Phyllanthin
ist eine aktive leberschützende Verbindung
und wird üblicherweise
aus Phyllanthus amarus extrahiert. Das bittere Hauptphyllanthin
aus Phyllanthus amarus Schum & Thonn
(syn. Phyllanthus niruri auct. Non. Linn) aus der Familie Eu- phorbiaceae
wurde zuerst in 1891 von Ottawa isoliert, obwohl es erst in 1964
durch L.R. Row et al. [Tetrahedron Lets. 1557 (1964)] charakterisiert
worden ist. Phyllanthin ist ein Lignan, das an die Kohlenstoffatome
8, 8' von zwei Zimtsäureresten
gekoppelt ist (Diarylbutanlignan). Das durch das Verfahren der Erfindung
erhaltene Phyllanthin hat die nachfolgende Molekülstruktur 1.
Die
Pflanze Phyllanthus amarus ist über Jahrhunderte
hinweg in indischen Systemen der Medizin für die Behandlung von Gelbsucht
verwendet worden. Aufgrund ihrer weiten Verbreitung sowohl in tropischen
als auch subtropischen Gebieten ist Phyllanthus amarus eine der
am weitverbreitetsten verwendeten Pflanzen der Gattung Phyllanthus
in der Volksmedizin der Welt. In der Volksmedizin wird P. amarus
als nützlich
bei der Behandlung von Urogenitalinfektionen, Hepatitis B-Virus,
Atemwegserkrankungen und Diabetes angesehen (Glossary of'Indian Medicinal
Plants, CSIR, New Dehli, 1956; L.M. Perry und J. Metzger, Medicinal
Plants of East and Southeast Asia: Attributed properties and uses,
MIT Press, Cambridge, MA, 1980, S. 149–151). In Indien ist er üblicherweise
als Bhumya malki, Tamalaki, Hazardana oder Jarmala bekannt. Die
Pflanze wird überall
innerhalb der Ebenen von Indien und in den Hügeln in einer Höhe von bis
zu 900 m gefunden. Es ist ein Wildkraut der Regenzeit in Brachlandgebieten und
im Schatten. Die gesamte Pflanze von P. amarus wird als einer der
Inhaltsstoffe in meh- rere Kräuter umfassenden
Formulierungen, die in Indien für
die Behandlung von Gelbsucht vertrieben werden, verwendet und als
Ergebnis besteht im Handel ein großer Bedarf an dieser. Es wird
berichtet, daß die
Blätter
und oberirdischen Teile von P. amarus Lignane, Flavonoide, Triterpenoide,
Tannine, Alkaloide und Glykoside enthalten. Klinische Studien, die
mit P. amarus ausgeführt
worden sind, ergaben, daß die verschiedenen
Extrakte von Menschen gut vertragen wurden. Sein Extrakt unterdrückt auch
das HBV-Oberflächenantigen
und zeigte schützende
Wirkung gegen einen durch CCl4 und Paracetamol
induzierten Leberschaden in Ratten und Mäusen. Es wurde gezeigt, daß unter
den isolier- ten Verbindungen das Hauptlignan Phyllanthin eine ausgeprägte antihepatotoxische
Aktivität
gegen durch CCl4 und Galactosamin induzierte
Zytotoxizität
in Rattenhepatozyten in Primärkultur
ausübte
[J Ethnopharmacol. 14, 41 (1985)]. Die obigen Fakten erklären seine
traditionelle Verwendung bei der Behandlung von Gelbsucht. Phyllanthin
lag als einer der Bestandteile von dessen Extrakten vor [U.S.-Patent
Nr. 4,673,575 (1987)].
Allopathische
Systeme der Medizin haben praktisch kein Heilmittel für Hepatitis.
Chronische virale Hepatitis B ist ein weitverbreitetes Problem in
der ganzen Welt und ist für
chronisch-persistierende Hepatitis und primäres hepatozelluläres Karzinom
verantwortlich. Ein weitverbreitetes Auftreten von Hepatitis in
Indien und anderen Ländern,
das zur Mortalität von
Millionen von Menschen geführt
hat, gab einen Anstoß,
ein neues Extraktionsverfahren für
die Isolierung von Phyllanthin in größeren Mengen (0,6%) zu entwickeln.
