DE2631887A1

DE2631887A1 - Antibioticagemisch a-32390 und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2631887A1
Application number: DE19762631887
Authority: DE
Inventors: Marvin Martin Hoehn; Gary G Marconi; Arvind Lavji Thakkar
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1975-07-18
Filing date: 1976-07-15
Publication date: 1977-01-20
Also published as: IL49739A0; FR2354776A1; JPS5212986A; FR2354776B1

Description

Antibioticagemisch A-32390 und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Antibioticagemisch A-32390, das die Faktoren A, B, C und D enthält, seine Herstellung durch submeres Züchten von Pyrenochaeta sp. NRRL 5786 unter aeroben Bedingungen, seine Trennung und die Isolierung der Faktoren A, B, C und D. Sie ist ferner auf das Antibioticum A-32390 Faktor A und dessen Tetra-(C₃-C₄)acylester sowie deren Zubereitungen mit Polyvinylpyrrolidon, das ein Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 360 000 hat, gerichtet. Der Komplex des Antibioticagemisches A-32390, der antibiotische Faktor A und dessen Acylester hemmen eine Dopaminß-hydroxylase und sind antifungal, antibakteriell sowie Hypotensiv wirksam.

Die Angabe "Antibioticagemisch" bezieht sich vorliegend auf ein Gemisch gleichzeitig gebildeter einzelner antibiotischer Faktoren. Das Verhältnis der Einzelfaktoren im Antibioticagemisch schwankt in Abhängigkeit von den zu seiner Herstellung angewandten Fermentationsbedingungen.

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Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines neuen Antibioticagemisches A-32390, der Faktoren A, B, C und D des Antibioticums A-32390 und der Tetra-(C₃-C₄)-acylester von Antibioticum A-32390 Faktor A.

Ferner sollen erfindungsgemäß Verfahren zur Herstellung und Trennung des Antibioticagemisches A-32390, das die Faktoren A, B, C und D des Antibioticums A-32390 enthält, zur Isolierung der Faktoren A, B, C und D sowie zur Herstellung der Tetra-(C₂-C₄)-acylester des Antibioticums A-32390 Faktor A geschaffen werden. Die Herstellung des Antibioticagemisches A-32390 erfolgt durch sumberses Züchten eines neuen Stammes von Pyrenochaeta sp. NRRL 5786 unter aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer entsprechenden Menge an antibiotischer Aktivität. Das Antibioticagemisch A-32390 wird aus dem Fermentationsmediura durch Extrahieren der Brühe mit einem polaren organischen Lösungsmittel und Einengen des Extrakts gewonnen, wodurch man das Antibioticagemisch in Form eines unreinen kristallinen Feststoffes erhält. Das Antibioticum A-32390 Faktor A wird von den anderen Faktoren von A-32390 in an sich bekannter Weise abgetrennt und als Einzelverbindung isoliert, was beispielsweise durch Saulenchromatographie oder durch Dünnschichtchromatographie geschehen kann. Die Tetraacylester des Antibioticums A-32390 Faktor A werden aus dem Faktor A durch übliche Acylierung hergestellt.

Schließlich soll erfindungsgemäß eine neue Zubereitung aus dem Faktor A des Antibioticums A-32390 und/oder dessen Tetra-(C₃-C₄)-acylestern mit einem Excipiens, wie Polyvinylpyrrolidon, das ein Molekulargewicht von 10 0OO bis 36O 000 hat, geschaffen werden.

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Das Antibioticagemisch A-32390 und das Antibioticum A-32390 Paktor A hemmen das Wachstum von Organismen, die Pathogene gegenüber Tier und Pflanze sind. Die Antibiotica A-32390 zeichnen sich besonders durch ihre Wirksamkeit gegenüber Pilzen, wie Candida albicans, aus. Ferner hemmen das Antibioticagemisch A-32390, das Antibioticum A-32390 Paktor A und die Tetra-(C₂-C₄)-acylester des Antibioticums A-32390 Paktor A das Enzym Dopamin-ß-hydroxylase, und diese Verbindungen sind auch hypotensive Mittel.

Erfindungsgemäß werden nun neue Antibioticagemische A-32390 mit den Paktoren A, B, C und D sowie neue Tetra-(C₃-C₄)-acylester von Faktor A geschaffen.

Ferner werden erfindungsgemäß das Antibioticum Faktor A und dessen Tetra-(C₃-C₄)-acylester geschaffen, die die Formel

RQ,/ HH „

haben, worin alle Substituenten R gleich sind und für Waiserstoff, Acetyl, Propionyl und Butyryl stehen.

Schließlich wird erfindungsgemäß ein neues Verfahren zur Herstellung des Antibioticagemisch.es A-32390 mit den Faktoren A, B, C und D sowie der Tetra-(C--C₄)acylester des Faktors A geschaffen, das darin besteht, daß man

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BRD - 4 -

(a) Pyrenochaeta sp. NRRL 5768 oder eine Mutante hiervon, die das Antibioticagemisch A-32390 produziert, in
einem assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium submers unter aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivität züchtet,

(b) das Antibioticagemisch A-32390 gegebenenfalls vom
Kulturmedium trennt,

(c) aus dem Antibioticagemisch A-32390 gegebenenfalls
die Antibiotica A-32390 Faktoren A, B, C und D isoliert, und

(d) das Antibioticum A-32390 Faktor A gegebenenfalls
acyliert.

Die Erfindung ist ferner auf eine neue antibiotische Zubereitung aus einem Excipiens und einem antibiotischen
Wirkstoff gerichtet, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als Wirkstoff das Antibioticum A-32390 Faktor A oder einen Tetraacylester hiervon der Formel

RO,

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BRD - 5 -

worin alle Substituenten R gleich sind und für Viasserstoff, Acetyl, Propionyl und Butyryl stehen, enthält.

Das erfindungsgemäße Antibioticagemisch A-32390 enthält wenigstens vier Faktoren, die als Faktoren A, B, C und D bezeichnet werden. Diese bisher voneinander getrennten Faktoren scheinen strukturell miteinander verwandt zu sein und weisen für Polyhydroxyalkohole charakteristische chemische, physikalische und Spektraleigenschaften auf. Diese antibiotischen Faktoren werden während der Fermentationszeit gebildet und fallen in Form eines Gemisches an. Die Faktoren werden dann voneinander getrennt, und der Faktor A wird als Einzelverbindung isoliert, wie dies später beschrieben wird. Das teilweise reine Antibioticagemisch A-32390 ist ein graues Pulver, das in Dimethylformamid, Dimethylacetamid und Dimethylsulfoxid löslich ist, sich etwas in niederen Alkoholen, Aceton, Äthylacetat und Chloroform löst, in Wasser, Benzol, Hexan, Diäthyläther und Tetrachlorkohlenstoff jedoch praktisch unlöslich ist.

