DK158587B - Agarosegelmateriale til brug ved isoelektrisk fokusering, vandige geler deraf og fremgangsmaade til fremstilling af en saadan gel - Google Patents

Description

i DK 158587B

Den foreliggende opfindelsen angår et agarosegelmateriale til brug ved isoelektrisk fokusering, vandige geler deraf og fremgangsmåde til fremstilling af en sådan gel. Et sådant agarosegelmateriale er en fint fordelt faststof-blanding af renset agarose og en gummiart, der er fri for elektrisk ladede grupper, og som i kogende vand danner en 5 højviskøs opløsning uden geldannelse, idet blandingen er opløselig i vand, til dannelse af en gel, der ikke besidder nogen elektroendoosmose egenskaber (-Mr).

Man har tidligere foreslået anvendelsen af vandige geler 10 fremstillet ud fra agarose som et substrat, hvori man kan udføre isoelektrisk fokusering. For at opnå tilfredsstillende isoelektrisk fokusering er det imidlertid absolut nødvendigt, at gel-substratet har ekstremt lave elektroendoosmose egenskaber så tæt til værdierne nul som 15 muligt. Til trods for mange bestræbelser for at rense agarose ved at fjerne iongrupperne eller de elektrisk ladede grupper (såsom sulfat og/eller carboxylat), som forårsager elektroendoosmose egenskaber i en sådan gel, har det ikke været muligt som en praktisabel fremgangs-20 måde at fjerne alle disse grupper, som forårsager elektroendoosmose, og som følge heraf udviser selv geler, der er fremstillet ud fra højt renset agarose, betydelige elektroendoosmose værdier (-Mr) i størrelsesordenen 0,02, eller højere. Størrelsesordenen for denne værdi, skønt

OC

" den er lille i sammenligning med de sædvanlige værdier for urenset agarose, er tilstrækkelig stor til at udelukke vellykket udbredt anvendelse af agarosegeler som substrat til isoelektrisk fokusering. Man har som følge heraf forsøgt at reducere elektroendoosmose egenskaberne 30 for agarosegeler yderligere ved, at man sammenblander med agarose forskellige vandopløselige materialer, som må formodes at være frie for iondannende grupper, såsom saccharose (Quast, J. Chromat., bind 54, siderne 405-412, 1971), polyethylenoxid (molekylevægt 4.000.000) eller 35 polyacrylamid (Johansson et al., Anal. Biochem., bind 59,

DK 158587 B

2 siderne 200-213, 1974), samt methylcellulose (Weise et al., Progress in Isoelektric Focusing and Isotachophoresis, Ed. Righetti, North Holland Publishing Co., 1974, siderne 93-98). Førstnævnte materiale, udviser 5 imidlertid ingen eller ganske ringe virkning med hensyn til reduktion af elektroendoosmose egenskaberne for agarosegel. Tilsætning af kommercielt tilgængeligt polyacrylamid har på den anden side en ugunstig virkning på geler fremstillet af højt renset agarose, eftersom det 10 i sig selv udviser målelige elektroendoosmose egenskaber i vandig gelform, og eftersom det har tilbøjelighed til at hydrolysere ved forskellige pH-niveauer, hvilket fører til dannelse af carboxylatgrupper og en yderligere forøgelse af elektroendoosmose egenskaberne. Med hensyn 15 til polyethylenoxid (molekylvægt 4.000.000) og methyl cellulose, gelerer vandige opløsninger af disse materialer ved opvarmning til temperaturer, der nærmer sig kogepunktet, medens agarose blot opløses i vand ved forhøjede temperaturer, fortrinsvis ved kogepunktet. En 20 blanding af en hvilken som helst af disse to tørre faste materialer med agarose kan som følge heraf ikke opløses i vand, og det er kun muligt at fremstille en opløsning, der indeholder såvel agarose som et af disse andre materialer, ved at opløse dem hver for sig under 25 omhyggelig temperaturkontrol.

