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"Verfahren und Vorrichtung für die Elektrophorese"
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Die Frfindung betrifft ein elektrophoretisches Verfahren für die,
insbesondere immunelektrophoretische, Untersuchung und/oder Darstellung chemischer
Substanzen, bei welchem die zu untersuchenden Substanzen oder die Ausgangsprodukte
der darzustellenden Substanzen in wässriger Lösung in einem Trägermedlum, z.B. einem
Gel, zur Behinderung t),'.W. Stabilisierung (Je konvektiven Transports unter F:inwirkung
eines elektrischen Feldes transportiert werden, wobei z.B. die wässrige Lösung Reaktionsmittel
enthält, welche mit den quantitativ zu bestimmenden Substanzen Präzipitate bilden
und aufgrund elektrophoretischen Transports in die wässrige Phase des Trägermediums
gelangen, um eine Präzipitation über eine Wanderstrecke zu erhalten, deren Länge
proportional zur Menge der zu bestimmenden Substanzen ist.
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Bei der quantitativen Bestimmung von Substanzen, beispielsweise Proteinen,
wird z.B. ein Typ der Immunelektrophorese ungwandt, die als "Rocket-Elektrophorese"
bezeichnet wird (vergl . Dawrel l C.B. , Anal . Biochem. 15 (1966), Seite 4i, fi').
hierbei wird auf die Oberseite einer horizontal angeordneien Clasplatte eine etwa
1 mm starke Schicht eines wasserhaltigen Agarosegels aufgetragen, das Antikörper
gegen Antigens enthält, welche die zu bestimmenden Substanzen sind. Die zu untersuchenden
Probelösungen,
welche die Antigene enthalten, werden in kleine runde
Vertiefungen gefüllt, die zuvor entlang der einen Kante des Gels ausgeschnitten
wurden. Entlang dieser Kante wird ein Flüssigkeitskontakt mit einem eine wässrige
Pufferlösung enthaltenden und mit einer Kathodenelektrode versehenen Gefäß mit Hilfe
dochtähnl Icher Verbindungsstreifen, z.J3. aus !>apier, hergestellt. Die gegenüberliegende
Kante der Agarosegelschicht ist auf analoge Weise mit einer Pufferlösung in einem
Anodengefäß in Verbindung gebracht.
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Während die Glasplatte horizontal auf eine gekühlten Oberfläche ruht,
wird die Elektrophorese so ausgeführt, daß die Antigene in das Agarosegel transportiert
werden, und zwar in Richtung der Anode. Während dieses Vorganges reagieren die Antigene
mit den Antikörpern. Es ergeben sich Präzipitate, die, von oben gesehen, als konischer
Teil einer Rakete beschrieben werden können, wobei die Spitze in Richtung der Anode
weist. Die Fläche, die durch die Umrißlinie des Präzipitats und eine Tangentenlinie
durch den am nächsten liegenden Teil der runden Vertiefung begrenzt wird, ist, jedenfalls
in einem begrenzten Bereich, direkt proportional zu der Menge des Antigens. Eine
analoge Proportionalität wird jedoch in einem engen Konzentrationsbereich auch bezüglich
der maximalen Höhe bzw. Länge des Präzipitatflächenbereiches festgestellt. Auf diese
Weise können nicht nur Antigene bestimmt werden, sondern auch solche Substanzen,
die eine spezifische Affinität zu einer anderen Substanz haben und mit welcher Präzipitate
gebildet werden können. So kann beispielsweise Protein A von Staphylococcen mit
bestimmten Immunoglobulinen Präzipitate bilden, ebenso Lektine mit Proteinen, die
bestimmte Polysacharide enthalten. Diese Verfahren werden Affinoelektrophorese genannt
und in analoger Weise wie die "Rocket-Elektrophorese" ausgeführt. Ein Nachteil bei
der Elektrophorese vom "Rocket"-Typ besteht darin, daß ein großer
Anteil
der reaktiven Agenzien in dem Gel nicht ausgenutzt wird. Ein weiterer Nachteil besteht
darin, daß mit der "Rocket-Elektrophorese" auch in Kombination mit der Proteinfärbemethode
sehr niedrige Proteinkonzentrationen nicht bestimmt werden können. Nur unter sehr
günstigen Bedingungen ist es möglich, Proteinkonzentrationen von etwa 5 mg pro titer
oder höher zu bestimmen. Obgleich die Empfindlichk(it relativ gut ist, besteit h.ufig
die Notwendigkeit, (leer <est imm'2ng niedrigerer Protei nkonzentra ti onen.
