DE2601280A1

DE2601280A1 - Verfahren zur mikrobiologischen analyse

Info

Publication number: DE2601280A1
Application number: DE19762601280
Authority: DE
Inventors: Carl-Goeran Prof Heden
Original assignee: HEDEN CARL GOERAN PROF
Current assignee: HEDEN CARL GOERAN PROF
Priority date: 1975-01-15
Filing date: 1976-01-15
Publication date: 1976-07-22
Also published as: GB1510557A; JPS5196381A; US4076591A; DE2601280B2; FR2297913A1; FR2297913B1; DE2601280C3

Description

Patentanwälte
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Professor Carl-Göran Hede"n, SoIn a/Schweden Verfahren zur mikrobiologischen Analyse

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Analyse,
bei dem das Wachstum eines Mikroorganismenstammes auf einer
länglichen Substratplatte stattfindet, die eine Anzahl von Substratkomponenten aufweist, um die gleichzeitige Beobachtung der Wirkung einer Anzahl verschiedener Nährstoffkomponenten auf das Wachstum der
Organismen zu ermöglichen.

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J/Li

26012ου

Die SW-PS 344 368 und die schwedische Patentanmeldung 7 264/71 zeigen eine Apparatur zur Automation der mikrobiologischen Analyse. Bei dieser Apparatur sind die üblichen Petrischalen zur Züchtung von Mikroorganismen durch rechteckige Substratplatten ersetzt worden, die aus einem großen Agarblock durch Schneiden des Blockes mit einem mechanisch angetriebenen Messer hergestellt wurden. Diese rechteckigen Substratplatten, die auf einem geeigneten Träger, z. B. einer Glas- oder Kunststoff scheibe, angeordnet sind, bilden den Nährboden und durchlaufen die verschiedenen automatisierten Stufen, z. B. diejenigen der Probenzugabe, der Einführung in eine schützende Umhüllung, der Inkubation und der Auswertung der stattfindenden mikrobiologischen Reaktion. Im allgemeinen wird ein Mikroorganismusstamm auf der Oberfläche eingeimpft oder er befindet sich innerhalb des Substrats. Das Substrat weist üblicherweise eine Anzahl von Substratkomponenten einer Standardart zur mikrobiologischen Züchtung auf oder es enthält eine besondere Mischung von Substratkomponenten. Z. B. kann im Substrat eine Anzahl von wichtigen Nährbodenkomponenten fehlen, die nach der Einimpfung als Reaktionsmittel zugegeben werden. Der Begriff Reaktionsmittel umfaßt wachstumsstimulierende sowie auch wachstumshemmende Substanzen.

Typische Anwendungsgebiete dieser automatisierten mikrobiologischen Analyse sind die der numerischen Taxonomie, der epidemiologischen Kennzeichnung "finger-printing", der Typisierung von Gonokokken und der Bestimmungen antibiotischer Resistenz. Üblicherweise beginnt man mit einem Agarblock einer für den zu verwendenden Mikroorganismusstamm geeigneten Zusammensetzung. Aus diesem Agarblock wird entlang einer Kante des Blockes eine Substratplatte ausgeschnitten,und der Mikroorganismus wird über die Oberfläche der Substratplatte verteilt. In alternativer Weise kann der Agarblock in zwei oder mehr Segmente verschiedener Zusammensetzung geformt sein. Das ausge-

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schnittene bandförmige Substrat besteht dann aus verschiedenen Teilen, die verschiedene Arten von Agar substrat enthalten. Bei der oben angeführten Analysenart soll die Wirkung einer Anzahl von Reaktionsmitteln ausprobiert werden. Der Begriff Reaktionsmittel bedeutet Nährbodenkomponenten, die aus dem Substrat des Agarblockes ausgeschieden worden sind, z. B. spezifische wachstumsfördernde Substanzen sowie auch spezifische hemmende Substanzen. Mit dieser Technik soll eine große Anzahl von Reaktionsmitteln bei ein und demselben.Mikroorganismus ausprobiert werden. Die bei den verschiedenen Reaktionsmitteln erhaltenen verschiedenen mikrobiologischen Reaktionen ergeben somit eine Kennzeichnung "finger-print", die z. B. bei taxonomischer oder epidemiologischer Auswertung Anwendung findet.

