DE2518843A1

DE2518843A1 - 3-desoxy-1-alpha-hydroxy-cholecalciferol und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2518843A1
Application number: DE19752518843
Authority: DE
Inventors: Hector Floyd Prof Deluca; @@ Lam Hing-Yat; Heinrich Konstantin Schnoes
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1974-06-17
Filing date: 1975-04-28
Publication date: 1976-01-08
Also published as: FR2274311A1; FR2274311B1; US3906014A; GB1503941A; DE2518843B2; DE2518843C3

Description

MÜLLER-BORE · GROEN¹NG . DSUFEL ■ SCHÖN ■ HERTEL

PATENTANWÄLTE
BRAUNSCHWEIG ■ MÜNCHEN ■ KÖLN 2518843

Dr. W. MüIler-Borä · Braunschweig H. Groening, Dipl.-Ing. · München Dr. P. Deufel, Dipl.-Chem. ■ München Dr. A. Schön, Dipl.-Chem. · München Werner Hertel, Dipl.-Phys. · Köln

8. Apr»

München

S/W 33-2

WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION, Madison, Wisconsin / USA

3-Desoxy-i- otz-hydroxy-cholecalciferol und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft eine Verbindung, die ein Vitamin D_-Derivat mit einer Vitamin D-ähnlichen Aktivität ist, ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung sowie pharmazeutische Zubereitungen, welche diese Verbindung enthalten.

Die D-Vitamine, insbesondere die Vitamine D₂ und D₃, sind seit langem bekannt und werden aufgrund ihrer Wirkung gegenüber Mangelerscheinungskrankheiten, die auf dem Kalziumstoffwechsel beruhen, beispielsweise Rachitis, verabreicht. In neuerer Zeit wurden verschiedene Derivate von D-Vitaminen, die eine antirachitische Wirkung zeigen, die grosser ist als diejenige von Vitamin D~ oder D-., aufgefunden. Andere Derivate von Vitamin D₂ und D~, die eine spezifischere Aktivität im Hinblick auf die Kalziumstoffwechselaktivität zeigen, welche beispielsweise den Kalziumtransport im Darm erhöhen oder die Knochenkalziummobilisierung erhöhen oder herabsetzen, wurden aufgefunden.

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Ein neues Derivat von Vitamin D^, das eine Vitamin D-ähnliche Aktivität dahingehend besitzt, dass es den Kalziumtransport im Intestinum begünstigt und die Knochenkalziummobilisierung erhöht, wurde nunmehr synthetisiert. Dieses Vitamin D_-Derivat wurde als 3-Desoxy-1 - 6ί·-hydroxycholecalciferol identifiziert.

Die erfindungsgemässe Verbindung kann in der Weise hergestellt werden, dass

a) Cholesterin in 3-ß-Hydroxy-5- (X-cholestan-6-on umgewandelt wird, das 6-on in 6,6-Äthylendioxy-5-o6-cholestan-3ß-ol überführt wird, das Ketal zur Gewinnung von 6, ö-Äthylendioxy-S-Qt-cholestan-S-on oxydiert wird, das 3-on bromiert und anschliessend einer Dehydrobromierung zur Gewinnung von 6,6-Äthylendioxy-5#-cholest-1-en-3-on unterzogen wird, das Cholestenon zur Gewinnung von Äthylendioxy-1 o£, 2 cG-epoxy-B-QO-cholestan-S-on epoxydiert wird, die Epoxyverbindung mit Hydrazin zur Gewinnung von 6,6-Äthylendioxy-1 oC-hydroxy-5 oi'-cholest-2-en behandelt wird, kata'lytisch das 6,6-Äthylendioxy-1 o£-hydrpxy-5oC-cholest-2-en zur Herstellung von 6,6-Äthylendioxy-1 <£-hydroxy-5^-cholestan reduziert wird, das zuletzt genannte Ketal in das entsprechende Keton umgewandelt wird und das Keton zur Gewinnung von 1 Ot-Acetoxy-5öC~cholestan-6-on acetyliert wird, die Acetoxyverbindung mit einem Hydrid-Reduktionsmittel zur Gewinnung von 10t-Acetoxy-50(rcholestan-6ß-ol behandelt wird, das 6ß-01 zur Herstellung von loC-Acetoxycholest-S-en dehydratisiert wird, das icfc-Acetoxycholest-5-en einer allylischen Bromierung und Dehydrobromierung mit Trimethylphosphit zur Gewinnung von 1 o6-Acetoxy-5,7-cholestadien unterzogen wird, dieses Dien mit einer UV-Strahlung zur Gewinnung von 3-Desoxy-iOC-acetoxyprecholecalciferol bestrahlt wird und thermisch das 3-Desoxy-IOCr-hydroxyprecholecalciferol zur Herstellung von 3-Desoxy-1i6-acetoxycholecalciferol isomerisiert wird, das zur Gewinnung von 3-Desoxy-ioCr-hydroxycholecalciferol

