DK155334B - Fremgangsmaade til fremstilling af et polysaccharid - Google Patents

Description

1 DK 155334 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til frem-? stilling af et polysaccharid, som har nyttige flydeegenskaber og geldannende egenskaber. Fremgangsmåden er ejendommelig ved, at man dyrker Pseudomonas sp. NCIB 11264 (ATCC 31260) .

Polysaccharider fremstillet ud fra mikrobiologiske kilder får større og større betydning til mange forskellige industrielle anvendelser, hvor der kræves materialer med bestemte flydeegenskaber. Mikrobielle exopolysaccharider kan besidde enestående egenskaber og kan endvidere fremstilles lettere til opfyldelse af bestemte specifikationer end plantepolysaccharider eller algepolysaccharider.

2 DK 155334 B

Polysaccharider såsom johannesbrødgummi og alginater anvendes i vid udstrækning i industrien som emulgeringsmidler, stabiliseringsmidler og fortykningsmidler. I fødevareindustrien anvendes de som emulsionsstabilisatorer for iscreme, som geleringsmidler for mælkebuddinger, som fortykningsmidler for sovser og som skumstabiliseringsmidler for øl. De anvendes også ved fremstillingen af papir og tekstiler og til fortykning af boreslam ved olieboring. Xanthangummier anvendes også i tiltagende udstrækning til en lang række anvendelser.

I Journal of Applied Chemistry and Biotechnology, 26, nr. 6, juni 1976, s. 326-327 er det beskrevet, at en organisme, der betegnes Pseudomonas PB 1, men som ikke er nærmere karakteriseret, ved dyrkning producerer et polysaccharid, som ikke er nærmere karakteriseret. Ved den foreliggende opfindelse karakteriseres mikroorganismen nærmere, ligesom det af mikroorganismen dannede poly-saccharids nyttige egenskaber også beskrives.

Ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes et polysaccharid, som i vandige systemer har pseudoplastiske flyde- og forskydningsfortyndingsegenskaber, som i bemærkelsesværdig grad ligner egenskaberne af xanthaner og alginater, hvilket indicerer tilsvarende kommercielle anvendelser. Dette polysaccharid fremstilles ved dyrkning af en polysaccharid-producerende stamme af Pseudomonas sp, som er deponeret ved National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen under nr. NCIB 11264, i et næringsmedium for denne organisme. Denne -polysaccharidproducerende stamme er også deponeret hos the American Type Culture Collection i Washington DC under nr. ATCC 31260.

Pseudomonas sp NCIB 11264 (ATCC 31260) er isoleret fra en car-bonhydratrig industriel effluent. Dens morfologi og fysiologi kan sammenfattes som følger:

Morfologi: Oxoid CM3-næringsagar, 25°C.

Gramnegative, små til middelstore stave med parallelle sider, som bliver korte stave og undertiden coccobacilli.

Motile. Flagellaposition: enkelt, polær (elektronmikrografi). Kolonier (6 dage): 2 mm, hvidlige, opake (gennemskinnelig sam

3 DK 155334 B

menflydende væske), cirkulær, hel, lavkonveks, glat, blød, let dispergerbar, ingen variation.

Fysiologi, 30°C.

Katalase +

Kovac's oxidase + Vækst ved 37°C + (kolonivæksthastighed ved 37°C er omtrentlig den samme som hastigheden ved 25°C).

Vækst ved temperaturer over 40°C meget ringe.

Anaerob vækst, glucoseagar - ringe

Hugh & Leifson glucose oxidativ

Pepton-vand-sukker, Andrade's indikator)

Glucose, lactose, fructose )

Saccharose, maltose, mannitol ) in9en syre

Glycerol, stivelse )

Koser's citrat +

Stivelseshydrolyse

King et al. A & B

Arginin, Møllers

Gelatinehydrolyse

Caseinhydrolyse NH^ fra trypton NO2 til NO2 eller ^

Christensen's urease alkalisk ($1 1/2 dag) DNAse Æggeblommepladereaktion Voges - Proskauer-test Methylrødt Indol

Polypectatnedbrydning

Mikroorganismen kan dyrkes under aerobe betingelser i et hvilket som helst bekvemt medium, hvori den vil vokse og producere exo-cellulært polysaccharid. Typiske medier er f.eks. complexe bouilloner, f.eks. en 1%'s næringsbouillon, eller et kemisk defineret medium såsom det medium, der er beskrevet af Gray et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 117, 22—32, 1966), med en supplerende car-

4 DK 155334 B

bonkilde af f.eks. glucose eller saccharose. Et supplement på ca. 2% w/v er ønskeligt.

