DE2803245A1 - Polysaccharid und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DlPL.-ING. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN . DI PL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K.FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAWS) · D-8000 MO N CH EN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATH E)

^ü 30 178 o/wa

TÄTE & LYLE LIMITED, LONDON / ENGLAND

Polysaccharid und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid mit nützlichen Fliess- und Gelbildungseigenschaften, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Polysaccharide aus mikrobiologischen Quellen haben bei verschiedenen industriellen Anwendungen steigende Bedeutung erlangt, bei denen spezielle Fliesseigenschaften gefordert werden. Mikrobiologische Exopolysaccharide können besondere Eigenschaften aufweisen und können ausserdem leichter und einheitlicher hergestellt werden als pflanzliche oder auf

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Algen aufgebaute Polysaccharide.

Polysaccharide, wie Johannisbrotbaumharz und Alginate, werden industriell in grossem Masse als Emulgatoren, Stabilisatoren und Verdickungsmittel angewendet. In der Nahrungsmittelindustrie werden sie als Emulsionsstabilisatoren für Eiscreme verwendet, als Gelierungsmittel für Milchpuddings, als Verdickungsmittel für Sossen und als Schaumstabilisatoren für Bier. Sie werden auch bei der Herstellung von Papier und Textilien und zum Verdicken vcn. Bohr schlämmen bei Ölbohrungen verwendet. Xanthanharze finden auch in einem weiten Anwendungsbereich Verwendung.

Es wurde nun ein Polysaccharid gefunden, dass im wässrigen System pseudoplastische Fliess- und Scher-Verdünnungseigenschaften aufweist, die bemerkenswert ähnlich denen von Xanthenen und Alginaten sind, so dass sie für ähnliche Anwendungen geeignet erscheinen. Diese Polysaccharide können hergestellt werden, indem man einen polysaccharidbildenden Stamm von Pseudomonas s£,der unter der Nr. NCIB 11264 bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, 135 Abby Road, Aberdeen, hinterlegt worden ist, auf einem Nährmedium züchtet. Dieser polysaccharidbildende Stamm wurde auch bei der American Type Culture Collection in Washington DC unter der Nr. ATCC 31260 hinterlegt.

Pseudomonas sp NCIB 11264 (ATCC 31260) wurde aus kohlehydratreichen Industrieabwässern isoliert. Seine Morphologie und Physiologie kann wie folgt umschrieben werden, wobei alle Temperaturangaben in ⁰C angegeben sind:

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Morphologie Oxoid CM3 Nährmittel Agar 25°C

Gram-negativ, mittelkleine, parallele Stäbchen, die in kurze Stäbchen und manchmal in Coccobazillen übergehen.

Beweglich. Geiselposition: einzeln, polar (elektronenmikrofotografisch).

Kolonien (6 Tage): 2 mm, weichlich, opak (durchsichtiges zusammenfliessendes Wachstum), kreisförmig, vollständig, niedrig konvex, glatt, weich, leicht dispergiert, keine Variationen.

Physiologie 3O°C

Catalase +

Kovacs' Oxidase +

Wachstum bei 37°C + (Kolonien-Wachstumsgeschwindigkeit bei 37°C ist annähernd gleich der Geschwindigkeit bei 25°C)

Wachstum bei Temperaturen

oberhalb 4O°C sehr wenig

anaerobes Wachstum,

Glucoseagar - (wenig)

Hugh & Leifson Glucose oxidativ

Pepton, wässrige Zucker, ) Andrade·s Indikator ) Glucose,Lactose, Fructose?