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hydrolysiert wird, oder

b) lOfc-Hydroxycholesterin-Diacetat zur Gewinnung von KJC-Acetoxycholesterin hydrolysiert wird, das ißrAcetoxycholesterin zur Gewinnung von lOi-Acetoxycholesterin-Tosylat tosyliert wird, das Tosylat mit einem Hydrid-Reduktionsmittel zur Gewinnung von 10C-Hydroxycholest-5-en reduziert wird, das loC-Hydroxycholest-5-en zur Erzeugung von KX-Acetoxycholest-5-en acetyliert wird, das loC-Acetoxycholest-S-en einer allylischen Bromierung und Dehydrobromierung mit Trimethylphosphit zur Gewinnung von 1oC.-Acetoxy-5,7-cholestadien unterzogen wird, das Dien mit einer UV-Strahlung zur Herstellung von 3-Desoxy-i^acetoxyprecholecalciferol bestrahlt wird und thermisch das 3-Desoxy- 1(£-acetoxyprecholecalciferol zur Gewinnung von 3-Desoxy- 1c£-acetoxycholecalciferol isomerisiert wird, das zur Gewinnung von 3-Desoxy-1(Jfhydroxycholecalciferol hydrolysiert wird.

Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zubereitung, die aus S-Des'oxy-ioC-hydroxycholecalciferol und einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel besteht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. In den Beispielen erfolgt die Identifizierung der verschiedenen Zwischenverbindungen sowie der beanspruchten 3-Desoxyverbindung unter Verwendung der nachfolgend angegebenen Geräte, Träger sowie analytischen Reagentien und Hilfsstoffe. Durch gleiche Zahlen werden identische Verbindungen in der Beschreibung und in den folgenden Verfahrensschemata identifiziert.

Zur Durchführung einer Säulenchromatographie werden Kieselsäure (Mallinckrodt Chemical Co., 100 mesh), neutrales Aluminiumoxyd (Bio-Rad minus 200 mesh, California Corp. for Biochemical Research, Los Angeles, Calif.) oder Sephadex LH-20 (ein Hydroxy-

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propyläther-Derivat eines Polydextrans, das von der Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J. in den Handel gebracht wird) verwendet. Dünnschichtplatten werden mit Merck-Kieselgel G überzogen und an der Luft getrocknet. Besprühungen mit Schwefelsäure oder Joddampf werden verwendet, um Flecken sichtbar zu machen. Die zur Durchführung von Reaktionen und Chromatographien eingesetzte Skellysolve B (im wesentlichen η-Hexan, das auf Erdöl zurückgeht und von der Skelly Oil Co. in den Handel gebracht wird) wird redestilliert, wobei die Fraktion verwendet wird, die bei 67 bis 69°C siedet. Die Schmelzpunkte werden auf einer Kofier-Bank bestimmt und sind nicht korrigiert. Die Infrarotspektren (IR) werden unter Verwendung des Modells IR 5 von Beckman Instruments, Inc. aufgezeichnet. Die UV-Spektren (UV) werden unter Einsatz eines Spektrophotometers (Modell DB-G) von Beckman Instruments, Inc. aufgenommen. Die Massenspektren werden mit einem doppelt fokusnierenden Massenspektrometer (Modell MS-902) der Associated Electrical Industries ermittelt. Perfluortributylamin wird als Standard für genaue Massenmessungen eingesetzt. Die kernmagnetischen Resonanzspektren (NMR) werden unter Verwendung des Modells T-60 von Varian Associates gemessen. Die Werte werden in ppm ( £) "Down-Field" im Vergleich zu Tetramethylsilan als interner Standard angegeben. Die Gasflüssigkeitschromatographie (GLC) wird unter Einsatz eines F & M-Instruments (Modell 402) (Hewlett-Packard Co., Avondale, Pa.) durchgeführt, wobei 1,2 m χ 0,63 mm-Glassäulen verwendet werden, die mit 3 % SE3Q auf 100 bis 120 mesh Gaschrom Z (ein Silikonöl auf einem keramischen Träger, der von der Hewlett Packard Co. erhältlich ist) gefüllt sind, und wobei eine Säulentemperatur von 250⁰C und eine Ausfliessgeschwindigkeit von 80 ml/Minute eingehalten wird. Die Mikroanalysen werden von der Micro-Tech Laboratories, Inc., Skokie, Illinois durchgeführt.

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Beispiel 1

Eine gerührte Lösung von 1,60 g Cholesterin in 240 ml Eisessig wird tropfenweise mit 4,5 ml einer rauchenden Salpetersäure behandelt. Die Mischung wird lann in einem Eis/Salz-Bad abgekühlt, worauf weitere 390 ml einer rauchenden Salpetersäure während einer Zeitspanne von 1 Stunde zugegeben werden. Das Rühren wird während weiteren 0,5 Stunden fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wird dann schnell unter Saugen abfiltriert. Der Filterkuchen wird in 570 ml Eisessig aufgenommen. Nach der Zugabe von 107 ml Wasser und 71 g Zinkstaub wird die Mischung während einer Zeitspanne von 1 Stunde auf einem Dampfbad erhitzt. Nach einer Rückflussbehandlung während einer Zeitspanne von 10 Stunden wird die Reaktionsmischung mit H₃O verdünnt und mit Diäthyläther extrahiert. Die Ätherschicht wird abgetrennt und zur Trockne eingedampft. Dem Rückstand v/erden 400ml eines 100%igen Äthanols sowie 85 ml einer konzentrierten HCl zugesetzt, worauf die Lösung während einer Zeitspanne von 2 Stunden am Rückfluss gehalten wird. Es wird dann soviel Wasser zugesetzt, um eine leichte Trübung hervorzurufen. Das Produkt wird kristallisieren gelassen. Eine Ümkristallxsation aus wässrigem Äthanol liefert 25 g (Ausbeute 40 %) eines reinen Sß-Hydroxy-Sct-cholestan-ö-on (2) F. 142,5 bis 144°C; Massenspektrum: m/e 402 M⁺, 100 % und m/e 387 (8 %) , 384 (7%), 369 (7 %) , 331 (6 %) , 289 (17 %) , 262 (9 %) , 247 (17 %), 248 (17 %), IR (CHCl₃) 1712 (C=O), 3400 (OH)cnf¹. Analyse für ^C ₂-]^H44°2^: Berechnet: C 80,54, H 11,41, gefunden: C 80,52, H 11,62.

