DE3004526C2 - - Google Patents

Description

Es wurde bereits empfohlen, wäßrige Gele aus Agarose als Medium für die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung zu verwenden. Um jedoch eine zufriedenstellende isoelektrische Fokussierung zu bewirken, ist es wesentlich, daß das Gelmedium außerordentlich geringe Elektroendosmoseeigenschaften besitzt, die soweit als möglich an den Wert 0 herankommen. Trotz zahlreicher Anstrengungen, Agarose durch Entfernung ionischer oder geladener Gruppen (wie Sulfat und/oder Carboxylat), die in einem derartigen Gel eine Elektroendosmose verursachen, zu reinigen, war es in praktischer Hinsicht nicht möglich, sämtliche eine Elektroendosmose verursachenden Gruppen zu entfernen, weshalb sogar Gele, die aus hochgereinigter Agarose hergestellt wurden, beträchtliche Elektroendosmosewerte (-Mr) in der Größenordnung von 0,02 oder höher zeigen. Die Größe dieses Werts ist, obgleich er gegenüber dem üblichen Wert für ungereinigte Agarose gering ist, ausreichend hoch, um eine erfolgreiche umfangreiche Verwendung von Agarosegelen als Medium für die isoelektrische Fokussierung auszuschließen.

Demzufolge wurde versucht, die Elektroendosmose von Agarosegelen noch weiter zu reduzieren, indem man mit der Agarose eine Vielzahl von wasserlöslichen Materialien, von denen man annahm, daß sie von ionischen Gruppen frei sind, vermischte, wie Sucrose (Quast, J. Chromat., Band 54, S. 405-412, 1971), Polyäthylenoxid (M.G. 4 000 000) oder Polyacrylamid (Johansson et al., Anal. Biochem., Band 59, S. 200-213, 1974) und Methylcellulose (Weise et al., "Progress in Isoelectric Focusing and Isotachophoresis", Ed. Righetti, North Holland Publishing Co., 1975, S. 93-98). Jedoch besitzt das erstgenannte Material, die Sucrose, wenig oder gar keine Wirkung im Hinblick auf eine Reduzierung des Elektroendosmosewertes des Agarosegels. Die Zugabe von im Handel erhältlichem Polyacrylamid besitzt andererseits eine nachteilige Wirkung auf Gele mit hochgereinigter Agarose, da es selbst eine meßbare Elektroendosmose in wäßriger Gelform zeigt und daher dazu neigt, bei verschiedenen pH-Werten zu hydrolysieren, was zur Bildung von Carboxylatgruppen und zu einer weiteren Zunahme der Elektroendosmose führt. Insoweit als es Polyäthylenoxid (M.G. 4 000 000) und Methylcellulose betrifft, gelieren wäßrige Lösungen dieser Gelmaterialien beim Erhitzen auf Temperaturen in Nähe des Siedepunkts, wohingegen Agarose sich in Wasser nur bei erhöhten Temperaturen, vorzugsweise beim Siedepunkt, löst. Eine Mischung einer dieser beiden trockenen festen Materialien mit Agarose kann demzufolge nicht in Wasser gelöst werden und es ist möglich eine Lösung, die sowohl Agarose als auch eines der weiteren Materialien enthält, nur durch getrenntes Auflösen derselben unter sorgfältiger Temperaturkontrolle zu erhalten.

In der US-PS 35 27 712 (Renn et al.) wurde auch empfohlen, trockene feste Agarose in rehydratisierbarer Form herzustellen, indem man sie in eine bestimmte Art eines makromolekularen Hydrokolloids einarbeitet. Weder die Agarose noch das Hydrokolloid müssen einen speziellen Reinheitsgrad besitzen und viele der als geeignet beschriebenen Hydrokolloide enthalten geladene oder ionische Gruppen, die zu einer Elektroendosmose führen. Zwei der beschriebenen Hydrokolloide sind Polyäthylenoxide mit niedrigem Molekulargewicht. 10 Gew.-%ige Lösungen derselben in Wasser besitzen Viskositäten weit unterhalb von 10 mPa · s bei 25°C und sind hinsichtlich der Reduzierung des Elektroendosmosewertes der Agarose unwirksam. Obgleich Guargummi, ein nicht ionisches Material, als Hydrokolloid beschrieben wird, werden weder gereinigter bzw. geklärter Guargummi noch gereinigter bzw. geklärter Johannisbrotschotengummi, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung benötigt werden, erwähnt. Ungereinigter Guargummi und ungereinigter Johannisbrotschotengummi enthalten Hülsenfragmente und andere Verunreinigungen, die eine bei isoelektrischen Fokussierverfahren verwendete Färbung undeutlich machen oder beeinträchtigen.

