DE2515670C2 - Verfahren zum Isolieren von Substanzen mit uteroevakuierender Wirkung aus der Zoapatl-Pflanze und diese Substanzen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

Unter Wirkstoffen mit uteroevakuierender Wirkung sind solche zu verstehen, die eine Uteruskontrakticin bei Warmblütern oder eine Austreibung des Uterusinhalts hervorrufen. Derartige Mittel werden im allgemeinen zur Herbeiführung von Monatsblutungen, zur Austreibung einer Blasenmole, Austreibung oder Resorption eines Fetus und Herbeiführung eines Aborts oder von verspäteten Wehen verwendet Außerdem werden diese Mittel dann eingesetzt, wenn der Uterusinhalt, wie Fetus oder Plazenta, entleert werden soll. s

Die Zoapatl-Pflanze ist ein in Mexiko wildwachsender Busch mit etwa 2 m Höhe. Botanisch wird sie als Montanoa tomentosa nach Cervantes, Familie Compositae, Klasse Heliantheae bezeichnet Eine andere Varietät hat die Bezeichnung Montanoa floribunda. Die Pflanze ist in Las Plantas Medicinales de Mexico, 3. Auflage, Udiciones Botas, 1944, näher beschrieben.

Seit Jahrhunderten wird diese Pflanze in Form eines Tees oder in Form anderer, wäßriger, roher Zubereitungen zur Auslösung von Wehen oder von Monatsblutungen verwendet. Diese Verwendung ist zwar in der Literatur beschrieben, es wurden jedoch bisher keine näheren chemischen oder pharmakologischen Untersuchungen darüber durchgeführt Die wenigen Angaben, die sich in der Literatur finden, widersprechen sich zudem in ihren Ergebnissen.

Gegenwärtig wird die Zoapatl-Pflanze von Frauen, insbesondere der einheimischen Bevölkerung in Mexiko, dann angewendet, wenn die Monatsblutung ausbleibt oder Verdacht auf Schwangerschaft besteht Dazu wird aus den Blättern der Pflanze durch Kochen mit Wasser ein bitter schmeckender Tee gebraut, der dann getrunken wird. Es ist bekannt, daß viele tatsächlich schwangere Frauen diesen Tee einnehmen, um eine unerwünschte Schwangerschaft zu beenden.

Dieser Tee enthält offensichtlich ein Gemisch aus den verschiedensten Wirkstoffen, von denen viele uaerwünscht und zur Herbeiführung der gewünschten Wirkung auch unnötig sind. Im allgemeinen ist die Zusammensetzung von natürlichen, pflanzlichen Substanzen sehr komplex. Es finden sich viele Verbindungen mit ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften sowie auch Verbindungen mit vollkommen anderen Eigenschaften. Daher bereitet die Abtrennung und Identifizierung der einzelnen Wirkstoffe große Schwierigkeiten. Bisher wurde kein Verfahren zur Isolierung der Wirkstoffe aus der Zoapatl-Pflanze beschrieben.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Isolieren von uteroevaUiierenden Substanzen aus der Zoapatl-Pflanze zu schaffen. Eine weitere Aufgabe ist es, Arzneimittel zur Verfugung zu stellen, die diese Substanzen enthalten. Diese Aufgaoen werden durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit die in den Ansprüchen 1,4 und 13 gekennzeichneten Gegenstände. Die Ansprüche 2,3 und 5 bis 12 betreffen bevonmgte Ausgestaltung«" des Verfahrens.

Erfindungsgemäß werden Pflanzenteile, insbesondere die Blätter, die die uteroevakuierenden Wirkstoffe enthalten, folgendermaßen behandelt (Verfahren A):

(a) Wäßrige Extraktion der Blätter und anschließende Extraktion der erhaltenen wäßrigen Phase mit einem organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel oder

(b) Extraktion der Blätter mit einem organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel und anschließende wäßrige Extraktion der erhaltenen organischen Phase.

Bevorzugt wird das vorstehend mit (a) bezeichnete Verfahren angewendet.

Es werden vorzugsweise folgende, mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel verwendet: niedere aliphatische Ester, wie Essigsäuremethylester, Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester sowie Ester mit einer längeren Kohlenstoffkette, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Methylenchlorid, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol, und höhere, mit Wasser nicht mischbare aliphatische Alkohole, wie Butanol und Pentanol. Bei diesem Verfahren spielt die Extraktion mit Wasser eine wesentliche Rolle. Diese wäßrige Extraktion läßt sich jedoch auch mit Erfolg mit einem Gemisch aus Wasser und mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln durchführen. Beispielsweise können Gemische aus Wasser und Äthanol oder Methanol zu diesem Zweck verwendet werden. Ferner ergibt sich aus der folgenden Beschreibung, daß man bei Anwendung von verschiedenen zwischengeschalteten Verfahrensstufen zu guten Ergebnissen gelangt.

Eine Menge in der Größenordnung von 3,5 kg von Zoapatl-Blättern, entweder in getrocknetem oder frischem Zustand, wird mit kaltem Wasser gewaschen. Gegebenenfall: können die Blätter vor der Extraktion zerkleinert werden. Sodann wird mit Wasser, vorzugsweise heißem Wasser, oder einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Extraktion mit Wasser wird zweckmäßig bei Temperaturen von 25 bis HXl⁰C, vorzugsweise durch mindestens I Ominütiges Kochen durchgeführt. Extraktionszeiten von mehr als 2 Stunden sind nicht notwendig und unwirtschaftlich. Nach dem Abtrennen vom pflanzlichen Rückstand erhält man die wäßrige Phase in Form einer dunkel gefärbten Lösung.

Diese Lösung wird dann, wie oben ausgeführt, der Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel unterworfen. Inder Praxis wird vorzugsweise das Volumen des dazu verwendeten organischen Lösungsmittels so gewählt, daß es dem Volumen der wäßrigen Phase entspricht. Diese Extraktionsstufe wird zweckmäßigerweise bei Temperaturen, die geringfügig oberhalb der Raumtemperatur liegen, bis zum Siedepunkt des jeweiligen Lösungs- mittels durehgeführl. Vorzugsweise extrahiert man beim Siedepunkt des Lösungsmittels.

Die Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel wird so lange fortgesetzt, bis die entsprechende Menge des gewünschten Materials erhalten ist. Üblicherweise wird 1 bis 2 Stundein extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt und zur Trockene eingedampft, vorzugsweise unter vermindertem Druck bei Temperaturen von 30 bis 80⁰C.