15 g 3ß-Hydroxy-5CC-cholestan-6-on werden in redestillierter Skellysolve B (67 bis 69⁰C) aufgelöst. Dieser Lösung werden 50 ml eines frisch destillierten Äthylenglykols sowie 100 mg p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat in einem 1 1-Rundkolben zugesetzt, der

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mit einer Dean-Stark-Falle versehen ist. Die Mischung wird währead einer Zeitspanne von 22 Stunden am Rückfluss gehalten, wobei periodisch die Falle entleert wird. Eine massenspektroskopische Analyse der Reaktionsmischung ergibt zu diesem Zeitpunkt, dass kein Ausgangsmaterial vorliegt. Der gekühlten Lösung werden 0,3 g Natriumacetat zugesetzt. Die Hexanschicht wird dekantiert, mit einer kleinen Menge Äther verdünnt und dreimal mit einer 2 %igen Natrxumacetatlosung gewaschen. Die Äthylenglykolschicht, die mit Wasser verdünnt worden ist, wird mit Äther extrahiert. Diese Ätherphase wird nach einem Waschen mit einer 2 %igen Natriumacetatlösung mit der Äther/Hexan-Schicht vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der weisse Rückstand ergibt nach einer Umkristallisation aus Äthylacetat 12,6 g (76 %) 6, e-Äthylendioxy-SaC-cholestan-Sßol (3). F. 114 bis 115°C, Massenspektrum: m/e 446 (M⁺ 26 %, C₂₉H₅₀O₃ erfordert 446, 291 (100 %) , 183 (25 %) . NMR (CDCl₃) S 3,90 (m, Ketal), IR (KBr) 3350 cm"¹ (OH). Analyse für ^c ₂9^H5o°3^: Berechnet: C 77,97, H 11,28, gefunden: C 11,19, H 11,49.

Eine Lösung von 12,5 g 6-Äthylendioxy-5 -cholestan-3ß-ol (3) in Pyridin wird einem eiskalten Pyridin-CrO₃-Komplex zugesetzt, der durch Zugabe von 182 g CrO₃ zu 182 ml eines eiskalten Pyridins hergestellt worden ist. Eine weitere Menge von 9 0 ml Pyridin wird zur Vervollständigung der überführung verwendet. Die Mischung wird dann auf Zimmertemperatur ansteigen gelassen und während einer Zeitspanne von 10 Stunden gerührt. Sie v/ird dann mit Äthylacetat auf ein Volumen von 5 00 ml gebracht und durch eine Säule filtriert, die mit Celite (ein Kieselgurprodukt, das von der Johns-ManvilIe Co. in den Handel gebracht wird) gefüllt ist, wobei die Füllmenge 50 g und der Durchmesser 4 cm betragen und das Celitematerial in Äthylacetat aufgeschlämmt ist. Das mit insgesamt 750 ml Äthylacetat eluierte Material wird gesammelt und durch eine 6 cm-Säule filtriert, die mit 100 g Aluminiumoxyd gefüllt ist, das in Äthylacetat aufgeschlämmt ist. Nach einer Eluierung mit 1200 ml Äthylacetat und einem Eindampfen des Lösungsmittels wird ein grünlicher

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Feststoff erhalten. Dieser wird auf eine 2 χ 23,5 cm-Säule, die mit 50 g Aluminiumoxyd (AG-7 minus 200 mesh) gefüllt ist, aufgebracht und mit Äthylacetat eluiert. Die ersten 150 ml des. Eluiermittels ergeben 12,3 g (98 %) eines reinen 6,6-Äthylendioxy-5oC-cholestan-3-ons (4) - Eine Analysenprobe, die aus MeOH umkristallisiert worden ist, fällt in Form von weissen Kristallen an, F. 115 bis 116°C, NMR (CDCl₃) /2,35 (m, C-2-und C-4-Protonen) , 3,9 (m Ketal), IR (KBr) 1710 cm"¹ (C=O), Massenspektrum: m/e (M⁺ 19 %, ^C29^H48°3^: ^he£·'· ^{C 78}'³³' ^{H 10}'⁸⁸' gefunden: c 78,37, H 10,93,