Aufgabe der Erfindung ist es demgegenüber ein getrocknetes Agarosegelgemisch bereitzustellen, das verwendbar ist bei der Herstellung von wäßrigen Gelen mit in hohem Ausmaß reduziertem oder nicht meßbarem Elektroendosmosewert über einen weiten Bereich von pH-Werten, die ihrerseits als Medium für die Durchführung einer isoelektrischen Fokussierung von Proteinen eingesetzt werden können.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein getrocknetes Agarosegelgemisch mit einem in siedendem Wasser ohne Gelbildung löslichen Gummi, das als wäßriges Gel für die isoelektrische Fokussierung geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß es

• a) 2-99 Gew.-% Agarose, die so gereinigt ist, daß sie einen Endosmosewert von höchstens 0,1 aufweist, und
• b) einen Gummi, der gegen ionische Hydrolyse stabil ist, dessen höchstens 10 Gew.-%ige Lösung in Wasser eine Viskosität von mindestens 10 mPa · s bei 25°C hat und der so gereinigt ist, daß er frei von Hülsenfragmenten, die Färbung beeinträchtigenden Verunreinigungen und ionischen Verunreinigungen ist,

enthält.

Die in dem vorliegenden Gemisch verwendete Agarose kann irgendeine sein, die ausreichend gereinigt worden ist, so daß sie einen Elektroendosmosewert (-Mr) von 0,10 oder niedriger besitzt, wobei verschiedene derartige Agarosen nunmehr im Handel erhältlich sind. Eine Agarose mit einem derartigen Reinheitsgrad unterscheidet sich von einer Agarose, die früher allgemein erhältlich war insoweit als gereinigte Produkte keine Zunahme der Gelstärke in Mischung mit Johannisbrotschotengummi oder geklärtem Johannisbrotschotengummi zeigen, wohingegen eine Agarose mit einem niedrigeren Reinheitsgrad (mit einem (-Mr)-Wert von höher als 0,10) eine derartige Zunahme der Gelstärke zeigt, wie es beispielsweise in der US-PS 24 66 146 beschrieben wird. Der Elektroendosmosewert der unreinen Agarose kann nicht eliminiert oder auf 0 herabgesetzt werden, indem man sie mit einem wasserlöslichen Gummi mit hoher Viskosität mischt, wie es bei demjenigen der gereinigten Agarose der Fall ist.

Der Elektroendosmosewert der Agarose wird gemessen, indem man eine 1-Gew.-%ige Lösung der Agarose in einem 0,05 m Barbitalpuffer mit einem pH-Wert von 8,6 herstellt. Man gießt drei Milliliter der Lösung auf einen reinen Objektträger eines Mikroskops und läßt bei Raumtemperatur gelieren. Unter Verwendung einer abgekanteten Nadel für die subkutane Injektion mit kleinem Durchmesser (Nr. 13), die an eine Spritze für die subkutane Injektion angebracht ist, wird aus dem Zentrum des Gels ein einziges Loch mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm abgesaugt. Man stellt eine Standardtestlösung her, die aus 10 mg pro ml Dextran 500 und 2 mg pro ml kristallinem (4x) Humanalbumin in 0,05 m Barbitalpuffer mit einem pH von 8,6 besteht. Unter Verwendung eines Tropfenzählers mit kleiner Öffnung wird ausreichend Lösung zugegeben, um das abgesaugte Loch nahezu zu füllen. Die Objektträger werden dann unter Verwendung von Papierdochten für die Elektrophorese in Position gebracht. Man wendet eine Spannung von 10 Volt pro cm (75 Volt) unter Verwendung konstanter Spannungseinstellungen an.

