SE449496B - Vattenhaltigt gel fri fran elektroendosmos och forfarande for dess framstellning - Google Patents

Description

449 496 2 (Quast, J. Chromat., Vol. 54, sid 405 - 4l2, 1971), polyety- lenoxid (molekylvikt 4.000.000) eller polyakrylamid (Johansson et al., Anal. Biochem., vol. 59, sid 200 - 213, 1974) och metylcellulosa (Weise et al., Progress in Isoelectric Focusing and Isotachophoresis, Ed. Righetti, North Holland Publishing Co., l975, sid 93 - 98). Det första materialet, sackaros, har emellertid ringa eller icke någon effekt när det gäller redu- cering av elektroendosmosvärdet för agarosgel. Tillsats av kommersiellt tillgänglig polyakrylamid medför å andra sidan en ogynnsam effekt på geler av i hög grad renad agaros, eftersom den i sig visar mätbar elektroendosmos i vattenhaltig gelform och eftersom den har tendens att hydrolysera vid olika pH- nivâer, vilket leder till bildning av karboxylatgrupper och en ytterligare ökning i elektroendosmos. Vad polyetylenoxid (molekylvikt 4.000.000) och metylcellulosa beträffar gelar vattenhaltiga lösningar av dessa material vid upphettning till temperaturer som närmar sig kokpunkten, under det att agaros löser sig i vatten endast vid förhöjda temperaturer, företrä~ desvis vid kokpunkten. En blandning av endera av dessa tvâ torra fasta material med agaros kan följaktligen inte lösas i vatten och det är endast möjligt att framställa en lösning som innehåller både agaros och ett av de andra materialen genom lösning av dem separat med noggrann temperaturreglering.

Det har även i den amerikanska patentskriften 3.527.712 före- slagits framställning av torr fast agaros i rehydratiserbar form genom införlivning däri av en viss typ av makromolekylär hydrokolloid; varken agarosen eller hydrokolloiden behöver ha någon specificerad utsträckning av renhet och många av de hydrokolloider som beskrives som lämpliga innehåller laddade eller joniska grupper som framkallar elektroendosmos. Två av de hydrokolloider som beskrives är polyetylenoxider med låg molekylvikt; 10 viktprocents-lösningar av dessa i vatten har viskositetsvärden som är vida under l0 cP vid 25°C och de är overksamma när det gäller att reducera elektroendosmosvärdet för agaros. Ehuru guargummi, en nonjonisk material, beskrives som en hydrokolloid, omnämnes varken renat guargummi eller 449 496 johannesbrödgummi vilka erfordras för användning i förelig- gande uppfinning. Icke renat guargummi och icke renat johan- nesbrödgummi innehåller skalfragment och andra föroreningar som skymmer eller stör färgning (staining) som användes vid isoelektriska fokuseringsförfaranden.

Föreliggande uppfinning avser en vattenhaltig gelkomposition fri från elektroendosmos, vilken utmärkes av att den har en gelstyrka av minst 50 g/cm2, företrädesvis minst 100 g/cm2 och är lämplig för användning som ett medium for isoelektrisk fokusering väsentligen bestående av en gelad lösning i vatten av renad agaros som har ett elektroendosmosvärde (-Mr) mindre än 0,10 och ett gummimaterial som väljes bland renat guargum- mi, renat johannesbrödsgummi, polyvinylalkohol eller dextran, varvid agarosen finnes närvarande i en mängd av från 2 till 99 viktprocent, räknat på vikten av agarosen och gummimaterial och, varvid vidare mängden agaros och gummimaterial som finnes* närvarande i gelkompositionen är från 0,2 till 10 viktprocent av vattnet. Sådana geler är ofta av stort värde för användning som ett medium i vilket isoelektrisk fokusering av proteiner kan genomföras.

