DD202800A1 - Verfahren zur gewinnung gereinigter proteinisolate - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Gewinnung gereinigter Proteinisolate in hoher Ausbeute aus pflanzlichen Rohstoffen, vorzugsweise aus Globuline und Albumine enthaltenden Pflanzensamen. Bisher angewandte Verfahren fuehren zu Proteinverlusten und unerwuenschter Proteinveraenderungen. Die Aufgabe besteht darin, Verfahrensbedingungen aufzuzeigen, unter denen Proteine nahezu vollstaendig, in hoher Reinheit und schonend gewonnen werden koennen. Erfindungsgemaess werden die Globuline und Albumine enthaltenden pflanzlichen Rohstoffe einer Extraktion mittels waessriger 0,5- bis 7%iger Salzloesung, vorzugsweise mittels einer Natriumchloridloesung, unterworfen. Der Extrakt wird nach einer gegebenenfalls vorgeschalteten Reinigung zunaechst ultrafiltriert, worauf das Retenat durch Dialyse gegen Wasser weitgehend vom eingesetzten Salz befreit wird. Erfindungsgemaess werden sowohl die salzloeslichen Globuline als auch die wasser- und salzloeslichen Albumine ab einer jeweils vorgegebenen relativen Molekuelmasse bei der Ultrafiltration zurueckgehalten.

Description

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Erfinder: Dr. Jürgen Kroll Regina Kröck Prof. Dr. Berthold Gaßmann

Verfahren zur Gewinnung gereinigter Proteinisolate Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Proteinisolaten in hoher Ausbeute aus pflanzlichen Rohstoffen, vorzugsweise aus Globuline und Albumine enthaltenden Pflanzensamen, durch Anwendung von Membran-Trennverfahren,

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Üblicherweise werden Proteinisolate aus Pflanzensamen oder entfettetem Samenmaterial technisch durch Extraktion mittels wäßriger Lösungen im alkalischen oder neutralen pH-Bereich oder durch Einsatz von Salzlösungen unterschiedlicher Art und Ionenstärke und nachfolgende Fällung der Proteinhauptfraktion, zumeist von Globulinen, oder von verschiedenen Proteinfraktionen gewonnen·

Im Falle der Abscheidung von Globulinen aus den Extrakten wird im allgemeinen eine isoelektrische Fällung im zumeist sauren Milieu durchgeführt. Die Präzipitation der Albumine geschieht im allgemeinen durch Hitzekoagulation im alkalischen mitunter jedoch auch im neutralen oder schwach sauren Bereich sowie durch Komplexbildung, z. B. mit polyanionischen und anderen Fällungsmitteln, oder durch Trock-

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nung des Extraktes bzw. des Uberstandes der isoelektrischen Fällung· Darüber hinaus ist vorgeschlagen worden, unter alkalischen Bedingungen durch Erhitzen Albumine und Globuline gemeinsam zu kopräzipitieren·

Wegen der unterschiedlichen Fällungseigenschaften der Globuline und Albumine, als den Hauptfraktionen pflanzlioher und insbesondere in pflanzlichen Samen enthaltener Proteine, können beide Proteinarten getrennt gewonnen werden, wobei jede der isolierten Fraktionen fast immer auch Beimenungen der anderen enthält. Die Gewinnung beider Proteinfraktionen bedingt einen hohen Verfahrensaufwand. Häufig wird daher nur auf die Isolierung der Globuline Wert gelegt, zumal wenn diese gegenüber Albuminen den größten Anteil ausmachen und vergleichsweise einfacher zu gewinnen sind« Nach isoelektrischer Fällung der Globuline verbleiben die Albumine im Überstand und werden verworfen. Das bedingt wiederum einen hohen Proteinverlust und wirft zusätzliche Abproduktprobleme auf.

