DE2414219A1 - Mittel zur immunoregulation von pollenallergie - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur immunologischen Steue~ rung (Immunoregulation), das geeignet ist zur Prophylaxe und Behandlung von Pollenallergie.

Ss ist bekannt„ daß Serumimmunoglofculin-(Ig)-Antikörper eine wesentliche Rolle bei allergischen Erkrankungen spielen» Zwei wichtige Gruppen von Immunoglobulin-Aiitikörpern in diesem Zusammenhang sind die hautsensibilisierenden Antikörper oder £ej ginartigen Antikörper Q⁵^E= oder Igl»AntikörpeE) und die TbXokkiesenden Antikörper₀ Ss ^jirä angenommen₉ daß die Wirkung von

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IgE-Antikörpern darin besteht, Gewebe-Mastzellen und Basophile so zu sensibilisieren, daß sie chemische Vermittler wie Histamine aus der Zelle freisetzen bei Belastung mit Antigen. Andererseits wurde gezeigt, daß blockierende Antikörper nahezu vollständig beschränkt sind auf die G-Klasse der Immunoglobuline.

Der erste Beweis für die Rolle der Antikörper bei der Allergie von Menschen wurde 1919 geliefert, als berichtet wurde, daß die Übertragung von Serum von einem symptomatischen oder asthmatischen Patienten auf einen nicht symptomatischen zu asthmatischen Symptomen führte. Prausnitz und Kuestner, ZbI. Bakt., 86:160, 1921, beschrieben das Phänomen der passiven, lokalen, sofortigen Hypersensibilität (Überempfindlichkeit ), die verursacht wird durch Serumübertragung von einem allergischen oder "atopischen" Individuum auf die Haut eines nicht allergischen Individuums. Cooke et al. (J. Exper. Med., 66:689, 1937) zeigten die Bildung von blockierenden Antikörpern in Serum von desensibilisierten Patienten. Diese Antikörper wurden im Gegensatz zu den Reaginen durch Erhitzen auf 56⁰G nicht zerstört und besaßen die Fähigkeit, reagines Serum in dem Prausnitz-Kuestner (P-K) l'est zu hemmen. Es wurde von einer positiven Wechselwirkung berichtet zwischen dem Vorliegen thermostabiler Antikörper und einer saisonbedingten bzw. eine Saison lang anhaltenden Resistenz gegen Allergie. Seit der ursprünglichen Beschreibung von Cooke et al. ist die Rolle, die blockierende Antikörper spielen, sehr umstritten.

Diese Streitfrage wurde in einem gewissen Maße in den letzten Jahren geklärt durch veröffentlichte Untersuchungen über Langzeitwirkungen bei der Therapie mit Antigen. Diese Untersuchungen zeigen, daß behandelte Patienten gute klinische Ergebnisse zeigen sowie eine deutliche Zunahme der Fähigkeit ihrer Leukozyten Antigene zu neutralisieren. Bei einigen dieser Patienten, die hohe Dosen erhalten hatten, hörte die Leukozyten-Histamin-Freisetzung vollständig auf, ein Befund, der eine Zelldesensibilisierung nahelegt. Obwohl die Ergeb-

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nisse seitdem teilweise bestätigt worden sind, wurde noch keine genaue Beziehung "bzw. Wechselwirkung zwischen den beiden hauptsächlichen immunologischen Unterdrückungstheorien (immunosuppressive theories) definiert; der Antikörperblokkierung und der Zelldesensibilisierung.