Det er ligeledes blevet foreslået af Renn et al. i USA-patentskrift nr. 3 527 712, udstedt 8. september 1970, at fremstille fast, tørt agarose i gen-hydratiserbar form 30 ved at inkorporere deri en vis form for makromolekylær hydrokolloid, idet dog hverken agarosen eller hydrokollo-idet er belagt med krav til en særlig grad af renhed, og adskillige af de som egnede omtalte hydrokolloider indeholdende elektrisk ladede eller iondannende grupper, som 35 frembringer elektroendoosmose. To af de omtalte hydrokolloider er polyethylenoxider med lav molekylvægt. 10 vægter opløsninger af sådanne i vand har viskositeter betyde-

DK 158587 B

3 ligt under 10 mPaxs ved 25 °C, hvilket er uønskværdigt af hensyn til anvendelsen ved isoelektrisk fokusering; og de er uden virkning med hensyn til at reducere agarosens elektroendoosmose værdier. Skønt guargummi, der er ikke-5 iondannende materiale, omtalt som værende et hydrokol-loid, omtales hverken renset guargummi eller renset Johannesbrødkernemel, som er nødvendige til anvendelsen ifølge den foreliggende opfindelse. Ikke-renset guargummi og ikke-renset Johannesbrødkernemel indeholder skalbe-10 standdele og andre urenheder, som tilslører eller interfererer med den farvemetode, der anvendes ved isoelektrisk fokuseringsfremgangsmåderne.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes en tør 15 faststofblanding, fortrinsvis i fint fordelt form, bestående af (1) renset agarose med en elektroendoosmose værdi (-Mr) under 0,10 sammen med (2) en vandopløselig gummiart, der er fri for skalbestanddele, der er fri for iondannende substituenter, dvs. elektrisk ladede grupper, 20 der i sig selv er opløselige i vand uden geldannelse ved temperaturer op til og inklusive kogepunktet (100 °C ved 760 mmHg) til dannelse af en viskøs opløsning, der har en viskositet på mindst 10 mPaxs ved 25 °C ved koncentrationer mindre end 10 vægt-%, idet denne omtalte blanding er 25 anvendelig til fremstilling af vandige geler med betydeligt formindskede eller ikke-målelige elektroendoosmose egenskaber gennem et bredt område af pH-værdier. Sådanne geler har stor værdi til anvendelse som substrat, hvori man kan udføre isoelektrisk fokusering af proteiner.

30

Agarosematerialet ifølge opfindelsen er af den i krav l's indledning angivne art og er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne. Desuden angår opfindelsen vandige geler fri for elektroendoosmose egenskaber og 35 anvendelige som substrat ved isoelektrisk fokusering, og de er ejendommelige ved det i krav 3's kendetegnende del angivne.

DK 158587B

4

Den til denne blanding anvendte agarose kan være en hvilken som helst, der er blevet tilstrækkeligt renset til, at den viser en elektroendoosmose værdi (-Mr) på 0,01 eller mindre, af hvilke agarosetyper der nu findes adskil-5 lige kommercielt tilgængelige. Agarosetyper med denne grad af renhed adskiller sig fra de tidligere almindeligt tilgængelige agarosetyper derved, at sådanne rensede materialer ikke udviser nogen forøgelse i gelstyrke, når de sammenblandes med Johannesbrødkernemelgummi eller ren-10 set Johannesbrødkernemelgummi, medens agarose med en mindre renhedsgrad (som har en -Mr-værdi større end 0,10) udviser en sådan forøgelse i gelstyrke, således som det f.eks. er omtalt af Baker i USA-patentskrift nr.

2 466 146. Elektroendoosmose værdierne for uren agarose 15 kan ikke fjernes eller formindskes til nul ved sammenblanding deraf med en vandopløselig gummiart med høj viskositet, således som det er tilfældet med renset agarose.

Man måler elektroendoosmoseværdien for agarosen derved, 20 at man fremstiller en opløsning på 1 vægt-% agarose i 0,05 molær pH 8,6 barbitalbuffer. 3 ml af opløsningen hældes på et tørt mikroskopobjektglas og får lov til at danne gel ved stuetemperatur. Idet man anvender en injektionsnål (nr. 13), der er skåret over, og som er forbun-25 det med en injektions sprøjte, suger man et enkelt hul på 1-2 mm diameter fra midten af gelen. Man fremstiller en standardafprøvningsopløsning, som består af 10 mg/ml dex-tran 500 (Pharmacia) og 2 mg/ml krystallinsk (4x) humant albumin i 0,05 molær pH 8,6 barbital buffer. Under anven-30 delse af en pipette med ganske lille diameter anbringer man tilstrækkelig opløsning til næsten at fylde de ovenfor omtalte udsugede huller. Objektglassene bringes derpå parat til elektroforese under anvendelse af papirvæger.

