JPH0630600B2 - 多糖類の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、微生物による炭水化物の発酵によって多糖類
を製造するための改良方法を目的とする。さらに詳しく
は、本発明は、栄養炭素源として殿粉又は殿粉加水分解
生成物を使用する発酵方法に関する。

［従来の技術］ 高分子量の発酵多糖類即ちバイオポリマーは、水性媒質
中のその増粘性、粘度付与性及び安定性のために多くの
工業用途に増大的に使用されている。例えば、キサンタ
ンゴムは、その異例なほどの流動学的性質の故に、ビル
ディング、塗料、紙、繊維、化粧品、食料品、農業、水
処理、ボーリング、石油の回収その他のような各種の領
域で使用されている。

バイオポリマーは、水性栄養媒質中での微生物の好気性
培養によって生成する。

キサンタンゴムはキサントモナス属の細菌によって製造
される。この種のバイオゴムは、最も周知のもののうち
でも、アグロバクテリウム属、アルスロバクター属、ア
ルカリゲネス属（スワシノグリカン）、プソイドモナス
属（レバン）、リゾビウム属、スクレロチウム属（スク
レログリカン）を包含する多種の微生物によって産生さ
せることができる。これらの多糖類は、高分子量であっ
て、多くの場合１・１０^６以上の分子量を有し、グルコ
ース、マンノース、ガラクトロース、ラムノース、グル
クロン酸、マンヌロン酸、グルロン酸単位と場合によっ
ては酢酸及びピルビン酸誘導体とからなっている。それ
らの特定の構造及び特性は、例えばホイッスラー著の
「工業用ガム質」第２版、章ＸＸＩ−ＸＸＩＩ（１９７
３）に記載されている。

また、発酵多糖類の製造に関する多くの刊行物がある。
キサンタンゴムの製造方法が米国特許第３，０２０，２
０６号、同３，２５１，７４９号、同３，３９１．０６
０号、同３，２７１，２６７号、同３，４２７，２２６
号、同３、４３３，７０８号、同３，４５５，７８６
号、同３，４８５，７１９号、同３，５９４，２８０
号、同４，１５４，６５４号、同４、２８２，３２１号
に記載されている。

水性栄養媒質は、各種の生長元素の他に、特に炭素源と
して同化できる炭水化物を含有する。好適な炭水化物に
は、グルコース、サッカロース、フラクトース。マルト
ース、ラクトース、可溶性殿粉及びその加水分解生成物
が含まれる。粗製殿粉が好適な炭素源として記載されて
いるが、このものはグルコースのような単糖類と比べて
発酵周期を相当に延長させるという大きな欠点を有す
る。さらに、微生物は還元糖の全てを消費することがで
きない。発酵の終了時にこれらの残留粉類が存在するこ
とは、一方では、多糖類の分離前に発酵液(mot)を分
解させる可能性のある汚染性菌株の増殖に対して媒質を
好都合なものにし、そして他方では場合により行われる
殺菌及び清澄化熱処理時に製品を着色させる恐れがあ
る。

［発明が解決しようとする課題］ したがって、本発明の主な目的は、炭素源として殿粉を
使用しかつグルコース又は高いグルコース含有量を有す
る殿粉加水分解生成物によって得られる生産性と少なく
とも等しい生産性を有する経済的な発酵方法を提案する
ことである。

［課題を解決するための手段］ ここに、多糖類が殿粉の酵素的加水分解を同時に生じる
微生物により発酵を行うことによって経済的な態様で製
造できることがわかった。この方法は、粗製殿粉につい
て得られるものと比べて改善された流動学的性質を有す
る多糖類を予期せずして得ることを可能にさせる。その
他の利点は、発酵時間の短縮、低分子量の残留デキスト
ロンの除去及び改善された生産性から生じる。

本発明に従う、同化性炭素源として殿粉を含有する水性
栄養媒質中で微生物の好気性発酵によって多糖類を製造
する方法は、発酵をさらに少なくとも１種の糖化型殿粉
分解酵素の存在下で実施することを特徴とする。

本発明に従って炭素源として使用される殿粉は、小麦、
とうもろこし、もろこし、米、タピオカ、ライ麦、オー
ト麦のような穀類殿粉、又はじゃがいもも殿粉のような
塊茎殿粉のどれでもよい。

