DE2430128A1 - Verfahren zur herstellung traegergebundener polypeptide - Google Patents

Verfahren zur herstellung traegergebundener polypeptide

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Description

iöhm
GmbH Darmstadt 19.6.1974
Pat.Dr.Hh/Hks/9
Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide
Trägergebundene Polypeptide werden in verschiedenen biochemischen Prozessen, sowie für medizinische, diagnostische und analytische Methoden und ähnliche Zwecke eingesetzt. Zu ihrer Herstellung verwendet man in der Regel Trägermoleküle mit reaktiven Gruppen, die sich mit korrespondierenden Gruppen der Polypeptide umsetzen. Die reaktiven Gruppen sind in allen Fällen gegenüber Wasser empfindlich; sie gehen daher zu einem erheblichen Anteil bei der Umsetzung mit dem in Wasser gelösten Polypeptid durch Hydrolyse verloren. Andere Nachteile der bekannten reaktiven Trägerverbindungen können im Einzelfall darin liegen, daß Polypeptide unter weitgehendem Verlust ihrer biologischen Aktivität gebunden werden oder daß überhaupt nur eine sehr geringe Menge an Polypeptid in biologisch aktiver Form gebunden wird.
Ein anderes bekanntes Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide besteht darin, daß man ungesättigte Verbindungen in Gegenwart des Polypeptids radikalisch polymerisiert, wobei ein Teil des eingesetzten Polypeptids in das entstehende Polymergerüst eingeschlossen wird. Ein Teil des in dieser Form gebundenen Polypeptids bleibt selbst für kleine Substratmoleküle unzugänglich und ist daher nicht biologisch aktiv. Die Ausbeute an gebundenem, biologisch aktivem Polypeptid ist bei diesem •Verfahren niedrig. Die Aktivität gegenüber hochmolekularen Substraten ist in der Regel
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imbefriedigend. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide zu finden, das allgemein anwendbar ist und mit wasserunempfindiichen Trägerstoffen arbeitet. Es wurde nun gefunden, daß man dieses Ziel erreicht, wenn man in einer wäßrigen Lösung eines Polypeptids in Gegenwart einer makrodekularen Verbindung, die wenigstens eine olefinische C=C-Doppelbindung je Molekül enthält, und in Abwesenheit radikalisch polymerisierbarer Monomerer Radikale erzeugt. Bei diesem Verfahren werden die Polypeptide in meistens hoher Ausbeute und unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität an die makromolekulare Verbindung gebunden. Jen nach dem Aufbau der verwendeten makromolekularen Trägerverbindung kann das Umsetzungsprodukt in Wasser löslich oder unlöslich sein. Es ist zwar nicht bekannt, welche chemischen Reaktionen bei der Bindung des Polypeptids im einzelnen ablaufen, jedoch spricht die weitgehende Erhaltung der biologischen Aktivität dafür, daß die Bindungsreaktion vorzugsweise nicht an den für die biologische Aktivität verantwortlichen funktioneilen Gruppen des Polypeptids angreift.
Die Bindungsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens läuft möglicherweise in begrenztem Umfange auch bei dem oben erwähnten bekannten Verfahren ab, bei dem man Monomere in Gegenwart des Polypeptids radikalisch polymerisiert, sofern das Monomerengemisch zum Teil aus Verbindungen mit wenigstens zwei polymerisierbaren Doppelbindungen besteht. Sobald ein Teil dieser Monomeren polymerisiert ist, ist unter der Einwirkung der bei der weiteren Polymerisation auftretenden Radikale mit Bindungsreaktionen zwischen dem Polypeptid und dem bereits entstandenen Polymeren zu rechnen. Im Gegensatz zu diesem bekannten Verfahren
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findet die Bindungsreaktion beim Verfahren der Erfindung in Abwesenheit von radikalisch polymerisierbaren Monomeren statt, so daß der nachträgliche Einschluß eines ggf. an ein Polymermolekül gebundenen Polypeptide durch nachträglich entstandenes Polymerisat nicht möglich ist. Dadurch bleibt das gebundene Polypeptid in jedem Fall frei zugänglich. Diese freie Zugänglichkeit würde natürlich noch nicht dadurch beeinträchtigt, daß das eingesetzte Trägerpolymerisat noch geringfügige Mengen des Ausgangsmonomeren enthält. Es ist demnach ausreichend, daß das Verfahren der Erfindung in Abwesenheit substantieller Mengen an radikalisch polymerisierbaren Monomeren durchgeführt wird.
