DE2920411A1 - Herzglykosid-antikoerperpraeparat - Google Patents

Herzglykosid-antikoerperpraeparat

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DE2920411A1
DE2920411A1 DE19792920411 DE2920411A DE2920411A1 DE 2920411 A1 DE2920411 A1 DE 2920411A1 DE 19792920411 DE19792920411 DE 19792920411 DE 2920411 A DE2920411 A DE 2920411A DE 2920411 A1 DE2920411 A1 DE 2920411A1
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acetylgitoxin
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Description

29 073-22
u-iKG. H. HAUCK · Dipl. >iiVs. W. SCHMITZ ■ dipl.-ing. S. GRAALFS DIPL.-1NG. W. WEHNERT · dipl.-phys. W. CARSTENS · dr.-ing. W. DÖRING
HAMBURG-MÜNCHEN -DÜSSELDORF
•PATENTANWÄLTE · NEUER VAU 41 · SOOO HAMBURG 3O-
TAD Pharmazeutisches Werk GmbH Postfach 720
2190 Cuxhaven
ZUSTELLUNGSANSCHRIFT/PLEASE HEPLY TO: SCHMITZ - GKAALFS NKUHIt WALL 41 · 2O00 HAMBURG 3» TELEFON + TELECOPIER (OiO) 86 67 85 TELEX 02 H 709 INPAT D CABLE NEGEDAPATENT HAMBURG HAUCK- CARSTENS
MOZARTSTRASSE 23 · SOOO MÜNCHEN TELEFON + TELECOPIER(OSO) 53 03 36 CABLE NEGEDAPATENT MÜNCHEN
WEHNERT-DÖRING K.-WILH.-RING 11· 4000 DÜSSELDORF
TELEFON (0211) 57 SO 27'28
TELEX OS SSl 3S9 DYNA D CABLE NEGEDAPATENT DÜSSELDORF
Hamburg, 18. Mai 1979
Herzglykosid-Antikörperpräparat
Die Erfindung betrifft ein Herzglykosid-Antikörperpräparat für die Radioimmunbestimmung der Konzentration eines Herzglykoside im menschlichen Serum odor Plasma·
Bekannte Herzglykoside sind Digoxin, Gitoxin und Digitoxint
R1 R2 R3 Difiitoxin
H H H Gitoxin
H OH H Di^oxin
OH H H
030048/031 1
Bei den Herzglykosiden liegt der Bereich therapeutisch wirksamer Dosen nahe an dem Bereich toxisch wirkender Dosen; anders gesagt, die therapeutische Breite ist verhältnismäßig klein. Es ist deshalb besonders wichtig, daß bei der Behandlung der sich tatsächlich einstellende Serumspiegel genau und in einfacher Veise bestimmt und laufend überwacht werden kann* Zu diesem Zweck ist die bekannte Radioimmunobestimmung besonders geeignet· Dabei wird eine der Wirksubstanz möglichst ähnliche, vorzugsweise gleiche, radioaktivmarkierte Testsubstanz in bekannter Konzentration mit einer bestimmten Menge Serum vermischt; das Gemisch wird auf einen selektiv mit der Wirksubstanz in Wechselwirkung tretenden Antikörper zur Einwirkung gebracht· Wegen der chemischen Ähnlichkeit oder Gleichheit von Wirksubstanz und Testsubstanz werden diese Substanzen in konkurrierender Reaktion an den Antikörper gebunden· Man trennt dann den Antikörper mit den daran gebundenen Substanzen ab und bestimmt in dem Rest radiologisch die Konzentration dor Testsubstanz· Daraus kann man dann die unbekannte Konzentration der Wirksubstanz in dem Ausgangs-Serum errechnen; meist verwendet man dafür empirisch bestimmte Eichkurven·
Das Antikörperpräparat wird in bekannter Weise aus einem Lieferantentier, z.B. einem KaninOier.., gewonnen, nachdem man dem Tier die Wirksubstanz in Form eines Konjugats mit einem Protein (zwecks Vergrößerung des Molekulargewichts) verabreicht hat·
Das beschriebene Verfahren ist zur Radioimmunobestimmung von Digoxin und Digitoxin bekannt (z.B. DE-OS 25 2.6
030048/0311
Es lag daher nahe, diese Bestimmungstnethode auch beim Gitoxin und dessen therapeutisch wirksamen Abkömmlingen anzuwenden. Die acetylierten Derivate des Gitoxins haben aus pharmakodynamischen Gründen den Vorzug geringer gastrointestinaler Nebenwirkungen, Insbesondere ist der Abkömmling Pentaacetylgitoxin (Pengitoxin) bekanntgeworden, der in seiner Yirkung Digoxin bzw. Digitoxin vergleichbar ist, jedoch eine größere therapeutische Breite besitzt. Der physiologische Metabolit von Pengitoxin ist 16-Acetylgitoxinj dieses stellt somit die eigentliche Wirksubstanz im menschlichen Organismus dar.