Die Elektrophorese wird drei Stunden fortgesetzt und danach entfernt man die Objektträger. Die Sichtbarmachung wird in zwei Stufen durchgeführt. Die Objektträger werden zuerst in denaturiertes (3A) Äthanol 15 Minuten, nachdem die Position des Dextrans im Hinblick auf den Ausgangspunkt gemessen werden kann (Zentrum zu Zentrum), eingebracht. Nach der Messung werden die Objektträger zu der Proteinfärbelösung übergeführt, die aus 0,5 g Amidoschwarz in 50 ml Eisessig unter anschließender Auffüllung mit 500 ml Äthanol hergestellt wurde. Nach 15 Minuten werden die Objektträger in einer Lösung von Essigsäure (5%) : Äthylalkohol (1 : 1) gewaschen, um überschüssige Farbe zu entfernen. Es ist eine Stunde ausreichend, obgleich die Albuminposition gewöhnlich nach 15 Minuten bestimmt werden kann. Man mißt den Abstand vom Zentrum des Fleckens zum Zentrum der Ausgangsposition.

Mit Hilfe eines Diagramms kann dies wie folgt dargestellt werden:

Der Grad der Elektroendosmose (-Mr) kann unter Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt werden:

Die Gelstärken (auch bekannt als "Bruchfestigkeit") auf die vorliegend Bezug genommen wird, können unter Verwendung des folgenden Verfahrens gemessen werden. Man füllt 500 g der zu untersuchenden Lösung derart auf, daß man die vorgeschriebenen Prozentanteile an extraktiven und anderen Bestandteilen erhält. Es ist zweckmäßig, zu Beginn die Zusammensetzung derart herzustellen, daß die Wassermenge geringfügig weniger ist als die insgesamt erforderliche, und die Zusammensetzung auf einem Wasserbad bei ca. 100°C unter Rühren wähend ca. 5 Minuten zu erhitzen, um die Auflösung der Feststoffe zu bewirken. Die Lösung wird dann auf das endgültige 500-g-Gewicht eingestellt und während sie noch heiß ist, in drei gleiche Teile geteilt, wobei jeder Teil in eine Kristallisationsschale mit einem Durchmesser von 7 cm, d. h. mit einer Tiefe von 5,0 cm, eingebracht wird, die in ein bei der vorgeschriebenen Testtemperatur gehaltenes Wasserbad gegeben wird. Danach werden die Schalen aus dem Wasserbad entnommen und der gelierte Gehalt einer jeden entfernt und nach dem Umdrehen in seine Schale wieder hineingegeben. Jede, das umgedrehte Gel enthaltende Schale wird auf den Auffang der Vorrichtung gestellt, die zur Messung der Kraft verwendet wird, die von einem Kolben mit einem Durchmesser von 1 cm, der mit einer Geschwindigkeit von 16,83 cm pro Minute absteigt, gegen die obere Oberfläche des Gels ausgeübt wird, bis die Kraft plötzlich zum Zeitpunkt des Reißens des Gels abfällt. Die festgestellte maximale Kraft wird als die das Brechen herbeiführende Kraft notiert. Die das Brechen herbeiführende Kraft für jede der drei Proben wird festgehalten und ihr Durchschnitt als Wert für die Gelfestigkeit für die zu untersuchende Extraktion zugrunde gelegt. Während andere Typen an Meßvorrichtungen verwendet werden können, wird die zur Ermittlung des vorliegenden Bruchfestigkeitswertes verwendete Vorrichtung in der US-PS 33 42 612 erläutert und beschrieben. Die vorliegend verwendete Vorrichtung besitzt einen automatischen Antrieb, um den Stempel mit einer konstanten Geschwindigkeit von 16,83 cm pro Minute vorrücken zu lassen. Zu Zwecken des Tests wird die Gelierung durch Kühlen der Lösung während 24 Stunden auf 5 bis 10°C bewirkt und die Messung wird bei 25°C unter Verwendung eines Stempels mit einem Durchmesser von 1 cm durchgeführt.

Eines von zahlreichen bekannten Reinigungsverfahren einschließlich der fraktionierten Ausfällung, der Adsorption von Verunreinigungen an einer festen Phase wie in der Ionenaustauscherchromatographie und dergl., kann entweder allein oder in Kombination verwendet werden, um den Sulfat- und/oder Carboxylatgehalt der Agarose und deren Elektroendosmosewert herabzusetzen.