Man påtrykker et potentiale på 10 volt cm (75 volt), idet 35 man anvender en indstilling til konstant spænding.

DK 158587 B

5

Elektroforesen fortsætter i 3 timer, og derpå fjernes glassene. Fremkaldelsen udføres i to trin. Først anbringes glassene i denatureret (3Ά) ethanol i 15 minutter, hvorefter man kan måle placeringen af dextranet i forhold 5 til udgangspunktet (centrum til centrum). Efter måling overføres glassene til en proteinfarvningsopløsning, der er fremstillet ud fra 0,5 g amidosort i 50 ml iseddikesyre, som derpå fyldes op til 500 ml med ethanol. Efter 15 minutter vaskes glassene i en opløsning i forholdet 1:1 10 eddikesyre (5%):ethylalkohol, til bortfjernelse af overskydende farvemiddel. 1 time er tilstrækkelig lang tid, skønt albuminplaceringen sædvanligvis kan bestemmes efter 15 minutters forløb. Afstanden fra plettens centrum til centrum for udgangspunktet måles.

15 I diagramform kan dette udtrykkes som følger: + A 0 D - A=albumin, 0=påføringsstedet (oprindelsen), D=dextran 20

Graden af elektroendoosmose (-Mr) kan beregnes under anvendelsen af ligningen:

OD

-Mr = — .

AO+OD

25

Gelstyrkeværdierne (der ligeledes omtales som "brudstyrkerne"), således som de her omtales, kan måles under anvendelse af følgende fremgangsmåde. Man fremstiller en mængde på 500 g af den opløsning, der skal afprøves, således at den indeholder de foreskrevne procentandele af 30 ekstraktive og andre bestanddele. Det er bekvemt i første trin at fremstille blandingen således, at vandmængden er lidt mindre end den totalt krævede mængde, og derpå at 35

DK 158587 B

6 opvarme blandingen på et vandbad til ca. 100 °C under omrøring i ca. 5 minutter for at sikre opløsningen af de faste bestanddele. Opløsningen justeres derpå til den endelige vægt på 500 g, og medens den stadig er varm, 5 opdeles den i tre lige store portioner, idet hver portion anbringes i et 7 cm diameter krystallisationskar, der er 5,2 cm dybt, og som anbringes i et vandbad, der holdes ved den foreskrevne afprøvningstemperatur. Derpå fjernes krystallisationskarrene fra vandbadet, og det i gelform 10 værende indhold i hvert af disse fjernes og anbringes igen i sin egen skål efter at være blevet vendt på hovedet. Hver skål, som nu indeholder sin gel vendt på hovedet, anbringes på prøvebordet af den anordning, der anvendes til at måle den kraft, der udøves af et stempel 15 med en diameter på 1 cm, som går nedad med en hastighed på 16,83 cm/min. imod den øvre overflade af gelen, indtil kraften pludselig svækkes i det øjeblik, hvor gelen brister. Den største kraft registreret betegnes som brudstyrken. Brudstyrken for hver af de tre prøver nedskrives, og 20 gennemsnittet betragtes som gelstyrkeværdien for den afprøvede blanding. Skønt man kan anvende andre typer på måleinstrumenter, er det apparat, der er anvendt til at måle de her anførte brudstyrker, beskrevet af Foster et al. i USA-patentskrift nr. 3 342 612, udstedt 19. septem-25 ber 1967. Den her anvendte anordning var forsynet med en automatisk fremføringsmekanisme, som bevægede stemplet med en konstant hastighed på 16,83 cm/min. Geldannelsen er komplet med henblik på denne afprøvning efter afkøling af opløsningen ved 5-10 °C i 24 timer, og målingen udfø-30 res ved 25 °C, idet man anvender et stempel med en diameter på 1 cm.

