DE2515670A1

DE2515670A1 - Verfahren zur extraktion, isolation und reinigung von praeparaten mit uteroevakuierender wirkung aus der zoapatl- pflanze

Info

Publication number: DE2515670A1
Application number: DE19752515670
Authority: DE
Inventors: Richard Huettemann; Ramesh Kanojia; Jose Luis Mateos; Luis Noriega; Michael Wachter
Original assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Current assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Priority date: 1975-04-10
Filing date: 1975-04-10
Publication date: 1976-10-14
Also published as: DE2515670C2

Description

" Verfahren zur Extraktion, Isolation und Reinigung von r äparaten mit uteroevakuierender Wirkung aus der Zoapatl-Pflanze n Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion, Isolation und Reinigung von Präparaten mit uteroevakuierender Wirkung aus der Zoapatl-Pflanze. Ferner betrifft die Erfindung die nach diesem Verfahren hergestellten Präparaten bzw. Wirkstoffe sowie Arzneipräparate, die diese Wirkstoffe enthalten.
Unter Wirkstoffen mit uteroevakuierender Wirkung sind solche zu verstehen, die eine Uteruskontraktion bei Warmblütern oder eine Austreibung des Uterusinhalts hervorrufen. Derartige Mittel werden im allgemeinen zur Herbeiführung von Monatsblutungen, zur Austreibung einer Blasenmole, Austreibung oder Resorption eines Fetus und Herbeiführung eines Aborts oder von verspäteten wehren verwendet. Außerdem werden diese Mittel dann eingesetzt, wenn der Uterusinhalt, wie Fetus oder Plazenta, entleert werden soll.
Die Zoapatl-Pflanze ist ein in Mexiko wildwachsender Busch mit etwa 2 m Höhe. Botanisch wird sie als Montanoa tomentosa nach 'Cervantes, Familie Compositae, Klasse Heliantheae bezeichnet.
Eine andere Varietät hat die Bezeichnung Montanoa floribunda.
Die Pflanze ist in Las Plantas Medicinales de Mexico, 3. Auflage, Ediciones Botas, 1944, näher beschrieben.
Seit Jahrhunderten wird diese Pflanze in Form eines Tees oder in Form anderer, wäßriger, roher Zubereitungen zur Auslösung von Wehen oder von Monatsblutungen verwendet. Diese Verwendung ist zwar in der Literatur beschrieben, es wurden jedoch bisher keine näheren chemischen oder pharmakologischen Untersuchungen darüber durchgeführt. Die wenigen Angaben, die sich in der Literatur finden, widersprechen sich zudem in ihren Ergebnissen.
Gegenwärtig wird die Zoapatl-Pflanze von Frauen, insbesondere der einheimischen Bevölkerung in Mexiko, dann angewendet, wenn die Monatsblutung ausbleibt oder Verdacht auf Schwangerschat besteht. Dazu wird aus den Blättern der Pflanze durch Kochen mit Wasser ein bitter schmeckender Tee gebraut, der dann getrunken wird. Es ist bekannt, daß viele tatsächlich schwangere Frauen diesen Tee einnehmen, um eine ungewünschte Schwangerschaft zu beenden.
Dieser Tee enthalt offensichtlich ein Gemisch aus den verschiedensten Wirkstoffen, von denen viele unenmnscht und zur Herbeiführung der gevmnschten Wirkung auch unnötig sind. Im allgemeinen ist die Zusammensetzung von natürlichen, pflanzlichen Substanzen sehr komplex. Es finden sich viele Verbindungen mit ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften sowie auch Verbindungen mit vollkommen anderen Eigenschaften. Daher bereitet die Abtrennung und Identifizierung der einzelnen Wirkstoffe große Schwierigkeiten. Bisher wurde kein Verfahren zur Isolierung der Wirkstoffe aus der Zoapatl-Pflanze beschrieben.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Extraktion von uteroevakuierenden Substanzen aus der Zoapatl-Pflanze und zur Isolation und Reinigung der Wirkstoffe aus den rohen Extrakten zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß werden Pflanzenteile, insbesondere die Blätter mit Wasser extrahiert und entweder vor oder nach der Extraktion mit Wasser mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert.
Daran kann sich eine weitere Isolation und Reinigung der Wirkstoffe mit uteroevakuierender Wirkung anschließen.
Verfahren A Das Verfahren A betrifft die wäßrige Extraktion, der eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln vorausgeht oder nachfolgt. Beispielsweise werden Pflanzenteile, insbesondere die Blätter, die die uteroevakuierenden Wirkstoffe enthalten, folgendermaßen behandelt: (a) Wäßrige Extraktion der Blätter und anschließende Extraktion der erhaltenen wäßrigen Phase mit einem organischen Lösungsmittel oder (b) Extraktion der Blätter mit einem organischen Lösungsmittel und anschließende wäßrige Extraktion der erhaltenen organischen Phase.
Bevorzugt wird das vorstehend mit.(a) bezeichnete Verfahren angewendet. Dabei werden vorzugsweise folgende mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel verwendet: niedere aliphatische Ester, wie Essigsäuremethylester, Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester sowie Ester mit einer längeren Kohlenstoffkette, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Methylenchlorid, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol, und höhere, mit Nasser nicht mischbare aliphatische Alkohole, wie Butanol und Pentanol. Bei diesem Verfahren spielt die Extraktion mit Wasser eine wesentliche Rolle. Diese wäßrige Extraktion läßt sich jedoch auch mit Erfolg mit einem Gemisch aus Wasser und mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln durchführen. Beispielsweise können Gemische aus Wasser und Äthanol oder Methanol zu diesem Zweck verwendet werden. Ferner ergibt sich aus der folgenden Beschreibung, daß man bei Anwendung von verschiedenen zwischengeschalteten Verfahrensstufen zu guten Ergebnissen gelangt.
Eine Menge in der Größenordnung von 3,5 kg von Zoapatl-Blättern, entweder in getrocknetem oder frischem Zustand, wird mit kaltem Wasser gewaschen. Gegebenenfalls können die Blätter vor der Extraktion zerkleinert werden. Sodann wird mit Wasser, vorzugsweise heißem Wasser, oder einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Extraktion mit Wasser wird zweckmäßigerweise bei Temperaturen von 25 bis 100°C, vorzugsweise durch mindestens lominütiges Kochen durchgeführt. Extraktionszeiten von mehr als 2 Stunden sind nicht notwendig und unwirtschaftlich. Nach dem Abtrennen vom pflanzlichen Rückstand erhält man die wäßrige Phase in Form einer dunkel gefärbten Lösung.
Diese Lösung wird dann, wie oben ausgeführt, der Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel unterworfen. In der Praxis wird vorzugsweise das Volumen des dazu verwendeten organischen Lösungsmittels so gewählt, daß es dem Volumen der wäßrigen Phase entspricht. Diese Extraktionsstufe wird zweckmäßigerweise bei Temperaturen, die geringfügig oberhalb der Raumtemperatur liegen, bis zum Siedepunkt des jeweiligen Lösungsmittels durchgeführt. Vorzugsweise extrahiert man beim Siedepunkt des Lösungsmittels.