Wie bereits erwähnt, kann die Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel vor der wäßrigen Extraktion durchgeführt werden. In diesem Fall gelten die vorgenannten Bedingungen für die einzelnen Extraktionsstufen sowohl für die Extraktion von Blättern wie auch die Extraktion von Blattextrakten. Außerdem kann das nach

der zweifachen Extraktion erhaltene Material zur Verbesserung seiner Qualität mit entsprechenden Lösungsmitteln weiterbehandelt werden. Diese Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in den Beispielen, insbesondere in Ssispie! I, erläutert.

Nach dem vorgenannten Verfahren erhält man einen Extrakt mit uteroevakuierender Wirkung, dessen Gehalt an Verunreinigungen im Vergleich zum Ausgangsmaterial wesentlich geringer ist.

Die Anwesenheit von Wirkstoffen mit uteroevakuierender Wirkung läßt sich an weiblichen Versuchstieiren anhand von Uteruskontraktionen und Aborten bzw. Beendigung der Trächtigkeit feststellen. Bei Durchführung dieser Versuche mit rohen Extrakten lassen sich Uteruskontraktionen bei Verwendung von etwa 150 bis 500 mg Extrakt/kg nachweisen. Bei trächtigen Meerschweinchen wird eine Beendigung der Trächtigkeit beobachtet,

ίο wenn der rohe Extrakt in Dosen von 300 bis 500 mg/kg verabfolgt wird.

Das gemäß dem Extraktionsverfahren A erhaltene Produkt enthält zwar die gewünschten Wirkstoffe und besitzt wertvolle biologische Eigenschaften, weist aber daneben immer noch unerwünschte Stoffe auf, die zur Erzielung der gewünschten Wirkung nicht nötig sind. Dieser Extrakt kann nach dem folgenden Verfahren B weiter gereinigt werden.

Auf geeignete Weise vorgereinigtes Material, beispielsweise ein durch Extraktion mit Wasser und organischen Lösungsmitteln erhaltener Extrakt, wird als Ausgangsmaterial verwendet. Gemäß einer Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens wird das zu reinigende Material zuerst in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel gelöst Die erhaltene Lösung wird filtriert und zur Lntfemung von wasserlöslichen und sauren Verunreinigungen mit einer wäßrigen Lösung einer schwachen Base gewaschen, beispielsweise mit Natriumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat ader Natriumacetat. Vorzugsweise wird eine gesättigte Lösung dieser Base verwendet. Beispiele für entsprechende organische Lösung mittel sind niedere aliphatische Äther, wie Diäthyläther urd Dibutyläther, niedere aliphatische Ester, wie Essigs? uremethyiester, Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester, Ester mit längeren Kohlenstoffketten, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Methylenchlorid, und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol. Die Lösung kann eingeengt und direkt in die nächste Stufe eingesetzt werden. Eine aidere Möglichkeit besteht darin, das organische Lösungsmittel nach üblichen Verfahren zu entfernen und den Rückstand in einem organischen Lösungsmittel zu lösen und über eine mit einem Adsorptionsmittel beschickte Säule zu geben. Beispiele für entsprechende Lösungsmittel sind Benzol und Toluol. Beispiele für entsprechende Adsorptionsmittel sind Copolymerisate, wie Vinylacetat-Copolymerisate, verschiedene Arten von Kieselgel und Aluminiumoxid. Bevorzugt sind Vinylacetat-Copolymerisate. Im allgemeinen werden einzelne Fraktionen aufgefangen und jeweils dünnschichtchromatographisch auf ihre biologische Aktivität untersucht. Wünscht man ein besonders reines Material zu erhalten, so werden die Fraktionen mit entsprechender Aktivität vereinigt und an einem adsorbierenden Material, wie Kieselgel, Magnesiumsilikatgel oder Aluminiumoxid chromatographiert. Als Elutionsmittel wird ein organisches Lösungsmittel oder ein Gemisch aus organischen Lösungsmitteln verwendet. Beispiele für entsprechende Lösungsmittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol, und niedere aliphatische Ester, wie Essigsäuremethylester, Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester, sowie Gemische dieser Lösungsmittel. Anschließend werden wieder mehrere Fraktionen aufgefangen und dünnschichtchromatographisch auf ihre biologische Aktivität untersucht. Die das gewünschte Material enthaltenden Fraktionen werden vereii :gt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man die gewünschten Substanzen mit uteroevakuierender Wirkung.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, den nach der ursprünglichen Reinigung erhaltenen vorgereinigten Extrakt chromatographisch an Adsorptionsmitteln, wie Kieselsäure, Kieselgel oder Magnesiumsilikatgel, unter Verwendung eines Gemisches aus polaren und nicht-polaren Lösungsmitteln als Elutionsmittel weiter zu reinigen. Als Adsorptionsmittel wird Kieselsäure bevorzugt. Es kann entweder neutrale oder saure Kieselsäure verwendet werden. Bevorzugt ist. lie Verwendung von neutraler Kieselsäure. Das chromatographisch zu reinigende Material wird vorzugsweise zuerst in einem Lösungsmittel, insbesondere in Chloroform gelöst, auf eine mit dem Adsorptionsmittel beschichtete Säule (mit einem entsprechenden Lösungsmittel äquilibriert) aufgesetzt und mit dem Gemisch aus einem polaren und einem nicht-polaren Lösungsmittel cluicrt. Beispiele für polare

Lösungsmittel sir«ri niedere Alkanole, wie Äthanol, Methanol, Propanol, Isopropanol und Butanol, niedere Alkyleste*", wie Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester, und aliphatische Ketone, wie Aceton, Metfoyläthy'keton und MeChylisobutylketon. Beispiele für nicht-polare Lösungsmittel sind chlorierte Kohlenwasserstoffe, wii Chloroform, Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan und aromatische Kohlenwasserstoffe, wi<5 Benzol und Toluol. Bevorzugt wird ein Lösungsinktelgemisch aus Isopropanol und Chloroform. Die aufgefangenen Fraktionen werden bei Temperaturen von Raumtemperatur bis etwa 40⁰C zur Trockene eingedampft. Pie Zusammensetzung der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch oder gaschromatographisch festgestellt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Lösung des rohen Extrakts ohne Entfernung des Lösungsmittels direkt zu chromatographieren. Um eine leichlere Handhabung zu ermöglichen, kann die Lösung vor dem Chromatographieren eingeengt werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das vorgereinigte Ausgangsmaterial durch Flüssigkeitschromatographie unter erhöhtem Druck weiter gereinigt werden. Dazu wird das Ausgangsmaterial zunächst in einem entsprechenden organischen Lösungsmittel gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit einer schwach alkalisch reagierenden Verbindung gewaschen. Sodann wird das Lösungsmittel nach einem üblichen Verfahren entfernt. Dur erhaltene Rückstand wird mit einer geringen Menge des zur Flüssigkeitschromalographie verwendeten Füllmaterials vermischt. Als Adsorptionsmittel können Füllmaterialien, wie v.-rschiedene Arten von Kieselgel, Aluminiumoxid und Polyamidmembranen verwendet werden. Vorzugsweise wird Kieselgel als Füllmaterial verwendet. Das Gemisch aus dem Rückstand und dem Adsorptionsmittel wird sodann in eine präparative Säule gegeben, die zusätzliches Füllmaterial enthält. Sodann wird die Säule mit einem nicht-polaren Lösungsmittel oder