Et særlig foretrukket defineret medium (det glucose-supplerede Gray et al.-medium) til anvendelse ved dyrkning af Pseudomonas sp NCIB 11264 har følgende sammensætning:

Glucose 20 g/liter NH4C1 2,66 g/liter KH2P04 5,44 g/liter

NaOH til pH-værdi 7 ca. 1,5 g/liter

Opløsning af sporgrundstoffer £ 6 ml/liter * En opløsning indeholdende MgS04.7H20 10 g

MnCl2.4H20 1 g

FeS04.7H20 0,4 g

CaCl2.2H20 0,1 g

Destilleret vand op til 1 liter.

Dyrkningen kan udføres chargevis eller kontinuerligt i overensstemmelse med konventionelle metoder. De kontinuerlige dyrkninger udføres fortrinsvis under nitrogenbegrænsende betingelser, f.eks. med ca. 0,5 g NH4Cl/liter. Med et glucoseberiget medium er glucose-omdannelsen ca. 30% i chargekulturer, men op til 75% i kontinuerlige kulturer.

En temperatur på fra 25°C til 35°C er tilfredsstillende, og en temperatur på ca. 30°C er optimal.

Almindeligvis viser det sig, at polysaccharidproduktionen forøges, når der er et overskud af carbonkilde til stede under nitrogen--begrænsende betingelser. Mediets pH-værdi bør fortrinsvis ikke komme ned på under 6 og kan hensigtsmæssigt være fra 6,5 til 8,0.

Det exocellulære polysaccharid kan isoleres fra dyrkningssuperna-tanten (fri for celler) ved udfældning med et organisk, med vand blandbart opløsningsmiddel såsom isopropanol og afioniseres, f.eks. ved konventionel afsaltning under anvendelse af dialyse. Uønsket cellulært materiale kan bekvemt fjernes ved trypsindigerering, 5

DK 155334 B

f.eks. ved digerering af en vandig opløsning af polysaccharidet pufret til pH-værdi 7-8, f.eks. under anvendelse af 0,2M HEPES-puffer ved ca. 30°C i nærværelse af et bakteriostatisk middel såsom mercurichlorid. F.eks. behandles 3,6 liter opløsning, pufret til pH-værdi 7-8 med 0,2M HEPES, med 20 mg af enzymet og mercurichlorid (1,5 ml af en mættet alkoholisk opløsning) i 5 dage ved 30°C.

Efter dialysen kan det isolerede materiale frysetørres til opnåelse af renset tørt exopolysaccharid.

Analyse har vist, at det rensede polysaccharid er et polysaccharid med en gentagende enhed indeholdende følgende komponenter; 7 g-glucoenheder omfattende 1 enhed 6-substitueret glucose, 2 enheder 4-substitueret glucose, 2 enheder 3-substitueret glucose og 2 enheder 4,6-disubstitueret glucose; 1 g-galactoenhed omfattende 3-substitueret galactose; 1 acetatenhed; og 1 pyru-vatenhed; hvorhos de ovennævnte komponenter omfatter ét 4,6-di-substitueret glucoseforgreningspunkt og én sidekæde, som afsluttes af en 4,6-0-(1-carboxyethyliden)-g-glucoseenhed.

Det rensede polysaccharid har optisk drejning, Ca3 22 = (c = 0,68 i ^O), hvilket indicerer, at alle sukkerarterne er sammenknyttet i β-g-konfiguration.

Viskositets- og flydeegenskaberne af polysaccharidet ifølge opfindelsen kan beskrives ved konsistensindeks k og flydeopfør-selsindeks n, således som det er foreslået af Krumel og Sarkar, "Flow Properties of Gums useful in the Food Industry", i Food Technology, April 1975, side 36-44, bind 29(4).

Den tilsyneladende viskositet (0) i centipoise måles under anvendelse af et konus- og plade-viskometer ved forskellige grader af forskydning (D) i sekund En grafisk afbildning af log η som funktion af log D for en 1 vægtprocents opløsning af polysaccharidet ifølge opfindelsen ved 25°C giver en retlinet kurve, som giver en k-værdi (η extrapoleret til en forskydningsgrad på 1 sekund ^) på 4600 cps og en n-værdi (hældningen af kurven +1)

6 DK 155334 B

på 0,22. En kommerciel prøve af xanthangummi af næringsmiddelkvalitet, som forhandles under varemærket Keltrol af Kelco,

San Diego, Californien, giver under samme betingelser værdier for k og n på henholdsvis 5000 og 0,23.

Opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler:

Eksempel 1.

10-Liters charge fermentation.

Pseudomonas sp NCIB 11264's exopolysaccharidproduktion følges ved en 10 liters charge fermentation uden pH-kontrol i 50 timer ved 30°C med volumen/volumen-luftning og en skovlhjulhastighed på 350 omdrejninger pr. minut. Organismens fordoblingstid under disse betingelser er 140 minutter.

Logaritmisk vækst fortsætter i ca. 18 timer, på hvilket punkt (E52O aHe næringsmidler tilsyneladende er til stede i overskud, selv om oxygenpartialtrykkene ikke blev bestemt.

Det vides imidlertid, at exopolysaccharidsyntesen er maksimal, når oxygenpartialtrykket er ikke-begrænsende. På dette stadium kunne polysaccharidet påvises ved isopropanoludfældning, selv om exopolymer havde været påviseligt i stigende mængder i kul-tursupernatanter fra 12 - 13 timer efter podningen under anvendelse af en mere følsom viskometrisk bestemmelse. Selv om således exopolysaccharidproduktionen tilsyneladende begyndte under den sene exponentielle vækstfase, holdtes dannelsen maksimal i yderligere 20 timer under den stationære vækstfase, før produktionshastigheden til sidst begyndte at falde. Dette fermentationsmønster er typisk for en sekundær metabolit.

Af den udnyttede glucose var kun 30% omdannet til exopolysac- charid, de andre 70% var metaboliseret til etablering og opret holdelse af kulturen.

Eksempel 2.

7 DK 155334 B

Steady-state exopolysaccharidproduktion.

Exopolysaccharidproducerende kulturer af Pseudomonas sp NCIB 11264 holdes i steady state i op til 500 timer. Det definerede medium, som er baseret på det af Gray et al. (1966) beskrevne medium, suppleret med glucose (10 mg/ml), anvendes i alle indtil nu beskrevne kontinuerlige dyrkningsundersøgelser.

Som følge af disse undersøgelser nedsattes initialkoncentrationerne af nogle af komponenterne, og kontinuerlig polymerproduktion fulgte under betingelser med påført nitrogenbegrænsning. Betingelserne optimeredes ved pH-værdi 7,0 - 0,1 med en vasks ttemperatur på 30 - 1°C og en luftningshastighed på 500 ml/minut.

Efter podningen dyrkedes kulturen i charge og lodes etablere sig i 24 timer, hvorefter strømningshastigheden indstilledes på 44 ml/time. Forløbet af fermentationen, som kørtes med en fortyndingshastighed på 0,08 time , fulgtes i 500 timer. Hele tiden holdtes en skovlhjulhastighed på 900 - 10 omdrejninger pr. minut. Steady state-værdierne for den samlede celletæthed, poly-saccharidniveauet og glucoseomdannelsen forblev konstante; efter 100 timer var disse værdier henholdsvis 0,26 (E..0~ x 10 1) , 1,6 dZo mg/ml og 40%, medens de efter 500 timer var henholdsvis 0,26 (E^g x 10 1), 1,6 mg/ml og 45%. Der var ingen tegn på forringelse af kulturen eller udvikling af mutantstammer.

De analyserede polysaccharidprøver var af konstant sammensætning, og opløsninger af den polymere (0,1 mg/ml) havde lignende relativ viskositet (1,7 - 0,05), når de måltes ved 25°C med et modificeret Zimm-Crothers viskosimeter af typen med roterende cylinder (55mA) hvilket tyder på, at der ikke havde været nogen ændring i molekylvægten af den exopolymere, der fremstilles gennem fermentationsperioden.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et polysaccharid ved dyrkning af en mikroorganisme til opnåelse af et exocellulært polysaccharid, kendetegnet ved, at mikroorganismen er Pseudomonas sp NCIB 11264 (ATCC 31260).

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Pseudomonas sp NCIB 11264 dyrkes i et medium i henhold til Gray et al. suppleret med en supplerende carbonkilde.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at mediet i henhold til Gray et al. er suppleret med glucose eller saccharose.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den nævnte Pseudomonas sp dyrkes ved 25 - 35°C.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 - 4, kendetegnet ved, at den nævnte Pseudomonas sp dyrkes ved en pH-værdi over 6. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at pH-værdien er 6,5 - 8,0.