Die Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel wird solange fortgesetzt, bis die entsprechende Menge des gewünschten Materials erhalten ist. Ublicherweise wird 1 bis 2 Stunden extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt und zur Trockene eingedampft, vorzugsweise unter vermindertem Druck bei Temperaturen ton 30 bis 8O0C.
Wie bereits erwähnt, kann die Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel vor der wäßrigen Extraktion durchgeführt werden.
In diesem Fall gelten die vorgenannten Bedingungen für die einzelnen Extraktionsstufen sowohl für die Extraktion von Blättern wie auch die Extraktion von Blattextrakten. Außerdem kann das nach der zweifachen Extraktion erhaltene Material zur Verbesserung seiner Qualität mit entsprechenden Lösungsmitteln weiter behandelt werden. Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in den Beispielen, insbesondere in Beispiel 1, erläutert.
Nach dem vorgenannten Verfahren erhält man einen Extrakt mit uteroevakuierender Wirkung, dessen Gehalt an Verunreinigungen im Vergleich zum Ausgangsmaterial wesentlich geringer ist.
Die Anwesenheit von Wirkstoffen mit uteroevakuierender Wirkung läß-t sich an weiblichen Versuchstieren anhand von Uteruskon-bzw. Beendigung der Trächtigkeit traktionen und Ab6rten\/£bststellen. Bei Durchführung dieser Versuche mit rohen Ex-trakten lassen sich Uteruskontraktionen bei Verwendung von etwa 150 bis 500 mg Extrakt/kg nachweisen. Bei Beendigunq der Trächtigkeit trächtigen Meerschweinchen wird eine V beobachtet, wenn der rohe Extrakt in Dosen von 300 bis 500 mg/kg verabfolgt wird.
Verfahren B Das gemäß dem Extraktionsverfahren A erhaltene Produkt enthält zwar die gewünschten Wirkstoffe und besitzt wertvolle biologische Eigenschaften, weist aber daneben immer noch unerwunschte Stoffe auf, die zur Erzielung der gewünschten Wirkung nicht nötig sind. Dieser Extrakt kann nach dem folgenden Verfahren weiter gereinigt werden.
Auf geeignete Weise vorgereinigtes Material, beispielsweise ein durch Extraktion mit Wasser und organischen Lösungsmitteln erhaltener Extrakt, wird als Ausgangsmaterial verwendet. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens wird das zu reinigende Material zuerst in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Die erhaltene Lösung wird filtriert und zur Entfernung von wasserlöslichen und sauren Verunreinigungen mit einer wäßrigen Lösung einer schwachen Base gewaschen, beispielsweise mit Natriumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat oder Natriumacetat. Vorzugsweise wird eine gesättigte Lösung dieser Base verwendet. Beispiele für entsprechende-organische Lösungsmittel sind niedere aliphatische ether, wie Diäthyläther und Dibutyläther, niedere aliphatische Ester, wie Essigsäuremethylester, Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester, Ester mit längeren Kohlenstoffketten, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Methylenchlorid, und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol. Die Lösung kann eingeengt und direkt in die nächste Stufe eingesetzt werden. Eine andere MöglicEteit besteht darin, das organische Lösungsmittel nach üblichen Verfahren zu entfernen und den Rückstand in einem organischen Lösungsmittel zu lösen und über eine mit einem Adsorptionsmittel beschickte Säule zu geben. Beispiele für entsprechende Lösungsmittel sind Benzol und Toluol. Beispiele für entsprechende Adsorptionsmittel sind Copolymerisate, wie Vinylacetat-Copolymerisate, verschiedene Arten von Kieselgel und Aluminiumoxid. Bevorzugt sind Vinylacetat-Copolymerisate. Im allgemeinen werden einzelne Fraktionen aufgefangen und jeweils dünnschichtchromatographisch auf ihre biologische Aktivität untersucht. Wünscht man ein besonders reines Material zu erhalten, so werden die Fraktionen mit entsprechender Aktivität vereinigt und an einem adsorbierenden Ma-(Magnesiums iliicatgel) terial, wie Kieselgel, Florisil/oder Aluminiumoxid chromatographiert. Als Elutionsmittel wird ein organisches Lösungsmittel oder ein Gemisch aus organischen Lösungsmitteln verwendet.
Beispiele für entsprechende Lösungsmittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol, und niedere aliphatische Ester, wie Essigsäuremethylester, Essigsäureäthylester und Essigsiurebutylester, sowie Gemische dieser Lösungsmittel. Anschließend werden wieder mehrere Fraktionen auf gefangen und dünnschichtchromatographisch auf ihre biologische Aktivität untersucht. Die das gewünschte Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man das gewünschte Material mit uteroevakuierender Wirkung.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, den nach der ursprünglichen Reinigung erhaltenen vorgereinigten Extrakt chromatographisch an Adsorptionsmitteln, wie Kieselsäure, Kieselgel oder Florisil, unter Verwendung eines Gemisches aus polaren und nicht-polaren Lösungsmitteln als Elutionsmittel weiter zu reinigen. Als Adsorptionsmittel wird Kieselsäure bevorzugt. Es kann entweder neutrale oder saure Kieselsäure verwendet werden. Bevorzugt ist die Verwendung von neutraler Kieselsäure. Das chromatographisch zu reinigende Material wird vorzugsweise zuerst in einem Lösungsmittel, insbesondere in Chloroform gelöst, auf eine mit dem Adsorptionsmittel beschichtete Säubriert) le (mit einem entsprechenden Lösungsmittel äquili/aufgesetzt und mit dem Gemisch aus einem polaren und einem nicht-polaren Lösungsmittel eluiert. Beispiele für polare Lösungsmittel sind niedere Alkanole, wie Äthanol, Methanol, Propanol, Isopropanol und Butanol, niedere Alkylester, wie Essigsäureäthylester und Essigsäurebuty-lester, und aliphatische Ketone, wie Aceton, ethyläthylketon und Methylisobutylketon. Beispiele für nichtpolare Lösungsittel sind chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan und aromatische Kohlenrasserstoffe, wie Benzol und Toluol. Bevorzugt wird ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol und Chloroform. Die aufgefangenen Frak-tionen werden bei Temperatu-Raumtemperatur bis ren von/etwa 40°C zur Trockene eingedampft. Die Zusammensetzung der Fraktionen wi rd wird duiinschichtchromatographisch oder gaschromatographisch festgestellt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Lösuiig des rohen Extrakts ohne Entfernung des Lösungsmittels direkt zu chromatographieren. Um eine leichtere Handhabung zu ermöglichen, kann die Lösung vor dem Chromatographieren eingeengt werden.
