DE3004526A1

DE3004526A1 - Agarosezusammensetzung und gel

Info

Publication number: DE3004526A1
Application number: DE19803004526
Authority: DE
Inventors: Richard Bradford Cook; Henry Joseph Witt
Original assignee: FMC Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 1979-02-07
Filing date: 1980-02-07
Publication date: 1980-08-21
Also published as: ES507322A0; GB2042571B; DK158587B; US4290911A; JPS6129664B2; FR2448553A1; CA1140833A; GB2042571A; DE3004526C2; DK51180A; JPS55110946A; DK158587C; ES8300789A3; FR2448553B1; SE449496B; SE8000966L

Description

FMC CORPORATION

Philadelphia, Pennsylvania, V.St.A.

Agarösezusammensetzung und Gel

Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine feinverteilte feste Mischung vor gereinigter Agarbse mit einem von geladenen Gruppen freien Gummi, der in siedendem Wasser ohne Gelierung eine Lösung mit hoher Viskosität bildet, wobei die Mischung in Wasser löslict ist, um ein Gel zu bilden, das keine Elektroendosmose (-Mr) zeigt, sowie das wässrige Gel und ein Verfahren für dessen Verwendung als Medium zur Durchführung einer isoelektrischen Fokussierung.

Es wurde bereits empfohlen, wässrige Gele aus Agarose als Medium für die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung zu verwenden. Um jedoch eine zufriedenstellende isoelektrisch Fokussierung zu bewirken, ist es wesentlich, daß das Gelmediu außerordentlich geringe Elektroendosmoseeigenschaften besitzt die soweit als möglich an den Wert O herankommen. Trotz zahlreicher Anstrengungen, Agarose durch Entfernung ionischer ode geladener Gruppen (wie Sulfat und/oder Carboxylate die in einem derartigen Gel eine Elektroendosmose verursachen^ zu reinigen,war es in praktischer Hinsicht nicht möglich, sämtliche eine Elektroendosmose verursachenden Gruppen zu entfernen, weshalb sogar GeIe^ die aus hochgereinigter Agarose hergestellt wurden, beträchtliche Elektroendosmosewerte (-Mr) in der Größenordnung von 0,02 oder höher zeigen. Die Größe dieses Werts ist, obgleich er gegenüber dem üblichen Wert für ungereinigte Agarose gering ist, ausreichend hoch,um eine erfolgreiche umfangreiche Verwendung von Agarosegelen als Medium für 'die isoelektrische Fokussierung auszuschließen.

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Demzufolge wurde versucht, die Elektroendosmose von A.garosegelen noch weiter zu reduzieren, indem man mit der Agarose eine Vielzahl von wasserlöslichen Materialien^von denen man annahm, daß sie von ionischen Gruppen frei sind,vermischte, wie Sucrose (Quast, J. Chromat., Band 54, S. 405-412, 1971)» Polyäthylenoxid (M.G. 4 000 000) oder Polyacrylamid ( Johansson et al., Anal. Bioehem., Band 59, S. 200-213, 1974·) und fiethylcellulose (Weise et al., "Progress in Isoelectric Focusing and Isotachophoresis", Ed. Righetti, North Holland Publishing Co., 1975, S. 93-98). Jedoch besitzt das erstgenannte Material^ die Sucrose^ wenig oder gar keine Wirkung im Hinblick auf eine Reduzierung des Elektroendosmosewertes des Agarosegels. Die Zugabe von im Handel erhältlichem Polyacrylamid besitzt andererseits eine nachteilige Wirkung auf Gele mit hochgereinigter Agarose, da es selbst eine meßbare Elektroendosmose in wässriger Gelform zeigt und daher dazu neigt, bei verschiedenen pH-Werten zu hydrolysieren, was zur Bildung von Garboxylatgruppen und zu einer weiteren Zunahme der Elektroendosmose führt. Insoweit als es Polyäthylene-Oxid (M-.G. 4 000 000) und Methylcellulose betrifft, gelieren wässrige Lösungen dieser Gel materialien beim Erhitzen auf Temperaturen in Nähe des Siedepunkts, wohingegen Agarose sich in Wasser nur bei erhöhten Temperaturen,vorzugsweise beim Siedepunkt ylöst. Eine Mischung einer dieser beiden trockenen festen Materialien mit Agarose kann demzufolge nicht in Wasser gelöst werden und es ist möglich eine Lösung, die sowohl Agarose als auch eines der weiteren Materialien enthält _T nur durch getrenntes Auflösen derselben unter sorgfältiger Temperaturkontrolle zu erhalten.