Die leberschützende
Verbindung liegt in Phyllanthus amarus in einer höheren Konzentration vor.
In
einem der Verfahren, über
die im Stand der Technik berichtet worden ist, wurden sonnengetrocknete
Blätter
(1 kg) mit gelöschtem
Kalk im Verhältnis
10:3 gemischt und 24 h getrocknet. Dies wurde dann mit Petrolether
mittels achtfachem Siphonieren extrahiert. Nach Entfernung des Lösemittels
wurde ein gelber Halbfeststoff mit Alkohol gekocht und abgekühlt und
filtriert. Das Verfahren wird zweimal wiederholt und auf ¼ seines
ursprünglichen
Volumens konzentriert. Weiteres Wachs wird durch Filtration entfernt.
Das Filtrat lieferte nach Verdampfung von Lösemittel einen blaßgelben
Feststoff. Das Verfahren wurde wiederholt, bis der Rückstand
weiß ist. Der
Rückstand
wurde des weiteren einer Chromatographie über Aluminiumoxid unterzogen,
wodurch Phyllanthin ausgehend von Benzol-Petrolether- und Benzol-Elutionsmitteln
erhalten wurde. Die Ausbeute an Phyllanthin beträgt 0,11% [Tetrahedron, 22,
2899 (1996)]. Dieses Verfahren ist zeitaufwändig und umfaßt eine
Anzahl von Schritten mit schlechter Ausbeute (0,11%). Es ist aus
dieser Offenbarung auch nicht klar, ob der weggelassene Extraktionsrückstand nach
der Hexanextraktion Phyllanthin enthält oder nicht. Das Verfahren
verwendete auch das kanzerogene Lösemittel Benzol und führt folglich
zu Zweifeln an seiner kommerziellen Durchführbarkeit.
In
einem anderen Verfahren wurden die Blätter von Phyllanthus amarus
(10 kg) pulverisiert und sukzessive mit n-Hexan ohne Mischen mit
Kalk extrahiert. Aus dem n-Hexan-Extrakt erhaltenes Öl wurde an
Kieselgel adsorbiert und in einer Kieselgelsäule einer Chromatographie unterzogen,
wobei nacheinander mit n-Hexan, n-Hexan:Benzol in unterschiedlichen
Anteilen und Benzol eluiert wurde. Phyllanthin wurde in 0,03% aus
n-Hexan:Benzol (1:1)- und n-Hexan:Benzol (3:1)-Elutionsmitteln isoliert.
Das Verfahren leidet unter einer geringen Ausbeute (0,03%) und ist
nur von akademischer Bedeutung, da es die Isolierung von neuen Verbindungen
beschrieb [Tetrahedron, 47, 8931 (1991)]. Das Verfahren widmet sich nicht
dem weggelassenen Extraktionsrückstand
hinsichtlich der Anwesenheit von Phyllanthin nach einer n-Hexan-Extraktion.
Das Verfahren verwendet ebenfalls Benzol als Lösemittel. Benzol ist als kanzerogene
Substanz wohlbekannt und ist in mehreren europäischen Ländern verboten. Aus diesem
Grund ist das Verfahren dieser Offenbarung nicht kommerziell durchführbar.
Bislang
ist kein geeignetes Verfahren für
die Isolierung von Phyllanthin in der Literatur verfügbar. Unter
Berücksichtigung
der reichlichen Verfügbarkeit von
Phyllanthus amarus als ein Wildkraut der Regenzeit in Indien ist
ein verbessertes Verfahren für
die Isolierung der leberschützenden
Verbindung Phyllanthin aus den Blättern von Phyllanthus amarus
entwickelt worden. Die Blätter
der Pflanze sind einer neuen Technik von Extraktion und Isolierung,
die zu der Rückgewinnung
von Phyllanthin in 0,6% auf einer Trockengewichtsbasis führt, unterworfen
worden. Das Pflanzenmaterial ist auf dem indischen Markt leicht
verfügbar
und ist sehr billig. Wenn es ausgereift ist, machen die Blätter nahezu
30% des trockenen Krauts aus.
GEGENSTÄNDE DER
ERFINDUNG
Es
ist ein Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren für die Extraktion
und Isolierung von Phyllanthin, einer leberschützenden Verbindung, aus einer reichen
natürlichen
Quelle, wie Phyllanthus amarus, von dessen unterschiedlichen Extrakten
berichtet wird, daß sie
für die
Hemmung einer HBV-Infektion der
Leber wirksam sind, bereitzustellen.