¥enn man üblichen Lieferantentieren das eben erwähnte 16-Acetyl- gitoxin verabreicht, zeigt sich, daß diese Wirksubstanz im Organismus des Lieferantentieres zn Gitoxin abgebaut wird. Es schien deshalb nicht möglich zu sein, die bekannte Methode der Radioimmuribestimmung auch bei dem Pengitoxin, genauer seinem Metaboliten 16-Acetylgitoxin, anzuwenden. Ein. dafür geeigneter Antikörper war nicht bekannt.
Die Erfindung geht von,der Aufgabe aus, die beschriebenen Schwie rigkeiten zu überwinden und demgemäß doch die Radioimmun-Be- stimmung des im menschlichen Organismus wirksamen Metaboliten des Pentaacetylgitoxins (Pengitoxins) zu ermöglichen.
Nach der Erfindung wird diese Aufgabe gelöst durch die Schaffung
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j?
eines Antikörperpräparats der eingangs angegebenen Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zum Bestimmen des im menschlichen Organismus wirksamen Metaboliten des Pentaacetylgitoxins einen Antikörper gegen 16-Acetylgitoxin enthält.
In dem erfindungsgemäßen neuen Antikörperpräparat sind neue, spezifisch mit 16-Acetylgitoxin reagierende Antikörper enthalten, so daß damit die Radioimmunbestimmung des 16-Acetylgitoxins im menschlichen Serum oder Plasma in der üblichen Weise durchgeführt werden kann, wenn man als Testsubstanz ein radioaktiv markiertes 16-Acetylgitoxin oder eine damit nahe verwandte Substanz verwendet·
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörper-Präparats eignet sich in weiterer Ausgestaltung der Erfindung ein Konjugat-Präparat zur Verabreichung an Antikörperseren liefernde Lieferantentiere; dieses Konjugat-Präparat ist dadurch gekennzeichnet, daß es ein Konjugat aus 16-Acetylgitoxin und einem die 16-Acetylgruppe vor Abbau durch den Organismus des Lieferant ent leres schützenden Protein enthält.
Es hat sich gezeigt, daß die neuen Konjugat-Präparate mit geringe?«» Aufwand hergestellt werden können, bequem verarbeitbar sind und zur Bildung der gewünschten Antikörper gut geeignet sind, und daß die Auswahl eines die Schut55wirkung entfaltenden Procelns aufgrund weniger gezielter Versuche leicht möglich ist. Besonders gut geeignet sind !Conjugate mit einer Koppelungsrate
0300A8/0311 ,-
• · */5
γ.
Herzglylcosid: Protein von etwa lsi bis 311» vorzugsweise lsi bis 2:1,
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung dient zur Ausführung der im übrigen in bekannter Weise durchzuführenden radioimmunologischen Bestimmung eine Testsubstanz zur konkurrierenden Anlagerung an einen Antikörper, der gegen den im menschlichen Organismus entstehenden Metaboliten eines Herzglykosid-Arzneimittels spezifisch ist; diese Testsubstanz ist dadurch gekennzeichnet, daß sie dem Herzglykosid-Arzneimittel Pentaacetylgitoxin (Pengitoxin) zugeordnet ist und als wirksamen Bestandteil eine dem 16-Acetylgitoxin weitgehend ähnliche, vorzugsweise gleiche, radioaktiv markierte Verbindung enthält.