Sucrose, Maltose, Mannit ) ^{keine säure}

Glyzerin, Stärke ^ Kosers' Citrat + Stärkehydrolyse

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King et al A & B Arginin, Millers Gelatinhydrolyse Caseinhydrolyse NH_ aus Trypton NO^ bis NO₃ oder N₂

Christensen¹ s Urease alkalisch 4-1 1/2 Tage DNAs e

Eidotter-Plattenreaktion Voges - Proskauertest Methylrot

Polypectatabbau -

Der Mikroorganismus kann unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium, in dem es wächst und exozellulares Polysaccharid bildet, kultiviert werden« Typische Medien schliessen ein Komplexbrühen, z.B. eine 1 %-ige Nährbrühe oder ein chemisch definiertes Medium, wie das von Gray et al in Biochimica et Biophysica Acta, 117, 22-32, 1966) beschriebene, mit einer ergänzenden Kohlenstoffquelle von beispielsweise Glucose oder Sucrose. Eine Ergänzung von etwa 2 % Gewicht/Volumen im Medium ist wünschenswert.

Ein besonders bevorzugtes definiertes Medium (das glucoseergänzte Gray et al Medium) zur Verwendung bei der Kultivierung von Pseudomonas sp NCIJ$11264 hat folgende Zusammensetzung:

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— *7 —

Glucose 20 g/1

NH₄Cl 2,66 g/1

KH₂PO₄ 5,44 g/1

NaOH bis pH 7 annähernd 1,5 g/1

Lösung von Spurenelementen* 6 ml/1

* eine Lösung enthaltend MgSO₄.7H₂O 10 g

MnCl₀.4H₉O 1 g

FeSO₄.7H₂O 0,4 g

CaCl₂.2H₂O 0,1 g

destilliertes Wasser bis zu 1 1

Die Kultivierung kann ansatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden und zwar nach üblichen Verfahren. Kontinuierliche Kultivierung wird vorzugsweise unter stickstoffbegrenzenden Bedingungen vorgenommen, beispielsweise von etwa 0,5 g NH₄C1/1. Bei einem durch Glucose ergänzten Medium beträgt die Glucoseumwandlung etwa 30 % bei absatzweisen Kulturen und bis zu 75 % bei kontinuierlichen Kulturen.

Eine Temperatur von 25 bis 35°C ist ausreichend, wobei eine Temperatur von etwa 30°C optimal ist.

Im allgemeinen stellt man fest, dass die Polysaccharidbildung beschleunigt wird, wenn ein Überschuss an einer Kohlenstoffquelle vorhanden ist und unter stickstoffbegrenzenden Bedingungen. Vorzugsweise soll der pH des Mediums nicht unter 6 fallen und er liegt am besten bei 6,5 bis 8,0.

Das exozellulare Polysaccharid kann aus der über dem Kulturmedium stehenden Flüssigkeit (von Zellen frei) durch Ausfällen

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mit einem organischen, wassermischbaren Lösungsmittel, wie Isopropanol, isoliert werden und dann, beispielsweise durch eine übliche Entsalzung unter Anwendung einer Dialyse, entionisiert werden. Nicht gewünschte Zellsubstanz kann durch Digerieren mit Trypsin entfernt werden, beispielsweise, indem man eine wässrige Lösung des Polysaccharids, gepuffert auf pH 7 bis 8, beispielsweise unter Verwendung von 0,2 m HEPES-Puffer bei etwa 3O°C in Gegenwart eines Bakteriostatikums, wie Mercurichlorid, digeriert. So kann man beispielsweise 3,6 1 der Lösung, gepuffert auf pH 7 bis 8 mit 0,2 m HEPES, mit 20 g des Enzyms und Mercurichlorid (1,5 ml einer gesättigten alkoholischen Lösung) 5 Tage bei 30°C behandeln.

Nach der Dialyse kann das isolierte Material gefriergetrocknet werden, wobei man das gereinigte trockene Exopolysaccharid erhält.

Die Analyse zeigt, dass das gereinigte Polysaccharid ein Polysaccharid ist, welches wiederkehrende Einheiten der folgenden Bestandteile hat:

7 D-Glucoeinheiten aus einer Einheit einer 6-substituierten Glucose, zwei Einheiten einer 4-substituierten Glucose, zwei Einheiten einer 3-substituierten Glucose und zwei Einheiten einer 4,6-disubstituierten Glucose; 1 D-Galactoeinheit aus 3-substituierten Galactosen; eine Acetateinheit und eine Pyruvateinheit, wobei die vorgenannten Komponenten einen 4,6-disubstituierten Glucoseverzweigungspunkt und eine Seitenkette einschliessen, die durch eine 4,6-0-(1-Carboxyäthyliden)-D-glucoseeinheit abgeschlossen ist.