Den agaros som användes i blandningen kan vara vilken som helst som har renats tillräckligt så att den uppvisar ett elektroendosmosvärde (~Mr) av 0,10 eller lägre, av vilka flera nu finnes kommersiellt tillgängliga. Agaros_som har denna grad av renhet skiljer sig från agaros som tidigare fanns allmänt tillgänglig genom att sådana renade produkter icke visar någon ökning i gelstyrka vid blandning med johan- nesbrödgummi eller renat johannesbrödgummi medan agaros med en lägre grad av renhet (med ett -Mr-värde större än 0,10) verk-- ligen uppvisar en sådan ökning i gelstyrka såsom exempelvis beskrivas i den amerikanska patentskriften 2.466.146.

Elektroendosmosvärdet för den orena agarosen kan icke elimi- neras eller minskas till 0 genom att man blandar den med ett vattenlösligt gummimaterial med hög viskositet såsom det för renad agaros kan. 449 496 Elektroendosmosvärdet för agarosen mätes genom att man bereder en l % (vikt)-lösning av agarosen i 0,05 M pH 8,6 barbitalw .buffert. 3 ml av lösningen hälles på ett rent objektglas och får gela vid rumstemperatur. Med användning av en avskuren injektionsnål med liten diameter (nr 13) fäst till en injek- tionsspruta drages ett enda hål med l - 2 mm diameter ut från centrum av gelet. En standardtestlösning beredes som består av l0 mg/ml dextran 500 (Pharmacia) och 2 mg/ml kristallint (4x) humant albumin i 0,05 M pH 8.6 barbital-buffert. Med användning av en droppräknare med liten inre diameter till- sättes lösning som är tillräcklig för att nästan fylla det utdragna hålet. Dessa objektglas placeras därefter i position för elektrofores med användning av pappersvekar. En spänning om l0 volt/cm (75 volt) pâlägges med användning av konstanta spänningsinställningar.

Elektrofores fortsättes i 3 h,därefter avlägsnas objektglasen.

Visualisering utföres i två steg. Objektglasen placeras först i denaturerad (3A) etanol i 15 min. varefter positionen för dextranet kan bestämmas med avseende på den ursprungliga. (centrum till centrum). Efter bestämning överföres objekt- glasen till proteinfärgningslösning beredd av 0f5 g amidosvart i 50 ml isättika som därefter fylles upp till 500 ml med eta- nol. Efter 15 min. tvättas objektglasen i en l:l ättiksyra (5 %):etylalkohol-lösning för avlägsnande av överskottsfärg.

En timme är tillräcklig även om albuminpositionen vanligtvis kan bestämmas efter l5 min. Avståndet från centrum av fläcken till centrum_av originalet bestämmes.

Schematiskt.kan detta beskrivas som: .

C+)A-.. ^ o DG) A = albumin O = anbringningspunkt (original) D = dextran Graden_av elektroendosmos (-Mr) kan beräknas med användning av _ekvationen: -Mr = OD AO+OD 449 496 Gelstyrkevärdena (även kända som "brottstyrkevärden") som här hänvisas till kan bestämmas med användning av följande förfa- rande. 500 g av en lösning som skall testas framställes så att den innehåller de föreskrivna procentandelarna av extrakt och andra ingredienser. Det är lämpligt att från början fram- ställa kompositionen så att mängden vatten är obetydligt mindre än den totala mängd som erfordras och att upphetta kom- positionen på ett vattenbad vid ungefär l00°C under omröring i ungefär 5 min. för âstadkommande av upplösning av de-fasta substanserna. Lösningen inställes därefter till den slutliga 500 g vikten och medan den fortfarande är varm uppdelas den i tre lika portioner, varvid varje portion placeras i en kris- tallisationsskål med 7 cm diameter, vilken är 5,0 cm djup och är placerad i ett vattenbad som hâlles vid den föreskrivna test- temperaturen. Därefter avlägsnas skålarna från vattenbadet och den gelade halten för varje avlägsnas och placeras på nytt i sin skål efter att ha vänts upp och ner. Varje skål som innehåller sitt omvända gel placeras pâ behållaren hos den anordning som användes för bestämning av den kraft som utövas av en kolv som har en diameter av l cm som sänker sig med en hastighet av 16,83 om/min. mot den övre ytan av gelet tills kraften plötsligt minskar vid ögonblicket för gelets brist- ning. Den maximikraft som noteras anges som brottkraft.