Es
ist ein anderer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren für die Extraktion
und Isolierung von Phyllanthin, das einfach, billig und verschmutzungsfrei
ist, bereitzustellen.
Es
ist ein anderer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren für die Extraktion
und Isolierung von Phyllanthin bereitzustellen, das zu einer hohen
Ausbeute von reinem Produkt führt.
Es
ist ein anderer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren für die Extraktion
und Isolierung von Phyllanthin, das zu der Erzeugung eines Produkts
mit hoher Stabilität
für eine
lange Zeitdauer führt,
bereitzustellen.
Es
ist ein anderer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren für die Extraktion
und Isolierung von Phyllanthin ohne eine Verwendung von kanzerogenem
Lösemittel
Benzol, und das frei von Gesundheitsrisiken ist, bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend
betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Extraktion und Isolierung
von Phyllanthin aus P. amarus, umfassend Pulverisierung der trockenen
Blätter,
Mazerierung der pulverisierten Blätter mit Calciumcarbonat in
dem Verhältnis,
das zwischen 19:1 und 7:3 liegt, Perkolation der pulverisierten
Blätter
unter Verwendung einer Mischung organischer Lösemittel, wie hier beschrieben,
in einem Verhält nis,
das zwischen 9:1 und 1:1 liegt, für eine Zeitspanne, die zwischen
10 und 30 h liegt, bei einer Temperatur, die zwischen Raumtemperatur
und 80°C liegt,
gefolgt von einer Entfernung von Lösemitteln durch Destillation,
Präzipitation
von Fetten durch die Kombination von organischen Lösemitteln
und darauffolgende Entfernung von Präzipitaten durch Filtration,
Abtrennung von n-Hexan-Fraktionen und dessen Entfernung im Vakuum,
um einen an Phyllanthin reichen Rückstand zu erhalten, Unterwerfen
des an Phyllanthin reichen Rückstands
einer Kieselgelsäulenchromatographie
für eine
Fraktionierung unter Verwendung von Lösemittel und Lösemittelmischungen
ansteigender Polaritäten,
Vereinigen der entsprechenden, an Phyllanthin reichen Fraktionen
und Kristallisieren von diesem in n-Hexan, Cyclohexan oder Methanol,
um reines Phyllanthin zu erhalten.
In
einer Ausführungsform
der Erfindung kann das für
eine Perkolation verwendete organische Lösemittel Hexan, Chloroform,
Ethylacetat, Ethanol, Methanol oder Toluol in unterschiedlicher
binärer Kombination
sein.
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist das für
eine Perkolation ausgewählte
Lösemittel
eine Kombination von n-Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 2:1.
In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird die Entfernung von Fetten mit einer Mischung
von n-Hexan und Methanol in einem Verhältnis von 2:1 bis 1:2 ausgeführt.
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird bei der Säulenchromatographie
n-Hexan als mobile Phase verwendet.
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wurde eine Lösemittelmischung
ansteigender Polaritäten,
wie 1 bis 50% Ethylacetat in n-Hexan, für eine Säulenchromatographie verwendet.
In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung erfolgt eine Lösemittelentfernung
durch Vakuumdestillation.
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird der n-Hexan-Anteil
von Methanol durch Verteilen abgetrennt.
In
noch einer anderen Ausführungsform
der Erfindung liegt die Extraktionstemperatur zwischen 25°C und 80°C.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
Das
Verfahren der Erfindung ermöglicht
die Extraktion und Isolierung von Phyllanthin aus einer reichen
natürlichen
Quelle, wie P. amarus, durch ein Mehrschrittverfahren. Die trockenen
Blätter
der Pflanze werden zuerst pulverisiert. Die pulverisierten Blätter werden
dann mit Calciumcarbonat in einem Verhältnis, das zwischen 19:1 und
7:3 liegt, mazeriert. Die mazerierten Blätter werden mit einer Mischung
von organischen Lösemitteln,
wie n-Hexan und Ethylacetat, in einem Verhältnis, das zwischen 9:1 und
1:1 liegt, 10 bis 30 h perkoliert, wobei die Extraktionstemperatur
zwischen Raumtemperatur und 80°C
liegt.
