DE2754830C2

DE2754830C2 -

Info

Publication number: DE2754830C2
Application number: DE19772754830
Authority: DE
Inventors: Burkhard Dr. Enders; Hans-Heinrich Hahn; Oswald Dr. 3550 Marburg De Zwisler
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1977-12-09
Filing date: 1977-12-09
Publication date: 1987-06-11
Also published as: DE2754830A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur in vitro Züchtung von Zellen und ihre Verwendung zur Kultivierung von Amoeben-Trophozoiten.

Verfahren zur Züchtung von Zellen werden in der Regel in Gewebekulturschalen, Erlenmeyer-Kolben, Gewebekulturröhrchen, quaderförmigen oder zylindrischen Gefäßen, sogenannten Rollflaschen, durchgeführt. Für die Verfahren ist wesentlich, daß eine ausreichende große Oberfläche zur Verfügung steht und daß die Zellen mit Nährmedium versorgt werden. Insbesondere die Rollflaschen haben den Vorteil, daß den zu züchtenden Gewebs-Zellen oder Organismen durch eine während der Kultivierung durchgeführte Rotation der horizontal liegenden Flasche die gesamte Flascheninnenfläche zur Verfügung steht. Demnach kann für eine relativ große Zellzahl eine relativ geringe Menge an Nährmedium eingesetzt werden.

Der arbeitsmäßige Aufwand bei der in vitro Züchtung von Zellen in Zellkultur-Rollflaschen ist gegenüber Gewebekulturschalen (z. B. Erlenmeyer- oder Fernbach-Kolben) oder Gewebekulturröhrchen wesentlich verringert, doch sind auch dabei die Ausbeuten an der Zellmenge, gemessen an der bereitgestellten Menge Kulturmedium, nicht immer befriedigend.

Einer Übertragung des Verfahrens zur Züchtung von Zellen in Zellkultur-Rollflaschen auf Amoeben-Trophozoiten stand bislang offenbar entgegen, daß diese Organismen bei der bisher durchgeführten Rotation der Zellkultur-Rollflaschen nicht an der Flaschenoberfläche anwuchsen und sich demnach darin auch nicht vermehrten.

Es wurde nun gefunden, daß Amoeben in Rollflaschen zu kultivieren sind, vorausgesetzt, daß die Rotation des Kulturgefäßes sehr niedrig gehalten (<10 U/Std.) wird. Allerdings muß in der Rollflasche ein relativ großes Volumen des Nährmediums vorliegen, um ein Austrocknen der Amoeben an der oberen, nicht mit Nährmedium benetzten Fläche zu verhindern.

Es wurde weiter nun gefunden, daß die Ausbeute an Zellen in der Zellkultur-Rollflasche bedeutend gesteigert werden kann, wenn deren innere Oberfläche vergrößert wird. Dies kann bei der Vorgabe einer bestimmten Flaschenkonstruktion erreicht werden durch Vergrößerung der Flaschenwandfläche, insbesondere dadurch, daß man den Flaschenboden stark wölbt und gegen die Mitte einzieht. Auch andere Maßnahmen sind hierfür geeignet, wie die Einfügung von parallel zur Zylinderwand laufenden Stäben oder ähnlichen Einbauten. Durch diese besonderen Konstruktionen der Kulturgefäße entsteht ein wesentlich günstigeres Verhältnis von Wachstumsoberfläche zu benötigtem, teurem Nährmedium und damit eine Vervielfachung der Ausbeute an Zellen pro eingesetzter Mediummenge.

Gegenstand der Erfindung ist demnach eine Vorrichtung für Zellzüchtungsverfahren bestehend aus einer Flasche, dadurch gekennzeichnet, daß der Flaschenboden stark in die Mitte eingezogen ist.

Vorzugsweise ist der Boden annähernd bis zum Flaschenhals eingezogen.

Ein stark in die Mitte eingezogener Boden führt dazu, daß ein im Querschnitt doppelringförmiges Gefäß und im Längsschnitt ein U-förmiges Gefäß entsteht.

Die Zeichnung veranschaulicht den Gegenstand der Erfindung, insbesondere die Vorrichtung zur Zellzüchtung. In der Zeichnung stellt die Fig. 1 eine Ansicht einer Flasche mit eingezogenem Boden, teilweise im Schnitt, dar. Fig. 2 zeigt einen Querschnitt der Flasche auf der Linie A-A. In der Zeichnung bedeuten

1 den Flaschenkörper,
2 den stark eingezogenen Boden.