In der US-PS 3 527 712 (fienn et al.) wurde auch empfohlen, trockene feste Agarose in rehydratisierbarer Form herzustellen, indem man sie in eine bestimmte Art eines makromolekularen Hydrokolloids einarbeitet. Weder die Agarose noch das Hydrokolloid müssen einen speziellen Reinheitsgrad besitzen und viele der als geeignet beschriebenen Hydrokolloide enthalten geladene oder ionische Gruppen, die zu einer Elektroendosmose

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führen. Zwei der "beschriebenen Hydrokolloide sind PoIyätJiylenoxide mit niedrigem Molekulargewicht. 10 Gew.-%ige Lösungen derselben in Wasser besitzen Viskositäten weit unte halb von 10 cP bei 25°C und sind hinsichtlich der Eeduzierur des Elektroendosmosewertes der Agarose unwirksam. Obgleich Guargummi, ein nicht ionisches Material, als Hydrokolloid beschrieben wird, werden wede^ gereinigter bzw. geklärter Guargummi noch gereinigter bzw. geklärter Johannisbrοίε chotengummi, die für die Verwendung bei der vorliegenden Ex findung benötigt werden,erwähnt. Ungereinigter Guargummi und ungereinigter Jphannisbrotschotengummi enthalten Hülsenfragmente und andere Verunreinigungen, die eine bei isoelektrischen Fokussierverfahren verwendete Färbung undeutlich mache oder beeinträchtigen.

Erfindungsgemäß wird eine trockene feste Mischung, Vorzugsweise in fein verteilter Form,geschaffen aus (1) gereinigter Agarose mit einem Elektroendosmose (-Mr)-Wert von nicht höher als 0,10 mit (2) einem wasserlöslichen Gummi, der frei ist von Hülsenfragmenten, frei ist von ionischen Substituenten, d. h. geladenen Gruppen und selbst in Wasser ohne Gelie rung bei Temperaturen bis zu und einschließlich des Siedepunkts (100⁰C bei 760 mm Hg) löslich ist, um eine viskose-Lösung mit einer Viskosität bei einer Konzentration von nicht größer als 10 Gew.-#> von zumindest 10 cP bei 25⁰C zu ergeben, wobei die Mischung verwendbar ist bei der Herstellung von wässrigen Gelen mit in hohem Ausmaß reduziertem oder nicht meßbarem Elektroendosmosewert über einen weiten Bereich von pH-Werten. Derartige Gele sind für die Verwendung als Medium für die Durchführung einer isoelektrischen Fokussierung von Proteinen von großem Wert.

Die in der Mischung verwendete Agarose kann irgendeine sein, die ausreichend gereinigt worden ist, so daß sie einen Elektroendosmosewert (-Mr) von 0,10 oder niedriger besitzt, wobei verschiedene derartige Agarosen nunmehr im Handel erhältlich sind. Eine Agarose mit einem derartigen Eeinheits-

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grad unterscheidet sich von einer Agarose, die früher allgemein erhältlich war insoweit als gereinigte Produkte keine Zunahme der Gelstärke in Mischung mit Johannisbrotschotengummi -oder geklärtem Johannisbrotschotengummi zeigen, wohingegen eine Agarose mit einem niedrigeren Reinheitsgrad (mit einem (-M^-Vert von höher als 0,10) eine derartige Zunahme der Gelstärke zeigt, wie es beispielsweise in der US-PS 2 466 146 beschrieben wird. Der Elektroendosmosewert der unreinen Agarose kann nicht eliminiert oder auf 0 herabgesetzt werden, indem man sie mit einem wasserlöslichen Gummi mit hoher Viskosität mischt, wie es bei demjenigen der gereinigten Agarose der !"all ist.