Brottkraften för var och en av de tre proven noteras och genomsnittsvärdet därav anges som gelstyrkevärdet för den testade extraktionen. Under det att andra typer av mätanord- ningar kan användas åskådliggöres och beskrives den anordning som användes vid erhållande av de brottstyrkevärden som här anges i den amerikanska patentskriften 3.342.612. Den anord- ning som här användes hade en automatisk drivning för fram- flyttning av kolven med en konstant hastighet av 16,83 cm/min.

Gelning utföres för ändamålet enligt testet genom kylning av lösningen vid s - 1o°c i 24 h och mätningen sker vid 25°c med användning av en kolv som har en diameter av l cm.

Vilka som helst av en mångfald kända reningsförfaranden inne- fattande'fraktionerad utfällning, fast~fasadsorption av föro- 449 496 reningar såsom i jonbyteskromatografi och liknande kan använ- das antingen ensamma eller i kombination med varandra för minskning av sulfat-och/eller karboxylat-halten för agarosen och för reduktion av dess elektroendosmosvärden, Det vattenlösliga gummimaterialet måste vara ett som av sig själv löses i vatten vid temperaturer upp till kokpunkten utan gelning; gummit måste av sig själv bilda en lösning med avse- värd viskositet, d v s en lösning som vüien]«xmenUatnm1avjcke större än 10 % av gummimaterialet uttryckt i vikt visar en viskositet av minst l0 cP vid 25°C. Några lämpliga vattenlös- liga gummimaterial bildar lösningar med denna viskositet vid låg koncentration, av storleksordningen 0,1 viktprocent eller ännu lägre, medan andra kommer att bilda lösningar som endast har den specificerade viskositeten vid en koncentration som närmar sig 10 viktprocent. Dessa och andra viskositetsvärden som här refereras till kan bäst mätas med en Brookfield- Viscometer vid 30 varv/min. med användning av en axel nr l.

Bland de bästa lämpliga gummimaterialen är renat johannesbröd- gummi, renat guargummi, polyvinylalkohol och dextran. Gummi- materialet måste vara fritt från joniska eller laddade grupper som har tendens att förorsaka elektroendosmos och måste vara beständigt mot hydrolys som kan ge sådana joniska eller ladda- de grupper; såsom framhållits ovan är polyakrylamid utesluten _p.g.a. elektroendosmosegenskaperna för kommersiellt tillgäng- lig polyakrylamid och p.g.a benägenheten hos detta material att hydrolysera vid olika pH-nivåer med bildning av karboxy- latgrupper och/eller en ökning i elektroendosmos. I fråga om naturliga produkter eller naturliga gummimaterial, såsom johannesbrödgummi och guargummi är det väsentligt att gummi- materialet är i renad form, fritt från skalfragment och andra föroreningar som kan skymma eller störa färgningsförfarings- sätt som användes vid isoelektrisk fokusering.

Den torra fasta blandningen kan innehålla från 2 till 99 vikt- procent renad agaros, varvid återstoden väsentligen består av det vattenlösliga gummimaterialet, och är företrädesvis i fin- 449 496 fördelad form. Ju större den grad av elektroendosmos som visas av vattenhaltiga geler framställda av den renade agaro- sen ensam är desto större är den mängd av vattenlösligt gummi- material som erfordras i blandningen; och ju lägre koncentra- tionen av en vattenlösning av gummimaterialet ensamt som har den erforderliga viskositeten är desto mindre av gummimateria- let erfordras för att framkalla en given minskning i elektro- endosmosegenskaperna för det vattenhaltiga gelet framställt av blandningen. I en föredragen utföringsform består den torra blandningen väsentligen av finfördelade partiklar av renad agaros blandade med partiklar av gummimaterial. Partikelstor- lek är icke kritisk och kan vara vilken som he1st.som är lämplig för snabb upplösning i vatten, varierande från mycket grova partiklar av storleksordningen l mm eller mer i dia- metern ner till så liten som bekvämt kan malas, av storleks- ordningen för de som passerar en 400 mesh sikt (38 mikron siktöppning) ASTM-testmetod E-ll-6l.