Die Faktoren A, B, C und D werden auf chromatographischem Wege aus dem Antibioticagemisch A-32390 abgetrennt. Die Dünnschichtchromatographie auf Silicagel G (Merk, F-254) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform und Methanol (9:1) führt beispielsweise zu einer Auftrennung von A-32390 in die Faktoren A, B, C und D. Unter Verwendung von Sarcina lutea ATCC 3241 als Detektionsorganismus erhält man in diesem System für die einzelnen Faktoren von A-32390 folgende R_f-Werte:

Faktor R_f

A 0,32

B 0,23

C 0,15

D 0,05

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In den folgenden Ausführungen werden die physikalischen und spektralen Eigenschaften von A-32390 Faktor A beschrieben.

Das Antibioticum A-32390 Faktor A ist eine weiße kristalline Verbindung, die bei etwa 162 ⁰C schmilzt. Die für den Faktor A vorgeschlagene empirische Formel ist ^cio^H24^N2°8" Die Elementaranalyse des Faktors A ergibt folgende prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff 54,63 %, Wasserstoff 6,03 %, Stickstoff 7,38 %. Die aus der Differenz gebildete Sauerstoff menge würde 31,96 % betragen. Dies entspricht folgender berechneter prozentualer Zusammensetzung: Kohlenstoff 54,6 %, Wasserstoff 6,06 %, Stickstoff 7,07 %, Sauerstoff 32,27 %. Das durch raassenspektroskopische Untersuchung bestimmte Molekulargewicht des Faktors A beträgt 396. Der spezifische Drehwert für den Faktor A /alpha/_D ist +17° (c=1, Dimethylformamid) .

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibioticums A-32390 Faktor A in Mineralölmull geht aus Figur 1 der anliegenden Zeichnung hervor. Im Infrarotspektrum lassen sich folgende Banden unterscheiden (y = schwach, m = mittel, s = stark): 2,92(s), 4,64(m), 5,73(m-s), 5,76(m-s), 6,14(w-m), 7,54(m), 7,74(m), 7,89(w), 8,O8(m-s), 8,21 (w-m), 8,8O(w), 9,15(m-s), 9,4O(w), 9,6O(w), 1O,25(w), 1O,45(w-m), 11,05(w), 11,20(w), 12,22(w), 13,00(w-m) und 13,16(w) Mikron.

Das ültraviolettabsoprtionsmaximum des Antibioticums A-32390 Faktor A in 95-prozentigem Äthanol ergibt ein Absorptionsmaximum lambda_m!!iv bei 230 nm (Epsilon 27 900) .

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Das magnetische Kernresonanzspektrum des Antibioticums A-32390 Faktor A in Dimethylsulfoxid geht aus Figur 2 der anliegenden Zeichnung hervor. Dieses Spektrum zeigt folgende Charakteristiken: delta 2,11 (s) , 2,24 (s), 3,61 (dd, J = 9, 7Hz), 3,77 (dddd, J = 9, 6, 5,5, 2 Hz), 4,21 (dd, J = 11, 6HZ), 4,45 (dd, J β 11, 2 Hz), 4,42 (austauschbares d, J = 7 Hz) und 4,91 ppm (austauschbares d, J= 5,5 Hz).

Aus Aceton umkristallisiertes Antibioticum A-32390 Faktor A zeigt folgendes charakteristisches Pulverröntgenbeugungsspektrum (Chromstrahlung 2,2896 lambda, Vanadiumfilter, d = Interplanarabstände in Angström, 1/I₁ = relative Intensität) :

d 1/I₁

18,75 100

9,33 50

7,48 10

6,93 10

. 6,46 70

6,11 40

5,17 70

4,77 30

4,54 30

4,27 30

3,76 10

3,60 70

3,46 60

3,33 05

3,25 30

3,02 ' 05

2,48 05

2,37 05

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Das Antibioticum A-32390 Faktor A ist in Dimethylformamid, Dimethylacetamxd und Dirnethylsulfoxid löslich/ es löst sich etwas in Aceton, fithylacetat und Chloroform, ist in Wasser, Benzol, Hexan, Diäthylather und Tetrachlorkohlenstoff jedoch praktisch unlöslich. Das Antinioticum A-32390 Faktor A ist ferner etwas in niederen Alkoholen löslich, darin jedoch instabil.

Die Strukturbestimmung des Antibioticums A-32390 Faktor A ergibt folgende Formel

Diese Struktur wird als 1,6-Di-O-(2-isocyano-3-methylcrotonyl)-■ D-mannit bezeichnet. Die Isocyanogruppen sind in obiger Formel als Gruppe -N=C: eingezeichnet.

Das Antibioticum A-32390 Faktor A hat vier veresterbare Hydroxylgruppen. Die Tetra-(C₂-C₄)-acylester von A-32390 Faktor A werden durch übliche Veresterung aus dem Faktor A hergestellt.

Das Antibioticum A-32390 Faktor A und die Tetra-(C₃-C₄)-acylester von A-32390 Faktor A lassen sich durch folgende Strukturformel darstellen:

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worin alle Substituenten R gleich sind und für Wasserstoff, Acetyl, Propionyl und Butyryl stehen.

Die Tetra-(C₃-C₄)-acylester von A-32390 Faktor A sind öle und haben daher keine bestimmten Schmelzpunkte. Die einzelnen Tetra-(C₃-C₄)-acylester von A-32390 Faktor A lassen sich dünnschichtchromatographisch über Silicagel G (Merck F-254) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform und Methanol (99:1) voneinander trennen. Durch Einsatz von Sarcina lutea ATCC 3241 als Detektionsorganismus ergeben sich dabei folgende R_f-Werte:

Faktor-A-Derivate	^Rf
Tetraacetat	0,30
Tetrapropionat	0,41
Tetrabutyrat	0,45

Der das Antibioticagemisch A-32390 produzierende Organismus ist durch Reihenverdünnungsverfahren aus einer subtropischen Bodenprobe gewonnen worden. Dieser Organismus ist taxonomisch als neuer Stamm des Genus Pyrenochaeta, der der Ordnung Sphaeropsidales der Deuteromycetes (Fungi Imperfecti) angehört, charakterisiert worden.

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Kulturcharakteristiken Czapek's-Lösung-Agar

Bei 26 ⁰C wächst die Kultur schlecht und bildet wenige gestreute Pycnidien.