Die im Verfahren der Erfindung verwendeten makromolekularen Trägerverbindungen haben in der Regel ein Molekulargewicht von wenigstens l.OOO, vorzugsweise von wenigstens 10.000. Eine obere Grenze besteht für das Molekulargewicht nicht, denn man kann auch vernetzte Trägerverbindungen verwenden, die ein unbestimmbar hohes Molekulargewicht haben. Die einzige Voraussetzung für die Eignung einer makromolekularen Verbindung als Trägerverbindung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Anwesenheit einer olefinischen C=C-Doppelbindung und deren sterische Zugänglichkeit für das in Wasser gelöste Polypeptid. Diese Zugänglichkeit kann dadurch gewährleistet «ein, daß die Trägerverbindung in Form von Festkörpern mit großer Oberfläche vorliegt. Geeignete Festkörper dieser Art sind Dispersionspartikel, feine Perlpolymerisate, Fasern und Filme. Die Filme können in freier Form oder als Membran oder als Überzug auf einem anderen Körper vorliegen. Faserförmige Träger können zu Vliesen, Fäden oder Geweben gebunden sein. Die olefinischen Doppelbindungen sind für das erfindungsgemäße Verfahren noch wesentlich besser zugänglich, wenn die Trägermoleküle hydrophil sind und in Wasser
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von 20 C auf wenigstens das Doppelte ihres Trockenvolumens anquellen. Eine Quellung auf das 5- bis 50-fache des Trockenvolumens ist besonders vorteilhaft. Die Trägerverbindungen können aber auch wasserlöslich sein und ergeben nach der Bindung des Polypeptids wasserlösliche Produkte. Derartige Produkte sind häufig erwünscht, um die Stabilität des gebundenen Polypeptide zu erhöhen oder ihr Diffusionsverhalten oder ihre Affinität gegenüber anderen Stoffen zu beeinflussen.
Obwohl die Kohlenstoffdoppelbindungen der makromolekularen Trägerverbindung auch in der Hauptkette des Polymerisats liegen kann, sind olefinische Gruppen dann besonders gut zugänglich, wenn sie als Seitengruppen und Endgruppen eines Polymermoleküls vorliegen. Die Trägerverbindungen sollen im allgemeinen wenigstens eine Kohlenstoffdoppelbindung je 5O.OOO Molekulargewichtseinheiten enthalten. Man kann diese olefinischen Gruppen nachträglich in ein fertiges Polymerisat einbringen, indem man es mit einer niedermolekularen Verbindung umsetzt, die sowohl eine olefinische Doppelbindung als auch eine gegenüber der makromolekularen Verbindung reaktive Gruppe enthält. Z.B. kann man Cellulose, Polyvinylalkohol oder einen Polyhydroxyalkylester einer ungesättigten polymerisierbaren Säure mit Maleinsäureanhydrid, Acryl- oder Methacrylsäureanhydrid, Acryl- oder Methacrylsäurechlorid, Hydroxyalkylamiden der Acryl- oder Methacrylsäure, Glycidylacrylat oder -methacrylat, Vinylisocyanat und ähnlichen Verbindungen umsetzen. Gleichzeitig kann in an sich bekannter Weise das Polymere mit geeigneten bifunktionellen Verbindungen vernetzt werden. Auch andere bekannte Methoden zur Erzeugung von olefinischen Doppelbindungen, wie z.B. die Abspaltung von Wasser aus hydroxylgruppenhaltigen Polymeren, können zur Herstellung von ungesättigten Polymeren für das Verfahren der Erfindung herangezogen werden.
