DE2517510A1 - Verfahren zum abtrennen und reinigen von d-aminosaeure-oxidase - Google Patents

Verfahren zum abtrennen und reinigen von d-aminosaeure-oxidase

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Description

betreffend:
Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von d-Aminosäure-Oxidase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von d-Aminosäure-Oxidase mittels Affinitätschromatographie .
Die ÄffinitätsChromatographie ist eine vor allem auf Enzyme angewandte, bekannte Methode zum Abtrennen und Reinigen von Substanzen. Im Falle der Abtrennung von Enzymen werden durch kovalente Bindungen entweder die Enzyme selbst oder die Verunreinigungen an Träger gebunden, die aus organischen Gelen bestehen, beispielsweise modifiziertes Polyacrylamid oder Dextran; darauf wird das gegebenenfalls an das Trägermaterial gebundene Enzym wieder abgelöst, indem die Bedingungen der Elution des Mediums verändert werden.
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Die bisher eingesetzten Gele sind jedoch mit Nachteilen behaftet. Sie sind instabil und wenig wärmebeständig, wenig druckfest und widerstandsfähig gegenüber Mikroorganismen; hierdurch wird ihre Gebrauchszeit und ihre Wirksamkeit merklich beeinträchtigt.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden diese Nachteile vermieden, weil die erfindungsgemäß eingesetzten Träger beständig sind sowie wärmefest, druckfest und von Mikroorganismen nicht angegriffen werden und weil mit ihrer Hilfe ohne Schwierigkeit die d-Aminosäure-Oxidase aus ihren Gemischen mit anderen inaktiven Proteinen abgetrennt und in großer Reinheit gewonnen werden kann.
Erfindungsgemäß wird eine Lösung des Proteingemisches, das die d-Aminosäure-Oxidase enthält, mit einem Träger in Berührung gebracht, an welchen sich das Enzym bindet und anschließend das Enzym wieder abgelöst. Der Träger besteht aus einem anorganischen Material mit aufgepfropften Halogenalkylsilangruppen, die ihrerseits Gruppen der Formel
- NH - (CH2)3 - NH - (CH2)2 - C5H4 COOH
tragen. Das daran gebundene Enzym wird mit einer Äthylenglykollösung ausgewaschen.
Die erfindungsgemäß verwendeten gepfropften Träger sind unlösliche und poröse Oxide, Hydroxide oder andere anorganische Verbindungen, auf die gegebenenfalls substituier te Halogenalkylsilangruppen aufgepfropft sind, deren Alkyl rest 3 bis 11 Kohlenstoffatome enthält. Diese gepfropften Träger und ihr Herstellungsverfahren werden in einem etwas älteren Vorschlag naher beschrieben. Danach werden auf Trägerstoffe wie Tonerden, Ziegel(stein), Glas, mineralische Silicate, Metalloxide sowie vor allem Kieselsäure Halogenalkylsilane der allgemeinen Formel
X - (CHp)_ - Si B
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in der X für ein Halogenatom: Chlor, Brom oder Jod steht, η eine ganze Zahl von 3 bis 11 ist und A, B und C gleich oder verschieden sein können und jeweils für ein Chloratom, eine Methoxy-, Äthoxy-, Methyl- oder Äthylgruppe stehen mit der Maßgabe, daß zumindest einer der Substituenten A, B oder C mit einer OH-Gruppe des Trägerstoffes reagieren kann, aufgepfropft.
Zu den besonders geeigneten Verbindungen zum Aufpfropfen gehören Triäthoxybrompropylsilan, Trimethoxyjodpropylsilan, Triäthoxyjodpropylsilan, Triäthoxychlorbutylsilan, Trichlorchlorpropylsilan, Dimethylchlorchlorpropylsilan und Methyldichlor-jodundecylsilan.
Die anorganischen Trägermaterialien sollen OH-Gruppen enthalten, eine Korngrößenverteilung von 40 ,um bis 5 mm besitzen und eine spezifische Oberfläche von 2 bis 600 m /g,
und einen Porendurchmesser von 5 bis 1 000 nm sowie ein Porenvolumen von 0,5 bis 1,8 ml/g.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es wichtig, daß der (gepfropfte) Träger ein gutes Fixierungsvermögen für d-Aminosäure-Oxidase besitzt, um diese Verbindung während der Abtrennung zurückzuhalten - daß aber andererseits diese Fixierung nicht zu beständig ist, damit anschließend die d-Aminosäure-Oxidase wieder vom Träger abgelöst oder abgetrennt werden kann.
Die mit Halogenalkylsilangruppen gepfropften anorganischen Trägermaterialien bilden mit dem Enzym beständige Komplexe. Es muß deshalb der in Betracht gezogene Träger vor seiner Verwendung modifiziert werden.
Die Modifizierung des Trägers wird dadurch erreicht, daß man das Halogen des Pfropfreises durch einen Rest der allgemeinen Formel
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- NH - (CH2)3 - NH - (CH2)2 - C6H4 COOH
ersetzt. Das hierfür angewandte Verfahren verläuft wie folgt:
a) Ss wird das gepfropfte Trägermaterial mit dem Ä'thylester der oben angegebenen Säure der Formel
- NH - (CH2)3 - NH - (CH2)2 - C5H4 COOH
auf beliebig bekannte Weise, vor allem durch Erhitzen einer Suspension bis zum Sieden zur Reaktion gebracht und