Zu einer Lösung von 10,9 g des Ketons (4) in 218 ml THF, das auf 9°C abgekühlt worden ist, wird eine Lösung von 1,21 g KOAc und 1,31 ml Br „ in 12,3 ml Essigsäure tropfenweise unter Rühren zugesetzt, wobei man zwischen den Zugaben wartet, bis sich die Lösung entfärbt hat. Die Lösung wird dann in 200 ml einer kalten 2 %igen NaOAc-Lösung eingegossen. Das Produkt wird in Äther extrahiert. Das Produkt besteht gemäss einer TLC aus ca. 50 % einer Bromverbindung und 50 % Ausgangsmaterial. Nach einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Methanol (CH₂Cl₂) (1:1) aufgenommen. Aus dieser Mischung scheiden sich nach einem Stehenlassen 3,91 g der 2-Bromverbindung (5) ab. Massenspektrum:m/e 524, 522 (M⁺), 443 (M⁺-Br), 291, NMR (CDCl₃) /4,8 (dd, J=6, 14 Hz, C-2-H), 3,9 (Ketal).

3,91 g des rohen Produktes (5) werden zu 3,1 g CaCO₃ in 39 ml eines siedenden DMA gegeben.Es wird während einer Zeitspanne von 15 Minuten eine Rückflussbehandlung durchgeführt. Die Mischung wird dann mit Äther verdünnt und gründlich mit H„0 extrahiert. Ein Eindampfen des Äthers ergibt einen hellgelben Feststoff, der auf eine Säule aufgegeben wird, die mit 150 g einer aktivierten Kieselsäure gefüllt ist. Eine Eluierung mit 20 % Äthylacetat in Skellysolve B (5 ml-Fraktionen) ergibt in den Fraktionen 52 bis die Δ -Verbindung, und zwar aus 6, S-Äthylendioxy-ScC-cholest-i-en-3-on (6) in Form eines amorphen Feststoffes (2,7 g , 25 % aus

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4), die bei der Durchführung einer Gasflüssigkeitschromatographie (Rf 0,62, 1:3-Äthylacetat/Cyclohexan) homogen ist. UV (95 % ÄtOH) L 227 nm ( 6 8340) , IR (CHCl.,) 2920, 1675 cm'¹, NMR (CDCl.) cf 7,12 (1H, d, J=10 Hz), 5,85 (1H, d, J=10 Hz), 3,9 (4H, m, Ketal), Massenspektrum: m/e (rel. Int.) 442 (M⁺, 36 %) , 291 (100 %); eine mit hoher Auflösung durchgeführte Massenspektralanalyse ergibt füi ^C29^H46°3 ^{den Wert von} 442,3447. Gefunden: 442,3452.

Zu 2,09 g des Δ -Steroids (6) in 25 ml Dioxan werden 6 ml einer 1n NaOH und 4,25 ml eines 30 %igen H^O- zugesetzt. Nach einem Stehenlassen während einer Zeitspanne von 20 Stunden bei Zimmertemperatur wird Wasser zugesetzt, worauf die Lösung einige Male mit Benzol und Äther extrahiert wird. Der Rückstand, der nach der Eindampfung der vereinigten organischen Phasen zurückbleibt, wird auf eine mit 30 g Kieselsäure gefüllte Säule aufgegeben und dann unter Einsatz von 11 ml-Fraktionen eluiert, und zwar mit 10 % Äthylacetat in Skellysolve B, dann mit 20 % Äthylacetat in Skellysolve B, wobei 1,4 g (65 %) des Epoxyds, und zwar 6,6-Äthylendioxy-1-aC, 2.X-epoxy-5oC~cholestan-3-on (7), erhalten werden. Eine Kristallisation aus Skellysolve A und dann aus Methanol ergibt ein Material mit einem F. von 98,5 bis 100⁰C. NMR (CDCl₃)cf3,9 (m, 4H), 3,46 (d, 1H, J=4,2 Hz), 3,2 (d, 1H, J=4,2 Hz) ,-stark aufgelöstes Massenspektrum: m/e (rel. Int.) 458,3396 (22 %, M , berechnet für C₃₉H₄₆O₄: 458,3396), 291 (100 %) . Analyse für C₃₉H₄₆O₄:

Berechnet: C 75,95, H 10,11, gefunden: C 75,71, H 10,27.

Eine Lösung von 2,0 g des Epoxyds (7) in 15 ml Hydrazinhydrat wird während einer Zeitspanne von 15 Minuten am Rückfluss gehalten und dann mit 50 ml H₃O verdünnt und anschliessend dreimal mit Äther extrahiert. Die Ätherschicht wird mit 20 ml H₃O gewaschen, über Na₃SO₄ getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird auf eine mit 180 g Kieselsäure in Skellysolve B gefüllte Säule aufgebracht. Die Eluierung erfolgt mit Mischungen aus Äthylacetat und'Skellysolve B (200 ml eines 2 %igen Äthylacetats in Skellysolve B, dann

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200 ml eines 5 %igen Äthylacetats, dann 300 ml eines 10 %igen Äthylacetats, dann 200 ml eines 15 %igen Äthylacetats, dann 600 ml eines 20 %igen Äthylacetats und schliesslich 200 ml eines 3 0 %igen Äthylacetats in Skellysolve B). Dabei erhält man in dem 20 %igen Äthylacetat-Lösungsmittel 72 0 mg der öligen 10G-Hydroxyverbindung, und zwar 6,6-Athylendioxy-1«(.-hydroxy-5<X.~cholest--2-en

(8) , die bei der Durchführung einer Gasflüssigkeitschromatographie homogen ist. Nach einigen Wochen bei -4⁰C verfestigt sich diese ölige Verbindung. F. 84 bis 90⁰C, NMR (CDCl₃) S3,66 (1H, m, C-1), 3,93 (4H, m, Ketal), 5,85 (2H, m, C-2,3) Massenspektrum: m/e (rel. Int.): 444 (66, M⁺), 375 (95), 291 (100).