Ein weiterer Nachteil der "Rocket-Elektrophorese" besteht in der Schwierigkeit,
in den Vertiefungen ein genügend großes Volumen der Probenflüssigkeit unterzubringen,
um die gewünschte hohe Empfindlichkeit zu erzielen. Nachteilig ist, auch bei der
"Rocket-"Methode der hohe Zeitaufwand.
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In vielen Fällen muß man die Elektrophorese über mehrere Stunden,
z.B. 12 Stunden oder über Nacht, ausführen, was teilweise von der Möglichkeit abhängt,
die Wärme durch einen unter der Glasplatte angeordneten Kühler abzuleiten.
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Die Wärmeableitung ist nicht so wirkungsvoll, als daß man die Stromstärke
in dem gewünschten Maß für eine signifikante Verkürzung der Elektrophoresezeit anheben
könnte.
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Durch die Verwendung der dochtähnlichen Verbindungsmittel entstehen
ebenfalls Nachteile durch signifikante Feldverluste und Wärmeerzeugung. Die dochtähnlichen
Verbindungsmittel tragen auch zur Kontamination durch Mikroorganismen, Proteine
und dergl. bei.
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Autabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Elektrophoreseverfahren
der eingangs genannten Art vorzuschlagen, welches die Nachteile der bekannten Verfahren
nicht aufweist und die es insbesondere ermöglicht, zur Erhöhung der Empfindlichkeit
größere Mengen Probeflüssigkeit zu verwenden und die verwendeten Reagenzien unter
günstigeren Fel dbedingungen auszunutzen.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der elektrophoretische
Transport in einem schichtförmigen Trägermedium durchgeführt wird, welches zwischen
wenigstens zwei zueinander beweglichen platten- oder folienförmigen Elementen so
gehalten wird, daß die einander gegenüberliegenden Enden des Trägermediums mit je
einer in zugeordneten Elektrodenbehältern enthaltenen Pufferlösung unmittelbar in
Verbindung steht, und daß nach dem elektrophoretischen Transport durch Abnehmen
wenigstens einer der platten- oder folienförmigen Elemente die eine Flachseite des
schichtförmigen Trägermediums freigelegt wird.
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Dieses neue elektrophoretische Verfahren eignet sich für die quantitative
oder semiquantitative Bestimmung von Substanzen sowie für immunelektrophoretische
Untersuchungen in einem Trägermedium in vergleichsweise sehr kurzer Zeit, beispielsweise
bis zu 1/6 der Zeit, die bei der "Rocket"-Elektrophorese notwendig ist. Das Xerfindungsgemäße
Verfahren ist daher sehr wertvoll für die Anwendung beispielsweise in Krankenhäusern,
wo kurzfristig ein Ergebnis erwünscht oder notwendig ist. Das erfindungsgemäße Verfahren
bringt erhöhte Empfindlichkeit insbesondere dadurch, daß größere Probenmengen, beispielsweise
mehr als das 10-fache wie bei der "Rocket"-Elektrophorese verarbeitet werden können.
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Durch die Verwendung eines Trägermediums, welches nach der Ausführung
der Elektrophorese weitgehend freigelegt werden kann, sind auch die anschließenden
Untersuchungsschritte, wie Anfärben oder dergl. schnell und wirkungsvoll ausführbar.
Dadurch, daß das Trägermedium unmittelbar mit den Pufferlösungen in Verbindung steht,
werden die Nachteile, die mit der Verwendung von dochtähnlichen Verbindungsmitteln
hinsichtlich der ungünstigen Beeinflussung des elektrischen Feldes und der Verunreinigung
verbunden sind, ausgeschlossen.
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Vorzugsweise wird der elektrophoretische Transport in einem vertikalen
schichtförmigen Trägermedium ausgeführt, welches benachbart eines oberen und unteren
Randes jeweils mit einer der Pufferlösung unmittelbar in Verbindung steht.
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Wenn gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung der elektrophoretische
Transport in einem schichtförmigen Trägermedium ausgeführt wird, welches in mehrere
im wesentlichen parallel zueinander verlaufende Streifen unterteilt ist, kann die
Elektrophorese gleichzeitig für eine Vielzahl von Proben entsprechend der Anzahl
der Streifen ausgeführt werden. Trotz der Unterteilung in Streifen ist die Freilegung
des Trägermediums nach der Ausführung er Elektrophorese auf einfache Weise möglich.
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Isei einer noch weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird der elektrophoretische
Transport in einem schichtförmigen Trägermedium ausgeführt, welches in mehrere im
wesentliche parallel zueinander verlaufende Streifen unterteilt ist, die über einen
geringen Bereich, vorzugsweise benachbart dem Ende, das dem Ende der Probenapplikation
gegeniiberliegt, miteinander in Verbindung stehen. Auf diese Weise kann einfach
die gemeinsame unmittelbare Verbindung des in Streifen unterteilten Trägermediums
mit der zweiten }>utSerl5sung hergestellt werden.
