DE2804495A1 - Neues antibioticum - Google Patents

Description

DR. ING. F. WUESTHOFF Ι)Η.Ε.ν.ΙΊ!ΟΗΜΑΝΝ

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1Α-50 351

Patentanmeldung

Anmelder: F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Basel (Schweiz)

Titel:

Neues Antibioticum

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1A-50 351

RAN 4410/115

F. HoiFmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz

Neues Antibioticum

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antibioticum, im folgenden SM-173B genannt, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Das neue Antibioticum SM-17 3B ist eine orangefarbene, schwach saure Substanz' und weist folgende physico-chemischen Eigenschaften auf:

a) Elementaranalyse:

Berechnet (für ^c ₂o^H16°7^^{: C 65}'^{22 H 4}'^35% Gefunden: C 64,60 H 4,34%.

b) Molekulargewicht (massenspektrometrisch): 368 c) Schmelzpunkt: 225-226°C

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d) Spezifische Drehung: [a]_D° = +123,5° (c = 0,2 in Chloroform)

e) Ültraviolett-Absorptionsspektrum:

*ÜSi^hano1 = 235 nm (ε 28600); 262 run (ε 21900);

ItleiX

° 434-435 nm (ε 11300);

,0,1N NaOH/Methanol
max = 246 nm (ε 22400); 256 nm (ε 23200);

523-524 (ε 9600);

f) Infrarot-Absorptionsspektrum (vgl. auch die Figur 1): 3500, 1710, 1672, 1628, 1600, 1575, 1472, 1452, 1420, 1390, 1295, 1255, 1218, 1200, 1182, 1105, 1025, 1005, 962, 938, 848, 765, 752, 730 cm"¹

g) Löslichkeit:

Löslich in Methanol, Aethanol, Butanol, Aceton, Chloroform, Aethylacetat und in Wasser unter alkalischen Bedingungen; schlecht löslich in η-Hexan; unlöslich in Petroläther und Wasser.

h) Farbreaktionen:

Positiv mit Schwefelsäure und Jod; negativ mit Ninhydrin und Anisaldehyd.

i) NMR-Spektrum in DCCl₃ (vgl. auch die Figur 2) :

1.42 ppm (3H, Singlett), 3,02 ppm (IH, Quartett),

3.43 ppm (3H, Singlett), 3,62 ppm (IH, Triplett), 3,64 ppm (IH, Singlett), 3,93 ppm (IH, Triplett), 7,31 - 8,41 ppm (4H, olefinische Protonen), 12,0 ppm (IH, Singlett), 12,5 ppm (IH, Singlett).

Beim erfindungsgemässen Antibioticum SM-173B handelt es sich um eine Verbindung aus der Anthracylinon-Reihe. Die Verbindung SM-173B unterscheidet sich in ihren physico-chemischen Eigenschaften von den bisher aus dieser Reihe bekannt gewordenen Antibiotica und stellt demzufolge eine neue Substanz dar. Es kann ihr die Formel

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OH

zugeschrieben werden.

Die biologischen Eigenschaften des erfindungsgemässen Antibioticums SM-173B sind wie folgt:

1. Antibakterielle Eigenschaften:

Das antibakterielle Spektrum ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich:

Minimale Hemmkonzentration (MIC)

Testorganismus Staphylococcus aureus 2O9P Staphylococcus epidermidis Sarcina lutea Bacillus subtilis Bacillus cereus Micrococcus flavus Echerichia coli Mycobacterium avium Mycobacterium smegmatis Mycobacterium rhodochrous Aspergillus niger Penicillium citrinum

MIC (pg/ml) 6,25 3,13 12,5
6,25 6,25 6,25

100
6,25 3,13 3,13

100

100

2. Toxizität: Die LDn_n ist bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse grosser als 200 mg/kg

35 Wie aus der obigen Tabelle ersehen werden kann, ist das erfindungsgemässe Antibioticum SM-173B antibiotisch gegen eine Vielzahl von grampositiven Bakterien und gegen Mycobakterien

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- 4r-

wirksam. Es kann dementsprechend als Desinfektionsmittel sowie als Therapeuticum verwendet werden. Die Dosierung als Therapeuticum richtet sich nach dem individuellen Bedarf des Patienten und der Vorschrift des Fachmannes; im allgemeinen werden Tagesdosen im Bereiche von etwa 200 bis 1000 mg an Erwachsene verabreicht (oral oder parenteral? die niederen Dosierungen sind für die parenterale Applikation vorgesehen).