Der wasserlösliche Gummi muß ein solcher sein, der sich in Wasser bei Temperaturen bis zum Siedepunkt (100°C bei 0,98 bar) ohne Gelierung von selbst löst. Der Gummi muß von selbst eine Lösung mit nennenswerter Viskosität bilden, d. h. eine Lösung die bei einer Konzentration von nicht höher als 10 Gew.-% an Gummi eine Viskosität von zumindest 10 mPa · s bei 25°C aufweist. Einige geeignete wasserlösliche Gummi bilden Lösungen dieser Viskosität bei niedriger Konzentration in der Größenordnung von 0,1 Gew.-% oder sogar geringer, während andere Lösungen mit der angegebenen Viskosität lediglich bei einer Konzentration von annähernd 10 Gew.-% bilden. Diese und andere Viskositäten, auf die vorliegend Bezug genommen wird, können am geeignetesten mit Hilfe eines Brookfield-Viskosimeters bei 30 UpM unter Verwendung einer Spindel Nummer 1 gemessen werden. Unter den geeignetesten Gummis befinden sich geklärter bzw. gereinigter Johannisbrotschotengummi, geklärter bzw. gereinigter Guargummi, Polyvinylalkohol und Dextran. Der Gummi muß von ionischen oder geladenen Substituenten bzw. Gruppen, die dazu neigen, eine Elektroendosmose zu verursachen, frei sein und muß gegenüber einer Hydrolyse, die derartige ionische oder geladene Gruppen hervorrufen könnte, beständig sein. Wie vorstehend ausgeführt ist Polyacrylamid ausgenommen aufgrund der Elektroendosmoseeigenschaften von im Handel erhältlichem Polyacrylamid und aufgrund der Neigung dieses Materials, bei verschiedenen pH-Niveaus unter Bildung von Carboxylatgruppen und/oder einer Zunahme der Elektroendosmose zu hydrolysieren. Im Falle von Naturprodukten oder natürlichen Gummis, wie Johannisbrotschotengummi und Guargummi ist es wesentlich, daß der Gummi in geklärter bzw. gereinigter Form vorliegt und frei ist von Hülsenfragmenten und anderen Verunreinigungen, die bei der isoelektrischen Fokussierung verwendete Färbetechniken undeutlich machen oder beeinträchtigen.

Das trockene feste Gemisch enthält 2 bis 99 Gew.-% gereinigte Agarose, wobei der verbliebene Teil im wesentlichen aus wasserlöslichem Gummi besteht, und es liegt bevorzugt in fein verteilter Form vor. Je größer das Ausmaß der Elektroendosmose ist, die bei verschiedenen Gels aus gereinigter Agarose allein in Erscheinung tritt, um so größer ist die Menge des in dem Gemisch erforderlichen wasserlöslichen Gummis. Je geringer die Konzentration an wäßriger Lösung des Gummis allein mit der erforderlichen Viskosität ist, um so weniger Gummi ist erforderlich, um eine gegebene Abnahme hinsichtlich der Elektroendosmoseeigenschaften des wäßrigen aus dem Gemisch hergestellten Gels herbeizuführen. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das trockene Gemisch im wesentlichen aus fein verteilten Teilchen von gereinigter Agarose im Gemisch mit Gummiteilchen. Die Teilchengröße ist nicht kritisch und kann irgendeine für eine rasche Auflösung in Wasser geeignete sein im Bereich von sehr groben Teilchen in der Größenordnung von 1 mm oder mehr für den Durchmesser bis herab zu einer so geringen, wie sie in geeigneter Weise durch Vermahlen erzielt wird, in der Größenordnung von solchen, die durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,038 mm bzw. durch eine Sieböffnung von 38 Mikron nach der ASTM-Testmethode E-11-61 hindurchgelangen.

Vorzugsweise besitzt die verwendete gereinigte Agarose einen Elektroendosmosewert (-Mr) von nicht höher als 0,05 und das Gemisch enthält 50 bis 90 Gew.-% der gereinigten Agarose, wobei der Rest von 10 bis 50 Gew.-% der wasserlösliche Gummi ist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein wäßriges Gel für die isoelektrische Fokussierung mit einer Gelstärke von mindestens 100 g/cm², das dadurch gekennzeichnet ist, daß es 0,2-10 Gew.-% des vorliegenden Gemisches in Wasser enthält.

