DE2730378A1

DE2730378A1 - Verfahren zur isolierung von uteroevakuierenden substanzen aus pflanzenextrakten

Info

Publication number: DE2730378A1
Application number: DE19772730378
Authority: DE
Inventors: Ramesh Kanojia; Seymour Levine
Original assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Current assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Priority date: 1976-07-07
Filing date: 1977-07-05
Publication date: 1978-01-12
Also published as: IE45391L; AT360642B; AU2675677A; FR2357255B1; IL52459A; IL52459A0; FR2357255A1; AU516055B2; NZ184498A; IE45391B1; US4061739A; BE856590A; ATA483177A; JPS5951931B2; GB1582963A; CA1085300A; GR62450B; PH12356A; NL7707583A; JPS539310A

Description

VOSSIUS VOSSIUS HILTL PATENTANWÄLTE P.O.BOK 8βΟ7β7 · βΟΟΟ Manchen ββ

u.Z.: M 266

Case: OBTH 300

QBTHO FHABMACEÜTICAL COBPOBATION

Baritan, N.J., T.St.A.

" Verfahren zur Isolierung von uteroevakuierenden Substanzen aus Pflanzenextrakten"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von uteroevakuierenden Substanzen aus der Zoapatlepflanze.

In der DT-OS 2 515 670 ist ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Extrakten aus der Zoapatlepflanze beschrieben, gemäß dem man ein gereinigtes Material von wertvoller biologischer Aktivität erhält. Bei diesem Verfahren wird das rohe Material der Säulenchromatographie an adsorbierendem Material und anschließend der Säulenchromatographie an einem organischen polymeren Gel unterworfen.

Aufgabe der Erfindung ist es, aus dem gemäß diesem Verfahren erhaltenen Material biologisch aktive Bestandteile zu isolieren und zu reinigen.

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Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß eine Chromatographie an Aluminiumoxid zum Erfolg führt.

Die Zoapatlepflanze ist ein in Mexiko wild wachsender Busch von etwa 2 m Höhe. Botanisch ist sie gemäß Cervantes als Montanoa tomentosa, Familie Compositae, Tribus Heliantheae bekannt. Eine andere Varietät dieser Art ist Montanoa floribunda. Die Pflanze ist ausführlich in Las Plantas Medicinales de Mexico, 3· Auflage, Ediciones Botas, 1944, beschrieben.

Die Zoapatlepflanze wird seit Jahrhunderten in Form eines "Tees" oder anderen wäßrigen Zubereitungen hauptsächlich zur Einleitung von Wehen oder Monatsblutungen beim Menschen verwendet. Eine derartige Verwendung ist zwar in der Literatur belegt, jedoch wurden bisher keine entsprechenden chemischen und pharmakologisehen Untersuchungen durchgeführt.

Gegenwärtig wird aus den Blättern der Zoapatlepflanze durch Kochen mit Wasser ein bitter schmeckender "Tee" zubereitet. Dieser Tee wird von Frauen nach dem Ausbleiben der Menstruation, d.h. nach dem Eintreten einer vermutlichen Schwangerschaft, eingenommen. Es ist aber auch bekannt, daß viele Frauen, bei denen eine Schwangerschaft bereits feststeht, diesen Tee zur Beendigung einer unerwünschten Schwangerschaft einnehmen. Offensichtlich enthält dieser Tee ein Gemisch aus komplexen Materialien, von denen viele zur Erzielung der gewünschten Wirkung nicht erwünscht oder unnötig sind. Im allgemeinen sind natürliche, aus

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Pflanzen gewonnene Substanzen in ihrer Zusammensetzung sehr kompliziert. Man findet darin eine Reihe von Verbindungen mit ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften sowie auch Verbindungen mit vollkommen unterschiedlichen Eigenschaften. Die Trennung und Identifizierung dieser Verbindungen ist im allgemeinen eine schwierige Aufgabe.