Der Elektroendosmosewert der Agarose wird gemessen, indem man eine 1-Gew.-%ige Lösung der Agarose in einem 0,05 m Barbitalpuffer mit einem pH-Wert von 8,6 herstellt. Man gießt drei Milliliter der Lösung auf einen reinen Objektträger eines Mikroskops und läßt bei Raumtemperatur gelieren. Unter Verwendung einer abgekanteten Nadel für die subkutane Injektion mit kleinem Durchmesser (Nr. 13), die an eine. Spritze für die subkutane Injektion angebracht ist, wird aus dem Zentrum des Gels ein einziges Loch mit einem Durchmesser von 1 bis mm abgesaugt. Man stellt eine Standardtestlösung her, die aus 10 mg pro ml Dextran 500 (Pharmacia) und 2 mg pro ml kristallinem (4x) Humanalbumin in 0,05 m Barbitalpuffer mit einem pH von 8,6 besteht. Unter Verwendung eines Tropfenzählers mit kleiner Öffnung wird ausreichend Lösung zugegeben, um das abgesaugte Loch nahezu zu füllen. Die Objektträger werden dann unter Verwendung von Papierdochten für die Elektrophorese in Position gebracht. Man wendet eine Spannung von 10 Volt pro cm (75 Volt) unter Verwendung konstanter Spannungseinstellungen an.

Die Elektrophorese wird drei Stunden fortgesetzt und danach entfernt man die Objektträger. Die Sichtbarmachung wird in zwei Stufen durchgeführt. Die Objektträger werden zuerst in

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denaturiertes (3A) Äthanol 15 Minuten, nachdem die Position des Dextrans im Hinblick auf den Ausgangspunkt gemessen werde] kann (Zentrum zu Zentrum), eingebracht. Nach der Messung werden die Objektträger zu der Proteinfärbelösung übergeführt, d: aus 0,5 g Amidoschwarz in 50 ml Eisessig unter anschließender Auffüllung mit 500 ml Äthanol hergestellt wurde. Nach 15 Minuten werden die Objektträger in einer Lösung von Essigsäure (5%) '· Äthylalkohol (1:1) gwaschen^ um überschüssige Farbe zu entfernen. Es ist eine Stunde ausreichend, obgleich die Albuminposition gewöhnlich nach 15 Minuten bestimmt werden kann. Man mißt den Abstand vom Zentrum des Fleckens zum Zentri der Ausgangsposition.

Mit Hilfe eines Diagramms kann dies wie folgt dargestellt wer^den: © A 0 D Q

A=Albumin, O=Auftragungspunkt (Ausgangspunkt) D=Dextran

Der Grad der Elektroendosmose (-Mr) kann unter Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt werden:

-Mr =.

AO₊OD

Die Gelstärken (auch bekannt als "Bruchfestigkeiten") auf die vorliegend Bezug genommen wird, können unter Verwendung des folgenden Verfahrens gemessen werden. Man füllt 500 g der zu untersuchenden Lösung derart auf, daß man die vorgeschriebenen Prozentanteile an extraktiven und anderen Bestandteilen erhält. Es ist zweckmäßig zu Beginn die Zusammensetzung derart herzustellen,daß die Wassermenge geringfügig weniger ist als die insgesamt erforderliche und die Zusammensetzung auf einem Wasserbad bei ca. 100°C unter Rühren während ca. 5 Minuten zu erhitzen^um die Auflösung der Feststoffe zu bewirken. Die Lösung wird dann auf das endgültige 500 g-Gewicht eingestellt und während sie noch heiß ist,in drei gleiche Teile geteilt,