Das vorliegende Gemisch kann verwendet werden, indem man es einfach in Wasser durch Erhitzen und Rühren in der gleichen Weise wie beim Auflösen von Agarose allein löst. Die Ampholyte und/oder Puffer, die in dem Gel für die Verwendung bei der isoelektrischen Fokussierung erforderlich sind, können mit dem trockenen festen Gemisch vermischt werden oder sie können getrennt vor dem Eintreten der Gelierung gelöst werden. Sie können auch später nach dem Erhitzen des Gels zur Verflüssigung desselben zugegeben werden, wobei man danach erneut gelieren läßt. Die für die Bildung des Gels verwendete Menge des Gemisches kann in weitem Umfang in Abhängigkeit von der gewünschten Gelstärke oder Porosität variieren. Die für die Auflösung in Wasser zur Bildung eines Gels mit der angegebenen Stärke erforderliche Agarosemenge kann beträchtlich in Abhängigkeit von der Agarosequelle und ihrer "Vorgeschichte", sowie ihres Reinheitsgrades variieren. Aus praktischen Erwägungen beträgt die minimale Stärke für ein als Medium zur isoelektrischen Fokussierung verwendbares Gel ca. 50 g/cm². Die Erfindung betrifft daher auch ein wäßriges Gel für die isoelektrische Fokussierung mit einer Gelstärke von mindestens 50 g/cm², das dadurch gekennzeichnet ist, daß es 0,2 bis 10 Gew.-% des vorliegenden Gemisches enthält, bei dem die Agarose einen Elektroendosmosewert von höchstens 0,05 aufweist und in einer Menge von 50 bis 90 Gew.-% vorliegt.

Da die Gummikomponente des erfindungsgemäßen Gemisches die Gelstärke der gereinigten Agarose nicht beeinflußt, ist es die Agarosemenge in dem Gemisch, das gelöst wird, die die Stärke des Gels kontrolliert. Im Fall von bestimmten im Handel erhältlichen Agarosen kann die Gelstärke eines 1 Gew.-% Agarose enthaltenden Gels so hoch wie 1000 bis 1500 g/cm² sein, während andere beträchtlich niedrigere Stärken unter den gleichen Bedingungen aufweisen.

Überdies ist es in praktischer Hinsicht erwünscht, daß die heiße Lösung des Gemisches in Wasser eine ausreichend niedrige Viskosität besitzt derart, daß die Lösung rasch gegossen werden kann, d. h. eine Viskosität von nicht größer als ca. 6000 mPa · s bei 75°C, unter Verwendung eines Brookfield- Viskosimeters mit geeignetem Zusatzgerät.

Es ist auch wichtig, daß ausreichend Gummikomponente vorliegt, derart, daß sie in Abwesenheit von Agarose eine Lösung in Wasser mit einer Viskosität von zumindest 10 mPa · s bei 25°C bildet. Demzufolge kann die Menge des Gemisches der gereinigten Agarose mit einem wasserlöslichen Gummi, die in einem erfindungsgemäßen wäßrigen Gel verwendet wird, von ca. 0,2 bis 10 Gew.-% des Wassers, vorzugsweise 0,2 bis 2 Gew.-% variieren. Gele, die 0,2 bis 2% des Gemisches, bezogen auf das Gewicht des Wassers enthalten, sind bevorzugt, da derartige Gele wenig oder keine Molekularsiebwirkung ungeachtet des Molekulargewichts oder der Größe des einer isoelektrischen Fokussierung unterzogenen Proteins besitzen, so daß nahezu die gesamte erfolgende molekulare Trennung lediglich eine Funktion des isoelektrischen Punkts eines jeden Proteins ist. Zusätzlich gestatten die bevorzugten Gele eine schnelle Diffusion der Proteinprobe in das Gel.