Die erfindungsgemäße neue Testsubstanz ist zur radioimmunologischen Bestimmung gut geeignet und kann leicht mit hoher spezifischer Aktivität ausgestattet werden. Mit besonders geringem Aufwand herstellbar ist eine Testsubstanz der beschriebenen Art, die ein 16-Acetylgitoxin darstellt, bei dem die endständige Digitoxose zwischen den beiden OH-Gruppen aufgetrennt und mit Tritium und ggf. Wasserstoff reduziert ist. Auf diese Weise können leicht zwei Tritium-Atome pro Molekül der Testsubstanz eingeführt' werden. Es hat sich gezeigt, daß die chemische Veränderung, die durch das Auftrennen und Hydrieren der endständigen Bigitoxöse erfolgt, für die Affinität zu dem 16-Acetylgitoxin-Antikörper praktisch bedeutungslos ist, so daß die neue Testsubstanz für die mit 16-Acetylgitoxin konkurrierende Anlagerung an den 16-Acetylgitoxin-Antikörper gut geeignet ist«
030048/031 1
Die Testsubstanz ist vorzugsweise bis zum Dialkoliol hydriert und enthält in jeder Alkoholgruppe ein Tritium-Atom. Das genügt normalen/eise, um eine für die üblichen Empfindlichkeits- und Genauigkeits-Anforderungen ausreichende Aktivität zu erzielen. Es kann damit beispielsweise ein Meßbereich von 5 bis 1000 ng 16-Acetylgitoxin pro ml Serum erzielt werden} das bedeutet, daß bei einem Serumvolumen von 0,1 ml der gesamte therapeutische und toxische Bereich erfaßt wird. Durch Erhöhung der spezifischen Radioaktivität der Testsubstanz kann der Meßbereich noch etwa um eine Größenordnung zu kleineren ¥erten verschoben werden. Dann würden 10/ul Serum für eine Bestimmung ausreichen.
Im Gegensatz zu Testsubstanzen, die mit radioaktivem Jod markiert sind, erfordert die Aktivitätsbestimmung bei der erfindungsgemäßen Testsubstanz, die mit Tritium markiert ist, einen etwas höheren Aufwand, weil üblicherweise die Beta-Strahlung des Tritiums indirekt über die Pluoreszenzstrahlung einer der Testsubstanz zugemischten fluoreszierenden Hilfssubstanz szinti« graphisch erfaßt wird. Für die routinemäßige praktische Anwendung mit standardisierten Test-Kits stellt das keine ins Gewicht fallende KfWplikation dar. Von wesentlich größerer Bedeutung sind die Vorteile, die mit der erfindungsgemäßen Testsubstanz erhielt werden. Zunächst hat die Testsubstanz eine erheblich
125 größere .Haltbarkeit als Testsubstanzen, die mit J markiert
sind, weil Tritium eine erheblich größere Halbwertszeit (12,3 Jahre) hat als 12^J (60 Tage), Beim Zerfall werden
030048/03 1 1
keine noch Restaktivität enthaltende Zerfallprodukte mit so veränderter Molekülstruktur gebildet, daß sie einen Meßfehler hervorrufen können« Zum Einbau des Tritiums ist keine stark© Veränderung des Molekülaufbaus erforderlich. Im Gegensatz dazu kann das erheblich größere Jodatom meist nur in zusätzlich angebauten Gruppen oder über zusätzlich angebaute Liganden eingeführt werden} dadurch ergeben sich auch im chemischen Verhalten und in der Affinität zu dem Antikörper größere Unterschiede zu der zu bestimmenden Wirksubstanz, so daß keine idealen Bedingungen für eine konkurrierende Anlagerung am Antikörper mehr vorliegen und die radioimmunologische Bestimmung demgemäß veniger spezifisch wird. Dagegen hat die erfindungsgemäße Testsubstanz, die vorzugsweise mit 2 Atomen Tritium pro Molekül radioaktiv markiert ist, nicht nur im Molekülaufbau, sondern auch im chemischen Verhalten und in der Affinität zu dem i6~Acetylgitoxin-Antikörper weitgehend gleiche Eigenschaften wie das 16-Acetylgitoxin selbst. Die Synthese ist einfach und kann mit hohen Ausbeuten geführt werden? es treten keine schwer abtrennbaren Nebenprodukte auf, und die Reinigung des Endprodukts ist einfach und reproduzierbar durchführbar. Es können spezifische Radioaktivitäten zwischen 8 und etwa 120 Ci/mMol erzielt werden. Dieser obere Wert ist für tritium-markierte Herzglykoside oder deren Derivate bisher nicht erreicht worden«
Zum Herstellen der beschriebenen erfindungsgemäßen Testsubstanz dient in weiterer Ausgestaltung der Erfindung ein Verfahren, bei dsm man 16-Acetylgitoxin mit Perjodat behandelt und das
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Reaktionsprodukt mit Tritium und ggf. Wasserstoff reduziert. Diese Verfahrensschritte sind von anderen Reaktionen her bekannt und bequem ausführbar®
Vorzugsweise wird die Testsubstanz bis zum Dialkohol hydriert ) sie enthält dann in jeder Alkoholgruppe wenigstens ein Tritium-Atom.