Eine Lösung von 720 mg der 1Cfc-Hydroxyverbindung (8) in 60 ml Cyclohexan wird unter 1 atm H₂ bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 4 Stunden hydriert, wobei 700 mg 5 % Pd/C als Katalysator eingesetzt werden. Die Lösung wird dann filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Skellysolve B umkristallisiert. Dabei erhält man 660 mg (92 % Ausbeute) 6,6-Äthylendioxy-1&-hydroxy-5oc-cholestan (9) . F. 96 bis 98°C, NMR (CDCl₃) Cf3;65 (m, 1H, C-1), 3,93 (4H, m. Ketal), IR (CHCl₃) 3480 cm"¹ (OH), 1205-1400 cm"¹ (4 Banden, Ketal), Massenspektrum: m/e (rel. Int.): 446 (39 M⁺), 291 (100). Analyse für C₃₉H₅₀O₃: Berechnet^ 77,94, H 11,28, gefunden: C 78,07, H 11,54.

660 mg des Ketals (9) werden in 8 ml MeOH aufgelöst. 10 ml eines 95 %igen ÄtOH, der 40 mg p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat enthält, werden zugesetzt. Diese Lösung wird bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 16 Stunden gerührt. Dann wird eine 5 %ige NaHCO_.-Lösung zugesetzt. Nach einer Extraktion mit Äther, einem Trocknen (Na₂SO₄) und einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Dabei erhält man farblose Kristalle mit einem F. von 181 bis 183⁰C (quantitative

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Ausbeute). NMR (CDCl₃) if3,75 (m, 1H, C-1) : IR (CHCl₃) 3480 (OH),

1700 cm"¹ (C=O), Massenspektrum: m/e (rel. Int.): 402 (83, M⁺), 384 (86), 369 (20), 367 (23), 331 (49), 289 (43), 271 (23), 247 (?.3) , 229 (60). Diese Werte identifizieren 1<?C-Hydroxy-5a>-cholestan-6~ori

Der leC-Alkohol (10) wird in 12 ml Ac₃O und 2 ml Pyridin bei 50⁰C während einer Zeitspanne von 3 6 Stunden acetyliert. Nach einer Zugabe von 25 ml H„0 wird das Produkt in Äther extrahiert. Ein Trocknen (Na„S0.) sowie ein Eindampfen des Äthers ergibt nach der ümkristallisation des Rückstandes aus heissemMethanol 400 mg weisse Kristalle aus 1o^-Acetoxy-56C~cholestan-6-on (11). F. 104 bis 105⁰C, NMR (CDCl,) cf2, 13 (s, 311, C-I-OAc), 4,98 (m, 1H, C-1);

— 1

IR (CHCl₃), 1710, 1730 cm (Keton und Acetat), Massenspektrum: m/e (rel. Int.): 444 (49, M⁺), 384 (84), 366 (48), 229 (26). Analyse für C₃₉H₄₈O₃: Berechnet C 78,33, H 10,88, gefunden: C 77,56, H 11_f04.

Zu einer Lösung von 300 mg der Verbindung (11) in 20 ml Isopropanol werden 64 mg NaBH. (2,5-fache Molmenge), gelöst in 5 ml isopropanol, zugesetzt. Nach einem Rühren bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 16 Stunden v/erden 20 ml H₃O, die 1 Tropfen einer 3 %igen H₃SO₄ enthalten, zugesetzt. Eine Extraktion mit Äther (3 χ), ein Trocknen (Na₀SO.) sowie ein Eindampfen der vereinigten Ätherschichten ergeben einen Rückstand, der an 15 g Kieselsäure chromatographiert wird. Eine Eluierung mit 20 % Äthylacetat in Skellysolve B ergibt 260 mg des reinen 6ß-Alkohols, und zwar 1yC-Acetoxy-5$-cholestan- 6ß-ol (12). Eine Kristallisation aus MeOH ergibt weisse Nadeln. F. 127 bis 128°C, NMR (CDCl₃) ^2,06 (s, 3H, C-1-OAc), 3,86 (m, 1H, C~6), 4,75 (m, 1H, C-1), IR (CHCl₃): 3480, 1725 cm"¹ (OH, Acetat); Massenspektrum: m/e (rel. Int.): 446 (1,2 M⁺), 428 (13), 386 (39), 368 (100), 255 (25), 231 (23), 228 (52), 213 (45).