Malz-Extrakt-Agar

Nach 7-tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 26 C bilden sich reichliche Lufthyphen mit verhältnismäßig wenigen und weit verstreuten Pycnidien.

Kartoffel-Dextrose-Agar

Nach 7 Tage langer Inkubation bei einer Temperatur von 26 C sind zahlreiche häufig büschel- oder traubenförmige Pycnidien und kurze Lufthyphen entstanden. Oberseite und Unterseite der Kolonie sind bräunlich-schwarz. Der Koloniendurchmesser beträgt nach 8 Tagen 35 bis 40 mm, und im Anschluß daran kommt es zu einem geringen weiteren Wachsen.

Morphologische Eigenschaften

Die Pycnidien liegen an der Oberfläche, wachsen in dichten Büscheln, sind membranartig bis subkohleartig, schwarz, haben eine offene und leichtschnabelförmige Ostiole, sind büschelartig, kugelförmig bis subkugelförmig und 135 χ 155 .u bis 235 χ 275 ,u groß, wobei der Mittelwert 169 χ 195 ,u beträgt.

Die Borstenhaare oder Seten sind steif, braun bis schwarz, verjüngen sich zu abgerundeten Spitzen, sind 3- bis 5-fach septiert und haben vergrößerte Basisenden, die um eine

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nahezu kreisförmige Ostiole einen dunkelbraunen Ring bilden (Wirbeleffekt). Gelegentlich kommen auch Seten ohne verbreitertem Basisende über die Pycnidienoberflache verstreut vor. Die Seiten sind in der Nähe der Basis 63 χ 2 ,u bis 112 χ 6,2,u groß (Mittelwert 81,25 χ 6,2 »u) .

Durch die Ostiole ragen einzellige Sporen aus einer Mucoidmasse heraus. Die Sporen sind hyalin, cylindrisch (wenige sind allentoid) mit abgerundeten Enden und sind bigluttulat. Die Sporen sind 7 bis 9 Ai lang und 2,8 /U breit (Mittelwert 8,4 χ 2,8 /U). Sie haben die Form von Phialiden, die aus der Pycnidienwand entspringen. Diese Phialiden verjüngen sich vom Fuß zur Spitze (von 2,8 auf 1,8 ,u) und sind 18,2 bis 29,4 ,u lang (Mittelwert 22 ,u) .

Eine Kultur des A-32390 produzierenden Organismus ist in der ständigen KulturSammlung des U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604 ohne Beschränkung über ihre Verfügbarkeit hinterlegt und dort mit der Nummer NRRL 5786 bezeichnet worden.

Wie im Falle anderer Organismen, so lassen sich auch die Eigenschaften des A-32390 produzierenden Stammes von Pyrenochaeta sp. NRRL 5786 verändern. Durch verschiedene· bekannte mutagene Mittel, wie Ultraviolettbestrahlung, Röntgenbestrahlung, Hochfrequenzwellen, radioaktive Bestrahlung und Chemikalien, lassen sich beispielsweise künstliche Varianten und Mutanten des Stammes NRRL 5786 herstellen. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten, die zur Species Pyrenochaeta gehören und die Antibiotica A-32390 produzieren, können erfindungsgemäß verwendet werden.

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Zur Bildung des Antibioticagemisches A-32390 kann man als Kulturmedium eine Reihe Medien verwenden, da der A-32390 produzierende Organismus in der Lage ist, Energie aus einer Reihe von Nährquellen zu utilisieren. Das Kulturmedium kann daher beispielsweise die verschiedensten Kohlenhydrate enthalten, damit der Organismus seinen Bedarf an Kohlenstoff decken kann. In ähnlicher Weise können in dem Medium A-32390 verschiedene Quellen für Stickstoff, wie Aminosäuren, Destillationsextrakte oder dergleichen, verwendet werden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, einer optimalen Ausbeute und einer leichten Isolierbarkeit des Antibioticums werden bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Eine zur Fermentation bevorzugte Kohlenhydratquelle ist beispielsweise Glucose, man kann jedoch auch Fructose, Mannose, Maltose, Dextrin oder Saccharose hierfür verwenden.

Der Zusatz bestimmter Crotonsäurederivate, wie 2-Cyano-3-methylcrotonsäure, Äthyl-2-cyano-3-methylcrotonat oder Methoxyäthyl-2-cyano-3-methylcrotonat, zu den Kulturmedien scheint die Ausbeute an Antibioticumkomplex A-32390 zu verbessern.

Äthylalkohol ist ein weiteres Mittel, das dem Kulturmedium zur Verbesserung der Ausbeute der Antibiotica A-32390 zugesetzt werden kann.

Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl und Aminsäuregemische. Wie bei der Produktion von Antibiotica allgemein üblich kann das Kulturmedium zur Produktion der Antibiotica A-32390 auch mit anorganischen Nährsalzen versetzt werden. Solche anorganische Nährsalze sind gewöhnlich Salze, aus denen man Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid- und Carbonationen erhält.

Die zum Wachsen und zur Entwicklung des A-32390 produzierenden Organismus essentiellen Elemente sollen ebenfalls im Kulturmedium vorhanden sein. Solche essentiellen Elemente

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werden gewöhnlich lediglich in Spurenmengen benötigt. Diese Spurenelemente kommen normalerweise als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die für ein Wachsen des A-32390 produzierenden Organismus ausreichen.

Der Stamm des zur Herstellung der Antibiotica A-32390 verwendeten Organismus kann unter einer Reihe von Bedingungen wachsen. So wächst der Organismus beispielsweise in verschiedenen Medien, bei denen der pH-Wert zu Beginn ziemlich stark schwankt. Zweckmäßigerweise beginnt man die Fermentation jedoch in einem Medium mit einem pH-Wert von etwa 6 bis 8, vorzugsweise etwa 6 bis 7. Während des Wachsens des Organismus fällt der pH-Wert des Mediums normalerweise etwas unter den Anfangswert ab. Der pH-Endwert des Kulturmediums hängt wenigstens zum Teil von Faktoren ab, wie dem pH-Anfangswert des Mediums, den darin vorhandenen Puffern und der Zeitdauer, über die man den Organismus wachsen läßt.

Der erfindungsgemäße A-32390 produzierende Organismus kann auf verschiedenen Medienarten wachsen und eine antibiotische Aktivität produzieren. Der Organismus kann auf Schrägagar, in Schüttelflaschen oder in mittelgroßen oder großtechnischen Fermentationstanks wachsen. Für die großtechnische Produktion dieser Antibiotica werden submerse aerobe Fermentationsbedingungen bevorzugt. Zur Herstellung verhältnismäßig kleiner Mengen des Antibxoticakomplexes A-32390 wird in einer Schüttelf laschenkultur gearbeitet.