.../9 030048/031 1
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung kann die Herstellung des beschriebenen Konjugat-Präparats in sehr einfacher ¥eise erfolgen mit einem "Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 16-Acetylgitoxin mit einem den Schutz der 16-Acetylgruppe bewirkenden Protein, vorzugsweise Rinderalbumin, unter schwach alkalischen Bedingungen, etwa zwischen pH 8 und pH 9, vorzugsweise bei etwa pH 8,5» während einer zur merklichen Hydrolisierung der 16-Acetylgruppe unzureichenden Reaktionszeit, insbesondere etwa kO Minuten, umsetzt. Durch den ungewöhnlich niedrigen pH-Wert und die verhältnismäßig kurze Reaktionszeit wird zwar die gewünschte schützende Bindung des Proteins an das 16-Acetylgitoxin erreicht, ein die Genauigkeit der radioimmunologischen Bestimmungsmethode verschlechternder Abbau des 16-Acetylgitoxins jedoch vermieden.
.../1O
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Die Herstellung dea erfindungsgemäßen Antikörpers kann ähnlich wie bei den bekannten radioimmunologischen Verfahren in einfädler Weise dadurch erfolgen, daß man einem Lieferantentier, z.B. einem Kaninchen, ein Konjugat aus 16-Acetylgitoxin ;ind einem die 16-Acetylgruppe vor Abbau durch den Tierorganismus schützenden Protein mit einer Koppilungsrate von etwa 1:1 bis 3t1, vorzugsweise 1:1 bis 2:1, verabreicht, und nach ausreichender Inkubationszeit den Antikörper aus dem Serum des Tieres gewinnt. Dieses Verfahren kann mit den allgemein üblichen Techniken bequem durchgeführt werden.
Nach der vorliegenden Erfindung erbringt die Verwendung der beschriebenen neuen Stoffe, nämlich des Antikörper-Präparats, des Konjugat-Präparats und der Testsubstanz, neue und vorteilhafte Möglichkeiten für die Hadioimmunbestimmung von Herzglykosiden, insbesondere den Vorteil, daß auch das einer radioimmunologischen Bestimmung bisher nicht zugängliche Gitoxin und seine Derivate ebenso bequem bestimmt werden können wie es bereits für die Herzglykoside Digoxin und Digitoxin bekannt ist. Ein weiterer wichtiger Vorteil besteht in diesem Zusammenhang darin, daß die Spezifizität der Bestimmung sehr hoch, also die sogenannte Kreuzreaktivität (Ansprechen auf andere chemisch oder immunologisch ähnliche Substanzen) sehr gering ist.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben.
030048/0311 #../n
292OA11
.1« Herstellung des Kon.jugat-Präparats
Die endständige Digitoxose des 16-Acetylgitoxins wird mit Perjodat zum Dialdehyd oxidiert. Dieser Aldehyd wird mit dem Protein in gepufferter Lösung umgesetzt, wobei sich das Herzglykosid über Schiffsche Basen an das Protein koppelt; diese instabilen Bindungen werden durch Reduktion mit Batriumborhydrid stabilisiert. Die Grundzüge dieses Prinzips sind bereits von der Anwendung bei anderen Substanzen her bekannt; demgegenüber werden erfindungsgemäß aber einige wichtige Abwandlungen vorgenommen: Um die 16-Acetylgruppe intakt zu lassen, wird die Reaktion bei einem pH-Wert geführt, der kleiner ist als 9· Die Reaktionszeit ist herabgesetzt·
Beispiel 1
a) Umsetzung von 16-Acetylgitoxin zum Dialdehyd
4i 1 mg 16-Acetylgitoxin (5OO jiMol)werden in 20 ml Methanol gelöst, und innerhalb von 30 min werden 20 ml 0.1 M NaJO^-Lösung (enthaltend 2 mMol Perjodat) zugetropft. Anschließend wird nochmals I5 Minuten gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1,2 ml 1 M Xthylenglykol gestoppt; dabei wird überschüssiges Perjodat zerstört. Wie sich durch dünnschichtchromatographische Analyse zeigen läßt, ist zu diesem Zeitpunkt das i6-Acetylgitoxin vollständig zu dem entsprechenden Dialdehyd umgesetzte
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.../12
Den Ansatz gibt man dann zu einer auf O°C gekühlten Lösung von 56O mg BSA (RiWer^Seruinalbumin) in 20 ml Wasser, die mit 5$ K 2 C°3 auf PH 8·-5 eingestellt ist. Im Verlauf der Zugabe wird der pH-¥ert durch Zugabe weiterer Base auf 8.5 gehalten. Die Zugabe erfolgt im typischen Pail innerhalb von 3° min. Dann wird noch 10 min gerührt, und 14O mg festes NaBH. werden zugesetzt. Dabei wird der pH-¥ert mit 1 N Essigsäure bei 8.5 gehalten. Nach 30 min wird auf pH 6.5 eingestellt, und danach wird noch 60 min lang gerührt. Das Konjugat wird dann durch Dialyse gereinigt und lyophilisiert.