用語「殿粉」とは、本明細書では、水性分散体状の粗製
殿粉、そして流動下殿粉、殿粉シロップ及びデキストロ
ースに富む加水分解生成物のような殿粉の不完全加水分
解から得られる殿粉加水分解生成物を包含する。殿粉の
加水分解生成物は、その加水分解度（デキストロース当
量Ｄ．Ｅ．で表わす）並びにそれらの高いオリゴ糖類及
び多糖類含有量により互いに異なっている。流動化殿粉
は、約３〜２０の間Ｄ．Ｅ．を示し、一般にＧ７（７単
位のグルコース）以上の重合度の多糖類５０〜９５％を
含む。殿粉シロップ又は低デキストロース当量のグルコ
ースシロップは、約２０〜６８のＤ．Ｅ．を示し、Ｇ７
以上の多糖類を１０〜５０％含む。殿粉の加水分解生成
物又はデキストロースに富むシロップは、９０〜９８％
になり得るＤ．Ｅ．を有する。殿粉の加水分解生成物の
製造は、斯界で周知である。一般的には、流動化殿粉及
び殿粉シロップは、酸加水分解及び（又は）液化型α−
アミラーゼ、場合によっては次いでβ−アミラーゼによ
る酵素的加水分解によって得られる。グルコースに富む
加水分解生成物については、殿粉は、多くの場合二工程
法で、即ち、液化型α−アミラーゼを作用させ、次いで
グルコアミラーゼ（アミログルコシダーゼの名でも知ら
れている）のような糖化型酵素を作用させることによっ
て転化される。

本発明方法の実施にあたっては、好ましくは、殿粉シロ
ップ、さらに好ましくは流動化殿粉が使用される。グル
コースに富む加水分解生成物の使用は経済的な観点から
有益ではない。なぜならば、それは５０℃以上の温度及
び4.5〜５のpHにあるアミログルコシダーゼの最大活性
条件下でさえも長い工程となる予備的糖化を前提とする
からである。

殿粉及びその加水分解生成物は、殺菌した後、未精製の
ままで本発明の方法に直接使用することができる。もち
ろん、マルトデキストリンとして精製され、濃縮された
又は脱水された市販製品を使用することができる。

殿粉は、発酵媒質に対して１〜１５重量％のグルコース
を与えるのに必要な量で発酵媒質中に存在させる。乾燥
基準で粗製殿粉として表わして、好適な量は発酵媒質１
につき５〜２００ｇ、好ましくは１０〜１５０ｇであ
ってもよい。

高分子量の多糖類を生産する微生物を含有する発酵媒質
に本発明の方法に従って添加される糖化型殿粉分解酵素
は、殿粉のデキストリンをグルコース及びマルトースに
転化させることができる。糖化型酵素としては、バシラ
ス・サグチリス(Bacillus subtilis var.amylosacchari
tiens)のα−アミラーゼ、菌類のα−アミラーゼ、β−
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プル
ラナーゼがあげられる。これらの酵素は単独で又はそれ
らの混合物として使用することができる。

好ましくはグルコアミラーゼがその高い特異性の故に使
用される。グルコアミラーゼは、アスペルギラス属、エ
ンドマイセス属又はリゾパス属に属する菌類のような菌
類の任意のグルコアミラーゼであってよい。特に、炭素
源として粗製殿粉が使用される場合には、糖化型酵素の
他に液化型酵素、例えば液化型α−アミラーゼ−β−ア
ミラーゼ混合物又は液化型α−アミラーゼ−グルコアミ
ラーゼ混合物を使用することが可能である。工業用酵素
製剤がEncyclopedia of pol.Sc.Vol.6、p.46-53に記載さ
れている。

糖化型、場合によっては液化型の殿粉分解酵素は、発酵
媒質中に殿粉のそれぞれ糖化、流動化を行うのに必要な
量で添加される。最少使用量は、酵素の活性、媒質中に
存在する殿粉の量及びＤ．Ｅ．によって左右され、そし
て当業者によって容易に決定することができる。一般的
には、殿粉（乾燥物として表わして）１ｇにつき0.02〜
４単位、好ましくは0.1〜２単位の酵素活性を与えるに
十分な量で使用される。糖化型酵素の例としては、ノボ
インダストリー社より市販されかつグルコアミラーゼで
ある「ＡＭＧ２００Ｌ」は、発酵媒質中に存在する液化
殿粉中に含まれる固形分を基にして0.01〜２重量％、好
ましくは0.05〜１重量％の量で添加することができる。

本発明の方法は、微生物による糖質の発酵による任意の
細胞外多糖類の製造に適用することができる。細菌、酵
母菌、菌類、藻類のような多くの微生物が細胞外多糖類
を製造することができる。