Zur Durchführung einer submersen aeroben Fermentation unter Bildung der Antibiotica A-32390 läßt man den Organismus zuerst auf Schrägagarkulturen oder vorzugsweise in submerser aerober Kultur in einem Glycerin-Lactose-Medium wachsen, wobei letztere in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff aufgehoben wird. Der Pilz wird dann in ein vegetatives Medium übertragen, damit der Organismus in einem kleinen Maßstab rasch wachsen kann. Dieses inokulierte vegetative Medium

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läßt man dann bis zum Erhalt einer Lebendkultur des Organismus wachsen, mit der man anschließend einen größeren Tank beimpft. Der Einsatz eines vegetativen Mediums als Zwischenstufe bei der Bildung des Antibioticums wird gegenüber einer direkten Inokulation eines großen Tanks bevorzugt. Durch Inokulation eines großen Tanks mit einem vegetativen Medium erhält man ein rascheres Wachstum des Organismus als durch direkte Inokulation mit Sporen.

Der A-32390 produzierende Organismus wächst bei Temperaturen im Bereich von etwa 13 bis 37 C. Zu einer optimalen Produktion an Antibioticum scheint es bei Temperaturen von etv/a 22 bis 28 °C zu kommen.

Wie bei aeroben submersen Kulturverfahren üblich, bläst man auch vorliegend während des Fermentationsverfahrens sterile Luft durch das Kulturmedium. Für ein wirkungsvolles Wachsen des Organismus und eine entsprechende Produktion an Antibioticum arbeitet man vorzugsweise mit einem Luftvolumen von mehr als etwa 0,1 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute (V/V/M). Bei einer submersen aeroben Fermentation der Antibiotica A-32390 erhält man optimale Ausbeuten, wenn bei einem Luftvolumen von wenigstens 0,3 V/V/M gearbeitet wird.

Wird nach einem submersen aeroben Fermentationsbedingungen oder nach Schüttelflaschenkulturbedingungen gearbeitet, dann kommt es innerhalb von etwa 3 bis 6 Tagen nach Inokulation des Kulturmediums zu einer maximalen Produktion der Antibiotica A3239O. Eine maximale Produktion der Antibiotica A-32390 tritt in großtechnischen Fermentationstanks unter submersen aeroben Bedingungen bei etwa 96 Stunden auf.

Der Verlauf der Fermentation läßt sich verfolgen, indem man das Fermentationsmedium von Zeit zu Zeit gegenüber einem gegen die Antibiotica A-32390 empfindlichen Organismus untersucht. Ein hierzu geeigneter Organismus ist Sarcina Iutea ATCC 9341.

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Nach erfolgter Produktion unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man die Antibiotica A-32390 aus der Fermentationsbrühe nach in der Fermentationstechnik bekannten Verfahren gewinnen. Die filtrierte Brühe enthält den größten Anteil der während der Fermentation entstandenen Antibiotica A-32390. Das Mycel enthält eine verhältnismäßig geringe Menge an Antibiotica A-32390.

Unter den bisher eingesetzten Bedingungen produziert der oben beschriebene und als Pyrenochaeta sp. NRRL 5786 bezeichnete Organismus den Faktor A als den überwiegenden Faktor. Im allgemeinen ist der Faktor A in Mengen von etwa 60 bis 95 %, bezogen auf die Gesamtmenge der gewonnenen Antibiotica A-32390, vorhanden.

Die Antibiotica A-32390 werden aus dem Fermentationsmedium in Form eines antibiotischen Gemisches gewonnen. Nachdem sich der Großteil der antibiotischen Aktivität in der Brühe befindet, erfolgt die Gewinnung vorzugsweise durch Filtrieren des Fermentationsmediums. Die filtrierte Fermentationsbrühe extrahiert man dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel. Im Anschluß daran wird der dabei erhaltene Extrakt mit einem Trockenmittel behandelt und nachfolgend auf ein geringes Volumen eingeengt, wodurch man den Antibioticakomplex A-32390 in Form eines rohen halbkristallinen festen Niederschlags erhält.

Zum Extrahieren der filtrierten Brühe eignen sich vor allem Ester, wie Äthylacetat, Amylacetat oder Isamylacetat. Äthylacetat wird als Lösungsmittel zur Extraktion bevorzugt.

Eine andere Methode zur Gewinnung des Antibioticagemisches A-32390 besteht in einer Absorption auf einem macronetzartigen Harz, wie Amberlite* ' XAD-2 oder XAD-4 (Rohm und Haas). Als Eluiermittel für dieses Verfahren eignet sich insbesondere Aceton.

609883/137?

Wahlweise kann man auch die gesamte Fermentationsbrühe mit einem geeigneten mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie frthylacetat, extrahieren und den dabei erhaltenen Extrakt dann eindampfen, wodurch man das Antibioticagemisch A-32390 erhält.

Das Antibioticagemisch A-32390 läßt sich durch übliche Methoden reinigen, wie durch fraktionierte Kristallisation oder durch Chromatographie über ein geeignetes Adsorbens. Beispiele geeigneter Adsorptionsmittel sind Silicagel oder Magnesiumsilicat.

Die Abtrennung und Isolierung des Antibioticums A-32390 Faktor A als Einzelverbindung erfolgt am einfachsten durch eine Kombination aus fraktionierter Kristallisation und chromatographischen Methoden. Die Abtrennung des Faktors A aus dem Antibioticumgemisch A-32390 kann so beispielsweise durch Chromatographieren über Silicagel und nachfolgendes Kristallisieren aus Aceton erfolgen. Nach Kristallisation und Abtrennen des Faktors A sind in der Mutterlauge die in geringerer Menge vorhandenen Faktoren B, C und D enthalten. Diese weniger häufigen Faktoren können beispielsweise durch präparative Dünnschichtchromatographie weiter abgetrennt werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert .

Beispiel 1 A. Schrägkultur von A-32390

Auf Schrägagar folgender Zusammensetzung wird eine Kultur von Pyrenochaeta sp. 5786 hergestellt:

1)09883/137?

	g	2631887
Menge	g
20,00	g
20,00	g
5,00	g
0,50	g
0,02	g.s. auf
0,01
	1 Liter

- 17 Bestandteile

Agar (Meer, dreimal gewaschen) 20,00 g

Dextrose Pepton KH₂PO₄ MgSO₄.7H₂O

FeSO..7H_nO 4 2

Deionisiertes Wasser

Den pH-Wert des Mediums stellt man durch Zusatz von Natriumhydroxid auf pH 6,2 ein. Nach Sterilisation hat das Medium einen pH-Wert von etwa 5,4.