Gemäß einer weiteren Ausfiihrungsform kann das vorgereinigte Ausgangsmaterial durch Flüssigkeitschromatographie untererhöh tem Druck weiter gereinigt werden. Dazu wird das Ausgangsmaterial zunächst in einem entsprechenden organischen Lösungsmittel gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit einer schwach alkalisch reagiercnden Verbindung gewaschen. Sodann wird das Lösungsmittel nach einem üblichen Verfahren entfernt. Der erhaltene Rückstand wird mit einer geringen Menge des zur Flüssigkeitschromatographie verwendeten Eüllmaterials vermischt. Als Adsorptionsmittel können Füllmaterialien, wie verschiedene Arten von Kieselgel, Aluminiumoxid und Polyamidmembranen verwendet werden. Vorzugsweise wird Kieselgel als Füllmaterial verwendet. Das Gemisch aus dem P.iickstand und dem Adsorptionsmittel wird sodann in eine präparative Säule gegeben, die zusätzliches Füllmaterial enthält. Sodann wird die Säule mit einem nichtpolaren Lösungsmittel oder einem Gemisch von nicht-polaren Lösungsmitteln, wie Dioxan, Heptan, Hexan und Pentan, eluiert. Die aufgefangenen Fraktionen werden gaschromatographisch und/oder dünnschlchtchromatographisch auf ihre Aktivität untersucht. Die aktiven Fraktionen werden sodann vereinigt, Anschließend wird das Lösungsmittel entfeflit. Die Hochdruck«Flüssig1feitschromatographie wird im allgemeinen bei Drücken von etwa 20 bis 35 at durchgeführt. Bevorzugt sind etwa 24 bis 32 at bei Raumtemperatur.
Gemäß den vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren erhält man Substanzen mit uteroevakuierender Wirkung, in denen sich gaschromatographisch mindestens drei Hauptkomponenten nachweisen lassen. Die uteroevakuierende Wirkung der Gemische läßt sich wiederum an Versuchstieren anhand von Uteruskontraktionen und bzw. Beendiqunq der Trächtiqkeit Aborten/feststellen. Bei trächtigen Meerschweinchen tritt eine Beendidung der Trächtigkeit 7 ' auf, wenn die Gemische in Dosen von etwa 75 bis 100 mg/kg verabfolgt werden. Uteruskontraktionen lassen sich bei Venrendung der Gemische in Mengen von etwa 2,5 bis 5,0 mg/kg nachweisen.
Verfahren C Gereinigtes Material mit uteroevakuierender Wirkung kann aus den vorstehend erhaltenen Extrakten durch zusätzliche Reinigungsschritte auf die nachstehend beschriebene Weise isoliert werden.
Der ursprüngliche Extrakt, aus dem das gereinigte Material mit uteroevakuierender wirkung erhalten wird, wird über eine Reihe von Extraktions- und Reinigungsschri ten aus der Zoapatl-Pflanze hergestellt. Bei einem Verfahren werden die Blätter zuerst in Wasser suspendiert, wonach das Gemisch einige Stunden auf etwa 98 bis 100°C erwärmt wird. Das heiße Gemisch wird filtriert und der feste Rückstand mit heißem Wasser gewaschen. Sodann wird das Gemisch ein zweites Mal filtriert. Die Filtrate werden vereinigt.
Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden mehrmals mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Nach der Trennung von wäB-rigen und nicht-wäßrigen Phasen wird das organische Lösungsmittel nach üblichen Verfahren entfernt. Beispiele für organische Lösungsmittel sind mit Wasser nicht mischbare aliphatische Ester, wie Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Methylenchlorid, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol, und mit Wasser nicht mischbare aliphatische Alkohole, wie Butanol, Pentanol und Hexanol. Bevorzugt wird Essigsäureäthylester. Der nach dem Entfernen des organischen Lösungsmittels erthaltene Rückstand wird mehrmals mit einem heißen organischen Lösungsmittel, wie Benzol oder Toluol, extrahiert. Sodann wird das Lösungsmittel wiederum entfernt und der Rückstand mehrmals mit einem heißen organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit Hexan. unter RückSlußbedingmngen, gewaschen. In einem zusätzlichen Reinigungsschritt kann der auf diese Weise erhaltene Rückstand in einem Lösungsmittel, wie Aceton, gelöst und anschließend mit einem Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, gerührt werden. Der nach dem Abfiltrieren und Entfernen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird als Ausgangsmaterial zur Herstellung der erfindungsgemäßen gereinigten Präparate mit uteroevakuierender Wirkung verwendet. Die erfindungsgemäßen gereinigten Präparate mit uteroevakuierender Wirkung erhält man, indem man den gemäß Verfahren A erhalteren rohen Extrakt in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel löst, die erhaltene Lösung filtriert und das Filtrat zur Entfernung von wasserlöslichen und sauren Verunreinigungen mit einer wäßrigen Lösung einer schwachen Base, wie Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat, wäscht. Vorzugsweise wird als Waschflüssigkeit eine gesättigte Lösung einer Base verwendet. Entsprechende organische Lösungsmittel sind niedere aliphatische Äther, wie Diäthyläther, Di-n-propyläther, Diisopropyläther, Methyl-nbutyläther, Äthyl-n-butyläther und Dibutyläther, niedere aliphatische Ester, wie Essigsäuremethylester, Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester und Propionsäuteäthylester, Ester mit längeren Kohlenstoffketten, wie. Essigsäureamylester und Essigsäurehexylester, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Ch:Loroform, Tetrachlorkohlenstoff unc SIethylenchlorid, und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol.
Die organischen Lösungsmittel werden nach üblichen Veiahren, vorzugsweise unter vermindertem Druck, entfernt. Der auf diese TZeise erhaltene vorgereinigte Extrakt wird chromatographisch an Adsorptionsmitteln, wie Kieselsäure, Kieselgel oder Floriffil' unter Verwendung eines Gemisches aus polaren und nicht po1aren Lösungsmitteln als Elutionsmittel weiter gereinigt. Als Adsorptionsmittel wird Kieselsäure bevorzugt. Es kann entweder neutrale oder saure Kieselsäure verwendet werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von neutraler Kieselsäure. Das zu chromatographierende Material wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel, wie Chloroform, gelöst. Die Lösung wird auf eine mit dem Adsorptionsmittel beschickte Säule (mit einem entsprechenden Lösungsmittel äquilibriert) aufgesetzt. Soda-nn wird mit einem Gemisch aus einem polaren und einem nicht-polaren Lösungsmittel eluiert. Beispiele für polare Lösungsmittel sind niedere Alkanole, wie Äthanol, Methanol, Propanol, Isopropanol und Butanol, niedere Alkylester, wie Essigsäureäthylester und Essigsäurebutylester, und aliphatische Ketone, wie Aceton, Methyläthylketon und Methylisobutylketon. Beispiele für nicht-polare Lösungsmittel sind chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylenchlorid und Tetrachlorkohlenstoff, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan und Heptan, und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol. Bevorzugt wird ein Gemisch aus Isopropanol und Chloroform. Die aufgefangenen Fraktionen werden bei Temperaturen von Raumtemperatur bis etwa 40°C zur Trockene eingedampft. Die Zusammensetzung der aufgefangenen Fraktionen wi rd dünns clii chtchromatographisch oder gas -chromatographisch festgestellt. Eine andere Möglichkeit besteh darin, die Lösung des rohen Extrakts direkt ohne Entfeniung des Lösungsmittels zu ohromatographieren. Die Lösung kann einfacNieitshalber vor dem Chromato graphi es chri t t eingedampft werden.