Das erfindungsgemässe Antibioticum SM-173B kann z.B. in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden, welche die Verbindung SM-173B in Mischung mit einem für die enterale, perkutane oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen inerten Trägermaterial, wie z.B. Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche OeIe, Polyalkylenglykole, Vaseline, usw. enthalten. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form, z.B. als Tabletten, Dragees, Suppositorien, Kapseln; in halbfester Form, z.B. als Salben; oder in flüssiger Form, z.B. als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffer. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Das erfindungsgemässe Antibioticum SM-173B kann dadurch hergestellt werden, dass man einen dieses Antibioticum produzierenden Mikroorganismus vom Genus Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Kulturmedium züchtet und aus der Fermentationsbrühe das Antibioticum SM-173B isoliert.

Als im erfindungsgemässen Verfahren anwendbare Mikroorganismen kommen alle Stämme (inkl. Varianten) des Genus Streptomyces in Frage, die das Antibioticum SM-173B zu produzieren vermögen. Bevorzugte Stämme sind Streptomyces chromofuscus SM-173 sowie Varianten desselben. Streptomyces chromofuscus SM-173 wurde aus dem Boden von Kumamoto-ken, Japan, isoliert

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und als ein zu Streptomyces chromofuscus gehörender Stamm identifiziert.

Der als Streptomyces chromofuscus SM-173 bezeichnete Stamm wurde unter der Nummer "FERM-P No. 3824" beim Fermentation Research Institute, Japan (Agency of Industrial Science and Technology) deponiert. Eine Subkultur dieses deponierten Stammes wurde in die Mikroorganismensammlung des United States Department für Landwirtschaft, Northern Utilization Research ^and Development Division, Peoria, Illinois, USA, unter No.

NRRL 11092 deponiert. Die mycologischen Eigenschaften dieser Mikroorganismen sind wie folgt:

I. Morphologie: Luftmycel bildet sich reichlich auf Hafermehl-Agar, anorganische Salze/Stärke-Agar und Bennet's Agar; die Sporenbildung ist reichlich. Das Mycel verzweigt sich unregelmässig und jeder Zweig endet in vorwiegend geöffneten Spiralen mit mehr als 5 Windungen. Gewöhnlich werden reife Sporenketten mit mehr als 10 Sporen pro Kette gebildet. Die Oberflächenstruktur der Sporen ist bei Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop stachlig.

II. Kultur-Charakteristika:

Hefe-Malz-Agar: Reichliches Wachstum, Luftmycel grau, Rückseite gelblich-braun bis gelblich

orange, keine Bildung von löslichem Pigment.

Hafermehl-Agar: Gutes Wachstum, Luftmycel grau, Rückseite gelblich-braun bis gelblich

orange, keine Bildung von löslichem Pigment.

Salz-Stärke-Agar,
Glycerin-Asparagin-Agar: Wie Hefe-Malz-Agar.

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turn und Sporenbildung bei 26°, 30° und 37⁰C.

- Gelatine-Verflüssigung: Negativ (20⁰C, 7 Tage auf

- 4Γ-

* 280U95

■\ Nähragar: Massiges Wachstum, wenig Luftmycel,

Rückseite braun bis dunkelbraun, keine Bildung von löslichem Pigment.

Sucrose-Nitrat-Agar: Schwaches Wachstum.

III. Physiologische Eigenschaften:

- Temperaturbereich auf Bennet's Agar: Reichliches Wachs-

Glucose-Pepton-Gelatine-Medium).

- Stärke-Hydrolyse: Negativ.

- Wirkung auf Milch (10% entrahmte Milch): Koagulation

negativ. Peptonisierung schwach positiv.

- Melaninartige Pigmentbildung: Pepton-Hefe-Eisen-Agar

positiv. Trypton-Hefeextraktbrühe positiv» Tyrosin-Agar negativ.

IV. Verwertung von Kohlenstoffquellen (auf Pridham-Gottlieb's Agar): Alle nachstehend angegebenen Kohlenstoffquellen werden positiv verwertet:

L-Arabinose, D-Glucose, D-Fructose, D-Xylose, D-Mannit, Inosit, Rhamnose, Raffinose, Sucrose.

Die oben erwähnten Charakteristika des Stammes SM-173 können wie folgt zusammengefasst werden: Das Luftmycel besteht aus geöffneten Spiralen und die Oberflächenstruktur der Sporen ist stachlig. Das Luftmycel ist grau. Melaninartige Pigmente werden auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar gebildet, aber nicht auf Tyrosin-Agar. Die Bildung von andern löslichen Pigmenten wird selten beobachtet.