Die Schräge wird mit Pyrenochaeta sp. NRRL 5786 beimpft, und die beimpfte Schräge wird anschließend 7 Tage bei einer Temperatur von 25 ⁰C bebrütet.

B. Schüttelflaschenfermentation von A-32390

Eine Hälfte der reifen Schrägkultur wird mit einer sterilen Nadel abgekratzt und zur Beimpfung von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile Menge

Glucose Verwertbare Melasse Maisquellwasser Malzextrakt

N-Z Case⁺ Czapek's Mineralgemisch Deionisiertes Wasser

Enzymatisches Abbauprodukt von Casein, Sheffield Chemical Co., Norwich, New York

Czapek¹s-Mineralvorgemisch hat folgende Zusammensetzung:

25	g
36	g
6	g
10	g
10	g
2	ml
q.s.	auf 1100 ml

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Bestandteile	Menge
FeSO₄.7H₂O
(gelöst in 2 ml konz. HCl)	2 g
KCl	100 g
MgSO₄.7H₂O	100 g
Deionisiertes Wasser	q.s. auf 1 Liter

Das in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben befindliche inoculierte vegetative Medium inkubiert man über eine Zeitspanne von 2 Tagen bei einer Temperatur von 25 ⁰C in einem Schüttler, der unter einem Bogen von 5 cm Durchmesser bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute rotiert.

Das auf diese Weise inkubierte vegetative Medium kann dann direkt zum Beimpfen des vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet werden, oder man kann es gegebenenfalls auch aufheben, indem man die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff hält. Die Kultur wird für eine spätere Verwendung wie folgt in verschiedene kleine Ampullen abgefüllt: In jede Ampulle werden 2 ml inkubiertes vegetatives Medium und 2 ml einer Glycerin-Lactose-Lösung folgender Zusammensetzung gegeben:

Bestandteile Menge

Glycerin 200 g

Lactose 100 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Die auf diese Weise hergestellten Suspensionen werden in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff gelagert.

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Mit 1 ml einer auf diese Weise hergestellten und gelagerten Suspension beimpft man dann 50 ml eines vegetativen Mediums erster Stufe, das die gleiche Zusammensetzung wie das vorher beschriebene vegetative Medium hat. Zwei gekrümmte inoculierte Kolben (250 ml) werden 2 Tage bei einer Temperatur von
25 C auf Schüttlern inkubiert, die sich unter einem Bogen
von 15 cm Durchmesser bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute bewegen.

Zur Bildung eines größeren Volumens an Inoculum beimpft man dann mit 10 ml des inkubierten vegetativen Mediums aus der
ersten Stufe 200 ml eines vegetativen Mediums einer zweiten Stufe, das ebenfalls die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Medium hat. Vier gekrümmte inoculierte Kolben (Volumen 1 1) werden hierzu 1 Tag bei einer Temperatur von 25 C auf Schüttlern bebrütet, die sich unter einem Bogen von 5 cm Durchmesser bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute bewegen.

C. Tankfermentation von A-32390

Das inkubierte vegetative Medium der zweiten Stufe (800 ml) verwendet man zum Inoculieren von 100 1 sterilem Produktionsmedium folgender Zusammensetzung:

Bestandteile	Menge
Saccharose	30,00 g/l
Glucose	15,00 g/l
Baumwollsaatmehl	5,00 g/l
KCl	0,50 g/l
K₂HPO₄	0,20 g/l
FeSO-.7H₀O 4 2	0,01 g/l
NaNO₃	0,50 g/l
MgSO₄.7H₂O	0,50 g/l
Antischaummittel	0,70 g/l
Czapek-Mineralgemisch	2,00 ml/1
Äthanol (95 %)	14,00 ml/1
Deionisiertes Wasser	q.s.auf 1 Liter

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Dieses Medium hat einen nichteingestellten pH-Wert von 6,6. Vor der Sterilisation stellt man den pH-Wert des Mediums durch Zugabe von etwa 10 ml 10 normalem Natriumhydroxid auf pH 7,3 ein. Das Medium hat nach Sterilisation bei einer Temperatur von 120 C über eine Zeitspanne von 30 Minuten

2 bei einem Druck von 1,12 bis 1,27 kg/cm einen pH-Wert von

Das inoculierte Produktionsmedium läßt man dann in einem 165 1 fassenden Fermentationstank 4 Tage bei einer Temperatur von 25 C fermentieren. Während dieser Zeit wird das Fermentatationsmedium mit steriler Luft unter einer Geschwindigkeit von 0,25 V/V/M belüftet. Das Medium wird gleichzeitig mit einem üblichen Rührer bei einer Rührgeschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute gerührt.

Beispiel 2 Abtrennung des Antibioticagemisches A-32390

Die nach Beispiel 1 hergestellte Fermentationsbrühe (100 1) wird unter Verwendung von 3 bis 5 % einer Filterhilfe (Hyflo Supercel) filtriert. Das auf diese Weise erhaltene Brühenfiltrat (etwa pH 7,0) extrahiert man dann mit Äthylacetat (2 χ je 60 1). Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden unter Vakuum auf ein Volumen von 1 1 eingeengt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird 24 Stunden gekühlt (5 ⁰C). Der hierbei entstandene halbkristalline Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt, mit kaltem Äthylacetat (50 ml) gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet, wodurch man den Antibioticakomplex A-32390 erhält.

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263188?

Beispiel 3 Isolierung von A-32390 Faktor A

Das nach Beispiel 2 hergestellte Antibioticageinisch A-32390 (5 g) wird in Benzol (100 ml) aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung gibt man anschließend auf eine mit Silicagel (Matheson, Sorte 62) gefüllte 3,7 χ 90 cm messende Säule, die unter Verwendung von Benzol zubereitet worden ist. Im Anschluß daran eluiert man die Säule der Reihe nach mit Benzol (2 1), einem 1:1 Gemisch aus Benzol und Methylacetat (3 1) und Äthylacetat (500 ml). Durch weitere Elution mit Äthylaeetat (12,5 1) erhält man die das Antibioticum A-32390 Faktor A enthaltenden Fraktionen. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wird in heißem Aceton (50 ml) gelöst. Beim Abkühlen dieser Lösung kristallisiert A-32390 Faktor A aus. Der Faktor A wird durch Filtrieren abgetrennt, mit kaltem Aceton (10 ml) gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet (Ausbeute 1,5 g).