Durch dieses Reinigungsverfahren erhält man ein Material mit utero evakui erender Wirkung, das gemäß gas chroinato graphischer Analyse aus einem Gemisch von mindestens drei Hauptbestandteilen besteht. Die Anwesenheit von Wirkstoffen mit uteroevakuierender Wirkung in diesem Gemisch wird an weiblichen Versuchs-bzw. Beendigung der Trächtiq};eit/ tieren an Hand von Uteruskontraktionen und Aborten festgestellt. Beendigung der Trachtiskeit/ Bei trächtigen Meerschweinchen tritt eine / auf, wenn das Gemisch in Dosen von 75 bis 100 mg/kg verabfolgt wird. Wird das Gemisch in Mengen von etwa 2,5 bis 5,0 mg/kg verwendet, so lassich sich Uteruskontraktionen feststellen.
Die Fraktionen mit uteroevakuierender Aktivität werden vereinigt und säulenchromatographisch an einem polymeren Gel, das in organischen Lösungsmitteln quellende organische Polymerisate enthält, behandelt. Beispiele für entsprechende Polymerisate sind Vinylacetat-Copolymerisate, vernetzte Dextrane und Polystyrol-Gele. Beispiele für Lösungsmittel sind Benzol, Toluol, Tetrahydrofuran und Cyclohexan. Als Polymerisat wird vorzugsweise. ein Vinylacetat-Copolymerisat' verwendet. Die Säule wird mit einem organischen Lösungsmittel eluiert, vorzugsweise mit einem Lösungsmittel, in dem sich der Rückstand löst. Sodann wird eine Anzahl von Fraktionen aufgefangen. Die Zusammensetzung der Fraktionen wird gaschromatographisch oder dünnschichtchromatographisch festgestellt. Nach dem vorgenannten Verfahren erhält man mindestens zwei chemisch voneinander verschiedene Verbindungen mit uteroevakuierender Wirkung, wie sich gaschromatographisch und spektralanalytisch feststellen läßt. Die uteroevakuierende Wirkung der isoj.ierten Substanzen wird festgestellt, indem man an weiblichen Testtiercll das ,ausmaß an Beendigunq der TLächtiskeit / Uteruskontraktionen und die Neigung zur / mitt. Gegebellenfalls können kleinere Mengen an Verunreinigungen aus den gereinigten Verbindungen durch weitere ChLoatographie an Adsorptionsmitteln, wie Kieselsäure oder Florisil, entfernt werden.
Die Säule wird mit einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch, vorzugsweise einem Gemisch aus Chloroform und Isopropanol, eluiert. Die Zusammensetzung der aufgefangenen Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch festgestellt. Die gereinigten Verbindungen mit uteroevakuierender Wirkung sind bei Verabfolgung in Dosen von 1,0 mg bis etwa 100 mg/kg wirksam. Die jeweilige Dosis hängt von der Spezies ab, an die die Verbindungen verabfolgt werden.
Die Erfindung betrifft auch Arzneipräparate, bestehend aus einem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Präparat mit uteroevakuierender Wirkung und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.
Beispielsweise können die Arzneipräparate in Form von Lösungen, Suspensionen oder festen Verabreichungsformen vorliegen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Verfahren A Beispiel. 1 Extraktion von Blättern mit einem organischen Lösungsmittel und anschließende Extraktion der organischen Phase mit Wasser 2,0 kg trockene Blätter werden 1 Stunde in CHCl3 unter Rückfluß erwärmt. Nach dem Abfiltrieren wird der Chloroformextrakt bei Temperaturen von 35 bis 50 0C unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 196 g einer dunklen halbfesten Masse. Dieser Rückstand wird mit einem heißen Gemisch aus Äthanol und Wasser (1 : 2) extrahiert. Die wäßrige Äthanolphase wird mit CHCl3 extrahiert und die CHC13-Phase abgetrennt und unter vermindertem Druck zu einem gelbbraunen Sirup eingedampft. Dieser Sirup wird in Diäthyläther gelöst. Die Lösung wird mit wäßriger, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung, Sprozentiger wäßriger Natriumhydroxidlösung und Wasser gewaschen und sodann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Nach dem Abdampfen des Diäthyläthers erhält man 11,9 g rohen Extrakt in Form eines gelben bls.
Beispiel 2 Extraktion der Blätter mit Wasser und anschließende Extraktion der wäßrigen Phase mit einem organischen Lösungsmittel 634 g trockene Blätter werden 1 Stunde mit 4,0 Liter Wasser unter Rückfluß erwärmt. Der Extrakt wird abdekantiert und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformphase wird getrocknet und abfiltriert. Sodann wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Man erhält 4,55 g einer halbSesten Masse.
Die wäßrige Phase wird mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die erhaltene organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 1,99 g Rückstand. Die aus dem Chloroform-und dem Essigsäureä-thylesterextrakt erhaltenen Rückstände werden vereinigt und bilden zusammen den rohen Extrakt.
Beispiel 3 Extraktion der Blätter mit wasser und anschließende Extraktion der wäßrigen Phase mit Essifflsäureäth-lester 140 g trockene Zoapatl-Blätter werden 1 Stunde in 2,5 Liter Wasser unter Rückfluß erwärmt. Der waßrige Extrakt wird hierauf auf ein Gesamtvolumen von 250 ml eingeengt und viermal mit je 750 ml Essigsäureäthylester extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man 1,3 g einer dunkel gefärbten Masse. Diese Masse wird mit 100 ml Chloroform extrahiert. Sodann wird abfiltriert und unter vermindertem Druck eingedamft. Man erhält 0,840 g rohen Rückstand.
Beispiel 4 Extraktion der Blätter mit Hexan 966 g trockene Zoapatl-Blätter werden 3 Stunden mit soviel Hexan, daß die Blätter vollkommen bedeckt sind, unter Rückfluß erwärmt. Nach dem Abfiltrieren und Eindampfen der erhaltenen Flüssigkeit zur Trockene, wie oben beschrieben, erhält man 56,8 g eines dunkelgrünen, rohen Extrakts.
Beispiel 5 Extraktion mit Hexan, anschließende Extraktion der organischen Phase mit Wasser und anschließende Extraktion der wäßrigen Phase mit Essigsäureäthylester 350 g trockene Zoapatl-Blätter werden mit Hexan bedeckt. Dieses Gemisch wird unter Rühren 15 bis 20 Minuten bis zum Sieden erwärmt. Sodann wird der Hexanextrakt abdekantiert, filtriert und mit einem gleich großen Volumen Wasser (etwa 700 ml) behandelt. Die Phasen werden abgetrennt. Die Hexanphase wird wiederum unter Rühren mit einem gleichen Volumen Wasser behandelt. Nach der Abtrennung der Phasen wird die Hexanphase nochmals auf die gleiche Weise mit Wasser behandelt. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt und dreimal mit einem gleichen Volumen Essigsäureäthylester extrahiert. Die Essigsäureäthylesterextrakte werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Man erhält 6,6 g rohen Extrakt in Form eines bräunlich-gelben Sirups.