Til nedbringelse af sulfat- og/eller carboxylatindholdet af agarosen og til nedbringelse af dennes elektroendo-35 osmose værdier kan man anvende en hvilken som helst af de kendte rensemetoder inklusive fraktioneret udfældning, fastfaseadsorption af urenheder, såsom ved ionbytning,

DK 158587 B

7 kromatografering og lignende, enten hver for sig eller i kombination med hverandre.

Den vandopløselige gummiart må være en sådan, som i sig 5 selv opløses i vand ved temperaturer op til kogepunktet uden geldannelse; gummiarten må i sig selv danne en opløsning med betydelig viskositet, dvs. en opløsning, som udviser en viskositet på mindst 10 mPaxs ved 25 °C ved en koncentration mindre end 10% af gummiarten beregnet efter 10 vægt. Visse egnede vandopløselige gummiarter danner opløsninger med denne viskositet ved lave koncentrationer i størrelsesordenen 0,1 vægt-% eller endog mindre, medens andre danner opløsninger, som kun opnår den krævede viskositet ved koncentrationer, der nærmer sig 10 vægt-%.

15 Disse og andre heri omtalte viskositeter kan bedst måles med et såkaldt Brookfield Viscometer ved 30 omdr./min. under anvendelse af en nr. 1 spindel. Egnede gummiarter er renset Johannesbrødkernemelgummi, renset guargummi, polyvinylalkohol samt dextran. Gummiarten må være fri for 20 iondannede eller elektrisk ladede grupper, som har tilbøjelighed til at frembringe elektroendoosmose, og den må være modstandsdygtig over for hydrolyse, som kunne føre til sådanne iondannende eller elektrisk ladede grupper; som ovenfor anført udelukkes polyacrylamid, på grund af 25 de elektroendoosmotiske egenskaber af kommercielt tilgængeligt polyacrylamid, og på grund af tendensen for dette materiale til at hydrolysere ved forskellige pH-værdier under dannelse af carboxylatgrupper og/eller en forøgelse af elektroendoosmose egenskaberne. Når det dre-30 jer sig om naturprodukter eller naturlige gummiarter, såsom Johannesbrødkernemelgummi, guargummi, er det vigtigt, at gummiarten foreligger i renset form fri for skalbestanddele og andre urenheder, som kunne tilsløre eller interferere med de farvningsfremgangsmåder, der 35 anvendes ved isoelektrisk fokusering.

DK 158587B

8

Den tørre faststofblanding indeholder fra 2 til 99 vaegt-% renset agarose, idet resten i hovedsagen består af den vandopløselige gummiart, og den foreligger i fint fordelt form. Jo større elektroendoosmose værdier, der udvises af 5 de vandige geler, der fremstilles ud fra den rensede agarose i sig selv, desto større er mængden af vandopløselig gummiart, som er nødvendig i blandingen; og jo lavere den koncentration af gummiart alene i en vandig opløsning, der har den ønskede viskositet, er, desto 10 mindre gummiart kræves til at opnå en given formindskelse af elektroendoosmose egenskaberne af den vandige gel, der fremstilles ud fra blandingen. I en foretrukken udførelsesform består den tørre blanding hovedsagelig af fint fordelte partikler af renset agarose blandet med gummi-15 artpartikler. Partikelstørrelsen er ikke kritisk og kan være en hvilken som helst, som er bekvem til hurtig opløsning i vand, idet den kan gå fra meget grove partikler i størrelsesordenen 1 mm eller mere i diameter, og ned til så små partikler, som man bekvemt kan formale, i 20 størrelsesordenen af sådanne, som kan passere igennem en 400 mesh sigte (maskevidde 38 μπι ASTM afprøvningsmetode E-ll-61).

Den anvendte, rensede agarose besidder fortrinsvis en 25 elektroendoosmose værdi (-Mr), der ikke er større end 0,05, og blandingen indeholder fra 50 til 90 vægt-% af den rensede agarose, idet resten, nemlig 10-50 vægt-%, består af den ønskede vandopløselige gummiart.