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Vorzugsweise ist die makromolekulare Verbindung ein Mischpolymerisat aus verschiedenen Vinylverbindungen, von denen wenigstens eine zwei oder mehr G=C-DoppeIbindungen enthält. Ein Anteil von 0,2 bis 20 MoI-^ von derartigen Monomeren an dem zugrunde liegenden Monomerengemisch ist besonders vorteilhaft. Monomere mit zwei Doppelbindungen führen, insbesondere wenn es sich um gleichartige C=C-Doppelbindungen handelt, schon bei der Herstellung des Polymerisats zur Vernetzung, was in der Regel erwünscht ist. Monomere mit zwei oder mehr gleichartigen C=C-doppelbindungen sind z.B. Methylen-bis-acrylamid oder -methacrylamid, Diacrylate oder Dirnethacrylate von Glykolen, Diglykoläthern, Triglykoläthern usw., Butadien, Divinylbenzol, Diallylphthalat oder Triallylcyanurat. Unter diesen Verbindungen sind diejenigen mit zwei oder mehr Allylgruppen besonders geeignet, weil die Allylgruppen weniger reaktiv sind und dadurch zu Polymerisaten führen, die neben einer verhältnismäßig kleinen Zahl von Vernetzungsstellen eine große Zahl von seitenfeeständigen Allylgruppen enthalten. Butadien verhält sich ähnlich. Vorteilhaft ist auch der Einbau von Verbindungen mit zwei unterschiedlichen C=C-Doppelbindungen, wie z.B. Allylacrylat, Allylmethacrylat, Vinylacrylat oder Vinylmethacrylat; auch hier wird vorwiegend nur eine Doppelbindung, nämlich die des Acryl- oder Methacrylsäurerestes, einpolymerisiert, während die andere größtenteils als olefinische Seitengruppe bestehen bleibt·
Im übrigen können die Vinylpolymerisate aus beliebigen anderen radikalisch polymerisierbaren Monomeren aufgebaut sein. Ausgesprochen hydrophobe Monomere können sich jedoch nachteilig auswirken. Wenn die Trägerverbindung in fester Form angewendet werden soll, sind niedere Ester der Acryl- und Methacrylsäure, Vinylester niederer Carbonsäuren, Acryl- oder Methacrylnitril oder niedere Olefine geeignete Comonomere. Vorzugsweise sind
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•0.
die Mischpolymerisate überwiegend aus hydrophilen, d.h. wasserlöslichen Monomeren aufgebaut. Beispiele für diese Monomeren sind Acryl- und Methacrylamid, Hydroxyalkylester der -Acryl- oder Methacrylsäure, diese Säuren selbst sowie ihre Alkali- und Ammoniumsalze, Aminoalkylester der Acryl- oder Methacrylsäure mit tertiären Aminogruppen oder die daraus hergestellten Salze oder quartären Ammoniumverbindungen, Vinylpyrrolidon, Vinyl imidazol usw.„ Mit Vorteil bilden wasserlösliche Monomere einen Anteil von mehr als 50 % der neben den Verbindungen mit zwei Doppelbindungen am Aufbau des Trägerpolymerisats beteiligten Monomeren. Diese bevorzugten Polymerisate zeichnen sich durch eine hohe Quellbarkeit aus, sofern sie nicht zu stark vernetzt sind. Es ist daher weiterhin bevorzugt, die Vernetzung durch geeignete Wahl der Art und Menge der mehrfach ungesättigten Comonomeren in solchen Grenzen zu halten, daß das Polymerisat in Wasser bei 200C wenigstens auf das doppelte Volumen quillt.
Nicht oder nur schwach quellbare Tragerverbindungen werden bevorzugt in Form ihrer wäßrigen Dispersionen oder in Form von Fasern oder Filmen bzw. daraus hergestellter Gebilde angewendet. Für quellbare Tragerverbindungen ist die Perlform besonders geeignet. Entsprechende Perlpolymerisate lassen sich in bereits gequollenem Zustand durch sogenannte umgekehrte Perlpolymerisation der wäßrigen Monomerenlösung in einer organischen Phase erzeugen. Wasserquellbare Polymerisate können mit Vorteil auch in Form von Überzügen auf festen Gegenständen angewandt werden.