Zur Zeit besteht die !Therapie allergischer Erkrankungen in einer Verabreichung von multiplen. Dosen wässriger allergener Extrakte, die lokal in nach und. nach annehmenden Dosen über eine längere Zeit* manchmal einige Jahre, injiziert werden. Doppelblindversuche haben die klinische Wirksamkeit dieser

Therapie zur Behandlung allergischer Erkrankungen wie KreuzirtägweecT) ο & ö

kraut-Polliniosis und Heufieber gezeigt. Bernton et al. in J_e Allerg«, _s 33» 356-364·, 1962 haben berichtet, daß Vorteile erreicht werden können durch eine gleichzeitige (co-seasonal) Behandlung mit Anti-Kreuzkraut-Hyperimmunglobulin. Sie stell~ ten jedoch fest, daß die gleichzeitige Verabreichung von Kreuzkrautpollenextrakt mit der Fraktion von blockierenden Antikörpern oder die Behandlung vor der gefährlichen Jahreszeit keinem nützlichen Zweck dient. Trotz gewisser Fortschritte wird das weiterhin häufige Auftreten von allergischen Erkrankungen im allgemeinen und von Pollenallergie im besonderen als sehr wichtiges Gesundheitsproblem in den Vereinigten Staaten und der gesamten Welt angesehen.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Immunoregulation zur Verhinderung und Behandlung von Pollenallergie zu entwickeln. Dieses neue Produkt soll gereinigtes aHergenspezifisches Hyperimmunglobulin enthalten, das geeignet ist zur parenteralen Verabreichung einer die Allergie unterdrückenden Menge von reaginartigen Antikörpern und zu einer immunologischen Reaktion führen. Dieses Produkt kann auch einen hyperimmunspezifischen Antikörper-Antigen-Komplex enthalten, der vorher in vitro hergestellt worden ist.

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Erfindungsgemäß besteht ein Verfahren zur immunologischen Behandlung von Pollenallergie darin, daß man einem allergischen Menschen vor der Pollenjahreszeit und vorzugsweise in einer Reihe von Dosen ein Mittel injiziert, umfassend ein pollenallergenspezifisches, menschliches Hyperimmunglobulin der Immunoglobulinklasse G (spezifisches IgG), in einer Dosis, die ausreicht, die Bildung von reaginartigen Antikörpern zu unterdrücken, die zu diesem Allergen spezifisch sind und die Gev/ebeinastzeilen und zirkulierenden Mastzellen zu desensibilisieren, wobei das spezielle IgG gebildet wird, indem man nicht allergischen menschlichen Spendern eine Reihe von Dosen eines injizierbaren Mittels injiziert, umfassend mindestens ein Pollenantigen, wobei die Reihe von Injektionen an die Spender ausreicht, um eine hyperimmune serologische Reaktion auf das Antigen hervorzurufen, den Spendern das entstehende hyperimrnune Blut entnimmt und das Blut weiterverarbeitet, um das spezifische IgG zu gewinnen, das frei ist von nachweisbaren spezifischen IgM- und IgE-Antikörpern und hyperimmun ist in Beziehung auf das Allergen (bezüglich der Immunoglobuline IgG, IgM und IgE, s. Bellanti, Immunology, 101 ff., W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1971).

Pur das erfindungsgemäße Verfahren werden Spender ausgewählt, die gegenüber dem speziellen Antigen nicht allergisch sind, d.h. die nicht atopisch sind und die auf das Allergen nicht unmittelbar reagieren. Die Dosis wird injiziert, vorzugsweise subkutan und so gewählt, daß sie in annehmbaren Zeiten zu einer immunologischen Reaktion führt·

Z. B. kann bei Anwendung eines wässrigen Auszugs von kurzem

(short ragweed J
Kreuzkraut, der einen hohen Antigen-E-Gehalt besitzt (vergl. Samter, Diseases, II, 777, Little, Brown und Co., Boston, 1971)i eine Einzeldosis typischerweise im Bereich von ungefähr 200 bis 5000 Protein-Stickstoff-Einheiten (P.N.U.) pro Injektion liegen. Derartige Injektionen führen, wenn sie wöchentlich nicht-allergischen Menschen verabreicht werden, zur Entwicklung von hohen Titern von Kreuzkraut-IgG-AntikÖrpern in verhältnismäßig kurzer Zeit, d.h. in ungefähr drei

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Monaten oder weniger. Die Injektionen können einige Monate bis zu zwei Jahren oder langer verabreicht "werden.