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Wenn die Streifen des Trägermediums für den elektrophoretischen Transport
jeweils in einem kanalförmigen Abteil gehalten sind, und die zu untersuchenden Substanzen
von einem sich stirnseitig von den jeweiligen Streifen nach außen erweiternden Abschnitt
des Abteils dem Streifen zugeführt wird, kann bei günstiger Geometrie für die Ausführung
der Elektrophorese und einfacher Freilegbarkeit
der Streifen des
Trägermaterials ein relativ großes Probenvolumen eingesetzt werden..
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Dadurch, daß das Trägermedium ein die Präzipitation der zu untersuchenden
Substanz förderndes und/oder der Elektroendosmose entgegenwirkendes Reaktionsmittel,
z.B. Polyäthylenglykol, enthält, kann die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens
noch weiter verbessert werden.
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Das gleiche trifft zu, wenn die zu untersuchenden Substanzen in einer
Probenlösung verwendet werden, deren Ionenzusammensetzung und/oder -1<onzentration
von denjenigen/derjenigen wässrigen Lösung des Trägermediums verschieden sind/ist.
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Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Vorrichtung zur Durchführung
des zuvor erläuterten Verfahrens, welche mit das Trägermedium, z.B. ein Gel enthaltenden
Kanälen, deren entgegengesetzte Enden mit Pufferlösung enthaltenden Elektrodengefäßen,
die mit den entgegengesetzten Polen einer Gleichstromquelle verbunden sind, in Verbindung
stehen, und zeichnet sich aus durch eine Trägerplatte, welche für die Aufnahme der
Trägermittelstreifen langgestreckte, im wesentlichen parallele Mulden, Schlitze,
Rillen oder dergl. aufweist, welche durch Anlegen wenigstens eines platten- oder
folienförmigen Elementes auf die jeweilige Flachseite der Trägerplatte an ihren
freiliegenden Längsseiten, gegebenenfalls unter Freihaltung eines oberen und unteren
Endbereiches verschließbar sind. Mit Hilfe einer solchen Vorrichtung läßt sich das
erfindungsgemäße Verfahren bei einfacher Konstruktion wirksam ausführen, wobei insbesondere
nach der Ausführung der Elektrophorese die Zugänglichkeit der Trägermediumstreifen
einfach und schnell gegeben ist.
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lhei einer besonderen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
stehen die Mulden, Schlitzen, Rillen oder dergl., vorzugsweise in Nachbarschaft
des dem Ende der Probenapplikation gegenüberliegenden Ende, über eine quer veilaufende
Mulde, einen solchen Kanal, eine solche Rille oder dergl. miteinander in Verbindung.
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Eine besondere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht
darin, daß die Trägerplatte, die nach einer Flachseite offene Mulden aufweist, mit
welcher Flachseite die Trägerplatte an eine Frontplatte des einen Elektrodengefäßes
derart anlegbar ist, daß die Mulden bis über eine Schwelle einer am oberen Rand
der Frontplatte vorgesehenen Aussparung reichen und daß die Trägerplatte irn Bereich
der die Mulden verbindenden, quer verlaufenden Mulde einen im wesentlichen über
die Länge der quer verlaufenden Mulde reichenden Spalt zur Verbindung mit dem anderen
Elektrodengefäß aufweist, welcher Spalt auf der der Trägerplatte abgewandten Seite
abdeckbar ist.
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Es ist aber auch möglich, daß die Trägerplatte die durch latten abgeteilte
nach beiden Flachseiten der Trägerplatte offene Schlitze aufweist, wobei die Trägerplatte
mit einer <lachseite an eine Frontplatte des einen Elektrodengees derart anlegbar
ist, daß die Schlitze bis über eine Setlwelle einer am oberen Rand der Frontplatte
vorgesehenen Aa:;sparurlg reichen, daß die Schlitze durch einen in die Latten eingeformten,
quer verlaufenden Kanal miteinander in Verbindung stehen, und daß an die äußere
Flachseite der Träerplatte eine Stützplatte mit einem im Bereich cic: Kanals quer
verlaufenden Spalt zur Verbindung mit dem anderen Elektrodengefäß anlegbar ist,
welcher Spalt ggf. im wesentlichen fluchtend zu dem Kanal anordenbar ist.