中でも下記の微生物があげられる。

・キサントモナス属(Xanthomonas)に属する細菌、特に
バーギイの「マニュアル・オブ・デターミネイティブ・
バクテリオロジー」８版（１９７４年、バルチモア州ウ
イルキンソン市、ウイルアムズＮ．）に記載された種、
例えばキサントモナス・ベゴニアエ(Xanthomonas begon
iae)キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas Cam
pestris)、キサントモナス・カロタエ(Xanthomonas car
otae)、キサントモナス・ヘデラエ(Xanthomonas hedera
e)、キサントモナス・インカナエ(Xanthomonas incana
e)、キサントモナス・マルバセアラム(Xanthomonas mal
vacearum)、キサントモナス・パパベリコーラ(Xanthomo
nas papaveicola)、キサントモナス・ファセリオ(Xanth
omonas phaseoli)、キサントモナス・ピシ(Xanthomonas
pisi)、キサントモナス・バスキュロラム(Xanthomonas
vasculorum)、キサントモナス・ベシカトリア(Xanthom
onas vesicatoria)、キサントモナス・ビチアンス(Xant
homonas vitians)、キサントモナス・ペラルゴニイ(Xan
thomonas pelargonii)；アルスロバクター属(Arthrobac
ter)、特に、アルスロバクター・スタビリス(Arthrobac
ter stabilis)、アルスロバクター・ビスコウス(Arthro
bacter viscosus)；エルウィニア属(Erwinia)；アゾト
バクター属(Azotobacter)、特にアゾトバクター・イン
ディカス(Azotobacter indicus)；アグロバクテリウム
属(Agrobacterium)に、特に、アグロバクテリウム・ラ
ジオバクター(Agrobacterium radiobacter)、アグロバ
クテリウム・ロジゲネス(Agrobacterium rhozigne
s)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacte
rium tumefaciens)；アルカリゲネス属(Alcaligenes)、
特にアルカリゲネス・ファエカリスAlcaligenes faecal
is)；プソイドモナス属(Pseudomonas)、特にプソイドモ
ナス・メタニカ(Pseudomonas methanica)；コリネバク
テリウム属(Corynebacterium)；バシラス属Bacillus)、
特に、バシラス・ポリミキサBacillus polymyxa)； ・スクレロチウム属(Sclerotium)に属する菌類、特にス
クレロチウム・グルカニキューム(Sclerotium glucanic
um)、スクレロチウム・ロルフシイ(Sclerotium rolfsi
i)、プレクタニア・オクシデンタリス(Plectania occid
entalis)． ・ハンセヌラ属(Hansenula)に属する酵母菌、例えばハ
ンセヌラ・カプシュラータ(Hansenula capsulata)． 本発明で使用される炭素源及び殿粉分解酵素の他に、発
酵媒質及び発酵条件はそれぞれの微生物について文献に
記載のもののうちから選ぶことができる。適切な発酵媒
質が、例えばシドニーＪ．グッチョウ著「発酵による化
学」（１９７３年ノイエス・データ社発行）に記載され
ている。

代表的な発酵媒質は、炭素源の他に、有機及び（又は）
無機窒素源、例えばとうもろこし（ＣＳＬ）及び（又
は）大豆の可溶性抽出物、酵母菌抽出物、ペプトン、ゼ
ラチン、カゼイン；塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウムのようなアンモニウム塩；硝酸ナ
トリウム又は硝酸カリウムのような硝酸塩を含有する。
さらに、発酵媒質は、発酵の開始時又は発酵中のpH調節
時に導入される同化性りん源、例えばＰＯ_4---イオンの
形のりん源、並びに硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウ
ム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウムのようなマグ
ネシウム源、そして生長及び増殖に必須の微量の痕跡元
祖（この種類は微生物の菌株に左右される）を含有し得
る。

本発明の方法を実施するための実際の態様については、
文献、特に、キサンタンゴムの製造について前記した特
許に記載の方法を参照することができる。多くの場合、
前記のその他の微生物にとる多糖類の製造の詳細は、キ
サンタンゴムのものと非常に類似している。

一般的には、微生物は、発酵媒質にそれ自体知られた方
法で、例えば２０の実験室用発酵器で得られた中間培
養物によって導入される。微生物自体は例えば１のエ
ーレンマイヤーフラスコ中で実施した接種物から得られ
る。