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wobei jeder Teil in eine Kristallisationsschale mit einem Durchmesser von 7 cm, d. h. mit einer Tiefe von 5^0 cm>eingebracht wird, die in ein bei der vorgeschriebenen Testtemperatur gehaltenes Wasserbad gegeben wird. Danach werden die Schalen aus dem Wasserbad entnommen und der gelierte Gehalt einer jeden entfernt und nach dem Umdrehen in seine Schale wieder hineingegeben. Jede, das umgedrehte Gel enthaltende Gchale wird auf den Auffang der Vorrichtung gestellt, die zur Messung der Kraft verwendet wird, die von einem Kolben mit einem Durchmesser von 1* cm.der mit einer Geschwindigkeit von 16,83 cm pro Minute absteigt, gegen die obere Oberfläche des Gels ausgeübt wird, bis die Kraft plötzlich zum Zeitpunkt des ßeissens des Gels abfällt. Die festgestellte maximale Kraft wird als die das Brechen herbeiführende Kraft notiert. Die das Brechen herbeiführende Kraft für jede der drei Proben wird festgehalten und ihr Durchschnitt als Wert für die Gelfestigkeit für die zu untersuchende Extraktion zugrunde gelegt. Während andere Typen an Messvorrichtungen verwendet werden können, wird die zur Ermittlung des vorliegenden Bruchfestigkeitswertes verwendete Vorrichtung in der US-PS 3 34-2 612 erläutert und beschrieben. Die vorliegend verwendete Vorrichtung besitzt einen automatischen Antrieb, um den Stempel mit einer konstanten Geschwindigkeit von 16,83 cm pro Minute vorrücken zu lassen. Zu Zwecken des Tests wird die Gelierung durch Kühlen der Lösung während 24 Stunden auf 5 bis 1O°C bewirkt und die Messung wird bei 25°C unter Verwendung eines Stempels mit einem Durchmesser von 1 cm durchgeführt.

Eines von zahlreichen bekannten Reinigungsverfahren einschließlich der fraktionierten Ausfällung, der Adsorption von Verunreinigungen an einer festen Phase wie in der Jonenaustauscherchromatographie und dergl., kann entweder allein oder in Kombination verwendet werden^um den Sulfat- und/oder Carboxylatgehalt der Agarose und deren Elektroendosmosewert herabzusetzen.

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Der wasserlösliche Gummi muß ein solcher sein, der sich in Wasser bei Temperaturen bis zum Siedepunkt ohne Gelierung von selbst löst. Der Gummi muß von selbst eine Lösung mit nennens werter Viskosität bilden, d. h. eine Lösung die bei einer Konzentration von nicht höher als 10 Gew.-% an Gummi eine Viskosität von zumindest 10 cP bei 25°C aufweist. Einige geeignete wasserlösliche Gummi bilden Lösungen dieser Viskosität bei niedriger Konzentration in der Größenordnung von 0,1 Gew.-% oder sogar geringer, während andere Lösungen mit der angegebenen Viskosität lediglich bei einer Konzentration von annähernd 10 Gew.-% bilden. Diese und andere Viskositäten auf die vorliegend Bezug genommen wird, können am geeignetesti mit Hilfe eines Brookfield-Viskosimeters bei 30 UpM unter Verwendung einer Spindel Nummer 1 gemessen werden. Unter den geeignetesten Gummis befinden sich geklärter bzw. gereinigter Johannisbrotschotengummi (locust bean gum), geklärter bzw. gereinigter Guargummi (guar gum), Polyvinylalkohol und Dextran. Der Gummi mxß von ionischen oder geladenen Gruppen, die dazu neigen, eine Elektroendosmose zu verursachen; frei sein und muß gegenüber einer Hydrolyse^die derartige ionische oder geladene Gruppen hervorrufen könnte, beständig sein. ¥ie vorstehend ausgeführt ist Polyacrylamid ausgenommen aufgrund der Elektroendosmoseeigenschaften von im Handel erhältlichem Polyacrylamid und aufgrund der Neigung dieses Materials^bei verschiedenen pH-Niveaus unter Bildung von Carboxylatgruppen und/oder einer Zunahme der Elektroendosmose zu hydrolysieren. Im Falle von Naturprodukten oder natürlichen Gummis, wie Johannisbrotschotengummi und Guargummi ist es wesentlich, daß der Gummi in geklärter bzw. gereinigter Form vorliegt und frei ist von Hülsenfragmenten und anderen Verunreinigungen,die bei der isoelektrischen Fokussierung verwendete Färbetechniken undeutlich machen oder beeinträchtigen.