Die
Lösemittel
werden durch Destillation entfernt und die Fette durch eine Kombination
von organischen Lösemitteln,
wie n-Hexan und
Methanol, vorzugsweise in einem Verhältnis von 2:1 bis 1:2 präzipitiert,
gefolgt von einer Entfernung der Präzipitate durch Filtration.
Die n-Hexan-Fraktionen werden abgetrennt und im Vakuum entfernt,
wodurch ein an Phyllanthin reicher Rückstand erhalten wird. Der Rückstand
wird einer Kieselgelsäulenchromatographie
für eine
Fraktionierung unter Verwendung von Lösemittel und Lösemittelmischungen
ansteigender Polaritäten
unterworfen. Die entsprechenden, an Phyllanthin reichen Fraktionen
werden dann vereinigt und in n-Hexan, Cyclo hexan oder Methanol kristallisiert,
um reines Phyllanthin zu erhalten.
Die
für den
Perkolationsschritt verwendeten organischen Lösemittel sind binäre Kombinationen von
einem oder mehreren herkömmlichen
organischen Lösemitteln,
wie Hexan, Chloroform, Ethylacetat, Ethanol, Methanol oder Toluol.
Die Lösemittel werden
in einem Verhältnis
von 9:1 bis 1:1 verwendet. Die Entfernung von Fetten wurde mit einer
Mischung von zwei organischen Lösemitteln,
wie n-Hexan und Methanol, in einem von denen Fett begrenzt löslich war,
ausgeführt.
Das bevorzugte Verhältnis der
Lösemittel
für den
Schritt der Fettentfernung ist 2:1 bis 1:2.
Während einer
Säulenchromatographie
umfaßt
die mobile Phase n-Hexan
und Lösemittelmischung
ansteigender Polaritäten,
wie 1% bis 50% Ethylacetat in n-Hexan.
Das
Verfahren der Erfindung erfolgt vorzugsweise durch folgende Schritte,
wie sie detailliert nachfolgend erläutert werden:
- 1. Mahlen der Blätter
von P. amarus zu Pulver.
- 2. Pulverisierte Blätter
wurden mit Calciumcarbonat gemischt (5% bis 30% pulverisierte Blätter).
- 3. Extraktion der pulverisierten Blätter durch Perkolation unter
Verwendung einer Mischung von organischen Lösemitteln, wie n-Hexan-Ethylacetat
9:1 bis 1:1, für
10 bis 30 h.
- 4. Temperatur von Extraktionen liegen zwischen Raumtemperatur
und 80°C.
- 5. Entfernung des Lösemittels
durch Vakuumdestillation bis zu erhaltenem lösemittelfreiem Extrakt.
- 6. Entfernung von Fetten durch Präzipitation mit Mischung von
Lösemitteln,
wie n-Hexan-Methanol (2:1).
- 7. Abtrennung von n-Hexan-Anteil von Methanol durch Verteilung.
- 8. Entfernung von n-Hexan durch Destillation, um einen an Phyllanthin
reichen Rückstand
zu erhalten.
- 9. Abtrennung von Phyllanthin von dem Rückstand durch Säulenchromatographie
unter Verwendung von Kieselgel (stationäre Phase) und n-Hexan (mobile
Phase). Die Polarität
wurde durch nacheinander erfolgendes Hinzufügen von 1%, 1,5%, 2%, 2,5%,
3%, 5%, 7,5%, 10%, 20%, 30% und 50% Ethylacetat in n-Hexan erhöht.
- 10. Fraktionen entsprechend Phyllanthin (überwacht durch Dünnschichtchromatographie)
wurden vereinigt und die organischen Lösemittel wurden durch Vakuumdestillation
entfernt. Organische Lösemittel,
wie Hexan und Methanol, wurden für
eine Kristallisation von Phyllanthin verwendet.