30 Blandingen kan anvendes ved simpelt hen at opløse den i vand under opvarmning og omrøring på samme måde, som man opløser agarose i sig selv. De ampholytter og/eller buffere, der kræves i gelen til anvendelse ved isoelektrisk fokusering, kan blandes med den tørre faststofblanding, 35 eller de kan opløses separat, før geldannelsen indtræder; de kan ligeledes tilsættes senere efter opvarmning af gelen til at smelte denne, idet man derpå lader den danne

DK 158587 B

9 gel igen. Den mængde blanding, der anvendes til fremstilling af gelen, kan variere inden for vide rammer, afhængigt af den ønskede gelstyrke eller porøsitet. Den mængde agarose, det som er nødvendigt at opløse i vand til 5 dannelse af en gel af fastlagt styrke, kan variere i stor udstrækning, afhængigt af oprindelsen af agarosen og dens historie, såvel som af dens renhedsgrad. I praksis er den mindste styrke for en gel, der er anvendelig som substrat 2 til isoelektrisk fokusering, på ca. 50 g/cm . Eftersom 10 gummiart-bestanddelen i gelmaterialet ifølge den foreliggende opfindelse ikke har indflydelse på gelstyrken af den rensede agarose, er det mængden af agarose i den opløste blanding, som styrer gelstyrken. Når det drejer sig om visse kommercielt tilgængelige agaroser, er gelstyrken 15 af en gel indeholdende 1 vægt-% agarose så høj som 1000 2 til 1500 g/cm , medens andre arter udviser betydeligt lavere styrkeværdier på samme betingelser. Det er yderligere som en praktisk foranstaltning ønskværdigt, at den varme opløsning af blandingen i vand har en tilstrækkelig 20 lav viskositet til, at opløsningen let kan udhældes, dvs. en viskositet mindre end ca. 6000 mPaxs ved 75 °C under anvendelse af et Brookfield Viscometer med passende udrustning. Det er ligeledes vigtigt, at der er tilstrækkelig gummiart-komponent til stede til, at den danner 25 uden tilstedeværelsen af agarose en opløsning i vand med en viskositet på mindst 1 mPaxs ved 25 °C. Som følge heraf kan den mængde af blandingen af renset agarose og en vandopløselig gummiart, der anvendes i en vandig gel i overensstemmelse med den foreliggende opfindelsen, varie-30 re fra ca. 0,2% til 10 vægt-% af vandet, fortrinsvis fra 0,2 til 2 vægt-%. Man foretrækker geler indeholdende fra 0,2 til 2% af blandingen baseret på vægten af vandet, fordi sådanne geler udviser ringe eller slet ingen mole-kylsigtevirkning uanset molekylvægten og størrelsen af de 35 proteiner, der underkastes isoelektrisk fokusering, således at praktisk talt hele den molekylære adskillelse, der foregår, kun er afhængig af det isoelektriske punkt for

DK 158587 B

10 hver enkelt protein. De foretrukne geler tillader derudover let diffusion af proteinprøven ind i gelen.

Det er ligeledes muligt at fremstille en sådan vandig gel 5 fri for elektroendoosmose egenskaber ved hjælp af den i krav 5’s kendetegnende del anførte fremgangsmåde.

De efterfølgende specifikke eksempler tjener til at belyse opfindelsen.