Die trockene feste Mischung kann 2 bis 99 Gew.-% gereinigte Agarose enthalten, wobei der verbliebene Teil im wesentlichen aus wasserlöslichem Gummi besteht und sie liegt bevorzugt in

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fein verteilter Form vor. Je größer das Ausmaß der Elektroendosmose ist, die "bei v,erschied'jnen Gels aus gereinigter Agarose allein in Erscheinung tritt, um so größer ist die Menge des in der Mischung erforderlichen wasserlöslichen Gummis. Je geringer die Konzentration an wässriger Lösung des Gummis allein mit der erforderlichen Viskosität ist, um so weniger Gummi ist erforderlich^um eine gegebene Abnahme hinsichtlich der Llektroendosmoseeigenschaften des wässrigen aus der Mischung hergestellten Gels herbeizuführen. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die trockene Mischung im wesentlichen aus fein verteilten Teilchen von gereinigter Agarose in Mischung mit Gummiteilchen. Die Teilchengröße ist nüit kritisch und kann irgendeine für eine rasche Auflösung in Wasser geeignete sein im Bereich von sehr groben Teilchen in der Größenordenung von 1 mm oder mehr für den Durchmesser bis herab zu einer so geringen, wie sie in geeigneter Weise durch Vermählen erzielt wird, in der Größenordnung von solchen, die durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,038 mm bzw. durch eine Sieböffnung von 38 Mikron (400 mesh) nach der ASTM-Testmethode E-11-61 hindurchgelangen.

Vorzugsweise besitzt die verwendete gereinigte Agarose einen Elektroendosmosewert (-Mr) von nicht höher als 0,05 und die Mischung enthält 50 bis 90 Gew.-% der gereinigten Agarose, wobei der Rest von 10 bis 50 Gew.-% der gewünschte wasserlösliche Gummi ist.

Die Mischung kann verwendet werden,indem man sie einfach in Wasser durch Erhitzen und Rühren in der gleichen Weise wie beim Auflösen von Agarose allein löst. Die Ampholyte und/oder Puffer, die in dem Gel für die Verwendung bei der isoelektrischen Fokussierung erforderlich sind, können mit der trockenen festen Mischung vermischt werden oder sie können getrennt vor dem Eintreten der Gelierung gelöst werden. Sie können auch später nach dem Erhitzen des Gels zur Verflüssigung desselben zugegeben werden, wobei man danach erneut gelieren läßt. Die für die Bildung des Gels verwendete Menge der Mischung kann in weitem

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Umfang in Abhängigkeit von der gewünschten Gelstärke oder Porosität variieren. Die für die Auflöung in Wasser zur Bildung eines Gels mit der angegebenen Stärke erforderliche Agarosemeng kann beträchtlich in Abhängigkeit von der Agarosequelle und ihr "Vorgeschichte", sowie ihres·Seinheitsgrades variieren. Aus praktischen Erwägungen beträgt die minimale Stärke für ein als Medium zur isoelektrischen Fokussierung verwendbares Gel ca. 50 g/c-Ji . Da die Gummikomponente der erfindungsgemäßen Mischung die Gelstärke der gereinigten Agarose nicht beeinflußt, ist es die Agarosemenge in der Mischung, die gelöst wird, die die Stärke des Gels kontrolliert. Im Fall von bestimmten im Handel erhältlichen Agarosen kann die Gelstärke eines 1 Gew.-% Agarose enthaltenden Gels so hoch wie 1000 bis 1500 g/cm sein, während andere beträchtlich niedrigere Stärken unter den gleich Bedingungen aufweisen. Über dies ist es in praktischer Hinsicht erwünscht, daß die heiße Lösung der Mischung in Wasser eine ausreichend niedrige Viskosität besitzt derart, daß die Lösung rasch gegossen werden kann, d. h. eine Viskosität von nicht größer als ca. 600OcP bei 75°C, unter Verwendung eines Brookfield-Viskosimeters mit geeignetem Zusatzgerät. Es ist auch wichtig, daß ausreichend Gummikomponente vorliegt, derart, daß sie in Abwesenheit von Agarose eine Lösung in Wasser mit einer Viskosität von zumindest 10 cP bei 25°C bildet. Demzufolge kann die Menge der Mischung der gereinigten Agarose mit einem wasserlöslichen Gummi, die in einem erfindungsgemäßen wässrigen Gel verwendet wird, von ca. 0,2 bis 10 Gew.-% des Wassers, vorzugsweise 0,2 bis 2 Gew.-% variieren. Gele_}die 0,2 bis 2% der Mischungjbezogen auf das Gewicht des Wassers enthalten, sind bevorzugt, da derartige Gele wenig oder keine Molekularsiebwirkung ungeachtet des Molekulargewichts oder der Größe des einer isoelektrischen Fokussierung unterzogenen Proteins besitzen, so daß nahezu die gesamte erfolgende molekulare Trennung lediglich eine Funktion des isoelektrischen Punkts eines jeden Proteins ist. Zusätzlich gestatten die bevorzugten Gele eine schnelle. Diffusion der Proteinprobe in das Gel.