Ein weiterer Nachteil der bekannten Proteingewinnungsverfahren besteht darin, daß sowohl durch isoelektrische Fällung als auch durch Hitzekoagulation oder durch Fällung mit Komplexbildnern und deren nachfolgende Abtrennung die Proteine mehr oder weniger stark verändert, speziell denaturiert werden, was sich auf deren funktioneile Eigenschaften auswirkt und die Anwendungsmöglichkeiten limitiert. Zum anderen weisen z. B. die nach Hitzekoagulation aus Extrakten von Sonnenblumen- und Rapssamen gewonnenen Proteine eine starke Dunkelfärbung auf, was deren Einsatzmöglichkeiten ebenfalls stark einschränkt·

Verfahren zur Proteinfällung mit Hilfe von Komplexbildnern haben unter anderem den Nachteil) daß die komplexbildenden Stoffe nach der Fällung zumeist von den präzipitierten Proteinen wieder abgetrennt werden müssen, was einen zusätzlichen verfahrenstechnischen Aufwand bedingt, oder aber es müssen Komplexbildner eingesetzt werden, die gesundheitlich und anwendungstechnisch unbedenklich sind und mitverarbei-

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tet bzw. mitverzehrt werden können. Solche speziellen Stoffe sind im allgemeinen nicht nur teuer, sondern sie beeinflussen die funktioneilen und anwendungstechnischen Eigenschaften der Proteine auch in einer Weise, daß sie nicht mehr in der vollen Anwendungsbreite einsetzbar sind.

Es sind auch Verfahren bekannt, welche die Ausfällung der Proteine mit den beschriebenen Nachteilen und dem verfahrenstechnischen Aufwand der Abtrennung durch die Trocknung der Extrakte vermeiden. In diesen Fällen ist aber der energetische und zeitliche Trocknungsaufwand wegen der in bezug auf den Proteingehalt im allgemeinen gering konzentrierten Extrakte relativ hoch. Darüber hinaus fallen dabei stark mit Begleit- und Extraktionsstoffen verunreinigte Proteinisolate und vergleichsweise niedrigem Proteingehalt an.

Die Anwendung der Ultrafiltration zur Gewinnung gereinigter und konzentrierter Proteine ist im Prinzip bekannt und außer für Ausgangsmaterialien tierischer Herkunft auch schon für Sonnenblumen- und Rapssamen sowie kleine Saubohnen beschrieben. Als Extraktionsmedium wird dabei eine natriumsulfithaltige alkalische Lösung eingesetzt, und es wird während der Ultrafiltration mit einer Lösung gewaschen, die denselben pH-Wert wie die Extraktionsflüssigkeit besitzt. Auf diese Weise gelingt zwar die konzentrierte Gewinnung von Proteinen, aber es kommt bekanntermaßen zu irreversiblen Wechselwirkungen zwischen gelösten Proteinen und Sameninhaltsstoffen mit reaktiven chemischen Molekülgruppen, z. B. Chlorogensäure. Dadurch treten in den anfallenden Proteinen negative Farbveränderungen auf. Außerdem kommt es in dem vorgeschlagenen pH-Bereich zu molekularen Protein— Veränderungen, die eine unerwünschte Beeinflussung der funktioneIlen Eigenschaften derart gewonnener Proteinpräparate zur Folge haben.

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Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Entwicklung eines Verfahrens zur Gewinnung von Proteinisolaten in hoher Ausbeute, Reinheit und Qualität aus pflanzlichen Globuline und Albumine enthaltenden Rohstoffen unter Vermeidung von Fällungsreaktionen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, spezifische Verfahrensbedingungen aufzuzeigen, unter denen Proteine nahezu vollständig, in hoher Reinheit und schonend gewonnen werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren der Gewinnung von gereinigten Proteinisolaten aus pflanzlichen Rohstoffen, vorzugsweise aus Globuline und Albumine enthaltenden Pflanzensamen, durch Extrahieren mittels wässriger 0,5 bis 7 %iger, vorzugsweise 3 bis 5 %iger Salz- und insbesondere Natriumchloridlösung, Abtrennen der ungelösten Bestandteile durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Filtrieren besteht in einer Kombination verschiedener Verfahrensschritte, wonach ein die Proteine enthaltender Extrakt, gegebenenfalls nach Reinigung durch Fällungsreaktionen und nachgeschalteter Zentrifugation oder durch Filtration, zunächst einer Ultrafiltration unterworfen und danach das Retenat durch Dialyse gegen Wasser weitgehend vom eingesetzten Salz befreit wird, worauf gegebenenfalls nach Trennung von gelösten und suspendierten Proteinen eine Trocknung erfolgt.