Beispiel' 6 Extraktion der Blätter mit Wasser und anschließende Extraktion des aktiven Materials mit Benzol 1 kg getrocknete Zoapatl-Blätter werden 3 Stunden mit 15 ml Wasser unter Rückfluß erwärmt (585 Torr/920C). Die wäßrige Phase wird abdekantiert und durch Gaze filtriert. Anschließend behandelt man mit etwa 700 g Aktivkohle,.bis eine Ausflockung eintritt. Das Gemisch wird hierauf 2 Stunden gerührt und unter rasch vermindertem Druck/abfiltriert, wobei ein klares Filtrat entsteht. Der abfiltrierte Feststoff wird 3 Tage bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet und anschließend in liter Benzol suspendiert. Durch Abdestillieren von Benzol werden etwa .200 ml Wasser entfernt. Man enthält eine Benzolphase, die, wie vorstehend beschrieben, unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft wird. Man erhält 3 g rohen Extrakt in Form eines Öls.
Beispiel 7 Extraktion der Blätter mit Wasser und anschließende Extraktion der wäßrigen Phase mit Essigsaurefithvlester 2 kg frische Zoapatl-Blätter werden mit Wasser bedeckt (10 bis 12 Liter Wasser) und 1 Stunde gekocht. Anschlie3end wird das noch heiße Gemisch durch ein Käsetuch filtriert. Sodann läßt man abkühlen und extrahiert den wäßrigen Anteil zweimal mit je 2 Volumina Essigsäureäthylester. Die Essigsäureäthylester lösung wird sodann unter vermindertem Druck bei 5O0C zur Trockene eingedampft. Man erhält 12 g einer dunkelgrünen Masse. Diese Masse wird mit 500 ml Benzol behandelt und etwa 15 Minuten bis zum Sieden erwärmt. Die Benzolphase wird abdekantiert und der Rückstand solange mit Benzol gewaschen, bis kein weiteres Material mehr extrahiert wird. Die Benzolextrakte werden vereinigt und bei 50°C unter vermindertem Druck getrocknet. Die erhaltene bräunliche Masse wird nacheinander gemäß dem vorstehend für Benzol beschriebenen Verfahren mit getrennten Mengen Hexan extrahiert, bis der Hexanextrakt farblos wird. Man erhält etwa 8 g Rückstand in Form eines dicken Sirups. Dieses Material wird gelöst sodann in Aceton (100 ml oder weniger)/und 5 g Aktivkohle (Darco) werden zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, bis die Aktivkohle ausflockt. Sodann wird das Gemisch abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck und geringem Erwärmen (30°C) eingedampft. Man erhält 4 bis 6 g rohen Extrakt.
Verfahren~ Beispiel 8 4,33 g des gemäß Beispiel 7 erhaltenen rohen Extrakts werden in 500 ml Diäthyläther gelöst. Die erhaltene Lösung wird filtriert und mit 50 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Der Diäthyläther wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und zur Trockene eingedampft. Man erhält 3,4 g eines hellgelben Öls. Dieses gelbe Öl wird sodann in 50 ml Benzol gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 2 kg OR-PVA-Merok-O-Gel 2000 (Vinylacetat-Copolymerisat, das in ororganischen Lösungsmitteln quillt, der Firma E. M. Merck, Inc.) beschickte Säule der Abmessungen 2 m x 10 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit Benzol eluiert. Folgende Fraktionen werden aufgefangen und zur Trockene eingedampft.
Fraktion Volumen Rückstand (Liter) (Liter) (Z) 1 5,1 0,320 2 . 3,1 0,305 3 5,3 1,1 4 4,3 0,440 Das aus Fraktion Nr. 3 erhaltene Material (1,1 g) wird in 10 ml Benzol gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 60 g Kieselgel beschickte Säule der Abmessungen 1 m x 2 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit einem Gemisch aus Benzol und Essigsäureäthylester (4 : 1) eluiert. Nach dem Abnehmen von 25 Fraktionen von jeweils 125 ml Volumen geht man auf ein Mischungsverhältnis von Benzol zu Essigsäureäthylester im Elutionsmittel von 1 : 1 über. Das gewünschte Material wird in den Fraktionen 28 bis 31 aufgefangen, wie sich dünnschichtchromatographisch feststellen läßt. Aus Fraktion 28 erhalt man nach dem Entfernen des Lösungsmittels 0,046 g halb gereinigtes Material. Die Fraktionen 29 bis 31 (0,350 g) werden in Chloroform gelöst. Der Rückstand wird auf fünf präpara-tive Dünnschichtplatten auf gesetzt. Die Platten werden sechsmal mit Benzol und dreimal mit einem Gemisch aus Benzol und Essigsäureäthylester (4 : 1) entwickelt. Die Hauptbande wird abgetrennt und mit Essigsäureäthylester eluiert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man ein halbgereinigtes Material.
13eispiel 9 4,5 g des gemäß Beispiel 7 erhaltenen rohen Extrakts werden in 50 ml Diäthyläther gelöst. Die erhaltene Lösung wird abfiltriert und mit 50 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat lösung gewaschen. Die Diäthylätherlösung wird anschließend über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft.
Man erhält 3,6 g Rückstand, der in 25 ml Chloroform gelöst wird. Diese Lösung wird auf eine mit 200 g neutralem Kieselgel (mit Chloroform äquiLibriert) beschickte Säule der Abmessungen 40 mm (Innendurchmesser) und.ÄO,6 cm (Höhe) aufgesetzt.
Die Säule wird mit Chloroform und Gemischen aus Chloroform und Isopropanol eluiert. Es werden Fraktionen von jeweils 25 ml abgenommen. Jeweils fünf dieser Fraktionen werden zu größeren Fraktionen mit einem Volumen von 125 ml vereinigt. Etwa 75 Fraktionen von einem Volumen von 125 ml werden aufgefangen und bei Temperaturen unter 400C unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Die Elution wird folgendermaßen durchgeführt: Fraktionen (125 ml) 1-18 CHCl3 19-30 Isopropanol : CHCl3 (1:99) 31-44 Isopropanol : CHCl3 (1:49) 45-51 Isopropanol : CHCl3 (3:97) 52-66 Isopropanol : CHCl3 (1:24) 67-75 Isopropanol : CHCl3 (1:19) Die Fraktionen werden gemäß Beispiel 8 dünnschichtchromatographisch untersucht. Aufgrund der dünnschichtchromatographischen Ergebnisse werden die Fraktionen Nr. 49 bis 66 vereinigt.
Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man 0,725 g öligen Rückstand.
