DE2754830A1

DE2754830A1 - Zellzuechtungsverfahren und -vorrichtung

Info

Publication number: DE2754830A1
Application number: DE19772754830
Authority: DE
Inventors: Burkhard Dr Enders; Hans-Heinrich Hahn; Oswald Dr Zwisler
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1977-12-09
Filing date: 1977-12-09
Publication date: 1979-06-13
Also published as: DE2754830C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Züchtung von
Zellen, vorzugsweise von einzelligen Parasitenspezies der Familie Entamoeba.
Verfahren zur Züchtung von Zellen werden in der Regel in Gewebekulturschalen, Erlenmeyer-Kolben, Gewebekulturröhrchen, oder förmigen oder zylindrischen Gefäßen, sogenannten Rollflaschen, durchgeführt. Für die Verfahren ist wesentlich, daß eine ausreichende große Oberfläche zur Verfügung steht und daß die Zell mit Nährmedium versorgt werden. Insbesondere die Rollflaschen haben den Vorteil, daß den zu züchtenden Gewebs-Zellen oder Organismen durch eine während der Kultivierung durchgeführte Rotation der horizontal liegenden Flasche die gesamte Flasche innenfläche zur Verfügung steht. Demnach kann für eine relativ große Zell zahl eine relativ geringe Menge an Nährmedium eingesetzt werden.
Der arbeitsmäßige Aufwand bei der in vitro Züchtung von Zellen in Zellkultur-Rollflaschen ist gegenüber Gewebekulturschalen (z.B. Erlenmeyer- oder Fernbach-Kolben) oder Gewebekulturröhrchen wesentlich verringert, doch sind auch dabei die Ausbeuten derzeilmenge, gemcssen an der bereitgestellten Menge Kultur medium, nicht immer befriedigend.
Einer Ubertragung des Verfahrens zur Züchtung von Zellen in Zellkultur-Rollflaschen auf Amoeben-Trophozoiten stand bislang offenbar entgegen, daß diese Organismen bei der bisher durchgeführten Rotation der Zellkultur-Rollflaschen nicht an der Flaschenoberfläche anwuchsen und sich demnach darin auch nicht vermehrten. Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß Amoeben in Rollflaschen zu kultivieren sind, vorausgesetzt, daß die Fvotation des Kulturgefäßes sehr niedrig gehalten ( c10 U/Std.).çird.
Allerdings muß in der Rollflasche ein relativ großes Volumen des Nährmediums vorliegen, um ein Austrocknen der Amoeben an der oberen, nicht mit Nährmedium benetzten Fläche zu verhincern.
Gegenstand der Erfindung ist demnach zunächst ein Verfahren zur Zellkultur in Zellkultur-Rollflaschen, dadurch gekennzeichnet, daß die zu kultivierende Zelle ein Amoeben-Trophozoit ist.
Es wurde weiter nun gefunden, daß die Ausbeute an Zellen in der Zellkultur-Rollflasche bedeutend gesteigert werden kann, wenn deren innere Oberfläche vergrößert wird. Dies kann bei der Vorgabe einer bestimmen Flaschenkonstruktion erreicht werden durch Vergrößerung der Flaschenwandfläche, insbesondere dadurch, daß man den Flaschenboden stark wölbt und gegen die Mitte einzieht. Auch andere Maßnahmen sind hierfür geeignet, wie die Einfügung von parallel zur Zylinderwand laufenden Stäben oder ähnlichen Einbauten.
Durch diese besonderen Konstruktionen der Kulturgefäße en-tsteht ein wesentlich günstigeres Verhältnis von Wachstumsoberfläche zu benötigtem, teuerem Nährmedium und damit eine Vervielfachung der Ausbeute an Zellen pro eingesetzter Mediuunenge.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Zellkultur in Zellkultur-Rollflaschen, dadurch gekennzeichnet, daß hierfür Rollflaschen verwendet werden, deren innere Oberfläche vergrößert wurde, vorzugsweise, daß der Flaschenboden stark gewölbt und gegen die Mitte eingezogen ist. Ein stark in die Mitte eingezogener Boden führt dazu, daß ein im Querschnitt doppelringförmiges Gefäß und im Längsschnitt ein U-förmiges Gefäß entsteht.
Die anliegende Zeichnung veranschaulicht den Gegenstand der Erfindung, insbesondere die Vorrichtung zur Zellzüchtung.
In der Zeichnung stellt die Figur 1ev1e Ansicht einer Flasche mit eingezogenem Boden, teilweise im Schnitt, dar.
Figur 2 zeigt einen Querschnitt der Flasche auf der Linie A-A. In der Zeichnung bedeuten 1 den Flaschenkörper 2 den stark eingezogenen Boden.
Derartige Zellkultur-Rollgefäße führen zu einer bedeutenden Steigerung der Ausbeute, insbesondere dann, wenn die ohnehin gegenüber bekannten Gefäßen bereits verringerte Nährmedienflüssigkeitdie beiden Innenflächen des Gefäßes gleichzeitig berührt. Damit entsteht ein günstiaes Verhältnis von der für viele Zellen zur Vermehrung zwingend notwendigen Haftoberfläche zu dem benötigten Nährmedium. Die Folge ist eine bedeutende Steigerung der Ausbeute der Zellen in der Zeiteinheit pro Menge des angebotenen Mediums.