einem Gemisch von nicht-polaren Lösungsmitteln, wie Oioxan, Heptan, Hexan und Pentan, eluiert. Die aufgefangenen Fraktionen werden gaschromatographisch und/oder dünnschichtchromatographisch auf ihre Aktivität untersucht. Die aktiven Fraktionen werden sodann vereinigt. Anschließend wird das Lösungsmittel entfernt. Die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie wird im allgemeinen bei Drücken von 196 bis 343 KPa durchgeführt. Bevorzugt sind Drücke von 235 bis 313 KPa bei Raumtemperatur.

Gemäß den vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren B erhält man Substanzen mit uteroevakuierender Wirkung, in denen sich gaschromatographisch mindestens drei Hauptkomponenten nachweisen lassen. Die uteroevakuierende Wirkung der Gemische läßt sich wiederum an Versuchstieren anhand von Uteruskontraktionen und Aborten bzw. Beendigung der Trächtigkeit feststellen. Bei trächtigen Meerschweinchen tritt eine Beendigung der Trächtigkeit auf, wenn die Gemische in Dosen von etwa 75 bis 100 mg/kg verabfolgt werden. Uterus- kontraktionen lassen sich bei Verwendung der Gemische in Mengen von etwa 2,5 bis 5,0 mg/kg nachweisen.

Verfahren C

Gereinigte Substanzen mit uteroevakuierender Wirkung können aus den vorstehend erhaltenen Extrakten durch zusätzliche Reinigungsschritte auf die nachstehend beschriebene Weise isoliert werden.

Der ursprüngliche Extrakt, aus dem das gereinigte Material mit uteroevakuierender Wirkung erhalten wird, wird über eins Rsihe vo« ExtrskticüE- und P.sinigungsschntt¹;·?? eus d?r 7.n»natl-P{\an7£ her&sstellt. Bei einem Verfahren werden die Blätter zuerst in Wasser suspendiert, wonach das Gemisch einige Stunden auf etwa 98 bis 100⁰C erhitzt wird. Das heiße Gemisch wird filtriert und der feste Rückstand mit heißem Wasser gewaschen. Sodann wird das Gemisch ein zweites Mal filtriert. Die Filtrate werden vereinigt. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden mehrmals mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Nach der Trennung von wäßrigen und nicht-wäßrigen Phasen wird das organische Lösungsmittel nach üblichen Verfahren entfernt. Beispiele für organische Lösungsmittel sind mit Wasser nicht mischbare aliphatische Ester, wie Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Methylenchiorid, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol, und mit Wasser nicht mischbare aliphatische Alkohole, wie Butanol, Pentanol und Hexanol. ' Bevorzugt wird Essigsäureäthylester. Der nach dem Entfernen des organischen Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird mehrmals mit einem heißen organischen Lösungsmittel, wie Benzol oder Toluol, extrahiert. Sodann wird das Lösungsmittel wiederum entfernt und der Rückstand mehrmals mit einem he^:3en organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit Hexan, unter Rücknußbedingungen gewaschen. In einem zusätzlichen Reinigungsschritt kann der auf diese Weise erhaltene Rückstand in einem Lösungsmittel, wie Aceton, gelöst und anschließend mit einem Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, gerührt werden. Der nach dem Abfiltrieren und Entfernen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird als Ausgangsmaterial zur Herstellung der erfindungsgemäßen gereinigten Präparate mit uteroevakuierender Wirkung verwendet. Die erfindungsgemäßen gereinig- ten Substanzen mit uteroevakuierender Wirkung erhält man, indem man den gemäß Verfahren A erhaltenen rohen Extrakt in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel löst, die erhaltene Lösung filtriert und das FiItrat zur Entfernung von wasserlöslichen und sauren Verunreinigungen mit einer wäßrigen Lösung einer schwachen Base, wie Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat, wäscht. Vorzugsweise wird als Waschflüssigkeit eine gesättigte Lösung einer Base verwendet. Entsprechende organische Lösungsmittel sind niedere aliphatische Äther, wie Diäthyläther, Di-n-propyläther, Diisopropyläther, Methyl-n-butyläther, Äthyl-n-butyläther und Dibutyläther, niedere aliphatische Ester, wie Essigsäuremethylester, Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester und Propionsäureäthylester, Ester mit längeren Kohlenstoffketten, wie Essigsäureamylester und Essigsäurehexylester, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Methylenchlorid, und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Ben- zol, Toluol und Xylol.

Die organischen Lösungsmittel werden nach üblichen Verfahren, vorzugsweise unter vermindertem Druck, entfernt. Der auf diese Weise erhaltene vorgereinigte Extrakt wird chromatographisch an Adsorptionsmitteln, wie Kieselsäure, Kieseigel oder Magnesiumsilikatgel unter Verwendung eines Gemisches aus polaren und nichtpolaren Lösungsmitteln als Elutionsmittel weiter gereinigt. Als Adsorptionsmittel wird Kieselsäure bevorzug, so Es kann entweder neutrale oder saure Kieselsäure verwendet werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von neutraler Kieselsaure. Das zu chrorrsatcgraphierer.de Materia! wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel, wie Chloroform, gelöst. Die Lösung wird auf eine mit dem Adsorptionsmittel beschickte Säule (mit einem entsprechenden Lösungsmittel äquilibriert) aufgesetzt. Sodann wird mit einem Gemisch aus einem polaren und einem nicht-polaren Lösungsmitte! eluiert. Beispiele für polare Lösungsmittel sind niedere Alkenole, wie Äthanol, Methanol, Propanol, lsopropanol und Butanol, niedere Alkylester, wie Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester, und aliphatische Ketone, wie Aceton, Methylethylketon und Methylisobutylketon. Beispiele für nicht-polare Lösungsmittel sind chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylenchlorid und Tetrachlorkohlenstoff, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan, und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol. Bevorzugt wird ein Gemisch aus lsopropanol und Chloroform. Die aufgefangenen Fraktionen werden bei Temperaturen von Raumtemperatur bis etwa 40⁰C zur Trockene eingedampft Die Zusammensetzung der aufgefangenen Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch oder gaschromatographisch festgestellt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Lösung des rohen Extrakts direkt ohne Entfernung des Lösungsmittels zu chromatographieren. Die Lösung kann einfachheitshalber vor dem Chromatographieschritt eingedampft werden.