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Es ist auch möglich, ein derartiges, von einer Elektroendosmose freies wässriges Gel herzustellen, indem man die gereinigte Agarose und den Gummi individuell in einem einzigen Wasservolumen löst. Dies "bedeutet, daß das Gel hergestellt werden kann, indem man in Wasser bei erhöhter Temperatur löst: (1) gereinigte Agarose mit einem Elektroendosmose (-Mr)-Wert von nicht höher als 0,10 und (2) einen wasserlöslichen, von Hülsenfragmenten und anderen Verunreinigungen,die eine Färbung beeinträchtigen, freien Gummi^ der zudem frei ist von geladenen Gruppen und von selbst in siedendem Wasser ohne Gelierung löslich ist unter Bildung einer Lösung mit einer Viskosität bei einer Konzentration von nicht größer als 10 Gew.-% von zumindest 10 cP bei 25°C, wobei die Gesamtmenge der Agarose und des Gummis 0,2 bis 10 Gew.-% des Wassers betragen, die Menge der Agarose 2 bis 99 Gew.-% der Gesamtmenge beträgt und die Menge des Gummis ausreichend ist, um in Abwesenheit der Agarose eine Lösung in dem Wasser mit einer Viskosität von zumindest 10 cP bei 25 C zu bilden.und indem man die Lösung unter Bildung eines Gels abkühlen läßt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiele;

Man trennt Agarose aus im Handel erhältlichem Agar ab, indem man eine Agarlösung bildet, zu der man in gelöstem Zustand ein anderes Polysaccharid wie !Carrageenan zugibt, das höher sulfatisiert ist als die Agaropectin-Komponente des Agars und das in abtrennbarer ausgeflokter Form durch Zugabe eines quaternären Ammoniumsalzes ausgefällt wird, wobei das Agaropectin, das andernfalls in schwierig abtrennbarer Form ausgefällt wird,durch den Einschluß eines quaternären Ammoniumsalzes in der Lösung in gewisser Weise mit dem durch Ausfällen des zugegebenen Polysaccharide gebildeten Niederschlag kombiniert wird, mit dem Ergebnis, daß wenn der Niederschlag des zugegebenen Polysaccharide aus der verbliebenen Agaroselösung durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt wird,

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das Agaropectin auch, wirksam aus der Lösung entfernt und voi der nicht ionischen Agarose, die in der Lösung verbleibt, abgetrennt werden kann. Die in der Lösung verbleibende Agarose ka ausgefällt werden, z.B. durch Zugabe von Isopropanol^und danach gewonnen werden, z.B. durch !Filtrieren oder Zentrifugieren (Blethen et al., US-PS 3 261 409). Man stellte dann eine Lösung her, indem man 12,0 g Agarose in 600 ml Wasser unter Rühren erhitzte. Zu der Lösung gab man nach, dem Abkühlen auf 60 C 200 g der in. V.^rasser gequollenen und entwässerten Kügelchen eines Kationenaustauscherharzes, QAE Sephadex (Pharmacia), und rührte die Mischung eine halbe Stunde bei 60⁰G und filtrierte. Zu der Lösung gab man 2 1 80%iges wässriges Isopropanol bei 45 C zu, um die gereinigte Agarose zu coagulieren die dann auf einem Sieb abgetrennt und bei 50⁰C getrocknet wurde und in einer Hammermühle^ auf eine Korngröße von 0,84 α (20-mesh) vermählen wurde. Ein Teil der gereinigten Agarose wurde in Wasser gelost, indem man auf 90⁰G erhitzte, um eine 1 Gew.-% Agarose enthaltende Lösung zu erhalten und abgekühlt, um sie zu gelieren. Für ihre Elektroendosmose (-Mr) fand man einen Wert von 0,03. Für die Gelstärke des 1 Gew.-% gereinigte Agarose enthaltenden Gels wurde ein Wert von ca. 950 g/cn' ermittelt.