Den renade agaros som användes har företrädesvis ett elektro- endosmosvärde (-Mr) som icke är större än 0,05 och blandningen innehåller från 50 till 90 viktprocent av den renade agarosen, varvid de återstående l0 - 50 viktprocenten utgör det önskade vattenlösliga gummimaterialet.' Blandningen kan användas genom att man helt enkelt löser den i vatten genom upphettning och omröring på samma sätt som upplösning av agaros enbart. De amfolyter och/eller buffert- substanser som erfordras i gelet för användning vid isoelekt- risk fokusering kan blandas med den torra fasta blandningen eller också kan de separat lösas innan gelning inträffar; de kan även tillsättas senare efter uppvärmning av gelet för att överföra det i vätskeform och därefter låta det gela igen.

Den mängd av blandningen som användes för framställning av 1 gelet kan varieras vidsträckt beroende på den gelstyrka eller porositet som önskas. Den mängd agaros som är nödvändig att lösas i vatten för framställning av ett gel med specificerad styrka kan variera avsevärt som en funktion av utgångsmate- 449 496 rialet för agarosen och dess tidigare historia samt dess grad av renhet. Som praktiskt förhållande gäller att den minimi- styrka för ett gel som är lämplig som ett medium för isoelekt- risk fokusering är ungefär 50 g/cm2. Eftersom gummikomponen- *ten_hos blandningen enligt föreliggande uppfinning icke på- verkar gelstyrkan för den renade agarosen är det-mängden aga- _ 6 ros i blandningen som löses som reglerar styrkan för gelet. 7 I fråga om vissa kommersiellt tillgängliga agarostyper kan gelstyrkan för ett gel innehållande l viktprocent agaros vara så stor som 1000 till 1500 g/cmz medan andra visar avsevärt lägre styrka under samma betingelser. Dessutom är det önsk- värt som en praktisk omständighet att den varma lösningen av blandningen i vatten har en viskositet som är tillräckligt låg så att lösningen med lätthet kan hällas, d v s en viskositet som icke är större än ungefär 6000 cP vid 75oC med användning av en Brookfield-viskosimeter med lämplig tillsats. Det är även viktigt att tillräcklig gummikomponent finnes närvarande så att den, i frånvaro av agaros, bildar en lösning i vatten som har en viskositet av minst l0 cP vid 25OC. Följaktligen kan den mängd av blandningen av renad agaros med ett vatten- lösligt gummimaterial som användes i ett vattenhaltigt gel i överensstämmelse med föreliggande uppfinning variera från ungefär 0,2 till l0 viktprocent av vattnet, företrädesvis från 0,2 till 2 viktprocent. Geler som innehåller från 0,2 till 2 % av blandningen baserat på vikten av vattnet föredrages eftersom sådana geler har ringa eller icke någon molekylsikt- effekt oberoende av molekylvikten eller storleken för det protein som underkastas isoelektrisk fokusering varför prak- tiskt taget hela den molekylära separation som inträffar är en funktion av endast den isoelektriska punkten för varje protein. :J Dessutom medger de föredragna gelerna lätt diffusion av pro- Ü teinprovet in i gelet. f” Det är även möjligt att tillverka ett sådant vattenhaltig gel fritt från elektroendosmos genom lösning av den renade agarosen och gummimaterialet individuellt i en enda vattenvolym. Detta innebär att gelet kan framställas genom upplösning i vatten \ 449 496 vid förhöjd temperatur av (l) renad agaros som har ett elektro- endosmos(-Mr)-värde som icke är större än 0,10 och (2) ett vattenlösligt gummimaterial fritt från skalfragment och andra föroreningar som stör färgning, fritt från laddade grupper och lösligt av sig självt i kokande vatten utan gelning för bild- ning av en lösning som har en viskositet vid en koncentration som icke är högre än l0 viktprocent av minst lO cP vid 25OC, varvid mängden av summan av nämnda agaros och nämnda gummi- material är från 0,2 till 10 viktprocent av vattnet; varvid mängden agaros är från 2 till 99 viktprocent av nämnda summa och varvid mängden av nämnda gummimaterial är tillräcklig för bildning, i frånvaro av agarosen, av en lösning i vattnet som har en viskositet av minst 10 CP vid 25°C, och varvid man låter lösningen svalna för bildning av ett gel. Üppfinningen âskådliggöres närmare medelst följande exempel.