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Bei der zuvor genannten ersten Ausführungsform kann die äußere Flachseite
der Trägerplatte ebenfalls eine Stützplatte mit einem dem unteren Ende der Mulde
zugeordneten Spalt anlegbar sein, welcher Spalt im wesentlichen fluchtend zu dem
Spalt in der Trägerplatte anordenbar ist.
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Bei einer dritten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist vorgesehen, daß die Trägerplatte als eine Wand eines der Elektrodengefäße ausgebildet
ist, welche an einer Oberfläche die mittels Rippen abgeteilte Rillen aufweist, die
an ihren oberen Enden jeweils bis zu einer Schwelle einer am oberen Rand der Wand
vorgesehenen Aussparung reichen und daß die Rillen durch ein an die die Rillen aufweisende
Fläche anlegbares platten- oder folienförmiges Element, gegebenenfalls bis auf einen
Schlitz im Bereich einer die Rillen verbindenden Querrille der Wand abdeckbar sind.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren kann also eine Vorrichtung verwendet
werden, deren Teile aus lichtdurchlässigem Material, beispielsweise Glas, Polyäthylen,
Polystyrol oder Polymethacrylat besteht. Die Vorrichtung weist im wesentlichen zwei
Elektrodengefäße auf, in denen die Elektroden, z.R. aus Platin, angebracht sind,
sowie aus im wesentlicher flächenförmige wand-, platten- oder folienförmigen Elementen
zur Begrenzung des Trägermediums, in welchem der elektrophoretische Transport der
zu untersuchenden Substanzen stattfindet. Das Trägermedium kann ein Gel aus beispielsweise
Agar, Agarose, Polyacrylamid oder Zelluloseacetat sein und insbesondere in Wasser
aufgelöste Puffersubstanzen, sowie zusätzlich Antikörper und analoge Substanzen
enthalten, die besonders auf die zu bestimmenden Elemente reagieren, so daß Präzipitate
in dem Trägermedium gebildet werden. Das Trägermedium wird also als Schicht zwischen
zwei
voneinander lösbaren flächenförmigen Elementen begrenzt, zwischen welchen Einzelabteile
für die streifenförmige Aufnahme des Trägermediums vorgesehen sein können.
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Diese Abteile können runden, ovalen oder rechteckigen rschnitt haben.
In diesen Abteilen sind langgestreckte, z.i3. gelförmig Trägermittelstreifen parallel
angeordnet, beispielsweise mit den Abmessungen 3 mm Breite, 1, 5 mm Tiefe und 60
mm Länge. Die flächenförmigen Begrenzungen des schichtförmigen Trägermediums brauchen
nicht flach zu sein, sie können beispielsweise auch gekrümmt, insbesondere in Anpassung
an die Krümmung der Wandung eines Elektrodengefäßes selbst, sein. Die zwischen den
Flächenbegrenzungen vorgesehenen langgestreckten Abteilungen für die Aufnahme des
Trägermediums sind beispielsweise vertikal stehend nur bis zur halben Höhe mit dem
Trägermedium gefüllt.
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Über ihnen körnen die einzelnen Probe lösungen leicht von oben her
mit Hilfe von kapillarförmigen Röhrchen eingegeben werden. Dadurch, daß die fl ä,chent'<irmi
gen Begrenzungen des schichtförmigen Trägermediums geeignete Aussparungen am oberen
und unteren Ende aufweisen, läßt sich die unmittelbare Verbindung des Trägermediums
mit den Pufferlösungen auf einfache und wirksame Weise herstellen. Bei Anwendung
von isotachophoretischen Grundsätzen oder zumindest im Flinblick auf Leitfähigkeit
und/oder pH-Wert nicht kontinuierlichen Puffersystemen ist es auch möglich, eine
Konzentration der zu bestimmenden Substanzen während ihres elektrophoretischen Transportes
von oben nach unten zu erreichen.
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Von den wand-, platten- oder folienförmigen Flächenelementen, die
das Trägermedium begrenzen, ist mindestens ei wies aus tansarentern Material wie
(las oder Kunststof1, insbesondere Polystyrol, Polyäthylen, Plolyvinylchlorid, Polycarbonat
oder Polyester und vorzugsweise aus relativ dünnem Material von einer Stärke von
weniger als 1 mm,
um den Kühleffekt zu erhöhen. Die Abdeckung bzw.
Abgrenzung ziels schichtförmigen Trägermediums ist jeweils so getroffen, daß jedes
Probeabteil mit der bei der Elektrophorese verwendeten Pufferlösung an beiden Enden
in Verbindung steht.