Dieser Rückstand wird an präparativen Kieselgel-Dünnschichtplatten weiter gereinigt. Als Laufmittel wird ein Gemisch aus Isopropanol und Chloroform (2 : 23) verwendet. Die Hauptbande wird mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (1 : 3) eluiert. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels erhält man 540 mg Rückstand. 400 mg dieses Materials werden auf ähnliche Weise chromatographiert. Man erhält. 268 mg halb-gereinigtes- Material in Form eines Öls.
13 e i 5 p i e 1 10 1 g des gemäß Beispiel 7 erhaltenen rohen Extrakts wird in einem 15 ml fassenden Reagensglas vorsichtig mit 5 ml Diäthyläther vermischt. Die erhaltene Lösung wird 1 Minute mit 2 ml Natriumhydrogencarbonatlösung vermischt. Das Gemisch wird zentrifugiert und der Diäthyläther entfernt. Die IIydrogencarbonatlösung wird zweimal mit je 2 ml Diäthyläther gewaschen. Die Ätherextrakte werden vereinigt. Das Lösungsmittel wird abgedampft. Der troclsele Rückstand wird mit einer geringen Menge Pellosil (Kieselgel-fiEllmaterial zur Flüssigchromatographie der Firma Reeve Angel & Co., Clifton, New Jersey) vermischt. Das Gemisch wirc in das vordere Ende einer präparativen Säule der Abrnessungen 122 cm x 9,5 mm, die Pellosil enthält, eingeführt. Die so gepackte Säule wird in einen Flüssigkeitchromatographen (du Pcnt 830) eingesetzt. Sodann wird die Säule bei einem Druck von 28 at mit einem Gradienten von 2,5 /o Dioxan in Hexan bis 7,5 Vo Dioxan in Hexan eluiert. Dabei wird die Säule 30 Minuten mit 2,5 ,0 Dioxan in riexan, 30 Minuten mit 5,0 Vo Dioxan in Hexan und 30 Minuten mit 7,5 % Dioxan in Hexan eluiert. Die aufgefangenen Fraktionen (Nachweis des gewünschten Materials durch UV-Chromophormessung bei 254 nm)werden gaschromatographisch und dünnschichtchromatographisch untersucht. Die während der letzten 20 Minuten der Elution mit 7,5 % Dioxan in Hexan aufgefangene Fraktion wird bei 50 0C unter Stickstoff zur Trockene eingedampft. Man verhält ein halb-gereinigtes Material.
Verfahren C Herstellung des Ausgangsmaterials Ein mit einem mit Dampf beheizten Heizmantel versehener Tank aus korrosionsbestündigem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 380 Liter wird mit 10 kg Zoapatl-Blättern und 114 Liter Wasser beschickt. Das Gemisch wird 2 1/2 Stunden auf 98 bis 1000C enrärmt und dabei von Zeit zu Zeit geruhrt. Das noch heiße Gemisch wird durch Gaze filtriert, wobei etwa 95 Liter eines klaren, dunklen Tees erhalten werden. Der feste Rückstand im Tank wird mit 15 Liter heißem Wasser gewaschen. Sodann wird abfiltriert und das Filtrat mit dem vorstehend erhaltenen Tee vereinigt. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden mit 114 Liter Essigsäureäthylester extrahiert. Das Gemisch wird heftig gerührt und sodann stehengelassen. Die an der Oberfläche befindliche Schaumschicht wird abgesaugt, um die Emulsion zu brechen. Sodann wird soviel Essigsäureäthylester wie möglich abgetrennt. Weitere 76 Liter Essigsäureäthylester werden zugegeben, worauf die vorstehende Verfahrens stufe wiederholt wird. Die vereinigten Essigsoureäthylesterextrakte werden unter vermindertem Druck bei 500C eingedampft. Der Rückstand wird dreimal mit insgesamt 10 Liter heißem (75 bis 80°C) Benzol extrahiert. Die Benzolextrakte werden unter vermindertem Druck bei 500C eingedampft. Der Rückstand wird dreimal mit insgesamt 8 Liter unter Rückfluß siedendem Hexan gewaschen. Der nach dem Waschen mit Hexan verbliebene Rückstand wird in 2 Liter Aceton gelöst. Sodann werden 10 g Nuchar (Aktivkohle) zugegeben, und das Gemisch wird eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf wird die Aktivkohle abfiltriert und das Filtrat durch Destillation unter vermindertem Druck bei 300C eingedampft. Man erhält 69 g rohen Extrakt.
3 e i 5 p i e 1 11 50 g des als Ausgangsmaterial verwendeten, vorstehend erhaltenen rohen Extrakts werden in 5 Liter Diäthyläther gelöst. Die erhaltene Lösung wird filtriert und mit 500 ml einer gesättigt ten Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Der Diäthyläther wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und zur Trockene eingedampft. Man erhält 44,6 g eines hellgelben Öls. Dieses Öl wird sodann in 400 ml Chloroform gelöst.
Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 2,5 g neutraler Kieselsäure (mit Chloroform äquilibriert) beschickte Säule der Abmessungen 10,2 x 122 cm aufgesetzt. Die Säule wird mit Chloroform und Gemischen aus Chloroform und Isopropanol eluiert. Es werden 110 Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden unter vermindertem Druck bei Temperaturen unter 400C zur Trockene eingedampft. Die Elution wird folgendermaßen durchgeführt: Volumen/ Fraktion Fraktion Elutionsmittel ~~~~~~~~ (ml) ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1-7 650 CHCl3 8-30 500 Isopropanol : CIiCl3 (1 : 41,7) 31-60 500 Isopropanol : CHCl3 (1 : 33,3) 61-105 500 Isopropanol ~ CHCl3 (1 : 28,6) 106-110 500 Isopropanol : CHCl3 (1 : 25) Die Zusammensetzung der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch (Kieselgel, Isopropanol/Chloroform 1 : 12,5) und gaschromatographisch 3 F3 V'> OV17 (Methylsilicon - Phenylsilicon 1 : 1)-Säule, programmierter Lauf (150 bis 250°C)g festgestellt. Die Fraktionen Nr. 78 bis 84 werden vereinigt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält 5,1 g eines öligen Rückstands,der mindestens drei Hauptbestandteile enthält, wie sich gaschromatographisch feststellen läßt.
3,2 g dieses Rückstands werden sodann in 50 ml Benzol gelöst.
Die Lösung wird auf eine mit 2 kg OR-PVA Merck-O-Gel 2000 (Vinylacetat-Copolymerisat, das in organischen Lösungsmitteln quillt, der Firma E. M. Merck, Inc.) beschickte Säule der Abmessungen 10,2 x 89 cm (mit Benzol äquilibriert) aufgesetzt.
Die Säule wird mit Benzol eluier-t. Insgesamt werden 47 Fraktionen aufgefangen. Die Zusammensetzung der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch und gaschromatographisch festgestellt.
Volumen/ Fraktion Fraktion (ml) 1-7 1000 8-45 300 46-47 1000 Die Fraktionen 23 bis 33 enthalten 1,77 g (54 O/o) des aufgesetzten Materials.