.../13 030048/031 1
2. Herstellen der Testsubstanz
Die endständige Digitoxose des Kj-Acetylgitoxins wird mit Perjodat oxidiert, wobei der entsprechende Dialdehyd entsteht« Die Aldehydgruppen des gereinigten Dialdehyds werden mit tritium-markiertem NaBHjL zu alkoholischen Gruppen reduziert, wobei 2 Tritiumatome in das Molekül eingeführt werden» Die Reinigung erfolgt dünnschichtchromatographisch.
R'-16-Acetylgitoxig.enin (-Digitoxose^p-Beispiel 2
41 mg 16-Acetylgitoxin werden in 2 ml Methanol gelöst. Dazu gibt man 2 ml einer 0.1 N NaJO^-Lösung. Die Zu^ab·? erfolgt über einen Zeitraum von 10 min. Anschließend rührt man noch 5 min, versetzt den Ansatz mit « ml Wasser und extrahiert den gebildeten Dialdehyd mit 4 5 ml Chloroform. Der Extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet, und dann wird im Vakuum das Chloroform
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abgezogen« Wie sich dünnschichtchroHiatographisch zeigen läßt, ist das erhaltene Produkt einheitlich, tuid die Umsetzung ist quantitativ. Man löst de-, gebildeten Dialdehyd in 1 ml Methanol und gibt die Lösung zu Λ,h mg tritium-markiertem NaBH2, (spezifische Aktivität 5.h Ci/mMol, /2ΟΌ mCi Ge samt aktivität). Man läßt 10 min bei Raumtemperatur reagieren.
Die Reinigung der gebildeten Testsubstanz erfolgt dünnschichtchromatographisch. Als Fließmittelgemisch wird ChloroformiMethanol =9:1 (Vol:Vol) verwendet. Als Trägermaterial findet Kieselgel Verwendung. In dem beschriebenen System ist eine vollständige Trennung des Reaktionsprodukte (16-Acetylgitoxin-Dialkohol) vom Ausgangsprodukt (16-Acetylgitoxin-Dialdehyd) möglich. Die Reaktionsmischung zeigt ein radioaktives Produkt mit dem R^-Wert von 16-Acetylgitoxin-Dialkohol. Die Substanz -wird in Methanol eluiert und als Lösung bei -18°C aufbewahrt. Sie ist stabil und kann mit überschüssigem NaBHj, nicht weiter umgesetzt werden. Daraus ergibt sich, daß quantitative Umsetzung zum Dialkohol stattgefunden hat. Die theoretisch ebenfalls zu erwartende monoreduaierte Verbindung tritt unter den beschriebenen Realctionsbedingungen nicht auf. In analoger Weise lassen sich unter jeweiliger Umrechnung der eingesetzten Substanzmengen höher spezifisch markierte Derivate herstellen, wenn NaBH^ höherer spezifischer Aktivität verwendet
030048/031 1 .../15
η.
wird. Die mögliche obere Grenze liegt derzeit bei etwa 120 Ci/inMol.
.../16
030048/0311
ORIGINAL
3. Durchführung des Radiolmmuntcsts
Pipettierschema: (Angaben in ml)
UB
Standardwerte Seren
Puffer 0. 6 min 0 0.6 0* 0.6
-3H-16-AG 0. 1 min 0.1 0.1 0.1
Standard - min - 0.1 -
Normalserum O. 1 0.1 - -
Probe - - - 0.1
Antikörper - 0.1 O.T O. 1
Mischen, 60 bei Raumtemperatur inkubieren
(NHi ) SO· 1. 1.O 1.0 1.0
Mischen, 15 bei Raumteperatur inkubieren.