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Bei der Untersuchung der zum Stamm SM-173 in naher Beziehung stehenden Stämme wurde unter Bezugnahme auf die Publikationen des "Internationalen Streptomyces Projekts" (ISP) im "International Journal of Systematic Bacteriology" Vol. 18, Seiten 69-189, 279-392 (1968), Vol. 19, Seiten 391-512 (1969) und Vol. 22, Seiten 265-394 (1972), gefunden, dass der Stamm SM-173 dem Stamm Streptomyces chromofuscus sehr stark gleicht. Beide Stämme sind identisch in morphologischen Merkmalen, der Bildung von Spiralen und stachligen Sporen, der Bildung von grauem Luftmycel und von melaninartigem Pigment auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar aber nicht auf Tyrosin-Agar. Die vergleichende Untersuchung der beiden Stämme im Detail zeigt, dass der Typenstamm Streptomyces chromofuscus Sucrose nicht verwertet, während der Stamm SM-173 dies tut. Der Stamm SM-173 bildet im übrigen viel besser Sporen als die Typenkultur. Diese Unterschiede dürften jedoch kaum zur Schaffung einer neuen Varietät oder Art ausreichen.

Die nahe Verwandtschaft von SM-173 zum Typenstamm,

S. chromofuscus, ist evident. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde der Stamm SM-173 als Streptomyces chromofuscus SM-173 bezeichnet und wie oben angegeben deponiert.

Die Züchtung kann in einem Kulturmedium durchgeführt werden, das übliche, von den erfindungsgemass eingesetzten Mikroorganismen verwertbare Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoff quellen kommen z.B. in Betracht: Glucose, Sucrose, Stärke, Glycerin, Melasse, Dextrin und Mischungen davon. Stickstoffquellen sind z.B. Soyabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe, Cornsteep-Lösung, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Mischungen davon. Im übrigen können dem Kulturmedium nötigenfalls andere organische oder anorganische Substanzen zur Förderung des Wachstums der Mikroorganismen und zur Erhöhung der Produktion des Antibioticums SM-173B zugefügt werden, wie anorganische Salze, z.B. Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Phosphate und dergleichen.

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Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Medium, bevorzugt durch Submers-Fermentation.

Geeignete Temperaturen sind solche im Bereich von 25-35°C.

Die optimale Temperatur liegt bei 28 C. Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung bei einem pH im Bereiche von 5-8. Die Zeit schwankt je nach den Verfahrensbedingungen. In der Regel werden 20-100 Stunden genügen.

Die Isolierung des gebildeten Antibioticums aus der Fermentationsbrühe kann nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden, wie z.B.: Das Mycel kann durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt werden. Aus dem Filtrat kann das Antibioticum mit einem organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Aethylacetat, Butylacetat etc., extrahiert werden. Andererseits kann im abgetrennten Mycel enthaltenes Antibioticum beispielsweise wie folgt gewonnen werden: Das Mycel wird mit einem Lösungsmittel, wie wässrigem Aceton oder wässrigem Methanol, extrahiert, worauf das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand mit einem organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel weiter extrahiert und so das Antibioticum gewonnen wird. Die so erhaltene Lösungsmittelphase wird mit einem Entwässerungsmittel wie Natriumsulfat etc., getrocknet, und dann unter reduziertem Druck konzentriert. Das so erhaltene rohe Antibioticum kann mittels Extraktionsmethoden, Fällungsmethoden, Kolonnenchromatographiemethoden (mit Silicagel, Aluminiumoxyd, etc. als Adsorbentien) oder mittels Molekularsiebmethoden gereinigt werden.

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Beispiel 1

Sporen von Streptomyces chromofuscus SM-173 (deponiert unter No. 3824 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan sowie auch unter No. 11092 in der Mikroorganismensammlung des United States Department für Landwirtschaft, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA) wurden in sechs 500 ml-Kolben, enthaltend je 100 ml Nährmedium [2% Glucose, 1% Pharmamedia (Baumwollsamenöl, Traders Oil Mill, Texas, USA), 0,5% Hefepulver (Ebios Pharmaceutical Co. Ltd., Japan), 1% Weizenkleber] eingeimpft und unter Schütteln drei Tage bei 28 C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde zur Beimpfung von 30 Litern desselben Nährmediums in einem 50-Liter-Fermenter verwendet. Die Kultivierung erfolgte bei 27°C unter Rühren (500 Upm) und Belüftung (30 l/min). Nach 48 Stunden wurde die Kultur zentrifugiert, wobei 22 Liter Filtrat erhalten wurden. Das Filtrat wurde zweimal mit gleichen Volumina Aethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Man erhielt so 12 ml rohes Antibioticum SM-173B in Form eines gelben Sirups. Der Sirup wurde dann auf eine Silicagel-Kolonne (Durchmesser 4 cm, Höhe 60 cm, Kieselgel 60, Merck) gegeben und das Antibioticum SM-173B mit Chloroform eluiert. Die Fraktionen, die nur dieses Antibioticum enthielten (ermittelt mit Dünnschichtchromatographie-Platten, Silicagel, Benzol:Aceton = 4:3) wurden kombiniert und unter reduziertem Druck auf 10 ml eingeengt. Eine kleine Menge η-Hexan wurde zum Konzentrat gegeben und dieses über Nacht kalt gehalten. Es wurden so 105 mg SM-173B als orangefarbene Kristalle erhalten.