Für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung wird die Trägerverbindung mit der wäßrigen Lösung des Polypeptids in Berührung gebracht. Das Mengenverhältnis des zu bindenden Polypeptids zu der eingesetzten löslichen oder quellbaren Trägerverbindung soll vorzugsweise im Bereich von 1 : 1000 bis 1 : 1 liegen.
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Auf die mit der Trägerverbindung versetzte Tiiäßrige Polypeptidlösung läßt man Radikale einwirken. Sie werden vorzugsweise mit Hilfe eines Redoxsystems bei Temperaturen zwischen 0 und 60°C erzeugt. Redoxsysteme bestehen aus einem Oxydationsmittel, einem Reduktionsmittel und vorzugsweise einem Schwermetall-ion als Katalysator. Redoxsysteme sind ausführlich in Houben-Weyl, Band 14/1, Seiten 26>-297 beschrieben und können z.B. aus folgenden Kombinationen bestehen:
Natriumdisulfit/ Ammoniumperoxidisulfat/ Silbernitrat Rongalit/ Ammoniumperoxidisulfat/ Eisen-II-Sulfat Natriumhydrogensulfit/ Natriumhypochlorit Titan-(III)-chlorid/ Hydroxylamin Triäthänolamin/ Natriumperoxidisulfat.
Eine hohe Ausbeute an gebundenem Polypeptid läßt sich erreichen, wenn je Gramm des Polypeptids etwa 0,001 - 0,1 Äquivalente an Radikalbildnern eingesetzt werden. In entsprechender Menge sind das Oxydation- und das Reduktionsmittel des Redoxsystems einzusetzen. Anstelle eines Redoxsystems können auch bei hinreichend niedriger Temperatur zu Radikale zerfallende Verbindungen eingesetzt werden. Hierzu gehören vor allem Azoverbindungen, wie azOdisulfonsaures Kalium, Diazosulfon (aktiviert mit Kupferionen), sowie Peroxide, wie Ammoniumperoxydisulfat, Acetyl-cyclohexansulfonyl-peroxid, Dicyclohexyl-peroxydicarbonat, tert.Butylpermaleinat (aktiviert mit Morpholin), sowie Wasserstoffperoxid.
Die Reaktionsdauer hängt vom Radikalstrom ab. Unter Einsatz der oben angegebenen Mengen wird in 1 bis 100 Minuten eine weitgehende oder vollständige Bindung des Polypeptids erreicht. Die Bindungsgeschwindigkeit nimmt mit steigender Temperatur im allgemeinen zu, jedoch muß ein ausreichender Abstand zu der jeweiligen Inaktivierungstemperatur des Polypeptids gewahrt werden« Vorzugsweise arbeitet man zwischen 0 und JO Ce
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Temperaturen über 6O°C kommen nur in Ausnahmefällen in Betracht. Die Umsetzung wird zweckmäßig unter einer sauerstoff-freien Atmosphäre durchgeführt.
Der Begriff "Polypeptid" ist weit zu fassen. Es fallen nicht nur wasserlösliche natürliche Eiweißkörper darunter, wie Enzyme, Antikörper, Hormone mit Proteinstruktur, Inhibitoren, sondern auch aus wenigen Aminosäureeinheiten aufgebaute natürliche oder synthetische Polypeptide, wie Dipeptide, oder Verbindungen, die nur teilweise peptidartig aufgebaut sind, wie Penicilline. Ferner kann man auch Substanzen, die keine Peptidstruktur haben, mit oligomeren Peptiden umsetzen und sie über diese Gruppen an Irägermoleküle binden.