10

EKSEMPLER

Agarose blev frasepareret fra kommercielt tilgængeligt agar ved dannelse af en opløsning af agaren, hvortil i 15 opløst tilstand blev tilsat et andet polysaccharid, såsom carrageenan, som er i højere grad sulfateret end agarpec-tin-komponenten i agaren, og som udfældes i en frasepa-rerbar flokkuleret tilstand ved tilsætning af et kvarternært ammoniumsalt. Idet agaropectinen, som ellers udfæl-20 des i en form, der vanskeligt lader sig fraseparere, ved tilførsel af et kvarternært ammoniumsalt i opløsningen, forenes på en eller anden måde med det bundfald, der dannes ved bundfældningen af det tilsatte polysaccharid, med det resultat at når bundfaldet af tilsat polysaccha-25 rid fjernes fra den tilbageblevne agaroseopløsning ved filtrering eller centrifugering, kan agaropectinen ligeledes effektivt fjernes fra opløsningen og frasepareres fra det ikke-iondannende agarose, som forbliver tilbage i opløsningen. Den agarose, der forbliver tilbage i opløs-30 ningen, kan udfældes f.eks. ved tilsætning af isopropanol og derpå indvindes ved filtrering eller centrifugering (Blethen et al., USA-patentskrift nr. 3 281 409, udstedt den 25. oktober 1966). Man fremstillede derpå en opløsning ved opvarmning af 12,0 g agarose i 600 ml vand under 35 omrøring. Til opløsningen blev efter nedkøling til 60 °C tilsat 200 g af vand-opkvældede og afdryppede kugler af en kationbytterharpiks, QAE "Sephadex"© (firmaet Phar-

DK 158587 B

11 macia), og blandingen blev holdt under omrøring i en halv time ved 60 °C og derpå filtreret; til opløsningen blev tilsat 2 liter 80 procentig vandig isopropanol ved 45 °C til koagulering af det rensede agarose, som derpå blev 5 frasepareret på en sigte, tørret ved 50 °C og formalet i en hammermølle, således at det kunne passere en 20 mesh sigte. En del af det oprensede agarose blev opløst i vand ved opvarmning til 90 °C til dannelse af en opløsning indeholdende 1 vægt-% agarose, blev nedkølet, således at 10 det dannende gel, og man konstaterede, at dets elektroen-doosmose værdi (-Mr) var 0,03. Gelstyrken af en gel indeholdende 1 vægt-% af den oprensede agarose blev bestemt 2 til at være ca. 950 g/cm .

15 I 500 ml destilleret vand blev dispergeret 5 gram Johan-nesbrødkernemel (pulverform), og blandingen blev opvarmet til 100 °C og derpå kogt i 30 sekunder; til den således fremkomne opløsning blev tilsat 10 g diatoméfilterhjælp (Hyflo Supercell), og blandingen blev filtreret ved et 20 tryk på 69-138 kPa gennem en forvarmet filterbombe monteret med et passende sammenfiltret filterklæde. Efter at filtreringen var tilendebragt, blev filterkagen vasket med 75 ml destilleret vand, og filtratet sammen med vaskevandet blev koaguleret ved blanding med 2,5 rumfang 85 25 procentig isopropanol. Efter afdrypning på en sigte blev koagelet igen bragt i suspension i 85 procentig isopropanol, der fik lov til at henstå i 15 minutter, der blev afdryppet, og der blev tørret ved opvarmning til 60 "C i 4-6 timer, hvorpå der blev formalet i en hammermølle til 30 størrelsen 20-40 mesh (udbytte ca. 3-3,5 g). Dette rensede Johannesbrødgummi var vandopløseligt, fri for elektrisk ladede eller iondannende grupper, stabilt over for hydrolyse, som kunne føre til elektrisk ladede grupper, og det var fri for skalbestanddele og andre urenheder, 35 som kan tage imod farvemateriale og dermed interferere med farvningen og/eller konstateringen af proteiner i gelen; en vandig opløsning indeholdende 0,3 vægt-% af gum-

DK 158587B

12 miarten alene udviste en viskositet større end 10 mPaxs ved 25 °C.

Der blev fremstillet en blanding ved at sammenblande 70 5 vægtdele af det rensede fint fordelte agarose, der var fremstillet som ovenfor beskrevet, og 30 vægtdele af fint fordelte partikler af renset Johannesbrødgummi. Blandingen lod sig let opløse i vand ved udrøring af 0,5 g i 100 ml vand og opvarmning til kogepunktet, eller indtil det 10 var helt opløst. Opløsningen blev derpå kølet til 56 °C, og 2 vægt-% ampholytter blev tilsat under omrøring. Opløsningen blev udstøbt i en passende form og fik lov til at danne gel ved køling, og den blev derpå opbevaret ved 4 °C i mindst 1 time før anvendelsen.