Die Extraktion mittels 0,5 bis 7 %iger Salzlösung, vorzugsweise 3 bis 5 %iger iiatriumchloridlösung, erfolgt dabei in an sich bekannter Weise durch Rühren bei einem Feststoff-Flüssigkeits-Verhältnis von 1 : 5 bis 1 : 20, einer Extraktionszeit von 10 bis 60 Minuten und einem pH-Wert zwischen 5»° bis 7,0. Unter diesen Bedingungen werden pflanzliche, insbesondere die in Pflanzensamen enthaltenen Albumine und Globuline weitgehend gelöst.

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Nach Abtrennung der ungelösten Bestandteile, wobei bekannte Verfalirensschritte der Fest-Flüssig-Trennung, wie Dekanta- · tion, Zentrifugation oder Filtration herangezogen werden, schließt sich gegebenenfalls eine Reinigung des Extraktes zum Zwecke der Abtrennung fein verteilter suspendierter Samenpartikel und gelöster Glykoproteine sowie nichtproteinhaltiger Pflanzeninhaltsstoffe, wie z. B. kohlenhydrathaltiger Schleimstoffe, an. Das kann durch stufenweise pH-Wert-Veränderung des Extraktes um jeweils bis zu einer Einheit, und zwar durch eine Verschiebung in den sauren oder in den alkalischen Bereich erfolgen.

Dadurch kommt es zu einer Ausfällung von Glykoproteinen sowie nichtprotexnischen Biopolymeren und anderen Inhaltsstoffen, wobei gleichzeitig noch suspendierte Feststoffe mitgerissen werden. Eine Klärfiltration, gegebenenfalls unter Verwendung von Filterhilfsmitteln, wie Aktivkohle oder Kieselgur, hat sich zur Reinigung des Extraktes ebenfalls als geeignet erwiesen.

Die erfindungsgemäß eingesetzte Ultrafiltration wird in an sich bekannter Weise unter Verwendung von solchen Membranen durchgeführt, die Proteine mit einer relativen Molekülmasse;?· 10.000 zurückhalten; Stoffe mit einer relativen Molekülmasse<c10.000 passieren diese Membranen und werden mit dem Ultrafiltrat entfernt. Damit ist eine weitere Reinigung der extrahierten Proteine verbunden.

Dem erfindungsemäßen Verfahren liegt die Erkenntnis zugrunde, daß bei Einhaltung dieser Bedingungen der Ultrafiltration sowohl die salzlöslichen Globuline mit einer relativen Molekülmasse p?50.000 als auch die wasser- und salzlöslichen Albumine mit relativen Molekülmassen von ca. 10.000 bis 25·000 zurückgehalten werden und im Ultraretenat enthalten sind. Dadurch wird eine nahezu vollständige Gewinnung der extrahierten Proteine erzielt, wobei das Retenat einen Gehalt von 1 bis 8 %, vorzugsweise 3 bis 6 % Protein aufweist. Gleichzeitig wird mit der Ultrafiltration eine weitere Reingung erzielt.

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Ein weiteres Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, aus dem Retenat in an sich bekannter Weise mittels geeigneter Membranen durch Dialyse gegen Wasser und bei ständiger Erneuerung des Lösungsmittels weitgehend das zur Extraktion der Proteine eingesetzte Salz zu entfernen. Die Dialyse kann in einem Dialyseschlauch erfolgen. Es haben sich jedoch auch andere Dialysevorrichtungen als geeignet erwiesen.

Die wasserlöslichen Albumine verbleiben dabei in Lösung, während die salzlöslichen Globuline in fein verteilter Form ausflocken.

Mit dem Salz passieren andere niedrigmolekulare Subsstanzen einschließlich Peptidverbindungen ebenfalls die Dialyse membran, wodurch eine zusätzliche Reinigung des Dialyse-Retenates erreicht wird.