Durch dieses Reinigungsverfahren erhält man ein Material mit uteroevakuierender Wirkung, das gemäß gaschromatographischer Analyse aus einem Gemisch von mindestens drei Hauptbestandteilen besteht. Die Anwesenheit von Wirkstoffen mit uteroevakuierender Wirkung in diesem Gemisch wird an weiblichen Versuchs-

tieren an Hand von Uteruskontraktionen und Aborten bzw. Beendigung der Trächtigkeit festgestellt. Bei trächli- ;"JJ

gen Meerschweinchen tritt eine Beendigung der Trächtigkeit auf, wenn das Gemisch in Dosen von 75 bis %\

100 mg/kg verabfolgt wird. Wird das Gemisch in Mengen von etwa 2.5 bis 5,0 mg/kg verwendet, so lassen sich ^;;

Uteruskontraktionen feststellen. ;.

Die Fraktionen mit uterocvakuiercnder Aktivität werden vereinigt und säulenchromatographiseh in einem jgj

polymeren Gel, das in organischen Lösungsmitteln quellende organische Polymerisate enthält, behandelt. Bei- fj

spiele für entsprechende Polymerisate sind Vinylacetat-Copolymerisate, vernetzte Dextrane und Polystyrol-OrIe. Beispiele für Lösungsmittel sind Benzol, Toluol, Tetrahydrofuran und Cyclohexan. Als Polymerisat wird voi'zugsweise ein Vinylacetat-Copolymerisat verwendet. Die Säule wird mit einem organischen Lösungsmittel eluiert, vorzugsweise mit einem Lösungsmittel, in dem sich der Rückstand löst. Sodann wird eine Anzahl von Fraktionen aufgefangen. Die Zusammensetzung der Fraktionen wird gaschromatographisch oder dünnschichtchromatographisch festgestellt. Nach dem vorgenannten Verfahren erhält man mindestens zwei chemisch voneinander verschiedene Verbindungen mit uteroevakuierender Wirkung, wie sich gaschromatographisch und spektralanalytisch feststellen läßt. Die uteroevakuierende Wirkung der isolierten Substanzen wird festgestellt, indem man an weiblichen Testtieren das Ausmaß an Uteruskontraktionen und die Neigung zur Beendigung der Trächtigkeit mißt. Gegebenenfalls können kleinere Mengen an Verunreinigungen aus den gereinigten Verbindungen durch weitere Chromatographie an Adsorptionsmitteln, wie Kieselsäure oder Florisil, entfernt werden. Die Säule wird mit einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch, vorzugsweise einem Gemisch aus Chloroform und «äopropanc!, ciuicri. Die Zusammensetzung der aufgefangenen Fraktionen «ird -·

dünnschichtchromatographisch festgestellt. Die gereinigten Verbindungen mit uteroevakuierender Wirkung ρ

sind bei Verabfolgung in Dosen von 1,0 mg bis etwa 100 mg/kg wirksam. Die jeweilige Dosis hängt von der Spe- ?5j

zies ab, an die die Verbindungen verabfolgt werden.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, enthaltend nach dem crfindungsgemäßcn Verfahren hergestellte ß,

Substanzen mit uteroevakuierender Wirkung und übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel und/oder / >

Hilfsstoffe. kl

Beispielsweise können die Arzneimittel in Form von Lösungen, Suspensionen oder festen Verabreichungsfor- '*$

men vorliegen. ,·<)

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Kl

h

Extraktion von Blättern mit einem organischen Lösungsmittel

und anschließende Extraktion der organischen Phase mit Wasser

2,0 kg trockene Blätter werden 1 Stunde in CHCl₃ unter Rückfluß erwärmt. Nach dem Abfiltrieren wird der Chloroformextrakt bei Temperaturen von 35 bis 50°C unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 196 g einer dunklen halbfesten Masse. Dieser Rückstand wird mit einem heißen Gemisch aus Äthanol und Wasser (1 : 2) extrahiert. Die wäßrige Äthanolphase wird mit CHCl₃ extrahiert und die CHCI₃-Phase abgetrennt und unter vermindertem Druck zu einem gelbbraunen Sirup eingedampft. Dieser Sirup wird in Diäthyläther gelöst. Die Lösung wird mit wäßriger, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung, 5prozentiger wäßriger Natriumhydroxidlösung und Wassergewaschen und sodann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdampfen des Diäthyläthers erhält man 11,9 g rohen Extrakt in Form eines gelben Öls.

Beispiel 2
50

Extraktion der Blätter mit Wasser und anschließende Extraktion der wäßrigen Phase mit einem organischen Lösungsmittel

634 g trockene Blätter werden 1 Stunde mit 4,0 Liter Wasser unter Rückfluß erwärmt. Der Extrakt wird abdekantiert und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformphase wird getrocknet und abfiltriert. Sodann wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Man erhält 4,55 g einer halbfesten Masse. Die wäßrige Phase wird mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die erhaltene organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 1,99 g Rückstand. Die aus dem Chloroform- und dem Essigsäureäthylesterextrakt erhaltenen Rückstände werden vereinigt und bilden zusammen den rohen Extrakt.

Beispiel 3

Extraktion der Blätter mit Wasser und anschließende Extraktion der wäßrigen Phase mit Essigsäureäthylester

140 g trockene Zoapatl-Blätter werden 1 Stunde in 2,5 Liter Wasser unter Rückfluß erwärmt. Der wäßrige Extrakt wird hierauf auf ein Gesamtvolumen von 250 ml eingeengt und viermal mit je 750 ml Essigsäureäthyl-

Verfahren A q

Beispiel 1 |'j

ester extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und über wasserfreiem Na..iumsullat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man 1,3 g einer dunkel gefarbten Masse. Diese Masse wird mit 100 ml Chloroform extrahiert. Sodann wird abfiltriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 0,840 g rohen Rückstand.