Exemgel Agaros separerade från kommersiellt tillgänglig agar genom framställning av enflösning av agar till vilken i löst till- stånd sättes en annan polysackarid, såsom karragenan, som är i högre grad sulfaterad än agaropektinkomponenten hos agar och som blir utfälld i en separerbar flockulerad form genom_till- sats av ett kvaternärt ammoniumsalt, agaropektin som i övrigt utfälles izen med svårighet separerbar form blüfgemmxinäïlrnflng av ett kvaternärt ammoniumsalt i lösningen på något sätt förenat med en fällning som bildas genom utfällningen av den tillsatta polysackariden med det resultat att när fällningen av tillsatt polysackarid avlägsnas från den kvarvarande aga- roslösningen genom filtrering eller centrifugering kan agaro- pektinet även pä effektivt sätt avlägsnas från lösningen och separeras från den nonjoniska agarosen som återstår i lös- ning. Den agaros som återstår i lösning kan utfällas såsom genom tillsats av isopropanol och därefter utvinning såsonlgarm filtrering eller centrifugering (amerikanska patentskriften 7 3.281.409). _En lösning framställes därefter genom upphettning av l2;0 g av agarosen i §Q0 ml vatten under omröring. Till 449 496 '10 lösningen sattes, efter kylning till 60oC, 200 g vattensvällda och avvattnade pärlor av ett katjonbytarharts, QAE Sephadex (Pharmacia) och blandningen omrördes i en halvtimme vid GOOC fu och filtrerades; till lösningen sattes 2 l 80-procentig vattenhaltig isopropanol vid 45°C för koagulering av den renade agarosen som separerades på en sikt, torkades vid 50oC och maldes i en hammarkvarn för passage genom en 20 mesh sikt.

En del av den renade agarosen löstes i vatten genom upphett- ning till 90°C för framställning av en lösning innehållande l viktprocent agaros, denna kyldes för att bringa den att gela och dess elektroendosmos (-Mr) visade sig vara 0,03. Gel- styrkan för ett gel innehållande l viktprocent av den renade agarosen bestämdes vara ungefär 950 g/cmz.

I 500 ml destillerat vatten dispergerades 5 g johannesbröd- gummi (pulver) och blandningen upphettades till l00°C och kokades i 30 sek.; 10 g diatomacëjordfilterhjälpmedel (Hyflo Supercell) sattes till den resulterande lösningen och bland- ”ningen filtrerades vid ett tryck av 0,7 ~ 1,4 kp/cm2 genom en förupphettad filterbomb försedd med en lämplig filtdynfilter- duk. När filtreringen var fullbordad tvättades filterkakan med 75 ml destillerat vatten och det förenade filtratet och tvättvattnet koagulerades genom blandning med 2,5 volymer 85-procentig isopropanol. Efter avrinning på en sikt åter- uppslammades koagulatet i 85-procentig isopropanol, fick stå i 15 min., fick avrinna och torkades genom uppvärmning vid 6006 i 4 - 6 timmar, maldes därefter i en hammarkvarn till 20 - 40 mesh (utbyte ungefär 3 - 3,5 g). Detta renade johan- nesbrödgummi var vattenlösligt, fritt från laddade eller joniska grupper, stabilt mot hydrolys som bildar laddade 'grupper och fritt från skal och andra föroreningar som upp- vy; tär färg och stör färgningen och/eller påvisande av proteiner i geletÉ en vattenlösning innehållande 0,3 viktprocent av gummit visade av sig själv en viskositet större än 10 cP vid _ 3 25°c. . ~ En blandning framställes genom sammanblandning av 70 viktdelar 449 496 ll av den renade finfördelade agaros som framställts såsom beskrevs ovan och 30 viktdelar av de finfördelade partiklarna av renat johannesbrödgummi. Blandningen löstes med lätthet i vatten genom omröring av 0,5 g i 100 ml_vatten och upp- hettning till kokpunkten eller tills den var omsorgsfullt löst; lösningen kyldes därefter till 56oC och 2 viktprocent amfolyter tillsattes under omröring. Lösningen_göts i en lämplig form och fick gela genom kylning, lagrades därefter vid 4°C under minst l h före användning.