Herstellung von ungesättigten makromolekularen Verbindungen
A. In einem Rundkolben (βΟΟ ml), versehen mit Thermometer, Rührer, Rückflußkühler und N2-Einleitungsrohr werden 1740 g n-Heptan
1100 g Perchloräthylen
4 g Verteiler: 50 $ige£ Lösung eines Polymerisats der
Zusammensetzung 90 Tl n-Butylmethacrylat/ 10 Tl : 2-Trimethylammoniumäthylmethacrylat-chlorid in .- Dimethylformamid
vorgelegt. Unter Einleiten von Stickstoff wird bei Raumtemperatur eine Mischung aus
700 g Formamid
120 g Acrylamid
30 g Allylmethacrylat
1,5 g Methylen-bis-methacrylamid 1 g BenaoXLpei'oxia
zugegeben und durch konstantes Rühren in der organischen Phase verteilt. Die Polymerisation wird durch Zugabe von 1 g Dirnethylanilin ausgelöst. Nach 8-stündiger Polymerisation wird die überstehende organische Phase abdekantiert und die Perlen werden durch Zugabe von 2000 g Aceton ausgefällt, über eine Glasfritte abgesaugt, mit Aceton gewaschen, und bei ca. 40° getrocknet. Ausbeute: 100 fc feine, fast weiße Perlen.
B. Es wird analog Beispiel 1 gearbeitet mit dem Unterschied, daß der Monomerphase noch 0,15 g Eisen(III)chlorid zugesetzt werden.
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C. Es wird analog Beispiel 1 gearbeitet mit dem Unterschied, daß der Monomerphase noch 1£ g Eisen(lII)chlorid zugesetzt werden.
D. Es wird analog Beispiel 1 gearbeitet mit dem Unterschied, daß anstelle von Allylmethacrylat Vinylmethacrylat eingesetzt wird.
Eo 0,75 Mol Acrylamid und 0,5 Mol Butadien wurden in 125 ml A'thylenglykol mit Kaiiumpersulfat als Initiator bei 6o°C im Autoklaven polymerisiert. Nach Entgasen, Waschen in n-Butanol sowie Trocknen wurde ein harzartiges, sprödes Produkt gewonnen, welches mechanisch zu etwa 0,1 mm bis 0,2 mm großen Teilchen zerkleinert wurde. 1 g des Produktes quillt in V/asser zu 19 g Feuchtprodukt. Das gequollene Produkt ist wasserunlöslich und hat die Beschaffenheit eines farblosen, hydrophilen Gels. Es enthält 6 Mol % an olefinischen Doppelbindungen, wie durch Bromaddition ermittelt wurde.
P.Io g eines Perlpolymerisates aus Acrylamid und Glycidylacrylat und 20 ml Allyamin wurden 60 Stunden lang bei 650C gehalten und danach mit Chloroform gewaschen. Anschließend wurde das Produkt über Nacht in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7i5> quellen gelassen und mit Wasser phosphatfrei gewaschen. Ausbeute: 68,2 g Feuchtprodukto Der Gehalt an olefinischen Doppelbindungen wurde mit der Bromadditionsmethode zu 4,4 Mol % bestimmt (bezogen auf 100 Monomereinheiten).
G. 10 g Acrylsäure-anhydrid wurden in 100 ml wasserfreiem Toluol gelöst und 1 g Azo-iso-butylrodinitril zugegeben. Nach ^o-minütigem Spülen mit Stickstoff wurde allmählich auf 60°C erwärmt und innerhalb 4 Stunden polymerisiert. Das ausgefallene Produkt wurde mit wasserfreiem n-Heptan entquollen und mehrfach in n-Heptan und Äther gewaschen. Ausbeute: 9,5 g. 1,26 g des Polyacrylsäure-anhydrids wurden in 40 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und unter gutem Rühren bei Raumtempe-
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ratur Il8 mg Allylamin, gelöst in 10 ml Dimethylformamid, zugegeben. Anschließend wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen gelassen. Dann wurden 200 ml M Phosphatpuffer (pH 8) zugegeben und über Nacht stehen gelassen. Die Lösung wurde gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert«,
Das Lyophilisat wurde in 0,2 M Phosphatpuffer und an Sephadex G 50 (0,2 M Puffer als Elutionsmittel) gelchromatographiert. Der mit dem Ausschlußvolumen eluierte Anteil wurde gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert (ca. 80 % gesamte Menge). Dutfch Stickstoffanalyse wurde ein Anteil von 9 Grundmol-$ an Allylacrylat ermittelt. Das Produkt enthält keine Anhydridgruppen mehr.