BeispieU

Extraktion der Blätter mit Hexan

966 g trockene Zoapatl-Blätter werden 3 Stunden mit so viel Hexan, daß die Blätter vollkommen bedeckt sind, unter Rückfluß erwärmt. Nach dem Abfiltrieren und Eindampfen der erhaltenen Flüssigkeit zur Trockene, wie oben beschrieben, erhält man 56,8 B eines dunkelgrünen, rohen Extrakts.

Beispiel 5

Extraktion mit Hexan, anschließende F.xtraktion der organischen Phase mit Wasser
und anschließende Extraktion der wäßrigen Phase mit Essigsäureäthylester

350 g trockene Zoapatl-Blätter werden mit Hexan bedeckt. Dieses Gemisch wird unter Rühren 15 bis 20 Minuten bis zum Sieden erwärmt. Sodann wird der Hexanextrakt abdekantiert, filtriert und mit einem gleich großen Volumen Wasser (etwa 700 ml) behandelt. Die Phasen werden abgetrennt. Die Hexanphase wird wiederum unter Rühren mit einem gleichen Volumen Wasser behandelt. Nach der Abtrennung der Phasen wird die Hexanphase nochmals auf die gleiche Weise mit Wasser behandelt. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt und dreimal mit einem gleichen Volumen Essigsäureäthylester extrahiert. Die Essigsäureäthylesterextrakte werden vereinigt und zurTrockene eingedampft. Man erhält 6,6 g rohen Extrakt in Form eines bräunlich-gelben Sirups.

B e i s ρ i e I 6

Extraktion der Blätter mit Wasser und anschließende Extraktion
des aktiven Materials mit Benzol

1 kg getrocknete Zoapatl-Blätter werden 3 Stunden mit 15 ml Wasser unter Rückfluß erwärmt (585 Torr/92°C). Die wäßrige Phase wird abdekantiert und durch Gaze filtriert. Anschließend behandelt man mit etwa 700 g Aktivkohle, bis eine Ausflockung eintritt. Das Gemisch wird hierauf 2 Stunden gerührt und unter vermindertem Druck rasch abfiltriert, wobei ein klares Filtrat entsteht. Der abfiltrierte Feststoff wird 3 Tage bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet und anschließend in 3 Liter Benzol suspendiert. Durch Abdestillieren von Benzol werden etwa 200 ml Wasser entfernt. Man erhält eine Benzolphase, die, wie vorstehend beschrieben, unte- vermindertem Druck zurTrockene eingedampft wird. Man erhält 3 g rohen Extrakt in Form eines Öls.

Beispiel 7

Extraktion der Blätter mit Wasser und anschließende Extraktion
der wäßrigen Phase mit Essigsäureäthylester

2 kg frische Zoapatl-Blätter werden mit Wasser bedeckt (10 bis 12 Liter Wasser) und 1 Stunde gekocht, so Anschließend wird das noch heiße Gemisch durch ein Käsetuch filtriert. Sodann läßt man abkühlen und extrahiert den wäßrigen Anteil zweimal mit je 2 Volumina Essigsäureäthylester. Die Essigsäureäthylesterlösung wird sodann unter vermindertem Druck bei 50⁰C zur Trockene eingedampft. Man erhält 12 g einer dunkelgrünen Masse. Diese Masse wird mit 500 ml Benzol behandelt und etwa 15 Minuten bis zum Sieden erwärmt. Die Benzolphase wird abdekantiert und eier Rückstand so lange mit Benzol gewaschen, bis kein weiteres Material mehr extrahiert wird. Die Benzolextrakte werden vereinigt und bei 50⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Die erhaltene bräunliche Masse wird nacheinander gemäß dem vorstehend für Benzol beschriebenen Verfahren mit getrennten Mengen Hexan extrahiert, bis der Hexanextrakt farblos wird. Man erhält etwa 8 g Rückstand in Form eines dicken Sirups. Dieses Material wird sodann in Aceton (100 ml oder weniger) gelöst, und 5 g Aktivkohle (Darco) werden zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, bis die Aktivkohle ausflockt. Sodann wird das Gemisch abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck und geringem Erwärmen (30⁰C) eingedampft. Man erhält 4 bis 6 g rohen Extrakt.

Verfahren B
Beispiel 8

4,33 g des gemäß Beispiel 7 erhaltenen rchen Extrakts werden in 500 ml Diäthyläthcr gelöst. Die erhaltene Lösung wird filtriert und mit 50 ml einer gesättigten Natriumhydrogcncarbonatlösung gewaschen. Der Diätny I-äther wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abfiltrierl und zur Trockene eingedampft. Man erhall 3,4 g eines hellgelben Öls. Dieses gelbe Öl wird sodann in 50 ml Benzol gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 2 kg OR-PVA-Merck-O-Gel 2000 (Vinylacetat-Copolymcrisat, das in organischen Lösungsmitteln quillt) beschickte

ίο Säule der Abmessungen 2 m x 10 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit Benzol eluiert. Folgende Fraktionen werden aufgefangen und zur Trockene eingedampft.

Fraktion Volumen (Liier) Rückstand (g)

1 5,1 0,320

2 3,1 0,305

3 5,3 1,1

4 4,3 0,440

Das aus Fraktion Nr. 3 erhaltene Material (1,1 g) wird in 10 ml Benzol gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 60 g Kieselgel beschickte Säule der Abmessungen 1 m x 2 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit einem Gemisch aus Benzol und Essigsäureäthylester (4 : 1) eluiert. Nach dem Abnehmen von 25 Fraktionen vonjeweils 125 ml Volumen geht man auf ein Mischungsverhältnis von Benzol zu Essigsäureäthylester im Elutionsmittel von 1 : 1 über. Das gewünschte Material wird in den Fraktionen 28 bis 31 aufgefangen, wie sich dünnschichtchromatographisch feststellen läßt. Aus Fraktion 28 erhält man nach dem Entfernen des Lösungsmittels 0,046 g halb gereinigtes Material. Die Fraktionen 29 bis 31 (0,350 g) werden in Chloroform gelöst. Der Rückstand wird auf fünf präparative Dünnschichtplptten aufgesetzt. Die Platten werden sechsmal mit Benzol und dreimal mit einem Gemisch aus Benzol und Essigsäureäthylester (4 : 1) entwickelt. Die Hauptbande wird abgetrennt und mit Essigsäureäthylester eluiert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man ein halbgercinigtes Material.