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Zu 0,5 ml einer eiskalten Pyridinlösung von 255 mg des Alkohols (12) werden tropfenweise 0,8 ml POCl-. zugesetzt. Die Lösung wird dann bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 5 1/2 Stunden gehalten. Nach einer Zugabe von Eiswasser wird die Lösunq mit Äther (3 x) extrahiert. Die vereinigten Ätherfraktionen werden über Na₂SO. getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird auf eine mit 10g Kieselsäure in Skellysolve B gefüllte Säule aufgebracht. Eine Eluierung mit 60 ml Skellysolve B und dann 10 % Äthylacetat in Skellysolve B ergibt in den Fraktionen 10 bis 12 (8 ml-Fraktionen) die Verbindung 1c£-Acetoxy-cholest-5-en (13) (Ausbeute 230 mg). Eine Kristallisation aus Äthanol ergibt weisse Kristalle mit einem F. von 65 bis 66°C, NMR (CDCl₃) cf2,05 (s, 3H, C-1-OAc), 4,98 (m, 1H, C-1), 5,45 (m, 1H, C-6), IR (CHCl-) :

-1
1725 cm (Acetat), Massenspektrum: m/e (rel. Int.): 368 (100,

M⁺-60), 255 (39), 247 (34), 219 (24), 213 (28). Analyse für C₂₉H₄₈O₃: Berechnet: C 81,25, H 11,29, gefunden: C 81,42, H 11,38.

150 mg der 1-Acetoxyverbindung (13), gelöst in 2 ml Skellysolve B sowie 2 ml Benzol, wird mit N,N¹-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin behandelt. Die Lösung wird während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei 70⁰C gehalten, dann in einem Eisbad während einer Zeitspanne von 5 Minuten abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wird in 2 ml Xylol aufgenommen und tropfenweise einer vorerhitzten Lösung von 0,25 ml Trxmethylphosphxt in 1 ml Xylol mit einer Temperatur von 135°C zugesetzt. Nach 1,75 Stunden bei 135°C wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Die Produkte werden in einer mit 10g Aluminiumoxyd gefüllten Säule getrennt. Eine Eluierung mit 5 % Äther in Skellysolve B liefert 9,3 mg (6,2 %ige Ausbeute) des 7-Dehydrocholesterin-Derivats, und zwar 1 CC-Acetoxy-5, 6-choleStadien (14). UV-Spektrum (Äthanol) >\_max295, 283, 273 nm, Massenspektrum: m/e (rel. Int.): 426 (12, M⁺), 366 (100), 351 (23), 253 (24), 226 (26), 211 X61), 199 (44).

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2 00 ml einer Ätherlösung von 2,3 mg der Δ ' -Verbindung (14) werden während einer Zeitspanne von 1,5 Minuten bei 0⁰C bestrahlt Die Produkte werden in einer Säule getrennt, die mit 5 g einer iait AgNO..j imprägnierten Kieselsäure gefüllt ist, wobei die Kieselsäure in Form einer Aufschlämmung in Skellysolve B hergestellt worden ist. Eine Eluierung mit 5 % Äther in Skellysolve B ergibt zwei Hauptfraktionen. Die nicht-polare Fraktion (Reagensglas Nr. 8 bis 11, 3,2 ml-Fraktionen) zeigt eine UV-Absorption bei ^l/\ 2 60 nm und X .235 nm und enthält das gewünschte Vorvitamin-"max /»mm ^

D-Derivat. Ein Erwärmen während einer Zeitspanne von 3 Stunden in Äthanol unter N^ hat eine Erhöhung der optischen Dichte zur Folge, woraus die Isomerisierung des Vorvitamins zu dem Vitamingerüst hervorgeht. Die Mischung wird dann mit 2 Tropfen einer 0,9n KOH in Methanol bei 60⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten verseift. Eine Zugabe von Wasser, eine Extraktion mit CHCl₃, ein Trocknen der CHCl₃-PlIasen sowie ein Eindampfen ergibt nach einer Chromatographie des Rückstandes an 20 g LH-2 0 und einer Eluierung mit CHCl₃:Skellysolve B (1:1) das gewünschte Produkt, und zwar S-Desoxy-i/iG-hydroxycholecalcif erol (15). UV (Äthanol)

/^™^ 264,5 μπι, /'s .229 ma, Massenspektrum: m/e (rel. Int.): max juxn

(19, M), 366 (8), 271 (7), 253 (7), 136 (100).

Reaktionsschema I

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R-Br

•6

25Ί8843

OR .

LJ

"■'■'.-9

10, R=H 11,-R=Ac

AcO

OH

12

13

AcO_

15

ORIGINAL INSPECTED

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Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt ein anderes Verfahren zur Herstellung von 3-Desoxy-loC-hydroxycholecalc if erol.

Eine Lösung von 600 mg liXr-Hydroxycholesterindiacetat (16) in 1,6 ml Diäthylather wird auf Eisbadtemperatur abgekühlt, worauf 1,6 ml einer 0,1 η KOH in Methanol langsam unter Rühren zugesetzt werden. Nach einem Rühren während einer Zeitspanne von 2_r5 Stunden werden 0,25 ml Essigsäure und Wasser zugesetzt, worauf die Mischung 3 χ mit Äther extrahiert wird. Die vereinigten Extrakte werden über Na„SO, getrocknet und zur Trockne eingedampft. Dabei erhält man 0,55 g iflC-Acetoxycholesterin (17), das bei der Durchführung einer Gasflüssigkeitschromatographie homogen ist. NMR (CDCl₃) <T5,55 (1H, breit, C-6), 5,00 (1H, m, C-1), 3,62 (1H, m, C-3), 2,10 (3H, s, OAc).