In der genannten DT-OS 2 5^5 670 ist ein Verfahren zur Reinigung von rohen Extrakten aus der Zoapatlepflanze beschrieben, gemäß dem man ein biologisch aktives Material erhält, das mindestens 3 Bestandteile enthält. Dieses halbgereinigte Material wird im erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterial verwendet.

Erfindungsgemäß erhält man durch Chromatographie dieses halbgereinigten Materials an einer mit Aluminiumoxid gepackten Säule 2 chemisch verschiedene Verbindungen mit uteroevakuierenden Eigenschaften. Unter "uteroevakuierenden" Mitteln sind solche Mittel zu verstehen, die bei Warmblütern eine Kontraktion oder eine Austreibung des Uterus bewirken. Derartige Mittel werden im allgemeinen zur Einleitung von Monatsblutungen, Austreibung von Hydatidenmolen, Austreibung oder Resorption von Föten, Einleitung von Aborten oder verspäteten Wehen sowie in Situationen, bei denen der Uterusinhalt, wie Fötus oder Placenta, entleert werden sollen, verwendet.

Die Abtrennung der uteroevakuierenden Substanzen kann an neutralem, basischen oder saurem Aluminiumoxid durchgeführt werden. Die Aktivität des Aluminiumoxids kann von I (aktivste Form) bis

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V (am wenigsten aktive Form) variieren. Die verschiedenen Aktivitätsgrade des zu verwendenden Aluminiumoxids ergeben sich, indem man Aluminiumoxid der Aktivität I zur Erzielung der jeweils nächstniedrigeren Aktivitätsstufe mit etwa 3,3 Prozent Wasser versetzt. Als bevorzugtes Adsorptionsmittel wird im erfindungsgemäßen Verfahren saures Aluminiumoxid der Aktivität IV verwendet, das man erhält, indem man saures Aluminiumoxid der Aktivität I mit etwa 10 Prozent Wasser versetzt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Probe des halbgereinigten uteroevakuierenden Materials in einem entsprechenden Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol, Chloroform, Diäthyläther und Hexan, gelöst und auf eine mit Aluminiumoxid gepackte Säule aufgesetzt. Die Säule kann trocken geschüttet werden, vorzugsweise wird sie jedoch unter Verwendung eines Lösungsmittels geschüttet. Dabei wird im allgemeinen das Lösungsmittel verwendet, das zum Auflösen oder Eluieren des uteroevakuierenden Materials verwendet wird. Anschließend wird die Säule mit Lösungsmittel eluiert, wobei mehrere Fraktionen aufgefangen werden. Zur Elution können verschiedene Kombinationen von polaren Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol, Aceton, Essigsäureäthylester, Acetonitril und Nitromethan, mit relativ unpolaren Lösungsmitteln, wie Chloroform, Methylenchlorid, Benzol, Toluol, Diäthyläther, Diisopropyläther, Hexan undCyclohexan, verwendet werden. Bevorzugt wird ein Lösungsmittel mit steigendem Gradienten von Essigsäureäthylester in Cyclohexan verwendet. Wird eine Erhöhung der Laufgeschwindigkeit ge-

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wünscht, kann die Säule unter Anwendung von geringem Druck, bis etwa 0,7 kg/cm , eluiert werden. Dies erreicht man, wenn man die Säule mit einem Inertgas, wie Stickstoff, unter Druck setzt. Die Zusammensetzung der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch an mit Silbernitrat imprägnierten Kieselgel GF-Flatten überwacht. Die Überwachung der Fraktionen kann auch gaschromatographisch vorgenommen werden.

Auf die vorstehend geschilderte Weise erhält man 2 chemisch unterschiedliche Produkte mit uteroevakuierenden Eigenschaften, was durch Gaschromatographie und Spektralanalyse nachgewiesen werden kann.

Die uteroevakuierenden Eigenschaften werden gemessen, indem man den Grad der Uteruskontraktionen bestimmt und feststellt, inwieweit es bei weiblichen Tieren zur Beendigung der Trächtigkeit kommt.