Beispiel 9

■4,5 g des gemäß Beispiel 7 erhaltenen rohen Extrakts werden in 50 mi Diäthyläther gelöst. Die erhaltene Lösung wird abfiltriert und mit 50 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die Diäthyiätherlösung wird anschließend über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Man erhält 3,6 g Rückstand, der in 25 ml Chloroform gelöst wird. Diese Lösung wird auf eine mit 200 g neutralem Kieselgel (mit Chloroform äquilibriert) beschickte Säule der Abmessungen 40 mm (Innendurchmesser) und 40,6 cm (Höhe) aufgesetzt. Die Säule wird mit Chloroform und Gemischen aus Chloroform und Isopropanol eluiert. Es werden Fraktionen vonjeweils 25 ml abgenommen. Jeweils fünf dieser Fraktionen werden zu größeren Fraktionen mit einem Volumen von 125 ml vereinigt. Etwa 75 Fraktionen von einem Volumen von 125 ml werden aufgefangen und bei Temperaturen unter 40⁰C unter vermindertem Druck zurTrockene eingedampft. Die ^.ution wird folgendermaßen durchgeführt:

Fraktionen (125 ml)

1-18	CHCl3
19-30	Isopropanol : CHCl3 (1 :99)
31-44	Isopropanol : CHCI3 (1 :49)
45-51	Isopropanol : CHCl3 (3 :97)
52-66	Isopropanoi : CHCl, (1 : 24)
67-75	Isopropanol : CHCl, (1 :19)

Die Fraktionen werden gemäß Beispiel 8 dünnschichtchromatographisch untersucht. Aufgrund der dünnschichtchromatographischen Ergebnisse werden die Fraktionen Nr. 49 bis 66 vereinigt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man 0,725 g öligen Rückstand.

Dieser Rückstand wird an präparativen Kieselgel-Dünnschichtplatten weiter gereinigt. Als Laufmittel wird ein Gemisch aus Isopropanol und Chloroform (2 :23) verwendet Die Hauptbande wird mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (1:3) eluiert. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels erhält man 540 mg Rückstand. 400 mg dieses Materials werden auf ähnliche Weise chromatographiert, Man erhält 268 mg halb-gereinigtes Material in Form eines Öls.

Beispiel 10

1 g des gemäß Beispiel 7 erhaltenen rohen Extrakts wird in einem 15 ml fassenden Reagensglas vorsichtig mit 5 ml Diäthylälher vermischt. Die erhaltene Lösung wird I Minute mit 2 ml Natriumhydrogcncarbonatlösung

vermischt. Das Gemisch wird zentrifugiert und der Diäthyläther entfernt. Die Hydrogcncarbonatlösung wird zweimal mit je 2 ml Diäthyiüthcr gewaschen. Die Ätherextrakte werden vereinigt. Das Lösungsmittel wird abgedampft. Der trockene Rückstand wird mit einer geringen Menge Pellcsil* (Kissclgel-Füllmalerial zur Flüssigchromatügraphic/ vermischt Das Gemisch wird in das vordere Ende einer präparativen Säule der Abmessungen 122 cm x 9,5 mm, die Pellosil enthält, eingeführt. Die so gepackte Säule wird in einen Flüssigkeitschroma- 5 tographen (du Pont 830) eingesetzt. Sodann wird die Säule bei einem Druck von 274 KPa mit einem Gradienten |

von 2,5% Dioxan in Hexan bis 7,5% Dioxan in Hexan eSuiert Dabei wird die Säule 30 Minuten mit 2,5% Dioxan 1

in Hexan, 30 Minuten mit 5,0% Dioxan in Hexan und 30 Minuten mit 7,5% Dioxan in Hexan eluiert Die auf- ff

gefangenen Fraktionen (Nachweis des gewünschten Materials durch UV-Chromophormessung bei 254 nm) U

werden gaschromatographisch und dünnschichtchromatographisch untersucht Die während der letzten io ^

20 Minuten der Elution mit 74% Dioxan in Hexan aufgefangene Fraktion wird bei 50⁰C unter Stickstoff zur S?

Trockene eingedampft. Man erhält ein halb-gereinigtes Material. 1 Verfahren C 15 ⁵| Herstellung des Ausgangsmaierials ■:'■ Eis mit einem mit Dampf beheizten Heizmante! versehener Tank aus korrosionsbeständigem Stahl mit einem #; Fassungsvermögen von 380 Liter wird mit 10 kg Zoapatl-BIättern und 114 Liter Wasser beschielet. Das Gemisch 20 · S

wird 2¹A Stunden auf98 bis 100⁰C erwärmt und daoei von Zeit zu Zeit gerührt. Das noch heiße Gsmisch wird kl durch Gaze filtriert, wobei etwa 95 Liter eines klaren, dunklen Tees erhalten werden. Der feste Rückstand im

Tank wird mit 15 Liter heißem Wasser gewaschen. Sodann wird abfiltriert und das FiItrat mit dem vorstehend /j

erhaltenen Tee vereinigt. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden mit 114 Liter Essigsäureäthylester extra- f]

hiert. Das Gemisch wird heftig gerührt und sodann stehengelassen. Die an der Oberfläche befindliche Schaum- 25 f schicht wird abgesaugt, um die Emulsion zu brechen. Sodann wird so viel Essigsäureäthylester wie möglich

abgetrennt. Weitere 76 Liter Essigsäureäthylester werden zugegeben, worauf die vorstehende Verfahrensstufe H

wiederholt wird. Die vereinigten Essigsäureäthylesterextrakte wurden unter vermindertem Druck bei 50°C ein- ..,

gedampft. Der Rückstand wird dreimal mit insgesamt 10 Liter heißem (75 bis 80° C) Benzol extrahiert. Die Ben- ·

zolextrakte werden unter vermindertem Druck bei 50⁰C eingedampft. Der Rückstand wird dreimal mit insge- 30 ,:■■-

samt 8 Liter unter Rückfluß siedendem Hexan gewaschen. Der nach dem Waschen mit Hexan verbliebene %

Rückstand wird in 2 Liter Aceton gelöst. Sodann werden 10 g Aktivkohle zugegeben, und das Gemisch wird eine |j

weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf wird die Aktivkohle abfiltriert und das Filtrat durch -'|

Destination unter vermindertem Druck bei 30°C eingedampft. Man erhält 96 g rohen Extrakt. ;'·■ Beispiel U ;;■

50 g des als Ausgangsmaterial verwendeten, vorstehend erhaltenen rohen Extrakts werden in 5 Liter Diathyl- :