Damit entlang der Subs trat platte, die aus den aus einem Agarblock ausgeschnittenen Streifen besteht, so viele Reaktionsmittel wie möglich zugegeben werden können, ist es nun wünschenswert, jeweils so wenig des Substrats wie nur möglich zu verwenden. Den begrenzenden Faktor stellt hierbei die Diffusion der verschiedenen Reaktions mittel im Agarnährboden dar.

Aufgabe der Erfindung ist es demgemäß, ein Verfahren vorzusehen,

um die Diffusion zwischen den verschiedenen Teilen der Substratplatte, zu denen die verschiedenen Reaktionsmittel zugegeben werden, zu verhindern, wobei das Verfahren eine schnelle und einfache Zugabe der verschiedenen Reaktionsmittel zum Substrat ermöglichen soll.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die längliche Substratplatte mittels eingeführter Trennwände, die im wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung der Platte verlaufen, in ihrer Längsrichtung in Segmente unterteilt wird, wobei die Trennwände Diffusionsbarrieren bilden, die benachbarte, jeweils mit einem Reaktions mittel versehene

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Segmente voneinander isolieren.

Erfindungsgemäß werden Diffu,-·>o/isbarrieren zwischen den verschiedenen Segmenten der Substratplatte gebildet. Ein einfaches Verfahren zur Anordnung derartiger Barrieren auf der Substratplatte besteht in der Herstellung von Rillen oder Einkerbungen, die durch die Platte verlaufen, wobei das Material aus den Rillen entfernt wird. Dies läßt sich mit Hilfe eines geeigneten Stanzgerätes durchführen, das mit einer Vakuumabsaugevorrichtung versehen ist. Ein weiteres Verfahren zur Erzeugung dieser Barrieren besteht in der Herstellung von geformten Diffusions barrieren aus polymeremMaterial, die in bestimmten Abständen voneinander auf der Platte angeordnet sind.

Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird eine Anzahl von Trögen von einer Seite her in die Substratplatte eingeführt. Jeder Trog besteht aus einem Boden und zwei gegenüberliegenden Seitenwänden und ist zumindest nach der Einführungsrichtung hin geöffnet. In geeigneter Weise sind die gegenüberliegenden Seitenwände von größerer Breite als diejenige der Substratplatte. Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das spezifische Reaktionsmittel auf der Innenseite des Troges, z. B. an seinem Boden, adsorbiert. Wird der Trog in das Gel eingeführt, so entsteht ein von Diffusionsbarrieren begrenztes Segment in der Substratplatte, in dem das Reaktionsmittel mit der Substratplatte in Berührung gebracht wird. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das aus nichtdiffundierenden Teilchen (Zellen, fettige Tropfen, starke Körner usw.) bestehende Reaktionsmittel in ein Gel von niedrigem Schmelzpunkt eingeformt, z. B. in einen Gelatineblock, der von den Kanten des Troges getragen wird. Bei der Inkubationstemperatur schmilzt der Block, wodurch das Reaktionsmittel mit der Substratplatte in Berührung gebracht wird.

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Bezüglich der Aus gestaltungsmerkmale der Erfindung wird auf die Ansprüche verwiesen.

Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 einen Teil einer Substratplatte;

Fig. 2a

und 2b Tröge, die bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des

erfindungsgemäßen Verfahrens Verwendung finden; Fig. 3 einen in die Substratplatte eingeführten Trog und

Fig. 4

und 5 eine zweite Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In der Fig. 1 stellt das Bezugszeichen 1 eine Substratplatte dar. Diese Platte ruht auf einem Träger 2, der z.B. aus einer Scheibe, Platte oder Folie aus Kunststoff besteht, die von einer Rolle zugeführt wird. Die Kante des Trägers ist bei bestimmten Abständen gefaltet, um Flansche 3 zu bilden.