Beispiel 4 Herstellung von A-32390 Faktor-A-Tetraacetat

Das nach Beispiel 3 hergestellte Antibioticum A-32390 Faktor A (206 mg) wird in trockenem destilliertem Pyridin (5 ml) gelöst. Die Lösung wird dann mit Essigsäureanhydrid (2,5 ml) versetzt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung läßt man anschließend über Nacht bei Raumtemperatur stehen, worauf sie unter Vakuum zu einem Rückstand eingeengt wird. Der Rückstand wird in einem Gemisch aus Wasser und Aceton gelöst, und die erhaltene Lösung wird erneut unter Vakuum zu einem Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird dann in Chloroform gelöst und anschließend erneut unter Vakuum so oft bzw. solange eingedampft, bis der erhaltene Rückstand nicht mehr nach Pyridin riecht.

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Der auf diese Weise schließlich erhaltene Rückstand wird in 2 ml Chloroform gelöst, und die Lösung gibt man auf eine Silicagelsäule (Grace, Sorte 62, 1,5 χ 30 cm). Die Säule eluiert man mit Chloroform in einer Geschwindigkeit von etwa 3 ml pro Minute. Es werden 25 Fraktionen von jeweils 15 ml gesammelt. Die aktiven Fraktionen (7 - 11) werden vereinigt und unter Vakuum zu einem sirupartigen Rückstand eingeengt. Der Rückstand wird in Diäthyläther gelöst, worauf man die Lösung erneut eindampft und den dabei erhaltenen Rückstand unter Vakuum trocknet. Hierdurch erhält man 268 mg A-32390 Faktor A Tetraacetat in Form eines Sirups {Ausbeute 91 %) .

Beispiel 5

A-32390 Faktor A (827 mg) und Propionsäureanhydrid setzt man in Pyridin nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren um, wodurch man das Antibioticum A-32390 Faktor A Tetrapropionat erhält (430 mg, Ausbeute 52 %).

Beispiel6

A-32390 Faktor A (820 mg) und n-Buttersäureanhydrid setzt man in Pyridin nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren um, wodurch man das Antibioticum A-32390 Faktor A Tetrabutyrat erhält (549 mg, Ausbeute 67 %).

In der folgenden Erörterung der Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet man den Einzelfaktor A des Antibioticagemisches A-32390 und die Te^a-(C₃-C₄)-acylester des Faktors A der Kürze halber als antibiotische Verbindungen A-32390.

Die antibiotischen Verbindungen A-32390 hemmen das Wachstum von Mikroorganismen, die Pathogene für Tiere und Pflanzen sind. Die in vitro Wirksamkeit des einzelnen Faktors A von A-32390 und der verschiedenen Tetraacylester des Faktors A gegenüber typischen Organismen geht aus der folgenden Tabelle I hervor. Die Wirksamkeit wird durch den Durchmesser der Inhibierungszone gemessen, der durch den jeweiligen Wirkstoff beeinflußt wird, wobei man bei einer Wirkstoffkonzentration von 1 mg/ml arbeitet.

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Tabelle Organismus

Styphylococcus aureus Bacillus subtilis Sarcina lutea Macobacterium avium Saccharomyces pastorianus Neurospora crassa Candida tropicalis Fusarium moniliforme Trichophyton mentagrophytes Escherichia coli

	Zonendurchmesser	Tetra- propionat	Tetra- butyrat
Faktor A	Tetra acetat	12	Spur
30	20	11	—
30	20	12	9
28	■ 24	—	—
26	10	22	10
24	24	16	9
20	• 18	14	—
19	15	17	—
—	28	11	—
—	22	19
30	27

Es besteht ein starker Bedarf an besseren antifungalen Mitteln/ insbesondere an Mitteln, die systemisch wirken. Gegenwärtig gibt es zur Behandlung einer großen Anzahl ernster fungaler Erkrankungen nur ein einziges systemisches Arzneimittel der Wahl, nämlich Amphotericin B. über dieses Arzneimittel sind jedoch mehrere nachteilige Nebeneffekte berichtet worden. Die systemische antifungale Wirksamkeit der antibiotischen Verbindungen A-32390 ist daher ein wesentlicher erfindungsgemäßer Aspekt.

A-32390 Faktor A wirkt in vivo beispielsweise gegenüber Candida albicans. Entsprechende Untersuchungen an Mäusen unter Verwendung von A-32390 Faktor A haben nämlich nach subkutaner oder intraperitonealer Verabreichung zu einem Schutz gegenüber durch Candida albicans hervorgerufenen Infektionen geführt.

Bei entsprechend wiederholten Versuchen werden Candida albicans infizierte Mäuse mit 4 Dosen (25 bis 5O/kg, intraperitoneal) A-32390 Faktor A behandelt. Die Überlebenszeit der auf diese Weise infizierten und behandelten Mäuse ist um 100 % größer als die Überlebenszeit ähnlich infizierter Mäuse, die jedoch nicht mit Wirkstoff behandelt worden sind.

Die antibiotischen Verbindungen A-32390 sind verhältnismäßig untoxisch. Der LD -Wert (niedrigste akute Dosis, bei der kein Versuchstier eingeht) von A-32390 Faktor A an der Maus (subkutan) beträgt beispielsweise über 1000 mg/kg.

Zur Verwendung als antifungale Mittel werden die antibiotischen Verbindungen A-32390 parenteral verabreicht. Es ist zwar nicht unbedingt wesentlich, doch sind die antibiotischen Verbindungen A-32390 bei Verwendung als antifungale Mittel besser bioverfügbar, wenn man sie zusammen mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) als Zubereitung formuliert.

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Antibiotische Zubereitungen

Während der folgenden Erörterung antibiotischer Zubereitungen des Antibioticums A-32390 Faktor A und seiner Tetraacylester wird wiederum die Bezeichung antibiotische Verbindungen A-32390 verwendet.