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Durch diese unmittelbare Berührung entsteht ein guter Flüssigkeitskontakt
mit den Pufferlösungen in den Elektrodengefäßen, vorzugsweise am oberen und am unteren
Ende des Trägermediums, so daß Verbindungen mittels dochtähnlicher Verbindungsmittel
entbehrlich sind.
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Bei der Elektrophorese werden die zu bestimmenden Substanzen von ihren
entsprechenden Probeabteilen in das Trägermedium transportiert. Hier reagieren sie
mit den vorher in dem Trägermedium verteilten Substanzen mit zu den zu untersuchenden
Probesubstanzen hoher und spezifischer Affinität.
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Ein solches Reaktionspaar kann in einem Antigen und einem Antikörper
bestehen oder Protein-Lektine und rezeptor-spezifische Proteine enthalten, analog
zu der Affino-Elektrophorese. Hierbei werden Präzipitate in Zonen gebildet, die
z.B. durch die Proteinanfärbung sichtbar gemacht werden können (vgl. z.B. Krantz
Th. et al, Z. Klien. Chem. Klin.
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Biochem. 12 (1974) 124) oder einfach durch Denaturierung.
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Die Präzipitate werden über eine desto längere Strecke in dem Trägermedium
gebildet, desto mehr Probensubstanz vorhanden ist, die zu bestimmen ist. Es besteht
annähernd direkte Proportionalität zwischen dieser Weglänge und der Probenlänge.
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Aufgrund der geringen Wandstärke wenigstens einer der begrenzenden
Wände und dem guten Flüssigkeitskontakt zwischen dieser Wand und der Pufferlösung
sind gute Bedingungen für die Ableitung der Joule'schen Wärme vorhanden, die bei
der Elektrophorese in dem Trägermedium entsteht. Die Wärme, die in die Pufferlösung
übergeht, kann auf einfache Weise mittels eines Wärmetauschers abtransportiert werden.
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Aufgrund dieses verbesserten Kühlsystems und der Ausschaltung dochtähnlicher
Verbindungmittel können wesentlich liübere elektrische Feldstärken in dem Trägermedium
erzielt werden als bisher, wodurch der benötigte Zeitaufwand für die Ausführung
der Elektrophorese erheblich gesenkt werden kann.
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Aufgrund des Umstandes, daß bei der Erfindung das schichtförmige Trägermedium
zwischen zwei voneinander lösbaren Wänden eingeschlossen ist, können relativ große
Mengen an Probelösungen eingesetzt werden, bei guter Zugänglichkalt des Trägermediums
nach der Elektrophorese.
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Weitere Merkmale, Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden
Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden feschreibung von Ausführungsbeispielen
anhand der beiliegenden Zeichnung. Dabei bilden alle beschriebenen und/oder bildlich
dargestellten Merkmale für sich oder in beliebiger sinnvoller Kombination den Gegenstand
der vorliegenden Erfindung auch unabhängig von ihrer Zusammenfassung in deri Ansprüchen
oder deren Rückbeziehung.
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Es zeigt: Flg. I schematisch die auseinandergezogene, teilweise weggebrochene
Ansicht der Stützplatte, der mit Mulden versehenen Trägerpiatte für die Aufnahme
des Trägermediums und der Frontplatte eines Elektrodenbehälters einer die Erfindung
aufweisenden Vorrichtung, Fix'. 2 schematisch in perspektivischer Ansicht eine andere
Ausgestaltung einer Trägerplatte zur streifenförmigen Aufnahme des Trägermediums,
Fig.
3 schematisch in perspektivischer Ansicht eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung für die Ausführung des erfindungsgemäßen Elektrophoreseverfahrens, und
Fig. 4 schematisch in perspektivischer Ansicht eine weitere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung, bei welcher die das Trägermedium in Rillen aufnehmenden Trägerplatte
als Wandung des inneren Pufferelektrodengefäßes ausgebildet ist.
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Fig. 1 zeigt die Frontplatte 1 eines (inneren) Elektrodengefäßes 13
(vgl. auch Fig. 3). Die Frontplatte 1 besteht beispielsweise aus Glas. Eine Trägerplatte
2 aus relativ dünnem Kunststoffmaterial, beispielsweise Polystyrol oder Polyvinylchlorid,
hat Rippen 3, die aus einer Fläche der Trägerplatte 2 herausragen und auf der Rückseite
langgestreckte, kanalförmige vertikale Mulden 3' bilden. Die Mulden 3' sind nach
vorne von dem die Rippen 3 bildenden Material der Trägerplatte abgeschlossen und
können durch Anlegen der Trägerplatte 2 an die Außenfläche der Frontplatte 1 auch
zur Rückseite hin zur Bildung geschlossener, röhrenförmiger Kanäle abgedeckt werden.