Blätter von
P. amarus (500 g) wurden pulverisiert und in 3 l Mischung von Lösemitteln
[Ethylacetat-n-Hexan (3:1)] bei Raumtemperatur eingeweicht. Nach
8 h ließ man
das Lösemittel
ablaufen und es wurde unter verringertem Druck destilliert. Das
rückgewonnene
Lösemittel
kann zweimal nacheinander für
ein Siphonieren des restlichen Pflanzenmaterials wiederverwendet
werden. Der nach Entfernung von Lösemitteln so erhaltene vereinigte
Rückstand
wurde durch Zugabe von 50% Methanol (300 ml) verdünnt und
dann abfiltriert. Er wurde dann nacheinander einer Verteilung mit
n-Hexan und Ethylacetat unterworfen. Der halbfeste Rückstand
von n-Hexan-Extrakt bestand aus Phyllanthin (13 g). Der Rückstand
wurde dann einer Chromatographie über Kieselgel (260 g) unter
Verwendung von n-Hexan unterworfen. Die Polarität von Elutionsmitteln wurde
durch nacheinan der erfolgendes Hinzufügen von 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%,
5%, 7,5%, 10%, 20%, 30% und 50% Ethylacetat in n-Hexan erhöht. Phyllanthin
entsprechende Fraktionen (überwacht
durch Dünnschichtchromatographie)
wurden vereinigt, um einen Feststoff zu erhalten, der in Methanol
kristallisiert wurde, wodurch man weiße Nadeln von reinem Phyllanthin
(0,48%) erhielt.
Blätter von
P. amarus (100 g) wurden pulverisiert und in 500 ml n-Hexan-Ethylacetat
im Verhältnis
1:1 bei Raumtemperatur eingeweicht. Nach 10 h ließ man das
Lösemittel
ablaufen und es wurde unter verringertem Druck destilliert. Das
rückgewonnene Lösemittel
wurde weitere zwei Mal für
ein Siphonieren des restlichen Pflanzenmaterials wiederverwendet.
Der nach Entfernung von Lösemitteln
so erhaltene vereinigte Rückstand
wurde durch Zugabe von 300 ml 70% Methanol verdünnt und dann abfiltriert. Er
wurde dann nacheinander einer Verteilung mit n-Hexan und Ethylacetat
unterworfen. Der halbfeste Rückstand
(5 g) von n-Hexan-Extrakt bestand aus Phyllanthin. Der Rückstand
wurde dann einer Chromatographie über Kieselgel (150 g) unter
Verwendung von n-Hexan unterworfen. Die Polarität von Elutionsmitteln wurde
durch nacheinander erfolgendes Hinzufügen von 1%, 1,5%, 2%, 2,5%,
3%, 5%, 7,5%, 10%, 20%, 30% und 50% Ethylacetat in n-Hexan erhöht. Phyllanthin
entsprechende Fraktionen (überwacht
durch Dünnschichtchromatographie)
wurden vereinigt, um einen Feststoff zu erhalten, der in Cyclohexan
kristallisiert wurde, wodurch man weiße Nadeln von reinem Phyllanthin
(0,49%) erhielt.
Blätter von
P. amarus (500 g) wurden mit 50 g Calciumcarbonat mazeriert und
6 h aufbewahrt. Es wurde dann in 3 l einer Kombination von Lösemitteln [n-Hexan-EtOAc
(2:1)] bei 60°–80°C 10 h perkoliert. Extrakt
wurde konzentriert, um rohen Rückstand
(25 g) frei von organischen Lösemitteln
zu erhalten. Der Rohextrakt wurde in 100 ml n-Hexan-Methanol (2:1) gelöst und Rückstand
abfiltriert. Rückstand
wurde mit 30 ml n-Hexan gewaschen. Der n-Hexan-Anteil wurde abdestilliert,
wodurch man einen Halbfeststoff erhielt. Der Halbfeststoff (10 g)
wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel
(300 g, stationäre Phase)
unter Verwendung von n-Hexan, Ethylacetat und deren Mischung (mobile
Phase) in der Reihenfolge ansteigender Polaritäten gereinigt. Die Polarität von Elutionsmitteln
wurde durch nacheinander erfolgendes Hinzufügen von 1%, 1,5%, 2%, 2,5%,
3%, 5%, 7,5%, 10%, 20%, 30% und 50% Ethylacetat in n-Hexan erhöht. Phyllanthin
entsprechende Fraktionen (überwacht
durch Dünnschichtchromatographie) wurden
vereinigt, wodurch man einen Feststoff erhielt, der in n-Hexan kristallisiert
wurde, wodurch man farblose Nadeln von reinem Phyllanthin erhielt (0,6%).