Die neuen Zubereitungen aus A-32390 und Polyvinylpyrrolidon (PVP) enthalten einen Teil einer antibiotischen Verbindung A-32390 zusammen mit 1 bis 15 Teilen eines Polyvinylpyrrolidone mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 10 000 bis 360 000. Das Molekulargewicht des PVP stellt zwar kein kritisches Merkmal der Zubereitungen dar, die Herstellung bevorzugter Zubereitungen erfolgt jedoch unter Verwendung eines PVP mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 10 000 bis 60 000/ beispielsweise mit dem im Handel erhältlichen PVP mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000. Zur Herstellung entsprechender Zubereitungen bildet man zunächst getrennte Lösungen des Antibioticums A-32390 Und des PVP, worauf man beide Lösungen miteinander vermischt und die erhaltene Lösung dann eindampft. Der Zusatz einer geringen Menge eines Netzmittels, wie Polyoxyäthylen(20)sorbitanmonooleat, zur Zubereitung aus A-32390 und PVP ist häufig mit Vorteilen verbunden. Eine einfache Methode zur Herstellung solcher Zubereitungen besteht in einem getrennten Lösen des Netzmittels, des PVP und der jeweiligen Verbindung von A-32390 Faktor A in entsprechenden Lösungsmitteln, nachfolgendem Vermischen der drei Lösungen und anschließendem Eindampfen der dabei erhaltenen Lösung unter Bildung der gewünschten Zubereitung. Die Zubereitung aus A-32390 und PVP stellt eine besser bioverfügbare Form ' der antibiotischen Verbindung A-32390 dar. Mit zunehmender Menge an PVP in der Zubereitung nimmt die Menge an antibiotischer Verbindung A-32390 ab, die für eine antifungale Wirksamkeit benötigt wird.

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Bei Verwendung als antifungales Mittel hängt die Dosis der antibiotischen Verbindung A-32390 ferner auch von anderen Faktoren ab, wie beispielsweise von der Art und Stärke der jeweiligen Infektion. Im allgemeinen erhält man jedoch zufriedenstellende Ergebnisse unter Verwendung von Tagesdosen einer antibiotischen Verbindung A-32390 von etwa 120 bis 600 mg/kg Tierkörpergewxcht oder unter Verwendung von Tagesdosen einer Zubereitung aus A-32390 und PVP von etwa 30 bis 600 mg/kg Tierkörpergewicht. Diese Wirkstoffmenge verabreicht man gewöhnlich zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel, und sie läßt sich in unterteilten Dosen zwei bis viermal täglich verabfolgen.

Beispiel 7 Herstellung von Zubereitungen aus A-32390 Faktor A und PVP

Zur Herstellung von Zubereitungen aus A-3239O und PVP löst man A-32390 Faktor A in Aceton und PVP mit einem Molekulargewicht von 40 000 in Chloroform= Die beiden Lösungen werden dann miteinander vermischt. Im Anschluß daran versetzt man das Gemisch solange mit Aceton und/oder Chloroform, bis die Lösung klar ist. Die dabei erhaltene Lösung wird dann unter Vakuum unter Bildung eines kristallinen Rückstands eingedampft, den man zu einem feinen Pulver vermahlt. Auf diese Weise werden folgende Zubereitungen aus A-32390 Faktor A und PVP hergestellt:

Verhältnis von Menge an A-32390

A-32390 zu PVP Faktor A Menge an PVP

1:1 1:3 1:4 1:9

75O	mg	750	mg
500	mg	1500	mg
500	mg	2000	mg
500	mg	4500	mg

609883/13?

Beispiel 8

Herstellung netzmittelhaltiger Zubereitungen aus A-32390

A und PVP

Die Herstellung netzmittelhaltiger Zubereitungen aus A-32390 und PVP erfolgt durch Lösen von A-32390 Faktor A in Aceton, Lösen von PVP mit einem Molekulargewicht von 40 000 in Chloroform und Lösen von 0,01 % Tween 80 (Polysorbate 80) in Aceton (1 mg/ml). Diese drei Lösungen werden dann miteinander vermischt. Im Anschluß daran versetzt man das erhaltene Gemisch bis zum Klarwerden der Lösung mit Aceton und/oder· Chloroform. Der nach nachfolgendem Eindampfen der erhaltenen Lösung unter Vakuum anfallende kristalline Rückstand wird zu einem feinen Pulver vermählen. In der oben beschriebenen Weise werden folgende Zubereitungen aus A-32390 Faktor A und PVP hergestellt:

Verhältnis von Menge an

A-32390 zu PVP A-32390 Faktor A Menge an PVP Menge an Tween

1:1 .	750 mg	750 mg	150 meg
1:3	500 mg	1500 mg	200 meg
1:4	500 mg	2000 mg	250 meg
1:9	500 mg	4500 mg	500 meg

Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß die antibiotischen Verbindungen A-32390 das Enzym Dopaminß-hydroxylase hemmen und hypotensive Mittel sind. Bei Dopaminß-hydroxylase handelt es sich um ein Enzym, das die Hydroxylierung von Dopamin zu Noradrenalin begünstigt. Die Inhibierung von Dopamin-ß-hydroxylase führt daher zu einer Erniedrigung der Noradrenalinwerte. In-vivo-Untersuchungen an Ratten haben ergeben, daß Dosen von 3 bis 200 mg/kg von A-32390 Faktor A

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zu einer Erniedrigung der Noradrenalinwerte im Herz über eine Zeitspanne von 1 bis 2 Tagen führen. Die Ergebnisse einiger dieser Untersuchungen gehen aus der später folgenden Tabelle III hervor.

Untersuchungsmethode

Für die vorliegenden Untersuchungen werden männliche Ratten (Harlan Industries, Cumberland, Ind.) in Gruppen aus jeweils 5 Tieren verwendet. Diesen Tieren verabreicht man durch intraperitoneale Injektion Akaziensuspensionen, die verschiedene Wirkstoffkonzentrationen enthalten. Nach 48 Stunden werden den Ratten die Köpfe abgeschnitten, worauf man die Gewebe entfernt, rasch auf Trockeneis einfriert und bis zu ihrer Analyse in gefrorenem Zustand hält. Die Bestimmung der Catechoamine erfolgt fluorometrisch nach der Methode von Chang /Int. J. Neuropharmacol. 3, 643 - 649 (1964)_/ anhand des Herzgewebes. Für die Umwandlung der Fluoreszenzintensität in entsprechende Catecholaminwerte werden in allen Fällen interne Standardkurven verwendet (d. h., es werden bekannte Mengen des jeweiligen Catecholamins, im vorliegenden Fall Noradrenalin, zu Gewebehomogenaten gegeben). Die entsprechenden Mengen werden als Sollwerte + s.e.m. ausgedrückt.

Tabelle III

Dosis an A-32390	Noradrenalinspiegel	Prozent
Faktor A		100
(mg/kg)	(mcg/g Gewebe)	84⁺
0 (Kontrolle)	0,87 + 0,03	92
3	0,73 + 0,04	71⁺⁺
10	0,80 + 0,07	38⁺⁺
32	0,62 + 0,04
100	0,33 + 0,07
⁺P < O,05

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Die antibiotischen Verbindungen A-32390 eignen sich ferner auch als hypotensive Mittel. Bei typischen Untersuchungen ergibt sich bei Verwendung des Antibioticums A-32390 Faktor A eine wirksame Erniedrigung des Blutdruckes künstlich hypertensiv gemachter Ratten.