Die gereinigten uteroevakuierenden Verbindungen sind bei einer Verabfolgung in Dosen von 1,0 mg bis etwa 100 mgAg wirksam. Die tatsächlich verwendete Dosis hängt von der Tierspezies ab, an die die Verbindungen verabfolgt werden. Die Verbindungen lassen sich in Form von Präparaten verabfolgen, die gemäß üblicher pharmakologischer Praxis hergestellt worden sind. Beispiele dafür sind Lösungen, Suspensionen und feste Präparate.

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Nachstehend wird die Erfindung näher erläutert.

Herstellung des Ausgangsmaterials

10 kg Zoapatleblätter und 114 Liter Wasser werden in einen dampfummantelten Behälter aus korrosionsbeständigem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 579 Liter gegeben. Das Gemisch wird 2 1/2 Stunden unter periodischem Rühren auf 98 bis 1OO°C erwärmt. Das heiße Gemisch wird durch Gaze filtriert, wodurch man einen klaren, dunklen Tee (etwa 95 Liter) erhält. Der im Behälter verbleibende feste Rückstand wird mit 15,1 Liter heißem Wasser gewaschen und filtriert. Das Filtrat wird mit dem vorstehend erhaltenen Tee vereinigt. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden mit 114 Liter Essigsäureäthylester extrahiert. Das Gemisch wird heftig gerührt und sodann zum Absetzen stehengelassen. Die obere Schaumschicht wird abgesaugt, um die Emulsion zu brechen. Sodann wird der Essigsäureäthylester soweit wie möglich abgetrennt. Anschließend wird das Gemisch mit weiteren 75,7 Liter Essigsäureäthylester versetzt und das vorstehend beschriebene Verfahren wird wiederholt. Die vereinigten Essigsäureäthylesterextrakte werden unter vermindertem Druck auf 50⁰C eingedampft. Der Rückstand wird mit 3 Anteilen an heißem (75 bis 8O⁰C) Benzol (Gesamtvolumen 10 Liter) extrahiert. Die Benzolextrakte werden bei 5O⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird 5 mal mit unter Rückfluß siedendem Hexan (Gesamtvolumen 8 Liter) gewaschen. Der mit Hexan gewaschene Rückstand wird in 2 Liter Aceton gelöst und mit 10 g Nuchar, (Aktivkohle) versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtempe-

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ratur gerührt. Sodann wird die Aktivkohle abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck bei 3O°C eingedampft. Man erhält 69 g rohen Extrakt.

50 g des rohen Extrakts werden in 5 Liter Diäthyläther gelöst. Die erhaltene Lösung wird filtriert und mit 500 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Der Diäthyläther wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Man erhält 44,6 g hellgelbes öl. Dieses Öl wird in 400 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 2,5 kg neutraler Kieselsäure gepackte, mit Chloroform äquilibrierte Säule der Abmessungen 10,2 χ 122 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit Chloroform und Gemischen aus Chloroform und Isopropanol eluiert. Es werden 110 Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden unter 4O°C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Die Elution wird folgendermaßen vorgenommen:

Volumen/Fraktion
Fraktion (ml) Elutionsmittel

1-7 650 CHCl₅

8-30 500 Isopropanol:CHCl₃ (1:41,7)

31-60 500 Isopropanol:CHCl₅ (1:33,3)

61-105 500 Isopropanol:CHCl₅ (1:28,6)

106-110 500 Isopropanol-.CHCl₅ (1:25)

Die Zusammensetzung der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch /"Tüeselgel, Isopropanol-Chloroform (1:12,5)__7 und

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gaschromatographisch an einer 3prozentigen OV/17 /"Methylsilicon:

Laufs Phenylsilicon (1:1)_7-Säule unter Anwendung eines programmierten / (150 bis 25O^CC) überwacht. Die Fraktionen 78 bis 84- werden vereinigt. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man 5»1 g halbgereinigtes Material als öligen Rückstand, der mindestens 3 Bestandteile enthält, wie die Gaschromatographie ergibt.