H. In einem Rührkolben, versehen mit Thermometer, Rührer, Stickstoff-Einleitungsrohr und Rückflußkühler werden
700 g n-Heptan
700 g Perchloräthylen
0,9 S Verteiler (wie bei A)
vorgelegt. Dazu gibt man bei Raumtemperatur folgende Lösung
100 g Wasser
126 g Acrylamid
54 g 2-rHydroxyäthylmethacrylat
1 g Glykoldimethacrylat
0,1 g Eisen-(III)sulfat
0,1 g Ammoniumpersulfat0
Die Monomerphase wird unter Rühren und Einleiten von Stickstoff in der kontinuierlichen Heptan/Perchloräthylen-Phase verteilt. Durch Zugabe von 4 g 5 ^iger wäßriger schwefeliger Säure wird die Polymerisation ausgelöst. Durch Kühlung des Ansatzes wird ein Temperaturanstieg über 300C vermieden.
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Nach 4 Stunden wird die organische Phase abdekantiert, die erhaltenen Perlen mit Aceton gewaschen und 10 Stunden im Vakuum bei 35°C getrocknet.
Jo 10 g handelsübliches Polyvinylalkohol-Granulat (PoIyviol 05/20 von Wacker-Chemie) wird in, einer Lösung aus 5 g Wasser, 30 g Isopropanol und 0,2 g konz. Schwefelsäure aufgeschlämmt. Das entstandene Gel wird getrocknet, etwas zerrieben und bei 1000G 20 Minuten getempert. Das Granulat ist nunmehr braun gefärbt und quillt in Wasser ohne sich zu lösen. Es enthält infolge Wasserabspaltung ungesättigte Gruppen in der Hauptkette.
Beispiele
l) Bindung von Ribonuclease-A an Perlpolymerisat -A
Zu 2 g Perlen A. wurden 50 mg RNase-A (gelöst in 50 ml Wasser), 2 mg Fe2(SO^)., (gelöst in 1 ml HgO) gegeben und J>0 Minuten lang mit Stickstoff gespült. Unter Fortsetzung der Stickstoff-Spülung wurden hintereinander zugegeben: 20 mg Ammoniumpersulfat (in 1 ml H2O) und 20 mg Natriumpyrosulfit (in 1 ml HgO).
Nach ^O Minuten wurde das Produkt auf eino? Glasfritte abgesaugt, 3 mal mit 1-molarer Kochsalzlösung und 2 mal mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Feuchtausbeute:
11,7 g.
Ausbeute an gebundener RNase: 68 %.
Die enzymatische Aktivität der gebundenen RNase gegen Hefe-•RNA (Boehringer/Mannheim, 4#) bei 370C und pH 7,5 ist ebenso hoch wie die Aktivität freier RNase.
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2) Bindung von Ribonuolease-A an Perlpolymerisat B.
Es wurde genau so umgesetzt wie bei Beispiel 1) mit dem Unterschied, daß kein Fe2(SO^), zugegeben wurde.
Feuchtausbeute: 11,7 g
Ausbeute an gebundener RNase-A: 75 %, Aktivität der gebundenen RNase-A (RNA, 37°C, pH 7,5): 97 % bez. auf freie RNase.
3) Bindung von Ribonuclease-A an Perlpolymerisat C
Umsetzung analog Beispiel 2) mit dem Unterschied, daß die Reaktionszeit nur 15 Minuten betrug.
Feuchtausbeute: 11,6 g.
Ausbeute an geb. RNase-A: 6j $» Aktivität (RNA, 37°, pH 7,5): 100 % verglichen mit freier RNase,
4) Bindung von Ribonuclease-A an Perlpolymerisat D
Es wurde genau nach Beispiel 1) gearbeitet, mit dem Unterschied, daß 2 g Perlpolymerisat D eingesetzt wurden. Feuchtausbeute: 1>,6 g.