äther gelöst Die erhaltene Lösung wird filtriert und mit 500 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonaüö- 40 ; sung gewaschen. Die Diäthylätherlösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und zur Trockene eingedampft. Man erhält 44,6 g eines hellgelben Öls. Dieses Öl wird sodann in 400 ml Chloroform gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 2,5 g neutraler Kieselsäure (mit Chloroform äquilibriert) beschickte Säule der Abmessungen 10,2 X 122 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit Chloroform und Gemischen aus Chloroform und Isopropanol eluiert. Es werden 110 Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden unter 45 vermindertem Druck bei Temperaturen unter 40⁰C zur Trockene eingedampft. Die Elution wird folgendermaßen durchgeführt: j

Die Zusammensetzung der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch (Kicselgel, Isopropanol/Chloroform 1 : 12,5) und gaschromutographisch [3% OV17 (Methylsilicon-Phcnylsilieon I : I (-Säule, programmierter Luuf( 150 bis 25O°C')| festgestellt. Die Fraktionen Nr. 78 bis 84 werden vereinigt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Mim erhalt 5,1 g eines öligen Rückstands, der mindestens drei Hauptbestandteile 65 enthalt, wie sich gaschromatographisch feststellen läßt.

3,2 g dieses Rückstands werden sodann in 50 ml Benzol gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 2 kg OR-PVA Mcrck-O-Gcl 2000 (Vinylaeelnt-Copolymerisat, das in organischen Lösungsmitteln quillt) beschickte Säule der

Fraktion	Volumen/Fraktion	Elutionsmittel	: 41,7)
	(ml)		: 33,3)
1- 7	650	CHCI1	: 28,6)
8- 30	500	Isopropanol : CHCIi (I	:25)
31-60	500	Isopropanol : CHCl, (1
61-105	500	Isopropanol : CHCIi (1
106-110	500	Isopropanol : CHCIi (I

Abmessungen 10,2 x 89 cm (mit Benzol äquilibriert) aufgesetzt Die Säule wird mit Benzol eluiert. Insgesamt werden 47 Fraktionen aufgefangen. Die Zusammensetzung der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch und gaschromatographisch festgestellt

Fraktion Volumen/Fraktion (ml)

1- 7	1000
8-45	300
46-47	1000

Die Fraktionen 23 bis 33 enthalten 1,73 g (54%) des aufgesetzten Materials.

A) Die Fraktionen 24 ursd 25 werden eingedampft Man erhält 0,251 geiner Verbindung Hais Öl mit folgenden is Eigenschaften:

IR-Spektrum (Reinsubstanz) 2,90, 5,96 und 6,21 μ. NMR-Spektrum ££"'' 6,11, 5,48,4,25,4,13, 3,56, 2,11, 2,08, 1,48, 1,13 und 1,01 ppm.

20 B) Die Fraktion 31 wird eingedampft. Man erhält 0.326 g der Verbindung I als Öl mit foleenden Eigenschaften ■

IR-Spektrum (Reinsubstanz) 2,91 und 5,88 μ. NMR-Spektrum S?_S ^C1· 5,41, 4,26, 4,15, 3,58, 3,18, 2,18, 1,76, 1,67, 1,15 und 1,04 ppm.

25 Spätere Untersuchungen (nachgereicht) ergaben für die Verbindung II folgende Eigenschaften:

IR-Spektrum (Reinsubstanz) 2,90, 5,96 und 6,21 μ.

30 NMR-Spektrum, ™_s ^c\ 6 in ppm: 6,11 (breit, s, 1, —C — CH=CJ; 5,48 (m, 1, C = CH-CH₂OH); 4,19 (d, 2, C = CH-CH₂OH);

35 / I \

4,13 ^,2,C-O-CH₂-C=J; I

3,56 [breit, t, 1, -CH(OH)J;

2,10 (d, 3,H₃C-C = c);

1,13 (s, 3, C —O — C-CH₃Y

1,07 [d, 6, C = C-CH(CHj)₂J.

50 Massenspektrum, [m/e]: 334 [M-18], 225, 140, 111, 95, 81, UV-Spektrum /I_n,,, (Äthanol): ~ 239 nm [ε = 8500]. Chemische Ionisation: M⁺ + H = 353; M.W. = 352.

Die Verbindung II hat die Formel " CHjO HO CHjOH

fyf) CH3 CHj ' „

10

Spätere Untersuchungen (nachgereicht} ergaben für die Verbindung I folgende Eigenschaften: IR-Spektrum (Reinsubstanz) 2,91 und 5,88 μ.

NMR-Spektrum ?£■?'', δ in ppm: 5,41 (m, 2, ^C=CH-CH₂OH und ^C=CH-CH₂-C— 4,20 (d, 2, C=CH-CHO₂H);

4,15 Vs,2, C—O —Cüj—C=J; 3,58 Tbreit, t, 1, ^CH(OH)I;

1,15 (s, 3, C-O-C-CH₃Y

Verfahren II: Beendigung der Trächtigkeit

Erwachsene, weibliche Meerschweinchen vom Hartley-Stamm werden ständig jeweils mit einem männlichen Tier gehalten, bis ein Vaginalpfropf im Käfig gefunden wird. Dies wird als Tag 1 der Trächtigkeit angesehen. Gruppen von jeweils 5 bis 6 weiblichen Tieren erhalten am Tag 22 der Trächtigkeit aufintraperitonealem Wege

Il

( ι Ϊ

3,18 Vd, 2, C = CH-CH₂-C—/;

i,7i [d, 6, C = C-(CHj)₂J;

Massenspektrum, [m/e]: 320 [M-W], 251, 233, 221, 171, 143, 141, 137, 125, 113 97, 95, 81, 69. Chemische Ionisation: M⁺H-H= 339; M.W. = 338. Die Verbindung I hat die Formel