b) die Estergruppe durch Einwirkung einer beliebigen konzentrierten Säure, vor allem Salzsäure in die Säuregruppe überführt.
Zur Reinigung der d-Aminosäure-Oxidase wird eine Chromatographiersäule mit dem modifizierten Träger gefüllt, der zuvor auf den mit dem Enzym verträglichen pH-Wert äquilibriert worden ist; darauf wird das Gemisch der Proteine, das die d-Aminosäure-Oxidase enthält, in einer Pufferlösung auf die Säule aufgegeben. Anschließend wird das Trägermaterial gewaschen, um die absorbierten inaktiven Proteine abzutrennen.
Die d-Aminosäure-Oxidase wird dann von dem Träger abgelöst durch Auflösen in einer Athylenglykollösung mit einer Konzentration von weniger als 50 Vol.-%. Die erhaltene d-Aminosäure-Oxidase ist rein und besitzt praktisch die volle Aktivität des ursprünglichen Gemisches.
Die auf diese Weise erhaltene und gereinigte d-Aminosäure-Oxidase eignet sich vor allem zur Herstellung von Ketonsäuren wie Brenztraubensäure.
Das nachfolgende Beispiel dient zur näheren Erläuterung der Erfindung.
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Beispiel
Herstellung des gepfropften Trägers
Zu 230 ml einer wäßrigen Schwefelsäurelösung enthaltend 120 g/l H2SO^ wurde unter Rühren eine Wasserglaslösung enthaltend 220 g/l SiO2 zugetropft. Sobald der pH-Wert 3,8 betrug,wurde die Zugabe von Natriumsilicat unterbrochen und das erhaltene Sol sowie 2 Tropfen eines Natriumalkylsulfonats unter starkem Rühren in 8 1 Trichloräthylen ausgegossen. Es fäen die gebildeten Hydrogelkügelchen aus. Darauf wurde 1 1 ammoniakalisches Wasser mit pH-Wert 9 zugegeben und dann filtriert.
Die kleinen Kugeln wurden dreimal mit 0,1n-Salzsäure und dann mit Wasser gewaschen; das erhaltene Hydrogel enthielt 80 % Wasser.
120 g Hydrogel, 15 g Triäthoxyjodpropylsilan und 200 ml Benzol wurden z7un Sieden erhitzt. Innerhalb von 3 h wurden 95 ml Wasser azeotrop abdestilliert. Nach dem Abkühlen lassen wurde das gebildete Produkt abgeschleudert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
Das Reaktionsprodukt war eine mit Jodpropylsilangruppen gepfropfte Kieselsäure, die· 2,1 Gew.-% Jod enthielt, Korngröße <200 /um, spezifische Oberfläche 425 m /g, Porenvolumen 1,1 ml/g.
Modifizieren der gepfropften Kieselsäure
11 g gepfropfte Kieselsäure wurden in 25 ml einer benzolischen Lösung enthaltend 1,5 g Verbindung der Formel
H2N - (CH2), -NH-(CH2)2-
gegeben und die Dispersion unter Rückfluß 24 h lang gekocht.
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Nach dem Abkühlen lassen wurde die Kieselsäure abfiltriert und mit Äthanol von 950C gewaschen, um die nicht umgesetzte Verbindung aufzulösen. Da diese Verbindung gefärbt ist, wurde so lange gewaschen, bis das Lösungsmittel farblos blieb. Anschließend wurde die modifizierte Kieselsäure mit Wasser gewaschen.
Das erhaltene Produkt wurde zusammen mit 50 ml 4n Salzsäure, 24 h lang zum Sieden erhitzt, um die Estergruppe zu hydrolisieren. Nach dem Abkühlen wurden die Kugeln abfiltriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und ihr pH-Wert mit einer Pyrophosphat-Pufferlösung auf 8,6 eingestellt bzw. äquilibriert. Es waren etwa 1 g Verbindung fixiert worden.
Reinigung von d-Aminosäure-Oxidase
Eine Chromatographiersäule wurde mit 11 g modifizierter Kieselsäure gefüllt; darauf ließ man mit einer Geschwindigkeit von 9 ml/h 5 ml einer Pyrophosphat-Pufferlösung von pH-Wert 8,5 durchlaufen, die 150 mg Proteingemisch enthielt, das behandelt werden sollte und aus d-Aminosäure-Oxidase und inaktiven Proteinen bestand. Die enzymatische Aktivität der aus der Säule ausfließenden Lösung wurde durch Zugabe von d-Alanin in einer 0,2m Pyrophosphat-Pufferlösung von pH-Wert Q,3, anschließend Zugabe von Dinxtrophenylhydrazin und Messung der Absorption bei 440 nm bestimmt. Die Lösung wies überhaupt keine enzymatische Aktivität auf; dies zeigte, daß die gesamte d-Aminosäure-Oxidase vom Trägermaterial in der Säule zurückgehalten worden war.
Darauf wurde die Säule mit Wasser gespült in der gleichen Geschwindigkeit wie oben, bis die spektrometrische Analyse bei 280 nm bestätigte, daß die aus der Säule ausfließende Lösung keine zunächst an das Trägermaterial absorbierten inaktiven Proteine mehr enthielt.
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Die inaktiven Proteine machten 90 % der gesamten eingesetzten Proteine aus.
20 ml einer Pyrophosphat-Pufferlösung von pH-Wert 8,5, die 30 Vol.-% Äthylenglykol enthielt, wurde darauf mit einer Geschwindigkeit von 9 ml/h auf die Säule aufgetropft. In der aus der Säule abfließenden Lösung wurde wie oben beschrieben die enzymatische Aktivität bestimmt; sie machte 90 % der Aktivität des ursprünglich eingesetzten Gemisches aus; der Anreicherungsfaktor betrug etwa 100.
Patentansprüche:
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Claims (4)