Im Rahmen der Erfindung bedeuten die Ausdrücke "Allergen" oder "Antigen^1|V7YUie mindestens eine Art von Pollena 11ergen oder antigen enthält, von dem bekannt ist, daß es zu einer allergischen Reaktion führt. Beispiele für solche fa 11ergene oder antigene sind gemeines Kreuzkraut, Riesenkreuzkraut, Raygr a s(. Gruppen I, II und IH^ Junigras, Obstgartengras, •wohlriechendes Ruchgras, Straußgras, Timotheusgras, gelbes Ampferkraut, Weizen, Mais, Beifuß, Blaugras, Kalifornisches einjähriges G-ras, zurückgekrümmter Puchsschwanz, Bermudagras j Russische Distel? Bergzeder, Eiche, Buchsbaum, Hollunder, wilder Feigenbaum, Ahorn, Ulme und ähnliche Pollenallergene und -antigene_o Derartige Allergene, Antigene, Extrakte und Konzentrate sind einzeln oder in Kombination in geeigneter Porm zur Injektion im Handel erhältlich oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. In den speziellen, in der folgenden Beschreibung angegebenen Beispielen wird Allergen von kurzem Kreuzkraut (short ragweed) zur Erläuterung der Erfindung angewandt, aber selbstverständlich können auch andere Allergene anstelle oder zu-? sätzlich zu dem Kreuzkrautallergen in den Beispielen verwendet werden_o Dabei müssen die Dosis usw_e nach anerkannten Grundsätzen gewählt werdezn

Das Auftreten von a11ergenspezifischen IgG—Antikörpern während der Immunisierung kann bestimmt werden durch periodieche Untersuchung auf irgend eine geeignete Weise_s ζ_ΘΒ_ο durch Allergen-=Bindungs=Bestimmuni(verglo Jo Allergy₉ 33? 45 )₉ durch passive Häraaggiutination (vergl_o J₀ E2sp_o MecL _s 93₉ 107) oder durch Radloimrmmodiffusion (iferglo Jo Immun_os 83j, 736)_o Wenn die Untersuchung seigtc, äaß d©r Siter ausreichend hoch. Ists wird das Spenderblut auf irgendeine geeignet© Weise ge·= sammelt ρ vorzugsweise durch Plasmapherese*, bei der die Blut= seilen abgetrennt und.dem Spenäes wieder lagiglest

— ο —

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Das von den Immunisierten Spendern gewonnene Blut wird nach bekannten Verfahren aufgearbeitet, um gereinigtes spezifisches IgG zu erhalten. Ein derartiges Verfahren, das bevorzugt ist, ist das Ausfällverfahren nach Cohn mit kaltem Äthanol (vergl. Encyclopedia of Chemical !Technology, 2, 557-584, 1948). Das gereinigte spezifische IgG ist als Merkmal der vorliegenden Erfindung frei von nachweisbaren allergenspezifischen IgM- und IgE-Antikörpern, wenn es nach Standardverfahren untersucht wird. Die Abwesenheit von allergenspezifischen IgM-Antikörpern kann gezeigt werden durch Immunoelektrophorese (vergl. J. Immun., s.o.) und von allergenspezifischen IgE-Antikörpern (hautsensibilisierenden oder Reagin-Antikörpern) durch den Radioallergosorbtionstest (RAST, vergl. Lancet, 2, 1105).

Eine bevorzugte Form des Produktes ist eine sterile wässrige. lösung von gereinigtem IgG, die geeignet ist oder geeignet gemacht werden kann zur Injektion. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt eine injizierbare 16%ige Lösung der Globulinfraktion, enthaltend z.B. im I'alle von Antikreuzlcrautglobulin 250 /ug/ml spezifische Kreuzkraut-IgG-Antikörper.