Beispiel

Eine ausreichende Menge an saurem Aluminiumoxid (Aktivität IV) wird in eine Glassäule (Innendurchmesser 5»1 cm), die in einer Höhe von etwa 91>5 cm mit Cyclohexan gefüllt ist, gepackt. Auf diese Aluminiumoxidsäule wird eine Lösung von 10 g halbgereinigtem Material in 25 ml Benzol aufgesetzt. Anschließend werden weitere etwa I5 ml Benzol aufgesetzt. Die Säule wird zunächst mit einem Gemisch aus Essigsäureäthylester und Cyclohexan (10:90) und anschließend mit steigenden Anteilen an Essigsäureäthylester in Cyclohexan eluiert. Es werden folgende Fraktionen aufgefangen.

Fraktions- Fraktions- Gesamtnummer volumen Elutionsmittel volumen

10:90, EtOAc:Cyclohexan 5 Liter 15:85, EtOAc:Cyclohexan 5 Liter 20:80, EtOAc:Cyclohexan 5 Liter 25:75» EtOAc:Cyclohexan 5 Liter

30:70, EtOAc:Cyclohexan "^19,5 Liter

EtOAc = Essigsäureäthylester

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1-5	1000 ml
6-10	1000 ml
11-15	1000 ml
16-35	1000 ml
36-113	25O ml

Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch an mit 20 Prozent Silbernitrat imprägnierten Kieselgel GF-Platten (Analtech) ^fAceton:Benzol = 1:1_/ und auch gaschromatographisch an einer 3prozentigen OV/17 /"Methylsilicon:Phenylsilicon = 1:1_7-Säule mit programmiertem Lauf (I50 bis 250⁰C) überwacht.

Die Fraktionen 45 bis 47 werden vereinigt. Man erhält etwa 280 mg (2,8 Prozent) eines Öls mit folgenden spektralen Daten: IR-Spektrum (Netz): 2,90, 5,96 und 6,21 ^;

NMR-Spektrum^³^: 1,01, 1,13, 1,48, 2,08, 2,11, 3,56, 4,13,

4,25, 5,48 und 6,11 S .

Die Fraktionen 68 bis 98 werden vereinigt und eingedampft. Man erhält 2,18 g (etwa 22 Prozent) eines Öls mit folgenden spektralen Daten:

IR-Spektrum (Netz): 2,91 und 5,88/1;

NMR-Spektrum^¹3: 1,04, 1,15, 1,67, 1,76, 2,18, 3,18, 3,58,

4,15, 4,26 und 5,41 £ .

Herstellung von Aluminiumoxid der Aktivität IV 150 ml Wasser werden langsam zu I5OO g saurem Aluminiumoxid (Woelm, Aktivität I) unter Mischen in einem 5 Liter-Rundkolben versetzt. Das erhaltene Gemisch wird gründlich und gleichmäßig vermischt, indem man den Kolben mindestens 2 Stunden an einem Rotationsverdampfer dreht. Das auf diese Weise erhaltene saure Aluminiumoxid weist die Aktivitätsstufe IV auf.

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Zum Nachweis von Uteruskontraktionen bei weiblichen Tieren wird das nachstehend beschriebene Verfahren angewendet.

Verfahren I

Geschlechtsreifen weiblichen Neuseelandkaninchen, die mit Natriumpentobarbital betäubt sind, werden die Eierstöcke entfernt. Nach einer 1-wöchigen Erholungspause werden die Kaninchen an 6 aufeinanderfolgenden Tagen subkutan mit 5 ,ug/Tag 17ß-östradiol und anschließend an 7 aufeinanderfolgenden Tagen subkutan mit 1,0 mg/Tag Progesteron behandelt. Die Uteri und die Eileiter der Kaninchen werden 72 Stunden nach der letzten Progesterongabe nach einem leicht modifizierten Verfahren gemäß Heilman u. Mitarb., Fertil. Steril., Bd. 23, S. 221 bis 229, perfundiert. Die Perfusion von Eileiter und Uterus wird mit einer Geschwindigkeit von 53/il/min vorgenommen. Der Uterus wird mit einem Rohr perfundiert, das 1,0 cm vom Eileiterende in den Uterus ragt. Der Uterus wird an der Verbindungsstelle zwischen Uterus und Eileiter abgebunden. Durch einen kleinen Vaginaschnitt wird eine weitere Kanüle 1,0 cm tief in den Uterus eingeführt, um die perfundierende Flüssigkeit zu sammeln. Das zu untersuchende Material wird zusammen mit einem Trägerstoff, der Polyäthylenglykol 200, Polyäthylenglykol -W)O, Äthanol und Phosphatpuffer enthält, intravenös in die Jugularvene verabfolgt. Die Kanüle ist mit einem P23-Dc-Stathan-Übertragungsgerät verbunden, das wiederum mit einem Grass Modell 5-Polygraph gekoppelt ist. Auf diese Weise werden die Uterus-