当業者に周知の接種物又は中間培養物の製造は、仏国特
許2,414,555号に記載されている。

次いで、発酵は、生長及び生産の一又はそれ以上工程で
曝気されかつ攪拌された媒質中で数時間実施される。生
長用媒質及び生産用媒質は同一の組成又は異なった組成
を有していてよい。満足できる量の多糖類を生じさせる
のに必要なインキュベーション温度及び時間は、当然に
使用した微生物によって変る。温度は一般に約３０℃±
１０℃にある。多くの場合、pHは6.0〜7.5、好ましくは
6.5〜7.2の範囲に保持される。必要ならば媒質にか性ソ
ーダ、か性カリ、アンモニアのようなアルカリ性物質を
導入するpH調節系を使用することができる。しかし、あ
る場合には、収率は低いpH範囲で最適となろう。例え
ば、スクレログルカンの製造に対しては、収率は3.5〜
5.5の初期pH範囲で最適となる。

迅速な発酵を達成するためには、増殖する菌培養物に対
して使用できる正確な量の酸素を与えるため媒質は十分
に曝気され攪拌されることが必須である。酸素での発酵
の要件は、一般に発酵及び酸素移動の条件に適合され
る。この点で、本発明の方法は、ヨーロッパ特許第５８
３６４号、同９８４７４号及び同１８７０９２号に記載
のような乳化媒質中での発酵方法に適合させることがで
きるといえる。

発酵が完了した後、多糖類を含有する発酵液はそれ自体
知られた方法で処理される。一般的には、微生物細胞を
殺すため殺菌が行われる。所望ならば、発酵液は、流動
学的性質、清澄化及び過適性を向上させるための熱及
び（又は）酵素処理及び（又は）過を受けるようにさ
せることができる。さらに、ある場合には、発酵液の濃
縮を行うのが有益である。これは任意の知られた方法に
より実施することができる。

多糖類は、発酵液から任意の通常の方法で単離すること
ができ、例えば生成物が不溶である溶媒、例えば低級ア
ルコール（好ましくはイソプロパノール）によるか及び
（又は）適当な無機塩による沈殿によって単離すること
ができる。沈殿した多糖類は、次いで過され、洗浄さ
れ、乾燥され、粉砕される。

上記の方法は、明らかに不連続式で、又は発酵容器に無
菌媒質を連続的に導入することによって連続式で実施す
ることができる。

上記の説明は、殿粉又はその分解生成物を一及び二糖類
に加水分解することができる酵素の存在下に、殿粉から
生じる炭水化物源を含有する媒体を微生物により発酵さ
せることによってバイオポリマーを製造するための特別
の方法を目的とすること並びに本発明自体は発酵媒質の
正確な組成にもまた特別の実施態様にも限定されないこ
とが理解される。

本発明の方法で得られる全発酵液及び多糖類粉末はヒド
ロコロイドの既知の用途のいずれにも使用することがで
きる。発酵液を希釈し又は粉末を可溶化することによっ
て得られる水溶液は、従来技術の方法に従って粗製殿粉
又は液化殿粉によって生じる多糖類を同じ濃度で希釈す
ることによって得られる溶液よりも優れた流動学的性質
を有することが示された。

［実施例］ 下記の実施例は本発明を例示するものである。

例１ 接種物の調製 酵母抽出物、麦芽抽出物、バクトペプトンおよび１０ｇ
／の小麦殿粉を含有する１００ｍの媒質を入れて攪
拌したフラスコに、試験管中のゲロース上に保持したキ
サントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestri
s)の培養物から播種する。この播種された媒質を殺菌し
た後、２８℃で２４時間インキュベートする。フラスコ
の内容物を１５の発酵液に接種するために使用する。

流動化粗製殿粉の調製 ３０重量％の乾燥物を含有する小麦殿粉乳状液を調製す
る。pHを７に調節し、流動化用酵素（TERMAMYL 120L、ノ
ボインダストリー社製）を、乾燥物として表わして殿粉
に対し0.１５重量％の割合で添加する。温度８５℃にも
たらし、この温度を３０分間保持する。得られた流動化
殿粉を１２１℃で３０分間殺菌する。

発酵 試験Ａ ２０の発酵器内で、下記の組成を有する１５の無菌
生産用媒質を調製する。

殿粉（上記で調製） ４５ｇ／（乾燥物として） 大豆粉末 5.１ｇ／ MgSO₄・7H₂O 0.２５ｇ／ 蒸留水 １に要する量 pH ７に調節 これにグルコアミラーゼ（ＡＭＧ ２００Ｌ、ノボイン
ダストリー社製）を乾燥物として表わして殿粉に対し１
％の割合で添加する。酵素の添加後、直ちにこの媒質に
上で調製した接種物を接種する。