Untersuchungsmethode

Frisch entwöhnte männliche Ratten (Sprague-Dawley) werden anästhesiert und uninephrectomisiert. In den Halsbereich der Tiere implantiert man dann ein 25 mg schweres Pellet aus Desoxycorticosteronacetat (DOCA). Im Anschluß daran läßt man die Tiere eine Woche erholen und ersetzt ihr Trinkwasser dann durch einprozentige Salzlösung. Die Tiere werden drei Wochen auf Salzlösung als Trinkwasser gehalten. Nach dieser Zeit sind die Ratten hypertensiv und behalten ihren hohen Blutdruck ohne Notwendigkeit einer weiteren Gabe von Natrium-Chlorid.

Die Bestimmung des Blutdruckes erfolgt nach einem indirekten Weg, wozu man sich des Schwanzes der Ratten und einer elektrosphygmographischen Technik bedient. Zur Feststellung irgendeines Pulsdruckes erwärmt man die Tiere 10 Minuten bei 39 ⁰C. Vor Verabreichung des Wirkstoffes bestimmt man den Blutdruck eines jeden Tieres zum Vergleich. Der Blutdruck wird ferner auch jeweils 3_# 6, 24 und 48 Stunden nach Verabreichung des Wirkstoffes gemessen. Die bei diesen Untersuchungen unter Verwendung von Ratten, denen verschiedene Dosen Antibioticum A-32390 Faktor A intraperitoneal gegeben werden, gehen aus der folgenden Tabelle IV hervor.

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Tabelle

IV

Blutdruck (mmHg + s.e.m.)

Dosis an

Kontrolle

0

3

9

Zeit nach

Verabreichung

24

(Stunden)

48

11

U)

A-32390

O

Faktor A

± ⁵

164 +

11

6

157

213 +

16

cr>

(i.p.)

CD

233

± ⁷

162 +

14

267 +

10

128

± ⁸

132 +

21

CD

200 mg/kg

12

8

co

192

± ¹⁴

163 +

138 +

7

175

± ¹³

163 +

co

200 mg/kg

± ¹³

140 +

38

202

217 +

205

159 +

24

+ 26

100 mg/kg

221

+ 14

154 +

147 +

10

+ 17

_

-J!

50 mg/kg

no

218

152 +

23

_

25 mg/kg

Mittelwert aus vier Tieren

N? CJ) CO

Die erfindungsgemäßen antibiotischen Verbindungen Ä 32390 werden sowohl bei Verwendung zur Inhibierung des Enzyms Dopaminß-hydroxylase als auch zur Blutdruckerniedrigung normalerweise parenteral in Form einer pharmazeutischen Zubereitung eingesetzt, die aus einer in einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger ein-, gearbeiteten therapeutisch wirksamen Menge eines Antibioticums A-32390 besteht. Die jeweils zu verwendende Dosis hängt zwar von Faktoren, wie der jeweils verwendeten Verbindung A-32390, der Verabreichungsart und dem gewünschten therapeutischen Effekt ab, doch liegt diese Dosis im allgemeinen zwischen etwa 2 und 30 mg/kg Körpergewicht. Ein bevorzugter Dosisbereich beträgt etwa 4 bis 10 mg/kg Tierkörpergewicht.

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Claims

Patentansprüche

1V Antibioticagemisch A-32390 mit den Faktoren A, B, C und D und die Tetra-(C₂-C₄)-acy!ester von Faktor A.
2. Antibioticum A-32390 Faktor A und dessen Tetra-(C₃-C₄) acy!ester der Formel

HH H OR RO H

worin alle Substituenten R gleich sind und für Wasserstoff, Acetyl, Propionyl und Butyryl stehen.
3. Antibioticum A-32390 Faktor A, dadurch gekennzeichnet , daß es sich dabei um eine Verbindung nach Anspruch 2 handelt, worin der Substituent R für Wasserstoff steht.
4. Verbindung nach Anspruch 2, worin R Acetyl bedeutet.
5. Verbindung nach Anspruch 2, worin R für Popionyl steht.
6. Verbindung nach Anspruch 2, worin R Butyryl darstellt.

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brd - 33 - 2831887
7. Antibioticum A-32390 Faktor B mit einem R_f-Wert von 0,23 durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel G unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chlorform und Methanol (9 : 1).
8. Antibioticum A-3239O Faktor C mit einem R_f-Wert von 0,15 durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel G unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chlorform und Methanol (9:1).
9. Antibioticum A-32390 Faktor D mit einem R_f-Wert von 0,05 durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel G unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform und Methanol (9:1).
10/ Verfahren zur Herstellung eines Antibioticagemisches A-32390 mit den Faktoren A, B, C und D sowie der Tetra-(C₂-C.)-acylester von Faktor A, dadurch gekennzeich net, daß man

(a) Pyrenochaeta sp. NRRL 5768 oder eine Mutante hiervon, die das Antibioticagemisch A-32390 produziert, in einem assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium submers unter aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivität züchtet,

(b) das Antibioticagemisch A-32390 gegebenenfalls vom Kulturmedium trennt,

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BRD - 34 -

(c) aus dem Antibiotxcagemisch A-32390 gegebenenfalls die Antibiotica A-32390 Faktoren A₇ B, C und D isoliert, und

(d) das Antibioticum A-32390 Faktor A gegebenenfalls acyliert.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß man das Produkt der Verfahrensstufe (d) herstellt, indem man das Antibioticum A-32390 Faktor A mit Essigsäureanhydrid, Propionsäureanhydrid oder n-Buttersäureanhydrid umsetzt.
12. Antibiotische Zubereitung aus einem Excipiens und einem Antibioticum, dadurch gekennzeich net, daß sie als Wirkstoff das Antibioticum A 3239O Faktor A oder einen Tetraacylester hiervon der Formel

si, Φι, 4ΐ_λ

H H H OR RO H

worin alle Substituenten R gleich sind und für Wasserstoff, Acetyl, Propionyl und Butyryl stehen, enthält.

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BRD - 35 -
13. Antibiotische Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Excipiens ein Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 360 000 enthält.
14. Antibiotische Zubereitung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie 1 Teil des Antibioticums A-32390 Faktor A oder eines Tetra-(C₃-C₄)-acylesters hiervon und 1 bis 15 Teile eines Polyvinylpyrrolidons mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 60 000 enthält. '
15. Zubereitung nach Anspruch 12, 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie als antibiotische Verbindung A-32390 das Antibioticum A-32390 Faktor A enthält.

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