Das 1 -Acetoxycholesterin (17) wird durch Auflösen in Benzol, Eindampfen des Lösungsmittels und weiteres Trocknen unter Vakuum getrocknet. 0,55 g des amorphen Materials werden in Pyridin aufgenommen. 0,6 g Toluolsulfonylchlorid v/erden zugesetzt, worauf die Mischung mit Stickstoff gespült und bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 15 Stunden gerührt wird. Weitere 50 ml einer 4 %igen wässrigen KHCO^-Lösung sowie 50 ml Äther werden zugesetzt, worauf sich eine weitere Extraktion mit Äther anschliesst. Dann werden die Ätherextrakte mit 2 % HCl gewaschen und über Na-SO, getrocknet. Abschliessend erfolgt eine Eindampfung des Lösungsmittels, Dabei erhält man das loi-Acetoxycholesterin-Tosylat (18) . NMR (CDCl₃) <fl_r 82, 7,38 (4H, aromatischer H), 5,50 (1H, m, C-6), 4,90 (1H, m, C-1), 3,75 (1H, m, C-3), 2,49 (3H, s, Tosylatmethyl), 1,98 (3H, s, OAc).

Eine Lösung von 0,900 mg des Tosylats (18) in 50 ml Benzol wird gerührt und mit Stickstoff gespült. Nach der Zugabe von 2,3 ml Vitride-Reagens (eine Lösung von 70 % Natriumbis-2-methoxyäthoxyaluminiumhydrid in Benzol, Aldrich Chemical Co.) wird die Mischung bei 8O⁰C während einer Zeitspanne von 18 Stunden am Rückfluss ge- ,

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25188Λ3

halten. Das Produkt wird in der üblichen Weise isoliert. Nach einer Zugabe von Wasser und 1,0 ml einer 10 %igen NaOH wird der anorganische Niederschlag durch Filtration entfernt und mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird weiter mit Äther extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden gewaschen (10 %ige NaOH) und über Na„SO. getrocknet und anschliessend im Vakuum eingedampft. Eine Chromatographie dieses Rückstandes an Kieselgel (unter Einsatz von 20 % Äthylacetat in Skellysolve B) ergibt reines "icG-Hydroxycholest-S-en (19). NMR (CDCl₃) cTs,53 (1H₇ m, C-6), 3,74 (1H, m, C-1), Massenspektrum: m/e 386 (M⁺), 371, 368, 273.

Eine Lösung von 140 mg der Verbindung (19) in 6 ml eines trockenen Pyridins wird mit 6 ml Essigsäureanhydrid behandelt und über Nacht am Rückfluss gehalten. Die Lösung wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einer Kieselgelsäule chromatographiert, wobei Skellysolve B als Lösungsmittel eingesetzt wird. Dabei erhält man reines 1c£-Acetoxycholest-5-en (13).

Die Umwandlung* des loi-Acetoxycholest-S-ens in 3-Desoxy-IÄjcholecalciferol, d.h. die Umwandlung der Verbindung (13) über die Verbindung (14) in die Verbindung (15), wird in der vorstehend beschriebenen Weise durchgeführt.

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Reaktionsschema II

AcO

16

HO

'"-) · AcO

.17

■ 18

OH

Λ.,ν-19

AcO

14 -

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^iNSPECT^

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die biologische Aktivität der erfindungsgemässon Verbindung.

Männliche entwöhnte Ratten werden in hängenden Drahtkäfigen ad libitum mit einem wenig Kalzium und kein Vitamin D enthciltendon Futter, das von Suda et al (J. Nutr. 100, 1049 (1970)) beschrieben wird, während einer Zeitspanne von 3,5 Wochen vor ihrer Verwendung zur Durchführung der folgenden Untersuchungen gefüttert.

Kalziumtransport im Intestinum

Die Ratten werden in Gruppen von jeweils 6 aufgeteilt, wobei an die Testratten 0,25 μg S-Desoxy-iOC-hydroxycholecalciferol, gelöst in Äthanol, intravenös verabreicht wird. Die zu Vergleichszwecken herangezogenen Tiere enthalten 0,05 ml eines 95 %igen Äthanols. Nach 12,5 Stunden wird allen Ratten der Kopf abgetrennt, worauf das Blut und die Duodena gesammelt werden. Die Duodena werden nach der Methode von Martin und DeLuca (Am. J. Physiology 216, 1351 (1969)) präpariert. Aliquots der Serosal- und Mukosalmedia werden punktweise auf Filterpapierscheiben aufgebracht, getrocknet und in 20 ml-Zählgefässe eingefüllt, die 10 ml einer Szxntillatxonslösung enthalten. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor:

Tabelle I

^{Material 45}Ca Serosal/⁴⁵Ca Mukosal

Vergleich (Äthanol) 1,9 + 0,12*

S-Desoxy-lüC-hydroxycholecalciferol 3,4 +_ 0,4*

* Durchschnitt von 6 Ratten

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- 18 Kalziummobilisierung aus Knochen