A) Die Frak-tionen 24 und 25 werden eingedampft. Man erhält 0,251 g einer öligen Verbindung mit folgenden Eigenschaften: IR-Spektrum (Reinsubstanz) 2,90, 5,96 und 6,21 NMR-Spektrum CDCl3 6,11, 5,S8, 4,25, 4,13, 3,56, 2,11 TMS 2,08, 1,48, 1,13 und 1,01 ppm.
B) Die Fraktion 31 wird eingedampft. Man erhält 0,326 g einer öligen Verbindung mit folgenden Eigenschaften: Iii-Spektruin (Reinsubstanz) 2,91 und 5,88 NMR-Spektrum CDCl3 5,41, 4,26, 4,15, 3,58, 3,18, 2,18, TMS 1,76, 1,67, 1,15 und 1,04 ppm.
Untersuchung dcr biologischen Aktivität der erfindungsgernäßen Prnr-:rate Verfahren I: Uteruskontraktionen Erwachsenen, weiblichen Neuseeland-Kaninchen werden nach Betäubung mit Natrium-pentobarbital die Eierstöcke entfernt. Nach einer Erholungszeit von 1 Woche werden den Kaninchen an sechs aufeinanderfolgenden Tagen auf subkutanem Wege täglich 5 17ß-Östradiol verabfolgt. Anschließend erhalten die Tiere an 7 aufeinanderfolgenden Tagen ebenfalls auf subkutanem Wege täglich 1,0 mg Progesteron. Nach der letzten Progesterondosis werden Uterus und Eileiter der Tiere' nach dem Verfahren von Heilman et al., Fertig. Steril., Bd. 23, Seiten 221 bis 229, (leicht modifiziert) 72 Stunden perfundiert. Die Perfusion von Eileitern und Uterus wird mit einer Geschwindigkeit von 53 min. durchgeführt. Der Uterus wird mit einem Rohr perfundiert, das vom Eileiterende her 1,0 cm in das Lumen des Uterus reicht. Der Uterus wird an der uterotubalen Verbindungsstelle abgebunden. Durch einen kleinen Schnitt in die Vagina wird eine weitere Kanüle 1,0 cm in den Uterus eingeführt, um das Perfusat zu sammeln. Das zu untersuchende Material wird zusammen mit einem Träger, der Polyäthylenglykol 200, Polyäthylenglykol 400, Äthanol und Phosphatpuffer enthält, auf intravenösem Wege in die Jugularvene verabSolgt. Die Kanüle wird mit einem P23-Dc-Stat;han-Transducer verbunden, der wiederum wit einem Grass-Modell 5-Polygraph gekoppelt ist. Dabei werden die Uteruskontrakti onen gemessen.
Durch intravenöse Verabfolgung der aus Fraktion 31 erhaltenen Verbindung in Dosen von 1,0 bis 4,0 mg/kg werden bei Kaninchen, die 72 Stunden ohne Progesteron geblieben sind, Uteruskontraktionen und eine Relaxation des Eileiters hervorgerufen. Die aus den Fraktionen 24 und 25 erhaltene Verbindung ist in Dosen von 25 bis 40 mg/kg wirksam.
Verfahren II:- 13eeindigunrächtikeit Erwachsene, weibliche Meerschweinchen vom Hartley-Stamm werden ständig jeweils mit einem männlichen Tier gehalten, bis ein Vaginalpropf im Käfig gefunden wird. Dies wird als Tag 1 der Trächtigkeit angesehen. Gruppen von jeweils 5 bis 6 weiblichen Tieren erhalten am Tag 22 der Trächtigkeit auf intraperitonealem Wege die zu untersuchenden Verbindungen in dem im Verfahren I beschriebenen Träger. Die Tiere werden zwischen dem 25.
und 45. Tag der Trächtigkeit getötet und auf Anzeichen von Resorption oder Abort untersucht.
Durch intraperitoneale VerabfolgLmg der als Fraktion 31 erhaltenen Verbindung in einer Dosis von 25 üis 85 mg/kg wird eine Unterbrechung der Trächtigkeit erreicht.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

Verfahren zur Extraktion von Präparaten mit uteroevakuierender Wirkung aus der Zoapatl-Pflanze, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man (a) Pflanzenteile, die die uteroevakuierenden wirkstoffe enthalten, bei erhöhten Temperaturen mit Wasser extrahiert, wobei ein Gemisch aus einer wäßrigen, zumindest einen Teil der uteroevakuierenden Rvrirkstoffe enthaltenden Phase und einer festen Phase erhalten wird, (b) die wäßrige Phase von der festen Phase abtrennt und (c) die wäßrige Phase zur Abtrennung von zumindest einem Teil der uteroevakuierenden Wirkstoffe mit einem mit Was er nicht mischbaren Lösungsmittel behandelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zoapatl-Pflanze Montanoa tomentosa oder Montanoa floribunda verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) bei Temperaturen von 25 bis 10000 und die Stufe (c) bei Temperaturen von 30 bis 800C durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Lösungsmittel niedere aliphatische Ester, aliphatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe oder aliphatische Alkohole verwendet.'
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel bssigsäureäthylester, Hexan, Chloroform oder Benzol verwendet.
6. Verfahren zur Extraktion von Präparaten mit uteroevakuierender Wirkung aus der Zoapatl-Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) Pflanzenteile, die die uteroevakuierenden Wirkstoffe enthalten mit einem mit Wasser nich-t mischbareIl organischen Lösungsmittel extrahiert, wobei ein Genri.sch aus einer organischen, zumindest einen Teil der uteroevakuierenden Wirkstoffe enthaltenden Phase und einer festen Phase erhalten wird, (b) die organische Phase von der festen Phase abtrennt und (c) die organische Phase zur Abtrennung von zumindest einem Teil der uteroevakuierenden l,rirkrstoffe mit Wasser behandelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zoapatl-Pflanze Montanoa tomentosa oder Montanoa floribunda verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) bei Temperaturen von 30 bis 80 0C und die Stufe (c) bei Temperaturen von 25 bis 1000C durchführt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel einen niederen aliphatischen Ester, einen aliphatischen Kohlenwasserstoff, einen aromatischen Kohlenwasserstoff oder einen aliphatischen Alkohol verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gek£nnzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Essigsäureäthylester, Hexan, Chloroform oder Benzol verwendet.
11. Präparat mit uteroevakuierender T¢Jirkung, dadurch gekennzeichnet, daß es gemäß Anspruch 3 erhalten w-orden ist.
12. Präparat mit uteroevakuierender tt1rkung, dadurch gekennzeichnet, daß es gemäß Anspruch 8 erhalten worden ist.
13. Verfahren zur Reinigung von gemäß Anspruch 1 bis 6 erhaltenen Extrakten aus der Zoapatl-Pflanze, die uteroevakuierende Wirkstoffe enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) den Extrakt mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt, (b) die erhaltene Lösung zur Entfernung von wasserlöslichen und sauren Verunreinigungen mit einer wäßrigen Lösung einer schwachen Base behandelt, löslichen Bestandteile (c) die in der organischen Phase/zur Abtrennung von uteroevakuierenden Wirkstoffen zumindest einmal der Säulenchromatographie an einem Adsorptionsmittel unterwirft und (d) die Säule mit einem zweiten Lösungsmittel oder eillem tosungsmittelgemisch eluiert.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeiclme-t, daß man als Zoapatl-Pflanze Montanoa tomentosa oder Mon-tanoa floribunda verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel einen niederen aliphatischen Ester, einen aliphatischen Kohlenwasserstoff, einen aromatischen Kohlenwasserstoff, einen chlorierten Kohlenwassnrs-toff oder einen aliphatischen Ester verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid oder Diäthyläther verwendet.