10 zentrifugieren, dekantieren
(50 *)
0.5
0.5
0.5
0.5
Mischen, 10 min zentrifugieren, dekantieren» Pellet in Wasser lösen, mit Szintillator versetzen, Radioaktivität bestimmen.
030048/03 ti
.../17
: 10 Vol. gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung mit 1 Vol. HgO mischen. Die gesättigte Lösung zuvor auf pH 7«0 einstellen.
(50 #)| 1 VoJ-· gesättigte Lösung mit 1 VoI, Wasser versetzen.
UB: Unspezifische Bindung
B : Maximale Bindung in Abwesenheit von Standard 16-Acetylgitoxin.
Puffer: Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, pH 7Λ
Standards: Stocklösung von 10 /Ug/ml 16-Acetylgitoxin in H2O. Hieraus werden die Standards durch Verdünnen in Normalserum hergestellt.
3„-i6-AG: Tritium-markiertes 16-Acetylgitoxin π.
.,./18
Q30CU8/031 1
4. Typische Eichkurve
030048/031 1
ORIGINAL INSPECTED
-yt-
JlZ.
stiouen gegmi verschindan.
O B P.
10
CO vO VO
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030048/031 1
.../2O
Substanz
Ac-Q
-Dx-Dx-Dx
R-O -H
f-Dx-Dx-Dx
-Dx-Dx-Dx
12-Aoetyldigoxin
Digitoxigenin. Digrfeoxin
Digiriatin
B/Bo = 50% Xreuzreaktion
τΗ Digoxigeaiia »2564
tI)x-Dx-Dx Digoxin »12.800*
-Dx-Dx-Dx-M? ß-Methyldigoxin . »12.600""
1180
2600 '4900
»1255
1S-Anhydrodig±toxigenin » 2690
«0.06
0.7
0.5 <0.2
R-O-V Aglykon Η' Substanz B/Bo »50%
(nniol)		 Kreuareaktion
-H
-Cym		 Strophantidiii
7 k-Strophantin		 »2475*
18.200"		 < 0.05
0300 Rhrn-0- Ui I
Λο
**> 		Ouabain
(=g-Strophantin)		 180.000 <0.006
■Ρ»
OO		 R'y
R-0·^
σ
co		 R1 = OH
E''= OH
R"1= 2Gl
2Ga
1Xy		 Digitonin ,»814 <T<0.9
- Rhm
-Rhm-Me		 Proscillaridin
Proscillaridin-4'-
'jnethylester		 »37-700*
98.000		 0.003
R-O'
co O O 4>· CO ■>» σ co
Sub&tsnz
Progesteron
Pregnenolon
Cholesterol
ßo50
(ρΐΎ1θ()
20.400
63.500
155-000
<0.02
0.005
Lanosterol
169.000
0.005
CH2OH C = O
Testosteron
»3.500
«0.2
Substanz
Kreuzreaktion
I
Cl
NH-CH2
Furosemid
» 30.250* «0.O3
NHCOCH2N(C2Hs)2
CH3
Lidocain
>430.000
ProcaFnamid -HCV
HCt
SV3S8.OOO*
ti
CH
HCQH
Chittidla:
«0.03
SpPronctactoiY 1^25-000
SOCCHl· 0.00&
OH OGH2- CHCH2N HCHtCHih
•HCl
Propranolol >>3.8S.GOO"
«0.0O5
030048/03 1 ../24
jte-
-2X-
Substanz
B/Bo = 50%
(pmol)
Kreuzreaktion
Prednison
OH CH2OH
I
0—CHC = O
H
Aldosteron 2.440
Cortison »27.75p
Hydrocortison »27-600
Östriol »3.500*
0.3
«0.04
<<0.04
<<0.3
OH COi-I,
ί5Ο·0Ο0 0.008
.Ό
»H-OO.000 « 0.005
'. /15
030048/031

Claims (1)

  1. Ansprüche
    1,) Herzglykosid-Antikörperpräparat für die Radioiinmunbestimmung der therapeutisch wirksamen Konzentration eines Herzglykoside im menschlichen Serum, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat für die Bestimmung des im menschlichen Organismus wirksamen Metaboliten von Pentaacetylgitoxin (Pengitoxin) einen Antikörper gegen 16-Acetylgitoxin enthält·
    2. Konjugat-Präparat zur Verabreichung an Lieferantentiere für Antikörperseren, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Konjugat aus i6-Acetylgitoxin und einem die 16-Acetylgruppe vor Abbau durch den Tierorganismus schützenden Protein enthält·
    3. Konjugat-Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat eine Koppelungsrate Herzglykosid:Protein von.etwa 1:1 bis 3*1 aufweist,
    h. Konjugat-Präparat nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat eine Koppelungsrate von etwa 1 :1 bis 2 j 1 aufweist·