Das gereinigte Polysaccharid zeigt eine optische Drehung

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^ QC_7₂₂ = -15° (C 0,68 ₀) was anzeigt, dass alle Zucker in der ß-D~Konfiguration verknüpft sind.

Die Viskositäts- und Fliesseigenschaften des Polysaccharids gemäss der Erfindung können durch den Konsistenzindex k
und den Fliessverhaltensindex η gezeigt werden, wie dies von Krümel und Sarkar in "Flow Properties of Gums useful in the Food Industry", in Food Technology, April 1975, Seiten
36-44, Band 29(4) vorgeschlagen wird.

Die scheinbare Viskosität (η ) in Centipoise wurde gemessen unter Verwendung eines konischen Plattenviskosimeters (cone and plate viscosimeter) bei verschiedenen Schergeschwindigkeiten (D) in Sek. . Zeichnet man Log r> gegen Log D für eine 1 Gew.%-ige Lösung des Polysaccharids gemäss der Erfindung
bei 25 C auf, so erhält man eine gerade Linie, welche einen k-Wert (T) extrapoliert für eine Schergewschindigkeit von

-1 '
1 Sek. ) von 4600 Centipoise und einen η-Wert (die Neigung der grafischen Darstellung plus 1) von 0,22 zeigt. Eine im
Handel erhältliche Probe eines Xanthanharzes für Esszwecke, das unter dem Handelsnamen Keltrol von Kelco, San Diego,
Kalifornien, verkauft wird, ergab unter den gleichen Bedingungen Werte von k und η von 5.000 bzw. 0,23.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.

Beispiel 1

20_l_absatzweise_Fermentation

Exopolysaccharidherstellung durch Pseudomonas sp NCIB 11264

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wurde durchgeführt in einem 10 1 Fermentationsansatz ohne pH-Kontrolle während 50 Stunden bei 30⁰C mit einer Volumen/ Volumen-Belüftung und einer Rührgeschwindigkeit von 350 üpm. Die Verdoppelungszeit des Organismus betrug unter diesen Bedingungen 140 Minuten.

Das logarithmische Wachstum hielt ungefähr 18 Stunden an und zu diesem Zeitpunkt (Ec₂Q 6*0) waren alle Nährmittel offensichtlich im Überschuss vorhanden, obwohl die Sauerstoffspannungen nicht bestimmt wurden. Es ist jedoch bekannt, dass die ExopolysaccharidherStellung bei einem Maxima verläuft, wenn die Sauerstoffspannung nicht begrenzt ist. Zu diesem Zeitpunkt konnte das Polysaccharid durch Ausfällen mit Isopropanol nachgewiesen werden, obwohl das Exopolymere in zunehmenden Mengen in den über der Kultur Stehendem während 12 bis 13 Stunden nach der Inokulierung unter Anwendung einer empfindlicheren Viskosimetereinrichtung nachgewiesen werden konnte. Obwohl die Exopolysaccharidbildung offensichtlich während der späten exponentialen Wachstumsphase verlief, wurde die Bildung maximal weitere 20 Stunden während der stationären Wachstumsphase ablaufen gelassen, bis die Menge der Produktion allmählich nachliess. Diese Art der Fermentation ist typisch für einen zweiten Metaboliten.

Von der eingesetzten Glucose wurden nur 30 % in das Exopolysaccharid umgewandelt, während die anderen 70 % metabolisiert wurden und in der Kultur verblieben.

Beispiel 2

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Eine exopolysaccharidbxldende Kultur von Pseudomonas sp NCIB 11264 wurde in stationärem Zustand bis zu 500 Stunden gehalten. Das definierte Medium, das auf dem von Gray et al (1966) beschriebenen aufbaute und mit Glucose (10 mg/ml) ergänzt war, wurde in allen bisher beschriebenen stationären Kulturstadien verwendet.

Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde die Anfangskonzentration einiger der Komponenten vermindert und die kontinuierliche Polymerproduktion unter Bedingungen einer Stickstofflimitierung durchgeführt. Die Bedingungen wurden bei einem pH von 7,0 + 0,1 bei einer Wachstumstemperatur von 30 + 1°C und einer Belüftungsmenge von 500 ml/min, optimiert.

Nach dem Beimpfen wurde die Kultur in einem Ansatz wachsen gelassen und 24 Stunden entwickelt, bis die Fliessgeschwindigkeit auf 44 ml/h eingestellt wurde. Die Fermentation wurde dann mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,08 h während 500 Stunden durchgeführt. Die Rührgeschwindigkeit wurde dabei die ganze Zeit auf 900 + lOUmdrehungen gehalten. Die Werte für den konstanten Zustand für die gesamte Zelldichte, das Polysaccharidniveau und die Glucoseumwandlung blieben konstant und betrugen nach 100 Stunden 0,26 (E^₂₀ χ 10 ) bzw. 1,6 mg/ml bzw. 40 %, während sie nach 500 Stunden 0,26 (E χ 10 ), 1,6 mg/ml und 45 % betrugen. Eine Zerstörung der Kultur oder eine Entwicklung von mutierenden Stämmen konnte nicht erkannt werden.

Die analysierten Polysaccharidproben zeigten eine konstante Zusammensetzung und Lösungen aus dem Polymer (0,1 mg/ml) zeigten eine gleiche relative Viskosität (1,7 + 0,05) bei einer

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Messung bei 25 C in einem modifizierten Zimm-Crothers-Viskosimeter mit rotierendem Zylinder (55 mA), wodurch gezeigt wird, dass keine Veränderung des Molekulargewichts in dem Exopolymeren während der Fermentationsperiode eingetreten ist.

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Claims (7)

PATENTANWÄLTE DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPL-I NG. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMAN N · Dl PL.-ING. W. LEH N DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MD NCH EN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATH E) 30 178 o/wa TÄTE & LYLE LIMITED, LONDON / ENGLAND Polysaccharide und Verfahren zu dessen Herstellung PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivierung eines Mikroorganismus unter Bildung eines exozellularen Polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, dass man Pseudomonas sp_ NCI^CBi 1264 (ATCC 31260) kultiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Pseudomonas sp in einem Medium gemäss Gray et al, ergänzt durch eine zusätzliche Kohlenstoffquelle, kultiviert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium gemäss Gray et al durch Glucose oder Sucrose ergänzt wird.

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ORIGINAL INSPECTED

4. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet , dass Pseudomonas sp bei 25°C bis 35°C kultiviert wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass Pseudomonas sp bei einem pH oberhalb 6 kultiviert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeich net, dass der pH 6,5 bis 8,0 beträgt.

7. Polysaccharid, dadurch gekennzeichnet , dass es durch Pseudomonas sp_ NCIB 11264 (ATCC 31260) gebildet wird und wiederkehrende Einheiten aufweist aus 7 g-Glucoeinheiten aus einer Einheit einer 6-substituierten Glucose, zwei Einheiten einer 4-substituierten Glucose, zwei Einheiten einer 3-substituierten Glucose und zwei Einheiten einer 4,6-disubstituierten Glucose; 1-g-Galactoeinheit aus 3-substituierter Galactose; einer Acetateinheit und einer Pyrovateinheit, wobei die Einheiten einen 4,6-disubstituierten Glucoseverzweigungspunkt und eine Seitenkette, die durch eine 4,6-o-(1-Carboxyäthyliden)-D-glucoseeinheit abgeschlossen wird, umfasst und das Polysaccharid eine optische Drehung ^ ^₀₁ von -15° (c O,68„ „) aufweist.

ΔΔ XInU

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