Ausbeute an geb. RNase: 75 %
Aktivität der geb. RNase: 96 % im Vergleich zum freien Enzym.
5) Bindung von Lactat-Dehydrogenase an Perlpolymerisat C
1 g Perlpolymerisat C wurde in 25 ml Wasser, enthaltend 12,5 nig Lactat-Dehydrogenase (aus Kaninchenmuskel), unter Eiskühlung suspendiert und I5 Minuten mit Stickstoff begast; dann wurden hintereinander jeweils 20 mg Ammoniumpersulfat und Natriumpyrosulfit in jeweils 1 ml Wasser zugegeben, weitere 30 Minuten Stickstoff eingeleitet und dann mit Wasser-
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Kochsalζ-Lösung und Phosphatpuffer gewaschen. Ausbeute: 8 g Feuchtperlen.
Aktivitätsbestimmung: 1 g Feuchtperlen und ^O ml Substrat (Pyruvat/Nicotinamid-Aden&n-Dinukleotid, reduzierte Form) entsprechend der Biochemica Test Combination Boehringer, Mannheim, wurden geschüttelt und zu den Zeiten 0, 15, JO und 6o Minuten Proben von je 2,5 ml entnommen und deren Absorption bei jj40 nm gemessen. Bei einer Ausgangsextinktion von 1,^50 wurde einj^ ~ Ext/Min von 0,015 bei J>kO nm gemessen. Die Perlen waren ohne Aktivitatsverlust wiederholt verwendbar.
6) hO g Feuchtgel E und 100 mg Chymotrypsin wurden in 60 ml Wasser, enthaltend ^O/ug Fe2(SO^)., ^O Min. mit Stickstoff gespült und dann in der bei Beispiel 1) beschriebenen Weise mit Ammoniumpersulfat und Natriumpyrosulfit umgesetzt und gewaschen. Ausbeute: 36 g Feuchtgel.
Ausbeute an gebundenem Chymotrypsin: 40 %.
Aktivität (Casein, pH 8, j57°C): 2o % verglichen mit freiem Chymotrypsin.
7) 7 g Feuchtprodukt F und l8 ml Wasser, enthaltend 25 mg Ribonuclease-A und 2 mg Fe2(SO2^),, wurden 15 Minuten mit Stickstoff und nach Zugabe von 1 ml wäßriger Ammoniumpersulfat-Lösung (20 mg/ml) und 1 ml wäßriger Natriumpyrosulfit-Lösung weitere 85 Minuten begast. Das Produkt wurde 3 mal mit Wasser- Kochsalzlösung und 2 mal mit 0,05 M Phosphatpuffer gewaschen,, Ausbeute an gebundenem Enzym: 87 %
Aktivität (RNA, 27°C, pH 7*5): 100 % vergl« mit freiem Enzym.
8) 100 mg Polymeres G und 10 mg Ribonuclease-A wurden in 20 ml Wasser, enthaltend 50 <ug Fe2 (SO2(U, gelöst. Nach Spülen mit Stickstoff wurden hintereinander jeweils 10 mg Ammoniunjsulfat
per
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GmbH Darmitadt
röhm
und Natriumpyrosulfit, gelöst in je 1 ml Wasser, zugegeben und weitere 100 Minuten lang mit Stickstoff gespült. Die Lösung wurde gegen Wasser dialysiert und lyXophilisierto Das Lyophilisat zeigte einen Proteingehalt (Polin) von 8 %. Bezogen auf das freie Enzym zeigte das Produkt 47 fo Aktivität (RNA^ JT°C, PH 7,5).
9) Es wurde in der gleichen Weise wie bei Beispiel 1) gearbeitet, jedoch wurde anstelle von Fe2(SO2,),, Ammoniumsulfat und Natriumpyrosulfit ein radikalbildendes System aus 50 mg Morpholin und 50 mg tertiär-Butyl-permaleinat verwendet. Feuchtausbeute: 12,1 g.
Ausbeute an geb. RNase: 65 %„
Aktivität der geb. RNase: 77 % des freien Enzyms.