Das aus den Ratten (vergleiche weiter unten) ei'haltene Blut wird zentrifugiert, worauf 0,1 ml des erhaltenen Serums mit 1,9 ml einer 0,1 Sigen NaCl-Lösung vermischt werden. Die Serumkai ζ iumkoiiz en trat ion wird mittels eines Atornabsorptionsspektrophotometers (Perkin~Elmer-Mode.ll Nr. 214) bestimmt. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle II hervor:

Tabelle Il
Material Serum Ca (mg-%)

Vergleich (Äthanol) 4,5 + 0,2*

3-Desoxy-ioC-hydroxycholecalciferol 5,8 _+ 0,2*

* Durchschnitt von 6 Ratten

Wie aus den vorstehenden Werten hervorgeht, stimuliert das 3-Desoxy-loS-hydifoxycholecalciferol hauptsächlich einen Intestinum-Kalziumtransport, wobei es jedoch auch eine Aktivität bezüglich einer Stimulierung der Mobilisierung von Kalzium aus Knochen zeigt. Dies deutet darauf hin, dass diese Verbindung ein bevorzugtes Mittel für die Behandlung von chronischen Nierenkrankheiten sein kann, da sie den Transport und die Absorption von Kalzium im Intestinum ohne Auflösung der Knochen zu bewirken vermag.

In der DT-OS (Patentanmeldung, die am gleichen Tag

wie die vorliegende Anmeldung unter dem Bearbeitungszeichen S/W 33-1 eingereicht worden ist) wird 1(£-Hydroxy- oder 1,25-Dihydroxyergocalciferol beschrieben.

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Claims

_ "I Q _

Patentansprüche

/ 1 . /3-Desoxy-icC-hydroxycholecalcif erol.
2. Verfahren zur Herstellung von B-Desoxy-ioi-hydroxycholecalciferol, dadurch gekennzeichnet, dass Cholestin in 3ß-Hydroxy-5-i-cholestan-6-on umgewandelt wird, das 6-on in 6, ö-Äthylendioxy-Bot-cholestan-3ß-ol überführt wird, das Ketal zur Gewinnung von 6,6-Äthylendioxy-5öt"Cholestan-3-on oxydiert wird, das 3-on einer Bromierung und anschliessend einer Dehydrobromierung zur Gewinnung von 6,6-Äthylendioxy-5i(,-cholest-1 -en-3-on unterzogen wird, das Cholestenon zur Herstellung von Äthylendioxy-1&, 2eC~epoxy-5<X--cholestan-3-on epoxydiert wird. Die Epoxyverbindung mit Hydrazin zur Gewinnung von 6,6-Äthylendioxy-1C'>-hydroxy-5t)6-cholest-2-en behandelt wird, katalytisch das 6,7-Äthylendioxy-1öC-hydroxy-5<x-cholest-2-en zur Gewinnung von 6, 6-Äthylendioxy-1 oC-hydroxy-5ci-cholestan reduziert wird, dieses zuletzt genannte Ketal in das entsprechende Keton umgewandelt und das Keton zur Gewinnung von 1oC-Acetoxy-5£(,-cholestan-6-on acetyliert wird, die Acetoxyverbindurig mit einem Hydrid-Reduktionsmittel zur Gewinnung von 1PC,-Acetoxy-50£-cholestan-6ß-ol behandelt wird, das 6ß-ol zur Gewinnung von ioC-Acetoxycholest-5-en dehydratisiert wird, das 1/»Acetoxycholest-5-en einer allylischen Bromierung und Dehydrobromierung mit Trimethylphosphit zur Gewinnung von loC-Acetoxy-5,7-cholestadien unterzogen wird, dieses Dien mit einer UV-Strahlung zur Gewinnung von 3-Desoxy-lOfr-acetoxyprecholecalciferol bestrahlt wird und das 3-Desoxy-ioC-acetoxyprecholecalciferol thermisch zur Gewinnung von 3-Desoxy-ioC-acetoxycholecalciferol isomerisiert wird, das zur Gewinnung von S-Desoxy-ioc-hydroxycholecalciferol hydrolysiert wird oder loC-Hydroxycholesterin-Diacetat zur Gewinnung von Icfc-Acetoxycholesterin hydrolysiert wird, das ICCr-Acetoxycholesterin zur Gewinnung von lOj-Acetoxycholesterin-Tosylat tosyliert wird, das

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Tosylat mit einem Hydrid-Reduktionsmittel zur Gewinnung von λ&- Hydroxycholest-5-en reduziert wird, das ioi-Hydroxycholest-5-en zur Gewinnung von 1oC--Acetoxycholest-5-en acetyliert wird, das 1oCr-Acetoxycholest-5-en einer allylischen Bromierung und Dehydrobromierung mit Trimethylphosphit zur Gewinnung von ic6~Acetoxy-5,7-cholestadien unterzogen wird, das Dien mit einer UV-Strahluiig zur Gewinnung von 3-Desoxy-loC-acetoxyprecholecalciferol bestrahlt wird und thermisch das S-Desoxy-IOC-acetoxyprecholecalciferol zur Gewinnung von S-Desoxy-iO^-acetoxycholecalciferol isomerisiert wird, das zur Gewinnung von 3 -Desoxy- Icir-hydroxycholecalc if erol hydrolysiert wird.
3. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus 3-Desoxy-IOi-hydroxycholecalciferol und einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel besteht.

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