Det sålunda framställda gelet visade sig icke ha någon mätbar elektroendosmos och en gelstyrka av 350 g/cmz. Ett prov av proteinlösning som anbringades till ytan av gelet på vanligt sätt utsattes på effektivt sätt för isoelektrisk fokusering.

Liknande resultat erhölls när man i stället för johannesbröd- gummit använde ett prov av guargummi i samma mängd.

När polyvinylalkohol och dextran användes i stället för renat johannesbrödgummi vid koncentrationer som framkallar en visko- sitet större än l0 CP vid 25OC (d v s ungefär 2 ~ 10 %) erhålles därvid liknande-resultat.

Claims (7)

449 496 Ii EATENTKRAV

1. l. Vattenhaltig gelkomposition fri från elektroendosmos, k ä n n e t e c k n a d av att den har en gelstyrka av minst 50 g/cm2, företrädesvis minst 100 g/cm2_och är lämplig för användning som ett medium for isoelektrisk fokusering - väsentligen bestående av en gelad lösning i vatten av renad agaros som har ett elektroendosmosvärde (-Mr) mindre än 0,lO och ett gummimaterial som väljes bland renat guargummi, renat johannesbrödsgummi, polyvinylalkohol eller dextran, varvid agarosen finnes närvarande i en mängd av från 2 till 99 viktprocent, räknat på vikten av agarosen och gummimaterial och, varvid vidare mängden agaros och gummimaterial som finnes närvarande i gelkompositionen är_från 0,2 till 10 viktprocent av vattnet. I

2. Komposition enligt patentkravet l, k_ä n n e t e c k n a d av att agarosen har ett elektroendosmosvärde (~Mr) som icke är större än 0,05 och finnes närvarande i en mängd från 50 till 90 viktprocent räknat på vikten av agarosen och gummimaterial.

3. Förfarande för framställning av ett vattenhaltigt gel fritt från elektrdendosmos, k ä n n e t e c k n a t av att man i vatten vid förhöjd temperatur löser (1) renad agaros som har ett elektroendosmos(-Mr)-värde som icke är större än 0,10 och (2) ett vattenlösligt gummimaterial som väljes bland renat guargummi, renat johannesbrödsgummi, polyvinylalkohol eller dextran, varvid mängden av summan av agarosen och gummimate! riälet är från 0,2 till l0 viktprocent av vattnet, mängden av agaros är från 2 till 99 viktprocent av-det sammanförda agaros och gummimaterialet, och varvid mängden av nämnda gummimate- rial är tillräcklig för bildning, i frånvaro av agarosen, av en lösning i vattnet som har en viskositet av minst 10 cP vid 25°C, och låter lösningen svalna för bildning av ett gel.

4. Förfarande för framställning av ett vattenhaltigt gel fritt från elektroendosmos~och lämpligt för användning som ett medium för isoelektrisk fokusering, k ä n n e t e c k n a t Q _ xp. x'\ 449 4% I3 av att man i vatten gelar en torr fast substans bestående av en blandning av renad agaros som har ett elektroendosmosvärde (-Mr) mindre än 0,10 tillsammans med ett gummimaterial som väljes bland vinylalkohol eller dextran, varvid agarosen finnes närvarande i en mängd av från 2 till 99 viktprocent baserat på vikten av den fasta blandningen.

5. Förfarande enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k n a t av att den torra fasta substansblandningen föreligger i parti- kelform vari några partiklar består av renad agaros och de återstående partiklarna består av gummimaterialet.

6. Förfarande enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k n a t av att den torra fasta substansblandningen finnes närvarande i en mängd av från 0,2 till 10 viktprocent av vattnet'för till- handahållande av en vattenhaltig gelkomposition fri från elektroendosmos och som har en gelstyrka av minst 50 g/cmz.

7. Förfarande enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a't av att den torra fasta substansblandningen finnes närvarande i en mängd av från 0,2 till 2 viktprocent av vattnet. renat guargummi, renat johannesbrödsgummi, poly-_