Der Abschluß der Mulden 3' zur Rückseite hin kann während des Finfüllens Trugermediums
in die Mulden 3' und der aufbewahrun trcti durch Anlegen einer dünnen Folie erfolgen.
Die Träg<'rplatte 2 mit den Rippen 3 und Mulden 3' kann einfach durch Vakuumverformen
einer dünnen Materialplatte hergestellt werden. Im unteren Bereich sind die Mulden
3' über eine horizontale Mulde 4 miteinander verbunden, die, wenn die Trägerplatte
2 an die Frontplatte 1 angepreßt ist, eine horizontale geschlossene Röhre bildet,
die sich an die Mulden 3' gebildeten vertikalen Röhren anschließt. Eine Stützplatte
7 ist von außen an die Trägerplatte 2 anlegbar und anpreßbar. Die Trägerplatte 2
und die Stützplatte 7 sind beispielsweise mittels Klammern der Frontplatte 1 bereit
Die
(nicht dargestellten) Klammern können beispielsweise an den Seiten und an der Unterkante
der Frontplatte 1 ansetzen. Um die Berührungsflächen zwischen Trägerplatte 2 und
Frontplatte 1 einerseits und Stützplatte 7 andererseits abzudichten, kann es von
Vorteil sein, die Platten in ihren Randbereichen vor dem Aneinanderlegen einzufetten
oder miteinander lösbar zu verleimen. Beim Einfüllen der lösung eines Trägermediums,
beispielsweise Gels, in die von den Mulden 3' gebildeten vertikalen Röhren dient
die horizontale Mulde 4 als Verbindungsleitung, so daß alle die von den vertikalen
Mulden 3' beispielsweise durch Anlegen einer Folie gebildeten Röhren leicht bis
zu einer srfwiinsichten Höhe in einem Arbeitsgang gefüllt werden können.
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Auf diese Weise entstehen in den Mulden 3' der Trägerplatte 2 mehrere
parallele, vertikale Streifen des Trägern,+(iiums. Über jedem der Trägermediumstreifen
ist in der jeweiligen Mulde 3' eine obere Abteilung für das Einfüllen einer Probenlösung
mittels einer Kapillare freigehalten.
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üle Mulden 3' haben eine solche Länge, daß beim bündigen Anlegen der
Trägerplatte 2 die Mulden 3' zu dem Elektrodengefäß 13 hin im Bereich einer oberen
Aussparung 34 der Frontplatte 1, die nach unten durch eine Schwelle 5 begrenzt wird,
offen liegen. In diesem Bereich kann das streifenförmige Trågermedium in unmittelbare
Berührung illit der in dem inneren Elektrodengefäß 13 vorhandenen Itufferlosung
treten, die in dem Elektrodengefäß 13 höher Zeit als die Schwelle 5 liegt. Die übrigen
Wandungen dei Ftektfl)dengefäßes 13 sind also, wie aus Fig. 1 und ersichtlich, höher
als die Frontplatte 1 im Bereich der oberen Randaussparung 34. Am unteren Ende des
in den Mulden 3' und 4 enthaltenen gelförmigen Trägermediums wird die unmittelbare
Berührung mit einer in dem äußeren Elektrodengefäß 14 (Fig. 3) enthaltenen Pufferlösung
dadurch
hergestellt, daß im Bereich der horizontalen Mulde 4 die
Trägerplatte 2 einen quer verlaufenden Spalt 6 aufweist.
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Beim Einfüllen der Trägermediumlösung in die Mulden 3', 4 wird der
Spalt 6 von der Stützplatte 7 abgedeckt, die auf den Rippen 3 und der der Mulde
4 entsprechenden Rippe anliegt. Die Stützplatte 7 hat einen dem Spalt 6 entsprechenden
Spalt 8, der beim vertikalen Verschieben der Stützp i t.e 7 in eine solche l.lyTe
gebracht werden kann, daß er mit dem Spalt 6 fluchtet, was während der Ausführung
der Elektrophorese der Fall ist. Vor dem Beginn der Elektrophorese wird die Einheit
aus innerem Elektrodengefäß 13, Trägerplatte 2 und Stützplatte 7 gemäß Fig. 3 in
das mit Pufferlösung gefüllte äußere Elektrodengefäß 14 eingestellt.