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kontraktionen gemessen.

Eine intravenöse Verabfolgung der aus dren Fraktionen 68 bis 98 erhaltenen Verbindung bewirkt Uteruskontraktionen und eine Entspannung des Eileiters bei Kaninchen, denen 72 Stunden Progesteron entzogen worden ist. Die Verbindung ist in einem Dosisbereich von 1,0 bis 4,0 mg/kg wirksam. Die aus den Fraktionen 45 bis 47 erhaltene Verbindung ist bei einer Verabfolgung in einem Dosisbereich von 25 bis 40 mg/kg wirksam.

Nachstehend ist das allgemeine Verfahren erläutert, mit dem der Abbruch einer Trächtigkeit nach erfolgter Implantation festgestellt wird.

Verfahren II

Geschlechtsreife weibliche Meerschweinchen vom Hartley-Stamm werden monogam ständig mit männlichen Tieren gehalten, bis ein Vaginalpfropf (Copulationspfropf) im Käfig gefunden wird. Dieser Zeitpunkt wird als Tag 1 der Trächtigkeit betrachtet. Die Testmaterialien werden an Gruppen von 5 bis 6 weiblichen Tieren intraperitoneal im Träger gemäß Verfahren I am Tag 22 der Trächtigkeit verabfolgt. Zwischen dem 25. und 45. Tag der Trächtigkeit werden die Tiere getötet und auf Anzeichen von Resorption oder Abort untersucht.

Die aus den Fraktionen 68 bis 98 erhaltene Verbindung bewirkt bei intraperitonealer Verabfolgung in Dosen von 25 bis 85 mgAg einen Abbruch der Trächtigkeit.

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ORIGINAL INSPECTED

Claims

VOGSIUS VOSSIUS · HILTL

PATENTANWÄLTE

P.O.Box 8OO767 · ΘΟΟΟ München θβ

u.Z.: M 266 _h .|«J!! 1977

Case: ORTH 500

ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION

Raritan, N. J., V.St.A.

"Verfahren zur Isolierung von uteroevakuierenden Substanzen aus Pflanzenextrakten"

Priorität: 7. Juli 1976, V.St.A., Nr. 703 160

Patentansprüche

1. Verfahren zur Reinigung von Extrakten mit einem Gehalt an uteroevakuierendem Material aus der Zoapatlepflanze, d adurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus halbgereinigtem uteroevakuierendem Material in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel löst,

die erhaltene Lösung an Aluminiumoxid chromatographiert, das Aluminiumoxid mit einem Gemisch aus polaren und nichtpolaren organischen Lösungsmitteln eluiert und die Fraktionen mit einem Gehalt an uteroevakuierendem

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ORIGINAL INSPECTED

Material auffängt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zoapatlepflanze Montanoa
tomentosa oder Montanoa floribunda verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel einen aromatischen Kohlenwasserstoff, einen chlorierten Kohlenwasserstoff oder einen aliphatischen Äther verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel
Benzol, Chloroform oder Diäthyläther verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gemisch aus polaren und nichtpolaren Lösungsmitteln ein Gemisch aus Essigsäureäthylester und Cyclohexan verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1,dadurcu gekennzeichnet, daß man als Aluminiumoxid suux-es Aluminiumoxid der Aktivität IV verwenuct.

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