O HO CH₂OH

CHj

Untersuchung der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Präparate

40

Verfahren I: Uteruskontraktionen

Erwachsenen, weiblichen Neuseeland-Kaninchen werden nach Betäubung mit Natrium-pentobarbital die Eierstöcke entfernt. Nach einer Erholungszeit von 1 Woche werden den Kaninchen an sechs aufeinanderfolgenden Tagen auf subkutanem Wege täglich 5 ng 17jß-Östradiol verabfolgt. Anschließend erhalten die Tiere an 7 aufeinanderfolgenden Tagen ebenfalls auf subkutanem Wege täglich 1,0 mg Progesteron. Nach der letzten Progesterondosis werden Uterus und Eileiter der Tiere nach dem Verfahren von Heilman et al., Fertil. Steril., Bd. 23, Seiten 221 bis 229, (leicht modifiziert) 72 Stunden perfundiert. Die Perfusion von Eileitern und Uterus wird mit einer Geschwindigkeit von 53 μΐ/min durchgeführt. Der Uterus wird mit einem Rohr perfundiert, das vom Eileiterende her 1,0 cm in das Lumen des Uterus reicht. Der Uterus wird an der uterotubalen Verbindungsstelle abgebunden. Durch einen kleinen Schnitt in die Vagina wird eine weitere Kanüle 1,0 cm in den Uterus eingeführt, um das Perfusat zu sammeln. Das zu untersuchende Material wird zusammen mit einem Träger, der PoIyäthylinglykol 200, Polyäthylenglykol 400, Äthanol und Phosphatpuffer enthält, auf intravenösem Wege in die Jugularvene verabfolgt. Die Kanüle wird mit einem P23-Dc-Stathan-Transduccr verbunden, der wiederum mit einem Grass-Modell 5-Polygraph gekoppelt ist. Dabei werden die Uteruskontraktionen gemessen.

Durch intravenöse Verabfolgung der aus Fraktion 31 erhaltenen Verbindung in Dosen von 1,0 bis 4,0 mg/kg werden bei Kaninchen, die 72 Stunden ohne Progesteron geblieben sind, Uteruskontraktionen und eine Relaxation des Iiileitcfs hervorgerufen. Die aus den Fraktionen 24 und 25 erhaltene Verbindung ist in Dosen von 25 bis 40 mg/kg wirksam.

die zu untersuchenden Verbindungen in dem im Verfahren I beschriebenen Träger. Die Tiere werden zwischen dem 25. und 45. Tag der Trächtigkeit getötet und auf Anzeichen von Resorption oder Abort untersucht.

Durch intraperitoneale Verabfolgung der als Fraktion 31 erhaltenen Verbindung in einer Dosis von 25 bis 85 mg/kg wird eine Unterbrechung der Trächtigkeit erreicht.

12

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   I. Verfahren zum Isolieren von Substanzen mit uteroevakuierender Wirkung aus der Zoapatl-Pflanze, ins-S besondere Montanoa tomentosa oder Montanoa floribunda, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (a) Pflanzenteile, die die uteroevakuierenden Wirkstoffe enthalten, bei erhöhten Temperaturen mit Wasser extrahiert, wobei ein Gemisch aus einer wäßrigen, zumindest einen Teil der uteroevakuierenden Wirkstoffe enthaltenden Phase und einer festen Phase erhalten wird, ίο (b) die wäßrige Phase von der festen Phase abtrennt und

   (c) die wäßrige Phase zur Abtrennung von zumindest einem Teil der uteroevakuierenden Wirkstoffe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt und gegebenenfalls

   (d) den erhaltenen Extrakt reinigt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) bei Temperaturen von 25 bis 100⁰C und die Stufe (c) bei Temperaturen von 30 bis 80⁰C durchfuhrt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Lösungsmittel nie^ ;re aliphatische Ester, aliphatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe oder aliphatische Alkohole, insbesondere Essigsäureäthylester, Hexan, Chloroform oder Benzol verwendet.

   4. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (a) Pflanzenteile, die die uteroevakuierenden Wirkstoffe enthalten, mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, wobei ein Gemisch aus einer organischen, zumindest einen Teil der uteroevakuierenden Wirkstoffe enthaltenden Phase und einer festen Phase erhalten wird, (b) die organische Phase von der festen Phase abtrennt und

   (c) die organische Phase zur Abtrennung von zumindest einem Teil der uteroevakuierenden Wirkstoffe mit Wasser behandelt und gegebenenfalls

   (d) den erhaltenen Extrakt reinigt.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) bei Temperaturen von 30 bis 80⁰C und die Stufe (c) bei Temperaturen von 25 bis 100⁰C durchführt.

   6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Reinigung des Extrakts gemäß Stufe (d)

   (a,) den Extrakt mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt,

   (b|) die erhaltene Lösung zur Entfernung von wasserlöslichen und sauren Verunreinigungen mit einer wäßrigen Lösung einer schwachen Base behandelt,

   (C₁) die in der organischen Phase löslichen Bestandteile zur Abtrennung von uteroevakuierenden Wirkstoffen zumindest einmal der Säulenchromatographie an einem Adsorptionsmittel unterwirft und (d,) die Säule mit einem zweiten Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch eluiert.

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel gemäß Stufe (a,) einen niederen aliphatischen Ester, einen aliphatischen Kohlenwasserstoff, einen aromatischen Kohlenwasserstoff, einen chlorierten Kohlenwasserstoff oder einen aliphatischen Äther, insbesondere ChIo roform, Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid oder Diäthyläther verwendet.

   8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elutionsmittel gemäß Stufe (d,) einen aromatischen Kohlenwasserstoff, einen niederen aliphatischen Ester oder ein Gemisch aus polaren und nicht-polaren Lösungsmitteln, insbesondere ein Gemisch aus Benzol und Essigsäureäthylester oder ein Gemisch aus Isopropanol und Chloroform verwendet.

   9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß Stufe (C₁) als Adsorptionsmittel

   ein Vinylacetat-Copolymerisat oder Kieselsäure verwentH. 10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ;n Stufe (ei) die Lösung auf eine mit

   Kieselsäure, Kieselgel oder Magnesiumsilikatgel beschickte Sau!*; aufsetzt, die Säule mit einem Gemisch aus

   Chloroform und Isopropanol eluier', die Fraktionen mit uteroevakuierender Aktivität vereinigt, das Lösungsmittel entfernt, den Rückstand in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel löst, diese Lösung auf eine mit Vinylacetat-Copolymerisat beschickte Säule aufsetzt, die Säule mit Benzol eluiert und die Fraktionen mit uteroevakuierender Aktivität sammelt.

   II. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (cj) die in der organischen Phase löslichen Bestandteile der Hoghdruck-Flüssigkcitschromatographie an einer mit einem Kicselgel beschickten Säule unterwirft und die Säule mil einem zweiten organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmiltclgcmisch bei einem Druck von 196 bis 343 KPa eluiert.

   12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweites organisches Lösungsmittel einen aliphatischen Kohlenwasserstoff oder ein Gemisch aus Hexan und Dioxan verwendet.

   13. Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff die nach den Ansprüchen 1 bis 12 erhaltenen Substanzen mit uteroevakuierender Wirkung.