Die Trocknung des gesamten dialysierten Retenates erfolgt in an sich bekannter Weise, z. B. durch Gefrier— oder Sprühtrocknung, wobei ein Proteinmischisolat, bestehend aus Albuminen und Globulinen, anfällt. Vor der Trocknung kann jedoch in bekannter Weise auch eine Abtrennung der gelösten Albumine von den suspendierten Globulinen durch Zentrifugation, Filtration oder Dekantation durchgeführt werden. Die Trocknung der Proteinfraktionen wird in diesem Fall getrennt vorgenommen.

Als wesentliche Vorteile der erfindungsgemäßen Arbeitsweise werden angesehen, daß die gelösten Proteine in hoher Ausbeute und Reinheit sowie ohne Fällungsreaktionen und unter Vermeidung der damit verbundenen Nachteile von Proteinveränderungen, speziell Denaturierung, verbunden mit einer Beeinträchtigung der funktioneilen Eigenschaften, gewonnen werden. Unter Berücksichtigung des Standes der Technik ist es erstaunlich, daß die erfindungsgemäß vorgesehene Kombination einzelner, teilweise bekannter Verfahrensschritte von der Fachwelt bisher unbeachtet blieb.

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Überraschenderweise ist gefunden worden, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren anfallenden Proteinisolate im Vergleich zu solchen Isolaten, die nach bekannten Verfahren, z. B. durch isoelektrische Fällung gewonnen werden, wesentlich verbesserte funktionelle Eigenschaften aufweisen; das betrifft vor allem die Löslichkeit sowie Schaum- und Emulgiereigenschaften. Als Ausgangsmaterialien kommen erfindungsgemäß Albumine und Globuline enthaltende Pflanzensamen, a. B. ölsamen wie Sonnenblumen- und Rapssamen, und deren Verarbeitungsprodukte, zur Anwedung, Die Erfindung wird anhand folgender Beispiele näher erläutert.

Ausführungsbe ispieIe Beispiel 1

Aus Sonnenblumensamen-Extraktionsschrot (Rohproteingehalt ca. 37 %) wird mit der lOfachen Menge einer 5 %igen Natriumchloridlösung bei 20 ⁰C und einem pH-Wert von 6,6 durch Rührextraktion ein Extrakt (Rohproteingehalt 1,8 %) hergestellt. Nach Abtrennung des Rückstandes mittels eines Dekanters wird der pH-Wert des Extraktes durch Zugabe von verdünnter Salzsäure auf 5»9 erniedrigt, und nach einer Standzeit von 5 Stunden werden die ausgefällten Schleimund Trübstoffe abzentrifugiert (Klärzentrifuge). Die geklärte Proteinlösung (Rohproteingehalt 1,7·%) wird unter Verwendung von Membranen, die alle Proteine mit einer relativen Molekülmassep· 10.000 zurückhalten, ultrafiltriert, bis das Ultra-Retenat einen Rohproteingehalt von 5»2 % aufweist. Die im Ultra-Filtrat enthaltenen Stickstoffverbindungen (0,12 %) sind durch Zugabe von 20 %iger Trichloressigsäure nicht fällbar.

Im Anschluß daran erfolgt in einem Dialyseschlauch innerhalb eines Zeitraumes von 20 Stunden und bei einer Temperatur von 10 C eine Dialyse des Ultra-Retenates gegen kontinuierlich fließendes Wasser. Dabei kommt es zu einer feinen Ausfällung der Globuline, und der Natriumchloridge-

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halt sinkt auf einen Wert von 0,08 %. Durch nachfolgende Sprühtrocknung des dialysierten Retenates wird ein.. Proteinisolat folgender Zusammensetzung erhalten:

Rohproteingehalt (N χ 6,25) = 94,6 % Natriumchloridgehalt = 0,9 %

Das Produkt weist über den gesamten pH-Bereich eine gegenüber einem nach gleicher Extraktion, aber durch isoelektrische Fällung (pH 3>5) gewonnenem Proteinisolat eine größere Löslichkeit (Pig. 1) sowie eine verbesserte Schaumaktivität und -Stabilität (Tab. 1) auf.