17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elutionsmittel einen aromatischen Kohlenwasserstoff, einen niederen aliphatischen Ester oder ein Gemisch aus polaren und nicht-polaren Lösungsmitteln verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel ein Gemisch aus Benzol und Essigsäureäthylester verwendet.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gemisch aus einem polaren und einem nicht-polaren Lösungsmittel ein Gemisch aus Isopropanol und Chloroform verwende.
20. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel ein Vinylacetat-Copolymerisat verwendet.
21. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Kieselsäure verwendet.
22. Verfahren zur Reinigung von gemäß Anspruch 1 bis 6 erhaltenen Extrakten aus der Zoapatl-Pflanze, die uteroevalruierende Wirkstoffe enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) den Extrakt mit einem mit Wasser nich-t mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt, (b) die erhaltene Lösung zur Entfernung von wasserlöslichen mit und sauren Verunreinigungen/einer waßrigen Lösung einer schwachen Base behandelt, (c) die in der organischen Phase löslichen Bestandteile der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie an einer mit einem Adsorptionsmittel beschickten Säule untertJirft und die Säule mit einem zweiten organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch bei einem Druck von 20 bis 35 at eluiert.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes organisches Lösungsmittel einen niederen aliphatischen Ester, einen aliphatischen Kohlenwasserstoff, einen aromatischen Kohlenwasserstoff, einen aliphatischen Äther oder einen chlorierten Kohlenwasserstoff verwendet.
24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweites organisches Lösungsmittel einen aliphatischen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch verwendet.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man als I.ösungsmittel ein Gemisch aus Hexan und Dioxan verwendet.
26. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck von 24 bis 32 at arbeitet.
27. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Kieselgel verwendet.
28. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zoapatl-Pflanze Montanoa tomentosa oder Montanoa floribunda verwendet.
29. Präparat mit utereevakulerender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Anspruch 13 erhalten worden ist.
30. Präparat mit uteroevakuierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Anspruch 22 erhalten worden ist.
31. Verfahren zur Reinigung von gemäß Anspruch 1 bis 6 erhaltenen Extrakten aus der Zoapatl-Pflanze, die uteroevakuierende Wirkstoffe enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt in einem mit Wasser nicht-mi-schbaren organischen Lösungsmittel wäscht, die erhaltene Lösung mit einer wäßrigen Lösung einer schwachen Base wäscht, die organische Phase von der wäßrigen Phase abgetrennt, die Lösung auf eine mit einem Adsorptionsmittel beschickte Säule aufsetzt, die Säule mit einem Gemisch aus einem polaren und einem nicht-polaren Lösungsmittel eluiert, die Fraktionen mit uteroeva.huierender Aktivität vereinigt, das Lösungsmittel entfernt, den Riickstand in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel löst, diese Lösung auf eine mit einem organischen polymeren Gel beschickte Säule aufsetzt, die Säure mit einer.! nicht-polaren organischen Lösungsmittel eluiert und die Fral-tionen mit uteroevakuierender Aktivität auffängt.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zoapatl-Pflanze Nontanoa to.itentosa oder Montanoa floribunda verwendet.
33. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser nicht-mischbares Lösungsmittel einen aromatischen Kohlenwasserstoff, einen chlorierten Kohl enwas 5erstoff oder einen aliphatischen Äther verwendet.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel, Diäthylä-ther, Chloroform oder Benzol verwendet.
35. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Kieselsäure, Kieselgel oder Florisil Magnesiumsilikatgel) verwendet.
36. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gemisch aus einem polaren und ci.nem nicht-polaren Lösungsmittel ein Gemisch aus Chloroform und Isopropanol veïazendet.
37. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man als polymeres Gel ein Vinylacetat-Copolymerisat verwendet.
38. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichne-t, daß man als nicht-polares Lösungsmittel Benzol verwendet.
39. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man als schwache Base Natriumhydrogencarbonat verwendet.
40. Präparat mit uteroevakuierender Wirkung, erhalten gemäß Anspruch 31, mit folgenden physikalischen Eigenschaften: 1R-Spektrum 3 : 6,11, 5,48, 4,25, 4,13, 3,56, 2,11, 2,08, 1,48, 1,13 und 1,01 ppm; IR-Spektrum (Reinsubstanz) 2,90, 5,96 und 6,21 µ.
41. Präparat mit uteroevakuierender Wirkung, erhalten nach Anspruch 31, mit folgenden physikalischen Eigenschaften: NMR-Spektrum CDCl3: 5,41, 4,26, 4,15, 3,58, 3,18, 2,18, 1,76, TMS 1,67, 1,15 und 1,04 ppm; IR-Spektrum (Reinsubstanz): 2,91 und 588ji.
42. Verfahren zur Reinigung von gemäß Anspruch 1 bis 6 erhaltenen Extrakten aus der Zoapatl-Pflanze, die uteroevakuie rende Wirkstoffe enthalten, dadurch gekenrlzeichnet, daß man den Extrakt in einem niederen aliphatischen Äther löst, die Lösung mit einer wäßrigen Lösung einer schwachen Base wäscht, die organische Phase von der wäßrigen Phase abtrennt, die Lösung auf eine mit einem Adsorptionsr.littel beschickte Säule aufsetzt, die Säule mit einem Gemisch aus einem polaren und einem nicht-polaren Lösungsmittel eluiert, die Fraktionen mit uteroevakuierender Aktivität vereinigt, das Lösungsmittel entfernt, den Rückstand in einem aromatischen Kohlenwasserstoff löst, die Lösung auf eine mit einem polymeren Gel beschickte Säule aufsetzt, die Säule mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff eluiert und die Fraktionen mit uteroevakuierender Mftivität auffängt.
43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zoapatl-Pflanze Montanoa tomentosa oder Montanoa floribunda verwendet.
44. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man als aliphatischen Äther Diäthylä-ther verwendet.
45. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Kieselsäure oder Kieselgel verarendet.
46. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gemisch aus einem polaren und einem nicht-polaren Lösungsmittel Chloroform und Is-opropanol verwendet.
47. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man als aromatischen Kohlenwasserstoff Benzol verwendet.
48. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man als polymeres G7 ein Vinylacetat-Copolymerisat verarerjdet.
49. Arzneipräparate, bestehend aus einem Präparat gemäß Beispiel 1 bis 48 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffc-n.