15

Den således fremstillede gel viste sig ikke at have nogen målelige elektroendoosmoseværdier, og den havde en gel-styrke på 350 g/cm . En prøve af proteinopløsning, som blev påført overfladen af gelen på en ved isoelektrisk 20 fokusering sædvanlig måde, blev med godt resultat underkastet isoelektrisk fokusering.

Man opnåede lignende resultater, når man i stedet for renset Johannesbrødkernemelgummi anvendte en prøve af 25 renset guargummi i samme mængdeforhold.

Når man anvendte polyvinylalkohol og dextran i stedet for renset Johannesbrødkernemelgummi i koncentrationer, som førte til en viskositet større end 10 mPaxs ved 25 °C 30 (dvs. ca. 2-10%), opnåede man lignende resultater, 35

Claims (5)

1. Agarosemateriale i form af tørre, partikelformede 5 faststofblandinger, der kan danne vandige geler fri for elektroendoosmoseegenskaber og er anvendelige som substrat ved isoelektrisk fokusering, kendetegnet ved, at de består af en blanding af 2-99 vægt-% renset agarose med en elektroendoosmose-værdi (-Mr) mindre end 10 0,10 samt en gummiart, der vælges blandt renset guargum- mi, renset Johannesbrødsgummi, polyvinylalkohol eller dextran, og som er opløselig i kogende vand uden geldannelse, hvilken gummiart er fri for skalbestanddele og andre urenheder, som kan interferere ved farvning, fri 15 for elektrisk ladede grupper samt stabil over for hydrolyse, der fører til dannelse af elektrisk ladede grupper, idet gummiarten i sig selv er opløselig i vand under dannelse af en gummiopløsning med en viskositet på mindst 10 mPaxs ved 25 °C ved en koncentration ikke 20 større end 10 vægt-%, og idet mængden af gummiart er så stor, at den uden tilstedeværelse af agarose er i stand til at danne en opløsning i vand med en viskositet på mindst 10 mPaxs ved 25 °C.

2. Agarosegelmateriale ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den anvendte agarose har en elektroendoos-moseværdi (-Mr) ikke større end 0,05 og forefindes i en koncentration på 50-90 vægt-%.

3. Vandige geler fri for elektroendoosmoseegenskaber og anvendelige som substrat ved isoelektrisk fokusering, kendetegnet ved, at de hovedsagelig består af til geler omdannede opløsninger i vand af blandinger ifølge krav 1, idet sådanne blandinger forefindes i en 35 koncentration på 0,2-10 vægt-% beregnet på vandmængden, 2 og hvor gelerne har en gelstyrke på mindst 50 g/cm , for- 2 trinsvis 100 g/cm . DK 158587 B

4. Vandige geler ifølge krav 3, kendetegnet ved, at blandingen forefindes i en koncentration fra 0,2-2 vægt-% beregnet på vandmængden, og at agarosen i blandingen har en elektroendoosmoseværdi (-Mr) ikke større 5 end 0,05 og forefindes i en koncentration på 50-90 vægt- %.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af vandige geler fri for elektroendoosmoseegenskaber ifølge krav 3, k e n - 10 detegnet ved, at man i vand ved forhøjet temperatur opløser (1) agarose med en elektroendoosmoseværdi (-MT) mindre end 0,10 og (2) en vandopløselig gummiart, der vælges blandt renset guargummi, renset Johannesbrøds-gummi, polyvinylalkohol eller dextran, og som er fri for 15 skalbestanddele og andre urenheder, som kan interferere ved farvning, fri for elektrisk ladede grupper og i sig selv opløselig i kogende vand uden geldannelse, til dannelse af en opløsning med en viskositet på mindst 10 mPaxs ved 25 °C ved koncentrationer ikke større end 10 20 vægt-%, idet den samlede mængde af den anvendte agarose og gummiart udgør 0,2-10 vægt-% beregnet på vandmængden, og agarosen udgør 2-99% af den samlede mængde af en vandig gel ifølge krav 3, og mængden af gummiart er tilstrækkelig til uden nærvær af agarose at danne en opløs-25 ning i vandmængden udvisende en viskositet på mindst 10 mPaxs ved 25 °C, samt ved, at man lader en sådan opløsning af blandingen nedkøle til dannelse af en gel. 30 35