10)1 g Perlpolymerisat H wurden mit 50 mg Insulin unter Einwirkung von 2 mg Pe2(SOh).., 50 mg Ammoniumpersulfat und 50 mg Natrium-pyrosulfat in 50 ml Wasser umgesetzt. Ausbeute an gebundenem Insulin: 78 /0.
11) 165 ml einer handelsüblichen wäßrigen Lösung von Glucamylase wurden in einem Austauscher (Sephadex 625) entsalzt und auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. 2 g Perlpolymerisat H wurden mit der Enzymlösung unter Zusatz von 2 mg Pe2(SO2,),, mg Ammoniumpersulfat und 50 ml Natriumpyrosulfat umgesetzt. Das Umsetzungsprodukt ist gegenüber Maltose oder Stärke enzymatisch^" aktiv. Eine jJO $ige Dextrinlösung (30 ml) wird mit 5 g des Enzymprodukts über Nacht geschüttelt, wobei das Dextrin quantitativ zu Glucose gespalten wird. Das Enzymprodukt wurde 50 mal nacheinander für die Dextrinspaltung eingesetzt und zeigte keinen Aktivitätsverlust.
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GmbH Darmstadt
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12) 1 g des Produktes J wurde in einer Lösung von 25 rag Ribonucleose A in 25 ml Wasser quellen gelassen. Nach Zugabe von 2 mg Pe2(QO2,)^ in 1 ml HpO wurde 15 Minuten Stickstoff durchgeleitet. Dann wurden hintereinander jeweils 20 rag Ammoniumpersulfat und Natriumpyrosulfit zugegeben und weiter ;50 Minuten Stickstoff durchgeleitet» Das Produkt wurde mehrfach mit 1 M Na Cl-Lösung und zuletzt mit 0,o5 M Phosphatpuffer, pH 7.»5 gewaschen,, Ausbeute an gebundenen RNase: 78 %· Enzymatische Aktivität (Heferibonucleinsaure, pH 7*5* 37°C): 88 % der entsprechenden Menge an freier RNase.
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Claims (1)

  1. Patentanspr üche
    1. Verfahren zur Herstellung trägergebundener Polypeptide,
    dadurch gekennzeichnet,
    daß man in einer wäßrigen Lösung eines Polypeptide in Gegenwart einer makromolekularen Verbindung, die wenigstens eine olefinische C=C-Doppelbindung je Molekül enthält, und in Abwesenheit radikalisch polymerisierbarer Monomerer Radikale erzeugt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Verbindung ein Molekulargewicht von wenigstens 1.000, vorzugsweise wenigstens 10.000 hat.
    3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Verbindung wenigstens eine olefinische C=C-Doppelbindung je 50.000 Molekulargewichtseinheiten enthält.
    4. Verfahren nach den. Ansprüchen 1 bis jj, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Verbindung ein Mischpolymerisat von Vinylverbindungen ist, das zu 0,5 bis 20 MoI-^ aus Monomeren mit wenigstens 2 C=C-Doppelbindungen aufgebaut ist.
    5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Verbindung in.Form von festen Teilchen, Fasern oder Filmen vorliegt.
    6β Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß die festen Teilchen oder Filme in Wasser bei 200C wenigstens au das Doppelte ihres Trockenvolumens quellen.
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    ORIGINAL INSPECTED
    GmbH Darmstadt
    7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis K, dadurch gekennzeichnet, daß die makromolekulare Verbindung in Wasser löslich ist.
    8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7* dadurch gekennzeichnet, daß man Radikale mittels eines Redox-Systems bei Temperaturen zwischen 0 und 60°C erzeugt.
    9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
    daß das Polypeptid ein Enzym, Enzymhibitor, Antikörper oder
    in
    Hormon ist.
    509883/0943 214871
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US4806348A (en) * 1986-06-28 1989-02-21 Rohm Gmbh Method for inducing antibody formation

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DE2312615A1 (de) * 1972-03-14 1973-09-27 Exploaterings Ab Tbf Verfahren zum kuppeln von verbindungen mit hydroxyl- und/oder aminogruppen an polymere

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BE830479A (fr) 1975-10-16
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