温度を２８℃に調節し、pHをか性ソーダの自動添加によ
り6.８〜7.０に保持する。空気を発酵器内に４０ＶＶＨ
の初期曝気量から媒質の粘度が上昇し始めるときの５５
ＶＶＨまでもたらして注入する。媒質を３段のラシュト
ンブレードにより２００〜４００ｒｐｍの速度で攪拌す
る。

発酵は糖類がもはや存在しなくなったときに停止する。
発酵液を殺菌し、次いでイソプロパノールを添加するこ
とにより多糖類を沈殿させ、過し、１２０℃で３０分
間乾燥する。

試験Ｂ（比較） 生産用媒質にグルコアミラーゼを添加しないことを除い
て、試験Ａの条件と同じ条件で操作する。発酵は、残留
糖類の濃度がもはや変動しなくなったときに停止する。

試験Ａ及びＢのそれぞれの間に、媒質中の残留殿粉の量
を測定するために発酵液の試料を一定間隔で採取する。
測定は、殿粉を酸加水分解した後に高性能液体クロマト
グラフィーにより行う。また、媒質の粘度（ブルックフ
ィールド粘度計、針ＮＯ．４、３０ｒｐｍ、２０℃）も
測定する。結果を第１図に図示する。ここで曲線Ａ，Ａ
１及びＢ、Ｂ１は、それぞれ試験Ａ及びＢの発酵時間
（Ｄ．ｈｒで表わす）の関数としての残留殿粉量（Ｓ．
ｇ／で表わす）及び媒質の粘度（Ｖ．ｍＰａ・ｓで表
わす）を表わす。発酵の結果及を以下に示す。

それぞれの場の生成物の粘度付与性を、粉末から蒸留水
中0.２％の濃度に調製した希釈水溶液について測定した
（ブルックフィールド、針NO.１、２０℃）。

例２及び３ 例１と同じ媒質及び操作条件を使用して例１に記載の態
様で二つの発酵を実施する。生産用媒質を構成した後、
乾燥物として表わして殿粉に対して0.２５％（例２）及
び0.５％（例３）の酵素ＡＭＧ ２００Ｌを添加する。

得られた結果を以下に記載する。

例４ 例１と同じ接種物及び同じ条件で調製した流動化殿粉を
使用して例１に記載の態様で発酵を実施する。

生産用媒質は次の組成を有する。

流動化殿粉 １００ｇ／ 粗大豆粉末 7.０ｇ／ MgSO₄・7H₂O 0.２５ｇ／ 蒸留水 １に要する量 生産用媒質を構成した後であって、接種する前に、乾燥
物として表わして殿粉の重量に対し0.５％のグルコアミ
ラーゼＡＭＧ ２００Ｌを添加する。発酵条件は例１と
同じである。

得られた結果を、同じ条件であるがただしグルコアミラ
ーゼの不存在下で実施した比較試験と比較して以下に示
す。

比較試験は残留糖類が多いので抽出できないため、粘度
付与能力は測定しなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法に従う発酵実験及び比較実験に
おける発酵時間（Ｄ）に対する残留殿粉量（Ｓ）及び発
酵液の粘度（Ｖ）を図示したものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】炭素源として殿粉を含有する水性栄養媒質
   中で微生物の好気性発酵によって多糖類を製造するにあ
   たり、多糖類を生産する微生物を含有する発酵媒質中に
   少なくとも１種の糖化型殿粉分解酵素を添加して発酵を
   該酵素の存在下で実施するようにしたことを特徴とする
   多糖類の製造方法。
2. 【請求項２】殿粉を発酵媒質に対し１〜１５％のグルコ
   ースを与えるのに必要な量で使用することを特徴とする
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】糖化型酵素の他に液化型酵素を添加するこ
   とを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】糖化型酵素がα−アミラーゼ、β−アミラ
   ーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナー
   ゼ及びこれらの混合物のうちから選ばれることを特徴と
   する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】微生物がキサントモナス属、アルカリゲネ
   ス属、アグロバクテリウム属、アルスロバクター属、ア
   ゾトバクター属、プソイドモナス属、コリネバクテリウ
   ム属の細菌、スクレロチウム属の菌類及びハンセヌラ属
   の酵母菌の群から選ばれることを特徴とする請求項１〜
   ４のいずれかに記載の方法。