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Der elektrophoretische Transport der in den oberen Abteilungen der
Mulden 3' befindlichen, zu bestimmenden Substanzen führt nach unten, so daß die
zu bestimmenden Substanzen mit Reagenzien, die zuvor in wässriger Lösung in das
Trägermedium eingebracht wurden, in Berührung kommen, mit welchen sie dann Niederschläge
bilden. Nach der Ausführung der b:ektrophorese kann man einfach Zugang zu den Trägermedlumstreifen
dadurch bekommen, daß man die Trägerplatte 2 mit der Stützplatte 7 von der Frontplatte
1 abnimmt. Durch Ausstülpen der Trägermediumstreifen auf eine Glasplatte können
diese getrocknet und/oder die darin enthaltenen Präzipitate angefärbt werden.
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Fig. 2 veranschaulicht eine Trägerplatte 9, die ebenfalls aus Kunststoff,
beispielsweise Polymethacrylat, Polystyrol oder Polyvinylchlorid besteht. Mittels
mehrerer vertikaler Latten 10 sind in der Trägerplatte 9 vertikale Schlitze 11 gebildet.
Die Breite der Latten 10 beträgt zwischen 1 und 5 mm. Im unteren Bereich der Latten
10 ist durch Einbuchten der Latten 10 ein horizontal verlaufender Kanal 12 gebildet.
Worin die Trägerplatte 9 mit ihrer hinteren
Flachseite gegen die
Frontplatte 1 gelegt wird und die vordere Flachseite der Trägerplatte 9 von der
Stützplatte 7 bgedeckt ist, bilden die beidseitig abgedeckten Schlitze 11 ebenfalls
vertikale Kanäle für die streifenförmige Atiünahme des Trägermediums, wobei die
vertikalen Streifen untereinander über den horizontalen Kanal 12 miteinander in
Verbindung stehen. I)as Einfüllen des Trägermediums orüolgt wie in Zusammenhang
mit Fig. 1 beschrieben, d.h.
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der horizontale Spalt 8 liegt in diesem Fall versetzt zu dem horizontalen
Kanal 12. Bei der Ausführung der Elektroaborese kann die Stützplatte so vertikal
verschoben werden, daß der Spalt 8 den Kanal 12 überdeckt und somit die Verbindung
mit der Pufferlösung in dem äußeren Elektroden-14 14 hergestellt ist.
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Fit'. 3 zeigt dn inneren Elektrodenbehälter 13 mit der Frontplatte
1 in dem äußeren Elektrodenbehälter 14 stehend.
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Uie behälter 13 und 14 kannen aus Glas oder Kunststoff hergesiellt
sein. Sie haben jeweils eine Elektroden 15 and 10, beispielsweise aus Platindraht,
die mit Hananensteckern 17 und 18 an den Wänden der Elektrodengefäße 13 ond 14 verrunden
sind. Am Deckel 19 befinden sich entsprechende Buchsen 20 und 21, von welchen aus
elektrische leitungen 22 und 23 zu den beiden Polen einer Gleichstromquelle führen.
Beim Aufsetzen des Deckels 19 auf das äußere Klektrodengefäß 14 entsteht ein elektrischer
Kontakt zwi-@hen den Bananensteckern 17 bzw. 18 und den Buchsen 20 bzw. 21. Die
Joule'sche Wärme, die bei der Elektrophorese von den Pufferlösungen in den Gefäßen
13 und 14 aufgenommen wird, wird mittels einer Kühlröhre 24, welche in der darestellten
Pfeilrichtung von einer Kühlflüssigkeit durch-@romt wird, abtransportiert,
Fig.
4 veranschaulicht eine Ausführungsform eines inneren Elektrodengefäßes 25 mit rundem
Querschnitt und mit einer wasserdicht angebrachtem Boden 26. Uber einen gewissen
wandungsbereich des Elektrodengefäßes 25 ist am oberen Rand eine Aussparung 35 vorgesehen,
die von einer unteren Schwelle 31, die in ihrer Funktion der Schwelle 5 gleictlkommt,
begrenzt ist. über 'ie Breite der Austip.aruny 35 sind in der Außenfläche der Gefäßwandung
zur Bildung einer erfindungsgemäßen Trägerplatte durch parallele vertikale Rippen
28 abgeteilte Rillen 27 zur streifenförmigen Aufnahme eines Trägermediums vorgesehen.
Die Rillen 27 stehen über eine horizontale Querrille 29 untereinander in Verbinden.
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I)ie Rillen 27 reichen mit ihrem oberen Ende jeweils bis zu der Schwelle
31. Die Querrille 29 und die vertikalen Rillen 27 können gemeinsam von einer beispielsweise
durchsichtigen Kunststoffolie 3() nach außen abgedeckt werden, die bis über die
Schwelle 31 hinaus nach oben übersteht.