In der Fig. 2a wird ein Trog dargestellt mit Boden 4 und gegenüberliegenden Seitenwänden 5 und 6. Die Enden 7 und 8 des Troges sind offen. Die Ziffer 9 bezeichnet ein adsorbiertes Reaktionsmittel. In der Fig.2b bezeichnet die Ziffer 10 eine aus einem Gel, ζ. Β. Gelatine, hergestellte Platte, die ein Reaktions mittel enthält und auf den Kanten der Seitenwände 5 und 6 des Troges aufliegt.

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Die Fig. 3 zeigt einen Trog 11, der von einer Seite in die geimpfte Substratplatte 1 eingeführt wordenist. Die Seitenwände 5 und 6 des Troges sind von größerer Breite als diejenige des Gels und ragen an den gegenüberl legenden Seiten des Gels und auch oberhalb des Gels hervor.

Die Funktion des Ausführungsbeispiels wird im folgenden beschrieben. Das zu verwendende Reaktionsmittel wird dem Tr rj zugegeben, z.B. an seinem Boden, durch Verdampfen oder durch ein ähnliches Verfahren. Die gegenüberliegenden Seiten 5 und 6 des Troges sind in bevorzugter Weise von einer Breite, die größer ist als diejenige der Substratplatte und von einer Höhe, die größer ist als die Dicke der Platte. Es soll wenigstens eine der Seiten 7 und 8 des Troges vollkommen offen sein, und der Trog wird aus dieser Richtung in die geimpfte Substratplatte eingeführt, vorzugsweise in senkrechter Richtung zu seiner Länge. Hierdurch entsteht eine mechanische Abscherbeanspruchung innerhalb der Substratplatte, die von den Flanschen 3 aufgenommen wird. In geeigneter Weise befinden sich die Flansche in einem solchen Abstand voneinander, daß ein Trog zwischen den Flanschen angeordnet werden kann, weil der Boden und die Seitenwände des Troges aus dem Gel herausragen sollen, um eine wirksame Diffusionsbarriere zu ergeben. Bei der Einführung wird das Reaktionsmittel, welches am Boden des Troges absorbiert ist, mit der Substratplatte in Berührung gebracht und die mikrobiologische Reaktion dadurch in Gang gesetzt. Entlang der länglichen Substratplatte werden die Tröge so dicht aneinander eingeführt wie es die Flansche 3 erlauben, wobei jeder Trog mit einem spezifischen Reaktions mittel oder einer spezifischen Zusammensetzung von Reaktions mitteln versehen ist. Nach der Inkubation erhält man zwischen den Flanschen Bezugsflächen oder -stellen, die es ermöglidien, auf einfache optische Weise eine Quantifizierung oder Bestimmung und eine Datenauswertung des gesamten Reaktions Verhaltens durchzuführen.

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Die Fig. 2b zeigt ein alternatives Verfahren für die Zugabe des Reaktiansmittels. Das Reaktionsmittel ist eingeformt in eine Platte aus z.B. Gelatine, die auf den roeren Kanten des Troges aufliegt. Nachdem der Trog in die Substratplatte eingeführt worden ist, kann die Inkubation in der Platte stattfinden, wobei die Gelplatte 10 aus einem Material bestehen soll, welches bei der Inkubationstemperatur schmilzt. Das Reaktionsmittel wird dann mit der Oberfläche der Substratplatte 1 in Berührung gebracht und die Reaktion in Gang gesetzt.

In geeigneter Weise wird eine große Anzahl von Trögen gleichzeitig von der einen Seite in die Substratplatte eingeführt, und zwar vorzugsweise automatisch mittels einer Einführungslehre oder einem ähnlichen '^.strument. Die Tröge werden in geeigneter Weise im wesentlichen senkrecht zur Substratplatte eingeführt, der Einführungswinkel kann jedoch auch variiert werden. Um ein automatisches Verfahren zu ermöglichen, werden die Tröge in geeigneter Weise in einem Lager aufbewahrt, in dem sie leicht zugänglich sind. Die Tröge sollten in geeigneter Weise bezeichnet werden und können mit einer Abdeckung versehen werden. In geeigneter Weise kann die Abdeckung mit einer Öffnung versehen werden, über die eine Gelatineplatte 10 gemäß der Fig. 2b gelegt werden kann, im Falle, daß das Reaktionsmittel auf der Oberseite der Substratplatte zugegeben werden soll.