Derartige Zellkultur-Rollgefäße führen zu einer bedeutenden Steigerung der Ausbeute, insbesondere dann, wenn die ohnehin gegenüber bekannten Gefäßen bereits verringerte Nährmediumflüssigkeit die beiden Innenflächen des Gefäßes gleichzeitig berührt. Damit entsteht ein günstiges Verhältnis von der für viele Zellen zur Vermehrung zwingend notwendigen Haftoberfläche zu dem benötigten Nährmedium. Die Folge ist eine bedeutende Steigerung der Ausbeute der Zellen in der Zeiteinheit pro Menge des angebotenen Mediums.

Das gemäß der Erfindung bevorzugte Gefäß mit dem annähernd bis zum Flaschenhals eingezogenen Boden führt dazu, daß bis dahin nur mit großen Schwierigkeiten in einer brauchbaren Ausbeute züchtbare Protozoen wie Entamoeba histolytica in dem erforderlichen Ausmaß gewonnen werden können. Bisher wurde hierfür die von Diamond, L. S. "Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica a like amoeba", J. Parasitol. 54, 1047-1056 (1968) sowie von Thompson, P. E. et al "Preparation and evaluation of standardized amoeba antigen from acenic cultures of Entamoeba histolytica", Bull. Wld. Hlth. Org. 39, 349-365 (1968) beschriebene axenische Kultur in stehenden Kulturgefäßen durchgeführt. Eine Übertragung des Kulturverfahrens auf rollende Kulturgefäße brachte wohl eine Steigerung der Ausbeute an Einzellern, das Verhältnis Nährmedium zu dem auf der Innenfläche der Rollrandflasche sich ausbildenden Zellrasen war jedoch noch ungünstig.

Man kann davon ausgehen, daß das erfindungsgemäße Gefäß die innere Oberfläche verdoppelt. Das Nährmedium kann im Vergleich zu einer gängigen Rollflasche mit dem gleichen Außenvolumen auf etwa 1/3 verringert werden. Wie das folgende Beispiel zeigt, kann hierdurch die Ausbeute an Amoeben jedoch verzehnfacht werden.

Um die erfindungsgemäßen Flaschen optimal auszunutzen und ein besonders gutes Wachstum der Kulturen zu erzielen, empfiehlt es sich, die Flasche weitgehend mit Nährmedium zu füllen. Bewährt hat sich insbesondere eine Füllung von 90% des lichten Volumens der Flasche.

Die Rotationsgeschwindigkeit einer als Rollflasche ausgebildeten Flasche beim Rollvorgang ist den Bedürfnissen der kultivierten Organismen anzupassen. Sie soll 100 U/Std. nicht überschreiten und vorzugsweise <10 U/Std. betragen.

Die Kultur der Entamoeba histolytica wird wie folgt durchgeführt:

Eine nach L. S. Diamond, J. Parasitol. 54, 1047-1056 (1968) in TP-S-1-Medium angelegte Vorkultur von E. histolytica wird wie folgt weiterbehandelt:

In eine als Rollflasche ausgebildete Flasche (1 Züchtungs-Einheit), die zuvor hitzesterilisiert wurde (300°C für 1 Stunde), werden 5 Erlenmeyerkölbchen-Vorkulturen eingefüllt. Das Wachstum in den Vorkulturen wird vor Transfer in die Rollflasche mikroskopisch beurteilt. Zu der vorgegebenen 600 ml Einsaat werden 200 ml frisches TP-S-1-Medium zugegeben. Alle Arbeitsgänge, vom Anlegen der Vorkulturen bis zur Ernte der Hauptkulturen, erfolgen unter sterilen Bedingungen. Die Rollflaschen werden horizontal auf einem "Rollacell Tissue Culture Apparatus", Modell RC-41 (Fa. New Brunswick Scientific Co., USA) gelegt und für 48 Stunden bei einer Umgebungstemperatur von 37°C gedreht. Optimales Wachstum erfolgt bei ca. 3-5 Umdrehungen des Kulturgefäßes in einer Stunde. Nach mikroskopischer Kontrolle von Wachstum und Reinheit (bakt. Kontamination) der Kultur wird die Rollflasche in einem Eisbad auf +4° bis +6°C abgekühlt. Die Kulturamoeben lösen sich von der Glasoberfläche und werden mittels Zentrifugation (Christ Zentrifuge I J IV KS) vom Medium abgetrennt. Das Amoeben-Sediment wird in 10 ml phys. NaCl aufgenommen und die Keimdichte durch Zählung (Thoma-Zählkammer) bestimmt.

Beispiel

Claims

1. Vorrichtung für Zellzüchtungsverfahren bestehend aus einer Flasche, dadurch gekennzeichnet, daß der Flaschenboden stark in die Mitte eingezogen ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden annähernd bis zum Flaschenhals eingezogen ist.

3. Verwendung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 zur Kultivierung von Amoeben-Trophozoiten.