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Dadurch wird durch die außen abgedeckten Rillen 27 ein System vertikaler
Kanäle gebildet, die über die horizontale Querrille 29 miteinander in Verbindung
stehen und an ihrem oberen Ende in das innere Elektrodengefäß 25 münden. Die Kanäle
können mit der gelförmigen Trägermediumlösung, z.B. aus Agarose, bis zur gewünschten
Höhe gefüllt werden.
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Wenn sich die Lösung beispielsweise zu einem Gel verfestigt hat, kann
leicht aus der Folie 30 im Bereich der Querrille 29 mit dem Messer ein schmaler
Streifen abgeschnitten werden, so daß nach dem Einsetzen des inneren Elektrodengesäßes
25 mit der Folie 30 in ein den Elektrodengefäf' 14 entsprechendes äußeres Elektrodengefäß
das streifenförmige Trägermedium am unteren Ende unmittelbar mit der Pufferlösung
in dem äußeren Elektrodengefäß in Verbindung steht. Die Pufferlösung im inneren
des Elektrodengefäßes 25 wird bis zu einem Niveau, das oberhalb der Schwelle 31
liegt, eingefüllt, so daß das streifenförmige Trägermedium
am
oberen Ende mit dieser Pufferlösung, unmittelbar in Verbindung steht. Das Einfilien
der Proben in die von den Rillen 27 oberhalb des Trägermediums gebildeten Abteilungen
kann. wie in Verbindung mit Fig. 1 beschrieben, erfolgen.
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Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel für das erfindungsgemäße
Verfahren naher erläutert: X,u 10 ml einer 1%-igen wässrigen Lösung aus Agarose
in (),04 M wässriger Lösung mit einem pH-Wert von 8,6, welche Nalriumsatz der Barbitursäure
und 4 % Polyäthylenglykol enthielt, und mit einer Temperatur von 550 C wurden 10
@ines Serums aus Kaninchon-Antihuman-Transferrin (DAKO @@mpglobuline, Kopenhagen)
gegeben. Nach Einfüllen dieser L@sung in die Röhrchen einer Vorrichtung gemäß Fig.
1 erreichte die Gellösung eine Ilöhe von etwa 3 cm unterhalb der Schwelle 5 der
Aussparung 34 in der Frontplatte 1 de Kicktrodengefäßes 13. Nach 20 Minuten wurde
Pufferlösung In die Eicktrodengefäße 13 und 14 eingefullt. Zu jeder @@benabteilung
oberhalb des Gels wurden 20 µl von normalem menschlichen Serum in Verdünnungen zwischen
1:500 und @@@on mit gleichmäßigen Schritten von 100, in der erwah@ten Pufferlösung,
jedoch mit einem Cehalt von 8 % Surrese, eingefül i t. Danach wurde ein Potential
von 110 t t, einer Gleichstromquelle an die Elektroden 15 und 16 gelegt. Nach 2
Stunden wurde der Strom abgeschaltet @@@ me Vorrichlung anseinandergenommen. Die
Gelstreifon wbrden auf eine Glasplatte gelegt und luftgetrocknet.
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@@ wurden dann 60 Minuton lang in eine Proteinfarbelösung unthaltend
0,5 % Coomassie Brilliant Blau $ 250 (einem Natriummnoxinaphthonal-Färbstoff der
ICI, Manchester, @@gland), 45 % Äthanol, 45 % Wasser und 10 % Essigsäure ungetaucht.
Danach wurde der überschuß an Anfärbemittel
mit derselben Losung,
jedech ohne den Farbstoff, wegge löst. In jedem Gelstreifen wurde die Wanderstrecke
vom oberen Gelrand der Probenapplikation zu der Stelle, bis zu der das Präzipitat
am weitesten gewandert war, gemessen.
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Diese Strecke war proportional zur Menge des Transferrin.
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In typischen Fällen wurde ein Regressionskoeffizient von 0,97 festgestellt.
Dieses Experiment zeigte, daß das erfindungsgemäße Verfahren für die quantitative
Bestimmung von Substanzen gut geeignet ist.
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Änderungen des dargestellten Ausführungsbeispieles sind ohne weiteres
möglich. Dabei ist es insbesondere auch möglich, die bereits mit Gel gefüllte Trägerplatte
durch allseitige Abdeckung für mehrere Tage aufzubewahren. Es kann auch vorteilhaft
sein, daß die Probe vor der Einführung in die erfindungsgemäße Vorrichtung in einer
Agnroselösung mit einer Konzentration von etwa 0,05 bis 0,2 Y, gehalten wird, wodurch
konvektiven Störungen entgegengewirkt wird und was Sucrose und entsprechende Agenzien,
wie sie in dem Ausführungsbeispiel genannt wurden, ersetzen kann.