Bei einer anderen Ausführungsform enthält das Produkt ungefähr 160 mg gereinigtes IgG pro ml (bei dem der spezifische Kreuzkraut-Antikörper-Gehalt vorzugsweise 250 /Ug/ml beträgt), gelöst in 0,2 bis 0,3 m Glycin, enthaltend 0,2 fo Natriumchlorid und 0,01 % Thimerosal als Konservierungsmittel mit einem geeigneten Puffer auf pH 6,8 eingestellt. Im allgemeinen beträgt die maximale Einzeldosis 10 ml gereinigtes Antikreuzkraut-IgG mit einer minimalen Konzentration von 250 bis 2500 /Ug/ml. Es wird angenommen, daß ein wirksamer Bereich das 10fache des oben genannten bevorzugten wirksamen Bereichs sein kann.

Das Produkt kann in einer Dosis von ungefähr 0,022 bis 0,22 ml/kg Körpergewicht (0,01 bis 0,1 ml per pound) verabreicht werden, wobei die Gesamtdosis in dem bevorzugten Falle 5>5

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Ms 55 /Ug (2,5 bis 25 /Hg) kreuzkraut-IgG-spezifische Antikörper pro kg (pound) Körpergewicht beträgt. Die bevorzugte Yerabreichungsart ist die intramuskuläre Injektion.

Wenn gewünscht _t kann die Bildung von Hyperimmunglobulin durchgeführt werden unter Anwendung von mehr als einer Art von Antigen in der injizierten Dosis ₉ was zur Bildung des entsprechenden hyperimmunen polyvalenten Globulins führt. Ein beispielhaftes Produkt ist eines₉ das gebildet worden istρ indem man den Spendern eine Kombination -von Antigegen wie Kreuzkrautr limotheuskraut-und Raygrasantigenen ■verabreichte

Wenn einer allergischen Person eine Reihe von Dosen von spezifischem IgG- erfindungsgemäß verabreicht werden soll₅ wird eine solche Dosis gewählt, die die Bildung von allergenspezifischen Reagin-(IgE)-Antikörpern unterdrückt und die Gewebemastzellen und zirkulierenden Mastzellen dosensibilisierto Zu diesem Zweck kann der Gehalt an Reagin-Antikörpern überwacht v/erden, z.B« durch in vitro-Diagnoseverfahren wie den Radioallergosorbtionstest (RASl¹ )· Es hat sich in dem typischen !Falle, wenn Z₉B₉ Antikreuzkraut-IgG in geeigneter injizierbarer Porm angewandt wird, gezeigt, daß die Personen, denen dieses Produkt injiziert worden ist₉ überraschenderweise eine Abnahme oder keine Zunahme an Kreuzkraut-lgl-Antikörpern zeigen. Der Yerlauf der Behandlung (Dosissteigerung, Anzahl der Injektionen usw.) kann variiert werden je nach dem Zustand des Patienten, seinem Toleranzgrad, ob es sich um einen behandelten oder nicht behandelten Patienten handelt usw. Im PaHe von Kreuzkrautallergie, z.B., kann die injizierte Dosis typischerweise 10 ml Kreuzkraut-IgG (250 /Ug Kreuzkraut-IgG-Antikörper pro ml) betragen oder eine entsprechende Wirksamkeit in einer einzelnen Dosis oder in zwei oder mehreren Dosen in einem gewissen Abstand (günstigerweise in wöchentlichen Intervallen), vorzugsweise drei Monate vor dem Beginn der Kreuzkrautjahreszeit. Im allgemeinen kann irgend-

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eines von verschiedenen Allergenen angewandt werden, wobei die Dosis in jedem Fall bestimmt wird durch vorhergehende Versuche zur Bestimmung des Bereichs und in vitro-Untersuchungen auf die spezifischen IgE-und Gesamt-IgE-Antikörper. Die Verabreichung v;ird in jedem Falle eine ausreichende Zeit durchgeführt, um die Bildung von allergenspezifischen Reagin-Antikörpern zu unterdrücken«