Es ist auch möglich, ein derartiges, von einer Elektroendosmose freies wäßriges Gel herzustellen, indem man die gereinigten Agarose und den Gummi individuell in einem einzigen Wasservolumen löst. Dies bedeutet, daß das Gel erfindungsgemäß hergestellt werden kann, indem man in Wasser bei erhöhter Temperatur löst: a) gereinigte Agarose mit einem Elektroendosmose (-Mr)-Wert von nicht höher als 0,10 und b) einen wasserlöslichen, von Hülsenfragmenten und anderen Verunreinigungen, die eine Färbung beeinträchtigen, freien Gummi, der zudem frei ist von geladenen Gruppen und von selbst in siedendem Wasser ohne Gelierung löslich ist unter Bildung einer Lösung mit einer Viskosität bei einer Konzentration von nicht größer als 10 Gew.-% von zumindest 10 mPa · s bei 25°C, wobei die Gesamtmenge der Agarose und des Gummis 0,2 bis 10 Gew.-% des Wassers betragen, die Menge der Agarose 2 bis 99 Gew.-% der Gesamtmenge beträgt und die Menge des Gummis ausreichend ist, um in Abwesenheit der Agarose eine Lösung in dem Wasser mit einer Viskosität von zumindest 10 mPa · s bei 25°C zu bilden, und indem man die Lösung unter Bildung eines Gels abkühlen läßt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung von Proteinen in einem wäßrigen Gel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Gel mit einer Gelstärke von mindestens 100 g/cm² verwendet, das 0,2-10 Gew.-% des vorliegenden Gemisches in Wasser enthält.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiele

Man trennt Agarose aus im Handel erhältlichem Agar ab, indem man eine Agarlösung bildet, zu der man in gelöstem Zustand ein anderes Polysaccharid wie Karrageenan zugibt, das höher sulfatisiert ist als die Agaropectin-Komponente des Agars und das in abtrennbarer ausgeflockter Form durch Zugabe eines quaternären Ammoniumsalzes ausgefällt wird. Hierbei wird das Agaropectin, das andernfalls in schwierig abtrennbarer Form ausgefällt wird, durch den Einschluß eines quaternären Ammoniumsalzes in der Lösung in gewisser Weise mit dem durch Ausfällen des zugegebenen Polysaccharids gebildeten Niederschlag kombiniert. Dies hat zur Folge, daß wenn der Niederschlag des zugegebenen Polysaccharids aus der verbliebenen Agaroselösung durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt wird, das Agaropectin auch wirksam aus der Lösung entfernt und von der nicht-ionischen Agarose, die in der Lösung verbleibt, abgetrennt werden kann. Die in der Lösung verbleibende Agarose kann ausgefällt werden, z. B. durch Zugabe von Isopropanol, und danach gewonnen werden, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren (Blethen et. al., US-PS 32 81 409). Man stellt dann eine Lösung her, indem man 12,0 g Agarose in 600 ml Wasser unter Rühren erhitzt. Zu der Lösung gibt man nach dem Abkühlen auf 60°C 200 g der in Wasser gequollenen und entwässerten Kügelchen eines Kationenaustauscherharzes, QAE Sephadex, und rührt die Mischung eine halbe Stunde bei 60°C und filtriert. Zu der Lösung gibt man 2 l 80%iges wäßriges Isopropanol bei 45°C zu, um die gereinigte Agarose zu koagulieren, die dann auf einem Sieb abgetrennt und bei 50°C getrocknet wird und in einer Hammermühle auf eine Korngröße von 0,84 mm vermahlen wird. Ein Teil der gereinigten Agarose wurde in Wasser gelöst, indem man auf 90°C erhitzt, um eine 1 Gew.-% Agarose enthaltende Lösung zu erhalten und abgekühlt, um sie zu gelieren. Für ihre Elektroendosmose (-Mr) findet man einen Wert von 0,03. Für die Gelstärke des 1 Gew.-% gereinigte Agarose enthaltenden Gels wird ein Wert von ca. 950 g/cm² ermittelt.

Man dispergiert in 500 ml destilliertem Wasser 5 g Johannisbrotschotengummi (Pulver) und erhitzt die Mischung auf 100°C und siedet 30 Sekunden. Man gibt 10 g Diatomeenerde-Filterhilfe zu der erhaltenen Lösung zu und filtriert die Mischung bei einem Druck von 0,69 bis 1,38 bar durch eine vorerhitzte Filterbombe, die mit einem geeigneten Filztuch für den Filterkuchen ausgestattet ist. Nach Beendigung des Filtrierens wird der Filterkuchen mit 75 ml destilliertem Wasser gewaschen und das vereinigte Filtrat und die Waschwässer werden koaguliert, indem man mit 2,5 Volumina 85%igem Isopropanol mischt. Nach dem Entwässern auf einem Sieb wird das Koagulum erneut in 85%igem Isopropanol suspendiert, 15 Minuten stehengelassen, entwässert und durch 4- bis 6stündiges Erhitzen auf 60°C getrocknet und anschließend in einer Hammermühle auf eine Korngröße von 0,37 bis 0,84 mm vermahlen (Ausbeute ca. 3-3,5 g). Dieser gereinigte bzw. geklärte Johannisbrotschotengummi ist wasserlöslich, frei von geladenen oder ionischen Gruppen, stabil gegenüber einer Hydrolyse, die geladene Gruppen bildet und frei von Hülsen und anderen Verunreinigungen, die Farbe annehmen und eine Färbung und/oder den Nachweis von Proteinen in dem Gel beeinträchtigen. Eine wäßrige 0,3 Gew.-% des Gummis enthaltende Lösung zeigt von selbst eine Viskosität mit einem Wert von größer als 10 mPa · s bei 25°C.