Man dispergierte in 500 ml destiliertem Wasser 5 g Johannisbrotschot engummi (Pulver) und erhitzte die Mischung auf 100⁰C und siedete 30 Sekunden. Man gab 10 g Diatomeenerde-Filterhilfe (Hyflo Supercell^ zu der erhaltenen Lösung zu und filtrierte die Mischung bei einem Druck von 0,69 bis 1,38 bar (10 bis 20 psi) durch eine vorerhitzte Filterbombe, die mit einem geeigneten Filztuch, für den Filterkurchen ausgestattet war. Nach Beendigung des Filtrierens wurde der Filterkuchen mit 75 ml destilliertem Wasser gewaschen und das vereinigte Filtrat und die Waschwässer wurden coaguliert, indem man mit 2,5 "Volumina 85%igem Isopropanol mischte. Nach dem Entwässern auf einem Sieb wurde das G oagulum erneut in 85?oigem Isoprop&no suspendiert, 15 Minuten stehengelassen, entwässert und durch

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4 tis 6 stündiges Erhitzen auf 60⁰C getrocknet und anschliessend in einer Hammermühle auf, eine Korngröße von 0,37 0,84 mm (20-40 mesh) vermählen (Ausbeute ca. J-J₅5 g)· Dieser gereinigte bzw. geklärte Johannisbrotschotengummi war wasserlöslich, frei von geladenen oder ionischen Gruppen _t stabil gegenüber einer Hydrolyse,die geladene Gruppen bildet und frei von Hülsen und anderen Verunreinigungen, die Farbe annehmen und eine Färbung und/oder d=o· Nachweis von Proteinen in dem Gel beeinträchtigen. Eine wässrige 0,3 Gew.-% des Gummis enthaltende Lösung zeigte von selbst eine Viskosität mit einem Wert von größer als 10 cP bei 25°C.

Man stellte eine Mischung her, indem man 70 Gewichtsteile der 'gereinigten fein verteilten, wie vorstehend beschrieben hergestellten Agarose und 30 Gewichtsteile fein verteilte Teilchen des geklärten Johannisbrotschotengummis mischte. Die Mischung wurde rasch in Wasser gelöst, indem man 0,5 S in 100 ml Wasser rührte und zum Siedepunkt oder bis zur vollständigen Auflösung erhitzte. Die Lösung wurde dann auf 56°C abgekühlt und man gab unter Rühren 2 Gew.-% Ampholyte zu. Die Lösung wurde in eine geeignete Form gegossen und man ließ sie durch. Abkühlen gelieren und lagerte sie danach bei 4°C während zumindest einer Stunde vor ihrer Verwendung.

Für das so hergestellte Gel fand man keine meßbare Elektroendosmose und eine Gelstärke von 350 g/cm . Eine Probe der auf die Oberfläche des Gels in üblicher Weise aufgebrachten Proteinlösung wurde auf wirksame Weise einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen.

Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, als man den Johannisbrotschotengummi durch eine Guargummiprobe in der gleichen Menge ersetzte.

Verwendete man Polyvinylalkohol und Dextran anstelle des geklärten Johannisbrotschotengummis bei Konzentrationen^die Viskositäten von höher als 10 cP bei 25°C ergeben (d. h. ca. 2 bis 10%), erhält man ähnliche Ergebnisse.