    5· Testsubntanz für die mit einem Herzglykosid konkurrierende Anlagerung an einen Antikörper des Herzglykosids, dadurch gekennzeichnet, daß die Testsubstanz für das Herzglykosid Pent»_icetylgitoxin bestimmt ist und als wirksamen Bestandteil eine dem 16-Acetylgitoxin chemisch weitgehend ähnliche,
    030048/0311
    .../26
    ORIGINAL INSPECTED
    vorzugsweise gleiche radioaktiv markierte Vex'foindung enthält,
    6. Testsubstanz nach Anspruch 5 t dadurch gekennzeichnet, daß sie als wirksamen Bestandteil ein 16-Acetylgitoxin enthält, bei dem die endständige Digitoxose zwischen den beiden OH-Gruppen aufgetrennt und mit Tritium und ggf. ¥asserstoff hydriert ist.
    7« Testsubstanz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie bis zum Dialkohol hydriert ist und in jederAlkoholgruppe ein Tritiumatom aufweistι
    _r
    V ο H
    R = 16-Acetylgitoxingenin (-Digitoxose-^,
    8. Verfahren zum Herstellen einer radioaktiv markierten Testsubstanz für die Radioimmunbestimmung des Virkstoffspiegels bei Verabreichen von Pentaacetylgitoxin an den Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man 16-Acetylgltoxin in an sich bekannter ¥eise mit Per jodat behandelt und das Reaktions-/rodnkt mit Tritium und ggf. Wasserstoff reduziert.
    030048/0311 .../27
    2920A11 3
    9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion bis zum Alkohol treibt.
    10. Verfahren zum Herstellen des Antikörper-Präparats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Lieferantentier ein Konjugat aus 16-Acetylgitoxin und einem dessen 16-Acetylgruppe vor Abbau durch den TierOrganismus schützenden Protein mit einer Koppelungsrate von etwa 1:1 bis 3:1 verabreicht und nach ausreichender Inkubationszeit das Antikörper-Präparat in bekannter ¥eise aus dem Tierserum herstellt.
    11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Konjugat mit einer 'Koppelungsrate von etwa 1:1 bis 2t 1 verwendet·
    12. Verfahren zum Herstellen des Konjugat-Präparats nach einem der Ansprüche 2 bis k, dadurch gekennzeichnet., daß man 16-Acetylgitoxin und ein für den Schutz der 16-Acetylgruppe des 16-Acetylgitoxins gegen Abbau durch den Organismus des Lieferantentieres schützendes Protein, vorzugsweise Rinderalbumin, unter schwach alkalischen Bedingungen während einer zur merklichen Hydro Iy si er ung der 16-Acetylgruppe unzureichenden Reaktionszelt umsetzt·
    13· Vwfifthrett nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man einen pH-Vert von etwa 8-9 und eine Reaktion-'.zeil* von etwa ^O Minuten verwendet.
    03Q048/0311 /9_
    14. Vervendung dos Antikörper-Präparats nach Anspruch 1 für die Radioimmunbestimmung der Konzentration des Metaboliten von Pentaacetylsitoxin in menschlichem Serum oder Plasma.
    15. Verwendung des Konjugats nach einem der Ansprüche 2-k für die Radioimmunbestimmung der Konzentration des Metaboliten von Pentaacetylgitoxin in menschlichem Serum oder Plasma.
    16. Verwendung der Testsubstanz nach Anspruch 5 oder 6 für die Radioimmunbestimmung der Konzentration des Metaboliten von Pentaacetylgitoxin in menschlichem Serum oder Plasma.
    030048/0311
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Chemiker-Zeitung, 103. Jahrgang, 1979, Nr. 2, Seiten 53 bis 68 *
Deutsche Medizinische Wochenschrift, Bd. 97, 1972, Seiten 1310 bis 1312 *

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