Ein weiteres Aisführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens soll nun unter Bezugnahme auf die Fig. 4 und 5 beschrieben werden.

In der Fig. 4 bezeichnet die Ziffer 18 eine Substratplatte, die mit einer Schneide 13 aus einem Substratblock 12 ausgeschnitten wird. Beim Ausschneiden wird die Platte auf einen Träger 14 aufgelegt, der mit senkrecht zur Längsrichtung der Substratplatte verlaufenden Einkerbungen

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versehen ist. Dies zeigt auch die Fig. 5 und es ist zu beachten, daß die Einkerbungen 15 auch entlang des Bodens des Trägers 14 verlaufen. Wenn die Substratplatte auf den Träger 14 gelegt wird, wird eine Anzahl von als Diffusionsbarrieren wirkenden Trennwänden 17 eingeführt, die in einer Halterung 16 im gleichen Abstand voneinander wie derjenige der Einkerbungen 15 befestigt sind. Hierbei haben die Trennwände 17 eine etwas größere Fläche als die Querschnittsfläche der Substratplatte, so daß sie beim Einschieben in die Einkerbungen 15 die benachbarten Segmente der Substratplatte vollkommen voneinander trennen.

Wie es bei den in der eingangs erwähnten Patentanmeldung beschriebenen Ausbildungen der Fall ist, werden die verschiedenen Segmente in geeigneter Weise mit einem Reaktionsmittel versehen, ehe sie voneinander getrennt werden. Dies läßt sich durchführen, indem die verschiedenen Teile des Trägers 14 zwischen den Einkerbungen 15 mit einem Reaktionsmittel versehen werden oder indem Gelplatten, z. B. aus Gelatine, mit einem enthaltenem Reaktions mittel zwischen den Trennwänden 17 auf der Halterung 16 angeordnet werden, wobei diese Platte zum Schmelzen gebracht wird, wenn die Substratplatte einer Inkubation ausgesetzt wird, wodurch das Reaktions mittel den entsprechenden Segmenten zugegeben wird.

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Claims

Patentansprüche

(Γ.) Verfahren zur mikrobiologischen Analyse, bei dem das Wachstum eines Mikroorganismenstammes auf einer länglichen Substratplatte stattfindet, die eine Anzahl von Substratkomponenten aufweist, um die gleichzeitige Beobachtung der Wirkung einer Anzahl verschiedener Nähr stoff komponenten auf das Wachstum der Organismen zu ermöglichen, dadurch gekennzeichnet, daß die längliche Substiatplatte mittels eingeführter Trennwände, die im wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung der Platte verlaufen, in ihrer Längsrichtung in Segmente unterteilt wird, wobei die Trennwände Diffusionsbarrieren bilden, die benachbarte, jeweils mit einem Reaktionsmittel versehene Segmente voneinander isolieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Segment dadurch vorgesehen wird, daß in die Substratplatte ein Trog in eine Richtung eingeführt wird, die einen Winkel mit der Längsrichtung der Substratplatte bildet, wobei der Trog einen Boden und zwei gegenüberliegende Seitenwände aufweist, jedoch in Einführrichtung offen ist, und der Boden und die Seitenwände des Trogs Diffusionsbarrieren für das Segment bilden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß am Anfang ein Reaktionsmittel im Trog absorbiert wird und mit dem bei der Einführung des Trogs gebildeten Segment der Substratplatte in Berührung gebracht wird.

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4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reaktionsmittel in eine Gelatineplatte eingeformt wird, die über die Kanten des Trogs hinausragt, so daß durch Schmelzen der Gelatineplatte bei der Züchtungs temperatur Nährstoff komponente oder eine Zusammensetzung von Nährstoff komponenten mit dem Segment der Substratplatte in Berührung gebracht wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Substratplatte auf einem Träger befindet, der mit im wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung der Substratplatte verlaufenden Einkerbungen versehen ist, und daß die Diffusionsbarrieren durch Wände gebildet werden, deren Breite und Höhe über die Querschnittsfläche der Substratplatte hinausragen, so daß die Trennwände an den durch die Einkerbungen gegebenen Stellen in den Rillen verlaufend in die Substratplatte eingeführt werdai.

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