | Ovarian carcinoma: Increase in clinical validity by simultaneous determination of SRA and CA 125 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE |
|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| BV | The patent application has lapsed |