Die Erfindung betrifft auch in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Immunoregulation von Pollenallergie, bei dem einem allergischen Patienten vor der Pollenjahreszeit ein Mittel verabreicht wird, umfassend ein spezifisches IgG, wobei die verabreichte Dosis ausreicht, daß sie die Entwicklung von allergenspezifischen Reagin-IgG-Antikürpern unterdrückt und die Gewebemastzeilen und zirkulierenden I-Iastzellen desensibilisiert und nach einer Inkubationszeit (d.h. einer Zeit zur Entwicklung der Toleranz gegen das Allergen, üblicherweise mehr als 48 h bis zu einer Woche oder darüber, d.h. mindestens einer Woche) . der Patient schnell ("rush") desensibilisierilirindem ihm vorzugsweise subkutan eine Dosis des spezifischen Allergens verabreicht wird.

Die Desensibilisierung wird durchgeführt, indem man den Patienten mit kleinen Dosen des spezifischen Allergens belastet, die nach und nach in so kurzen Zeiträumen wie möglich erhöht werden bis zu dem Punkt der maximalen Toleranz.

Bei einem typischen Fall der Kreuzkrautallergie,z.B. wird eine Woche nach Verabreichung einer 10 ml i.m. Dosis (250 /ag Kreuzkraut-IgG-Antikörper pro ml) spezifisches Kreuzkrauthyperimmun-IgG, Kreuzkrautallergen subkutan in 0,2 ml Volumina mit einer Anfangsverdünnung von 1:10 000 verabreicht und die Konzentration in subkonstitutionellen Dosen, die periodisch verabreicht werden (z.B. in halbstündigen Intervallen) auf eine Stärke von 1:100 bis 1:33 an Kreuzkrautextrakt während 6 bis 8 h der Desensibilisierung verabreicht.

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Wenn gewünscht, kann die Verabreichung des Allergens in relativ hohen Dosen längere Zeiten wie 1 Jahr oder langer anschließend fortgesetzt werden_o

Die erfindungsgemäße Immunoregulation unterscheidet sich von der üblichen Immunreaktion» Bei der üblichen Immunreaktion stimulieren vom Thymus abgeleitete Zellen (!D-Zellen), wenn sie durch ein Allergen stimuliert werden, die Knochenmarkzellen (B-Zellen) in Klonen (clones) von Iramunocyten zu wuchern« Die Immunocyten bilden wieder allergenspezifisehe Immunoglobuline (sowohl IgG- als auch IgE). Erfindungsgemäß führt jedoch die Kombination der Behandlung eines atopischen

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Patientfmit einem spezifischen IgG- und nach der Inkubation das Injizieren von spezifischem Allergen au einer selektiven Immunoregulationswirkung die zur Bildungen Immunoglobulin ausschließlich der Klasse G führt» Es wird angenommen, daß diese Wirkung ebenfalls durch T-Zellen_s B-Zellen und Immunocyten vermittelt wird₉ aber es wird postuliert, daß die Allergenkomplexe mit dem Antikörper und die Allergen-Antikörper -Komplexe sich mit verfügbaren spezifischen Antigenrezeptoren an den Membranen der T- und B-Zellen verbinden und dadurch eine weitere Stimulierung der IgE-spezifischen 2- und B-Zellen durch Allergen verhindern^ So führen diese Allergen-Antikörper-Komplexe su einer Blockierung oder Hemmung der Immunocyten ₉ die dazu bestimmt waren, IgE zu bilden_o In diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Produkt, das geeignet ist oder geeignet ge~ macht werden kann zur Injektion zur Immunoregulation von Pollenallergiesdas pollenallergenspeziflsche Hyperinimun-IgGl·= Antikörper umfaßt_s dl® komplexiert sind mit eines äquivalenten- Menge des spezifischen Ällergenso Uli solohe_ts Produkt wird vor der entsprechenden Jaliresgelt ä@w, allergischen Pa= tlenten durch Injektion auf die gleiche Weis© νesa "breicht wi© das oben beschrieben© pollenallergenspezlilsc-lie Hypes·= Immun»Ig0<=lmmEnogen un& In äquivalenten Dosen auf den Gehalt an allergenspeaifieche-n IgCr