  1. DR. INtJ. F. AVUESTHOFF 8 MÜNCHEN OO
    DR.K.v.PEOHMANN & schweigshstkasse 2
    ^* TKLEKON (080) GG 20 31
    DR. ING. D. BEHRENS .„,„-„
    TELEX S24 070
    PATENTANWÄLTE piioteotpatejit mCnciien
    1A-46 341^5175
    Patentansprüche
    ny Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von d-Aminosäure-Oxidase durch in Berührung bringen einer Lösung des Proteingemisches, welches d-Aminosäure-Oxidase ent hält, mit einem Trägermaterial, das das Enzym bindet und anschließendes Abtrennen der d-Aminosäure-Oxidase von dem Trägermaterial, dadurch gekennzeich net, daß man als Träger ein anorganisches Trägermaterial mit aufgepfropften Halogenalkylsilangruppen verwendet, die durch Gruppen der Formel
    -NH -
    - NH -
    COOH
    modifiziert worden sind und daß man die gereinigte d-Aminosäure-Oxidase durch Auflösen in einer Äthylenglykollösung von dem Trägermaterial wieder ablöst.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägermaterial ein poröses unlösliches anorganisches Oxid, Hydroxid oder anderes Material verwendet, das gegebenenfalls substituierte Halogenalkylsilangruppen mit 3 bis 11 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe aufgepfropft enthält.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e kennz e i ohne t '^ daß man ein- gepf ropf tes Trägermaterial durch Umsetzen mit der Verbindung der Formel
    H2N - (CH2)3 - NH-(CH2J2-C6H4-COOC2H5
    *verwendet, das
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    und anschließende Hydrolyse der Estergruppe mittels konzentrierter Säure modifiziert, worden ist.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Lösung enthaltend weniger als 50 Vol.-% Äthylenglykol verwendet.
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DE19752517510 1974-04-22 1975-04-21 Verfahren zum Reinigen von d-Amlnosäure-Oxidase Expired DE2517510C3 (de)

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