Beispiel 2

Aus Rapsextraktionsschrot (Rohproteingehalt ca. 33 %) wird mit der 10fachen Menge einer 6 %igen Natriumchloridlösung bei 20 ⁰C und einem pH-Wert von 6,5 unter Rühren ein Extrakt (Rohproteingehalt 1,5 %) hergestellt. Nach Abtrennung des Rückstandes durch Filtration über ein.feines Sieb und ein Filtertuch folgt eine Klärfiltration mittels einer Filterpresse mit Asbestfiltern. Die geklärte Proteinlösung (Rohproteingehalt 1,5 %) wird unter Verwendung von Membranen, die alle Proteine mit einer relativen Molekülmasse

10.000 zurückhalten, ultrafiltriert, bis das Ultra-Retenat einen Rohproteingehalt von 4,9 % aufweist. Die im Ultra-Filtrat enthaltenen Stickstoffverbindungen (0,10 %) sind durch Zusatz von 20 %iger Trichloressigsäure nicht fällbar. Im Anschluß daran erfolgt innerhalb eines Zeitraumes von 25 Stunden und bei einer Temperatur von 10 ⁰C in einem Dialyseschlauch eine Dialyse des Ultra-Retenates gegen kontinuierlich fließendes Wasser. Dabei kommt es zu einer feinen Ausfällung der Globuline, und der Natriumchloridgehalt verringert sich auf einen Wert von 0,09 %» Der Niederschlag wird durch Zentrifugation (Becherzentrifuge) von der Lösung abgetrennt, und nach getrennter Gefriertrocknung der Fraktionen fallen folgende Produkte an: 1. Globulinisolat

Proteingehalt (N χ 6,25) = 95,2 % Natriumchloridgehalt = 0,8 %

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2. Albuminisolat

Proteinisolat (N χ 6,25) = 88,2 % Katriutnchloridgehalt = 0,95 %

In Fig. 1 ist die Löslichkeit von Sonnenblumensamen-Pro· teinisolaten in Abhängigkeit vom pH-Wert aufgetragen. Darin bedeuten

Proteinisolat, gewonnen durch isoelektrische Fällung

Proteiisolat, gewonnen durch Ultrafiltration

Tab. 1

Schaumeigenschaften von Sonnenblumensamen-Proteinisolaten

	Schputn-	Schaum
	lndex C%J	stabilität £%J
Isolat,
isoelektr.	40,0	0
gefällt
Isolat,
gewonnen
durch	390,0	75 ·
Ultrafiltra
tion

Claims (6)

237034 8 10 Erf indungs an spxHÜche

1. Verfahren zur Gewinnung gereinigter Proteinisolate aus pflanzlichen Rohstoffen, vorzugsweise aus Globuline und Albumine enthaltenden Pflanzensamen, durch Extraktion mittels wäßriger 0,5 bis 7 %iger, vorzugsweise 3 bis 5 %iger Salz- und insbesondere Natriumchloridlösung, Abtrennen der ungelösten Bestandteile durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Filtrieren und gegebenenfalls Reinigen des Extraktes durch Fällungsreaktionen und nachgeschaltetes Zentrifugieren oder durch Filtrieren, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt zur gemeinsamen Abtrennung und Reinigung der gelösten Proteinfraktionen zunächst einer Ultrafiltration unterworfen, danach das Retenat durch Dialyse gegen Wasser weitgehend vom Kochsalz und anderen Inhalts- oder Begleitstoffen mit geringer relativer Molekülmasse befreit wird, worauf gegebenenfalls nach Trennung der gelösten und suspendierten Proteine eine Trocknung erfolgt.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß Proteine mit einer relativen Molekülmasse 10.000 durch Ultrafiltration abgetrennt werden.

3· Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt bis zu einem Proteingehalt von 1 bis 8 %, vorzugsweise 3 bis 6 %, ultrafiltriert wird.

4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dialyse bei ständiger Erneuerung des Lösungsmittels erfolgt.

5· Verfahren nach Punkt 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu einem Salzgehalt des Extraktes von 0,01 bis 0,5 %> vorzugsweise 0,05 %» dialysiert wird.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5> dadurch gekennzeichnet, daß vor der Trocknung eine Trennung der gelösten und der suspendierten Proteine erfolgt.

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