Das gemäß der Erfindung bevorzugte Gefäß mit dem annähernd bis zum Flaschenhals eingezogenen Boden führt dazu, daß bis dahin nur mit großen Schwierigkeiten in einer brauchbaren Ausbeute züchtbare Protozoen wie Entamoeba histolytica in dem erforderlichen Ausmaß gewonnen werden können.
Bisher wurde hierfür die von Diamond, L.S. "Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica a like amoeba", J.Parasitol. 54, 1047-1056 (1968) sowie von Thompson, P.E. et. al "Preparation and evaluation of standardized amoeba antigen from acenic cultures of Entamoeba histolytica", Bull.Wld.Hlth.
Org. 39, 349-365 (1968) beschriebene axenische Kultur in stehenden Kulturgefäßen durchgeführt. Eine Übertragung des Kulturverfahrens auf rcllende Kulturgefäße brachte wohl eine Steigerung der Ausbeute an Einzellern, das Verhältnis Nährmedium zu dem auf der Innenfläche der Rollrandfiasche sich ausbildenden Zellrasen war jedoch noch ungünstig.
Man kann davon ausgehen, daß das erfindungsgemäße Gefäß die innere Oberfläche verdoppelt.Das Nährmedium kann im Vergleich zu einer gängigen Rollflasche mit dem gleichen Außenvolumen auf etwa 1/3 verringert werden. Wie das folgende Beispiel zeigt, kann hierdurch die Ausbeute an Amoeben jedoch verzehnfacht werden.
Um die erfindungsgemäßen Rollflaschen optimal auszunutzen und ein besonders gutes Wachstum der Kulturen zu erzielen, empfiehlt es sich, die Flasche weitgehend mit Nährmedium zu füllen. Bewährt hat sich insbesondere eine Füllung von > 90 % des lichten Volumens der Flasche.
Die Rotationsgeschwindigkeit der Flasche beim Rollvorgang ist den Bedürfnissen der kultivierten Organismen anzupassen.
Sie soll 100 U/Std. nicht überschreiten und vorzugsweise <10 U/Std. betragen.
Die Kultur der Entamoeba histolytica wird wie folgt durchgeführt: Eine nach L.S. Diamond, J.Parasitol. 54,1047-1056 (1968) in TP-S-1-D1edium angelegte Vorkultur von E.histolytica wird wie folgt weiterbehandelt: In eine erfindungsgemäße abgewandelte Rollflasche (1 Züchtungs-Einheit), die zuvor hitzesterilisiert wurde (3000C für 1 Stunde), werden 5 Erlenmeyerkölbchen-Vorkulturen eingefüllt. Das Wachstum in den Vorkulturen wird vor Transfer in die Rollflasche mikroskopisch beurteilt.
Zu der vorgegebenen 600 ml Einsaat werden 200 ml frisches TP-S-1-Medium zugegeben. Alle Arbeitsgänge, vom Anlegen der Vorkulturen bis zur Ernte der Hauptkulturen, erfolgen unter sterilen Bedingungen. Die Rollflaschen werden horizontal auf einem "Rollacell Tissue Culture Apparatus", Modell RC-41 (Fa. New Brunswick Scientific Co., USA) gelegt und für 48 Stunden bei einer Umgebungstemperatur von 37 C gedreht. Optimales Wachstum erfolgt bei ca. 3 - 5 Umdrehungen des Kulturgefäßes in einer Stunde. Nach mikroskopischer Kontrolle von Wachstum und Reinheit (bakt. Kontamination) der Kultur wird die Rollflasche in einem Eisbad auf + 40 bis + 60 C abgekühlt. Die Kulturamoeben lösen sich von der Glasoberfläche und werden mittels Zentrifugation (Christ Zentrifuge I J IV KS) vom Medium abgetrennt. Das Amoeben-Sediment wird in 10 ml phys. NaCl aufgenommen und die Keimdichte durch Zählung (Thoma-Zählkammer) bestimmt.
Beispiel Fermentationsgefäß Material Roll- Flasche flasche (erfindungsgemäß) Vorkulturen/Flasche (Erlenmeyerkölbchen 10 5 a100 ml) TP-S-1 Medium pro Flasche 2000 ml 800 ml Anzahl Kulturen aus 100 1 Medium 50 125 Ausbeute an Kulturamoeben aus 100 1 Medium 23-30 x 108 22-25 x 109 Leerseite

Claims

Zellzüchtgunsverfahren und -vorrichtung PATENTANSPRUCHE: 1. Verfahren zur Zellkultur in Zellkultur-Rollflaschen, dadurch gekennzeichnet, daß die zu kuitivierende Zelle ein Amoeben-Trophozoit ist.
2. Verfahren zur Zellkultur in Zellkultur-Rollflaschen, dadurch gekennzeichnet, daß hierfür Rollflaschen verwendet werden, deren innere Oberfläche vergrößert wurde.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden der Rollflasche stark in der Mitte eingezogen ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem Verfahren kultivierten Zellen Entamoeba histolytica sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Rollflasche mit einer Geschwindigkeit von(100 U/Std., vorzugsweise C10 U/Std., rotiert.
6 Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß b90 % des Volumens der Rollflasche mir ulturflüssigkeit gefüllt sind.
7. Vorrichtung für Zellzüchtungsverfahren, dadurch gekenn zeichnet, daß es eine Flasche, deren Flaschenboden stark in die Mitte eingezogen ist, darstellt.
8. Verwendung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 5 zur KulLivierung von Entamoeba histolytica.