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Claims

Dr. F. Zumstein sen. ~ Or. E. Assmann ?'Dr. R. Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipi.-lnö- F- KUngj^isen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTANWÄLTE 80OO München 2 · BräuhausstraBe 4 · Telefon Sammel-Nr. 22 5341 · Telegramme Zumpat · Telex S^ Q^T) Λ F) 2 6 ΪΜ0 6533 Patentansprüche

1. Trockene feste Zusammensetzung,die in der Lage ist ein wässriges Gel zu bilden,das frei ist von einer Elektroendosmose und geeignet ist für die Verwendung als Medium zur isoelektrischen Fokussierung,gekennzeichnet durch eine Mischung von gereinigter Agarose mit einem Elektroendosmosewert (-Mr) von geringer als 0,10 in einer Menge von 2 bis 99 Gew.-% mit einem in siedendem Wasser ohne

Gelbildung löslichen Gunmi, wobei dieser Gummi frei ist von Hülsenfragiaenten und anderen eine Färbung beeinträchtigenden Verunreinigungen, sowie frei ist von geladenen Gruppen und stabil ist gegenüber einer Hydrolyse, die geladene Gruppen bildet und selbst in Wasser löslich ist unter Bildung einer Gummilösung mit einer Viskosität bei einer Konzentration von nicht größer als 10 Gew.-% von zumindest 10 cP bei 25°C

2. Von einer Elektroendosmose freie wässrige Gelzusammensetzung mit einer Gelstärke von zumindest 100 g/cm , die für die Verwendung als Medium zur isoelektrischen Fokussierung geeignet ist, im wesentlichen bestehend aus einer gelierten Lösung in Wasser der in Anspruch 1 angegebenen Zusammensetzung, v/obei die Menge dieser Zusammensetzung 0,2 bis 10 Gew.-^ des Wassers beträgt.

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3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Agarose einen Elelrtroendosmosewert (-Mr) von nicht größer als 0,05 besitzt und in einer Menge von 50 "bi 90 Gev&-% vorliegt.

4-. Von einer Elektroendosmose freie wässrige Gelzusammen-

2 setzung mit einer Gelstärke von zumindest ^O g pro ein , di geeignet ist für die Verwendung als Medium zur isoelektrischen Fokussierung, im wesentlichen bestehend aus einer gelierten Lösung in Wasser der in Anspruch 3 angegebenen Zusammensetzung, wobei die Menge dieser Zusammensetzung 0,2 bis 10 Gew.-% des Wassers beträgt.

5· Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 öder 3, gekennzeichnet durch eine T.eilchenform, bei der einige Teilchen aus der gereinigten Agarose bestehen und die übrigen Teilchen aus dem Gummi bestehen.

6. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß der Gummi gereinigter bzw. geklärter Guargummi ist.

7. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß der Gummi gereinigter bzw. geklärter Johannisbrotschotengummi ist.

8. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß der Gummi Polyvinylalkohol ist.

9. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß der Gummi Dextran ist.

10. Wässriges'Gel gemäß Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, da die Menge der Zusammensetzung gemäß Anspruch 3 0,2 bis 2

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Gew.-% des Wassers beträgt.

11. Verfahren^um ein wässriges Gel freizumachen von einer Elektroendosmose, dadurch gekennzeichnet, daß man bei erhöhter Temperatur in .Wasser löst: (1) gereinigte Agarose mit einem Elektroendosmose (-Mr)-WeIt von nicht höher als 0,10 und (2) einen wasserlöslichen Gummi, der frei ist von Hülsenfragmenten und anderen eine Färbung beeinträchtigenden Verunreinigungen, frei ist von geladenen Gruppen und selbst löslich ist in siedendem Wasser ohne Gelierung^um ei^e Lo- - sung zu bilden· mit einer Viskosität bei einer Konzentration von nicht höher als 10 Gew.-% von zumindest 10 cP bei 25°C, wobei die Gesamtmenge der Agarose und des Gummis 0,2 bis 10 Gew.-% des Wassers beträgt, die Menge der Agarose 2 bis 99 Gew.-% der Gesamtmenge beträgt und die Menge des Gummis ausreicht, um in Abwesenheit der Agarose im Wasser eine Lösung mit einer Viskosität von zumindest 10 cP bei 25°C zu bilden,und daß man die Lösung zur Bildung eines Gels abkühlen läßt.

12. Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung von Proteinen in einem wässrigen Gelmedium,dadurch gekennzeichnet, daß man die Fokussierung in einem wässrigen Gelmedium gemäß Anspruch 2 durchführt.

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