Man stellt ein Gemisch her, indem man 70 Gewichtsteile der gereinigten fein verteilten, wie vorstehend beschrieben hergestellten Agarose und 30 Gewichtsteile fein verteilte Teilchen des geklärten Johannisbrotschotengummis mischt. Das Gemisch wird rasch in Wasser gelöst, indem man 0,5 g in 100 ml Wasser rührt und zum Siedepunkt oder bis zur vollständigen Auflösung erhitzt. Die Lösung wird dann auf 56°C abgekühlt und man gibt unter Rühren 2 Gew.-% Ampholyte zu. Die Lösung wird in eine geeignete Form gegossen und man läßt sie durch Abkühlen gelieren und lagert sie danach bei 4°C während zumindest einer Stunde vor ihrer Verwendung.

Für das so hergestellte Gel findet man keine meßbare Elektroendosmose und eine Gelstärke von 350 g/cm². Eine Probe der auf die Oberfläche des Gels in üblicher Weise aufgebrachten Proteinlösung wird auf wirksame Weise einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen.

Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn man den Johannisbrotschotengummi durch eine Guargummiprobe in der gleichen Menge ersetzt.

Verwendet man Polyvinylalkohol und Dextran anstelle des geklärten Johannisbrotschotengummis bei Konzentrationen, die Viskositäten von höher als 10 mPa · s bei 25°C ergeben (d. h. ca. 2 bis 10%), erhält man ähnliche Ergebnisse.

Claims (12)

1. Getrocknetes Agarosegelgemisch mit einem in siedendem Wasser ohne Gelbildung löslichem Gummi, das als wäßriges Gel für die isoelektrische Fokussierung geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß es

• a) 2-99 Gew.-% Agarose, die so gereinigt ist, daß sie einen Endosmosewert von höchstens 0,1 aufweist, und
• b) einen Gummi, der gegen ionische Hydrolyse stabil ist, dessen höchstens 10 Gew.-%ige Lösung in Wasser eine Viskosität von mindestens 10 mPa · s bei 25°C hat und der so gereinigt ist, daß er frei von Hülsenfragmenten, die Färbung beeinträchtigenden Verunreinigungen und ionischen Verunreinigungen ist,

enthält.

2. Gemisch nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gummi gereinigter bzw. geklärter Guargummi ist.

3. Gemisch nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gummi gereinigter bzw. geklärter Johannisbrotschotengummi ist.

4. Gemisch nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gummi Polyvinylalkohol ist.

5. Gemisch nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gummi Dextran ist.

6. Wäßriges Gel für die isoelektrische Fokussierung mit einer Gelstärke von mindestens 100 g/cm², dadurch gekennzeichnet, daß es 0,2-10 Gew.-% eines Gemisches nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Wasser enthält.

7. Gemisch nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Agarose einen Elektroendosmosewert von höchstens 0,05 aufweist und in einer Menge von 50 bis 90 Gew.-% vorliegt.

8. Wäßriges Gel für die isoelektrische Fokussierung mit einer Gelstärke von mindestens 50 g/cm², dadurch gekennzeichnet, daß es 0,2 bis 10 Gew.-% eines Gemisches nach Anspruch 7 enthält.

9. Wäßriges Gel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch nach Anspruch 7 in einer Menge von 0,2 bis 2 Gew.-% des Wassers vorliegt.

10. Verfahren zur Herstellung eines elektroendosmosefreien wäßrigen Gels, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch nach Anspruch 1 in heißem Wasser löst und die Lösung zur Bildung des Gels abkühlen läßt.

11. Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung von Proteinen in einem wäßrigen Gel, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gel gemäß Anspruch 6 verwendet.