Andererseits wurde das beim oben beschriebenen Verfahren erhaltene und gesammelte Mycel mit 15 Litern Aceton extrahiert. Nach Abtrennung des Mycelkuchens und des Lösungsmittels wurde der Extrakt zweimal mit je 3,5 Litern Aethylacetat extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Konzentration unter reduziertem Druck wurden 10 ml rohes Antibioticum SM-173B in Form eines Sirups erhalten. Das rohe Antibioticum wurde an

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Silicagel (Siliciumsäure, Mallincrodt) in einer Glaskolonne (Durchmesser 4 cm, Höhe 50 cm) adsorbiert. Das Antibioticum SM-173B wurde aus der Kolonne mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (95:5) eluiert. Die Fraktionen, die nur dieses Antibioticum enthielten (Ermittlung wie oben) wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das Konzentrat wurde in einer kleinen Menge heissen Benzols gelöst und über Nacht stehen gelassen. Es wurden so weitere 220 mg SM-173B als orangefarbene Kristalle erhalten.

Beispiel 2

Herstellung von Tabletten

pro Tablette

Antibiotikum SM-173B 1,0 mg

wasserfreier Milchzucker 137,0 mg

Maisstärke 20,0 mg

mikrokristalline Cellulose 40,0 mg

Magnesiumstearat 2,0 mg

200,0 mg

Der Wirkstoff wird mit einem Teil des Milchzuckers vorgemischt. Das Gemisch wird gemahlen und anschliessend 15 Minuten mit der Maisstärke, dem verbleibenden Milchzucker und der Cellulose gemischt. Das Gemisch wird gemahlen und anschliessend 2 Minuten mit dem Magnesiumstearat gemischt. Aus diesem Gemisch werden Tabletten zu 200 mg und von einem Durchmesser von 6 mm ausgestanzt. Die Tabletten können flach oder bikonvex sein und können erwünschtenfalls mit einer Bruchrille versehen werden.

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Claims (5)

1A-50 351 Anm.: Hoffmann-La Roche

. wtreeretof»

* ΛϊΟΒδΙΑΧϊί Q. l>. BBHRgHn

UfO R. Oü

Λ ./ Neues Antibioticum(SM-173B^ das eine orangefarbene, schwach saure Substanz ist und folgende physico-chemischen Eigenschaften aufweist:

a) Elementaranalyse:

-.Ι',-..,.-; Berechnet (für C₃₀H₁₆O₇): C 65,22 H 4,35% ir ' ■ Gefunden: C 64,60 H 4,34%.

b) Molekulargewicht (massenspektrometrisch): 368

c) Schmelzpunkt: 225-226°C

d) Spezifische Drehung: [aJ_D = +123,5° (c = 0,2 in Chloroform)

e) Ültraviolett-Absorptionsspektrum:

,Methanol _ „,_ , _η!!ί:ηΛ, _oco „„, . _o, _Qrir,» λ =235 nm (ε 2ö600); 262 nm (ε 21900); max

434-43.5 nm (ε 11300) ; ,0,1N NaOH/Methanol
max = 246 nm (ε 22400); 256 nm (ε 23200);

2Q 523-524 (ε 9600);

f) Infrarot-Absorptionsspektrum:

3500, 171Ο, 1672, 1628, 1600, 1575, 1472, 1452, 1420, 1390, 1295, 1255, 1218, 1200, 1182, 1105, 1025, 1ΟΟ5,

962, 938, 848, 765, 752, 730 cm"¹

g) Löslichkeit:

Löslich in Methanol, Aethanol, Butanol, Aceton, Chloroform, Aethylacetat und in Wasser unter alkalischen Bedingungen; schlecht löslich in η-Hexan; unlöslich in Petroläther und Wasser.

h) Farbreaktionen:

Positiv mit Schwefelsäure und Jod; negativ mit Ninhydrin und Anisaldehyd.

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-Z-

280A495

2. Neues Antibiotikum der Formel

9^H3

OCH,

OH

3. Verfahren zur Herstellung des AntiMoticums (SM-173B) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen dieses Antibioticum produzierenden,Mikroorganismus vom Genus Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Kulturmedium züchtet und aus der Fermentationsbrühe das Antibioticum (SM-173B) isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Streptomyces chromofuscus SM-173 verwendet.

5. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es das Antibiotikum (SM-173B) nach Anspruch und einen Träger enthält.

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