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Die Anwendung des Produktes (in Form eines Antikörper-Antigen-Komplexes) führt zu einer Desensibilisierung des allergischen Patienten, während die Notwendigkeit einer getrennten, schnellen Desensibilisierung erfindungsgemäß weitgehend herabgesetzt wird.

Das erwähnte spezifische IgG-Antikörper-Antigen kann vorher in vitro hergestellt werden durch Kombination des getrennten spezifischen Hyperimmunglobulin-IgG und spezifischen Antigen in äquivalenten Mengen nach bekannten immunologischen Verfahren. Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung des Antikörper-Antigen-Kornplexes wird eine aliquote Menge von gereinigtem allergenspezifischen Hyperimraunglobulin-Jgegen mit J markiertes spezifisches Allergen titriert (J. Allergy, 33» 4-5), urn den Antigenbindungstiter des Globulins quantitativ zu bestimmen. Hieraus wird ein geeignetes Produkt zur Injektion hergestellt durch Vermischen von gereinigtem spezifischen IgG, das frei ist von nachweisbaren allergenspezifischen IgI! und IgE und einem wässrigen Extrakt, enthaltend eine äquivalente Menge des spezifischen Allergens in einem zur Injektion geeigneten Medium bei 0 bis 4°C ausreichend lange und vollständige Kompiexbildung zu erreichen. Der entstehende Antikörper-Antigen-Koaplex kann vor Beginn der Allergenjahreszeit parenteral verabreicht werden, vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion in einer einzigen Dosis oder einer Reihe von zwei oder mehreren Dosen in einem Abstand von günstigerweise einer Woche, um eine Unterdrückung der Bildung von allergenspezifischen Reagin-Antikörpern zu vermeiden (wie in vitro durch das RAST-Verfahren gezeigt werden kann) und eine Desensibilisierung gegen das spezifische Allergen herbeizuführen (wie durch provozierende Belastung gezeigt werden kann).

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert«

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Beispiel 1: Herstellung von Antikreuzkraut-IgG-Injektions-

" °"~~~ " mittel

42 nicht allergischen Freiwilligen (zuerst in The Lancet, 1971 j H₉ 1121 berichtet) wurden-wöchentlich -wässrige Auszüge von krusem Kreuzkraut, die einen hohen Antigen-E-Gehalt besaßen^ verabreicht (Einzeldosis von 200 Ms 5000 P.Ή.U₈ pro Injektion), wobei die Zeiten von 6 Monaten bis zu 2 Jahren variierten₀

Es wurden wöchentlich Hautversuche mit 1:1000 Verdünnungen (1 mg/ml) von biologisch aktivem Kreuzkrautextrakt durchgeführt ο Die Tersuchslösungen wurden intrakutan in Mengen von O₉02 ml in die Volarseite des Unterarms injiziert und die Ergebnisse nach 15 min interpretiert. Eine mit Phosphat gepufferte Salzlösung5 pH 7_S2, wurde in Kontrollstellen injiziert«, Die Reaktionen wurden als positiv angesehen, wenn die intrakutane Reaktion 3 + oder stärker war. Merkmal für positive intrakutane Versuche nach 15 min waren: 2+, eine Quaddel von der 3fachen Größe der Vergleichsstelle (mit oder ohne Rötung bzw_e Erythem)₉ 3+_? eine Quaddel von der 4facben Größecfer Vergleichssbelle (mit oder ohne Erythem),4+? irgendeine Quaddel mit Pseudopodia» Innerhalb von 4 Wochen nach Beginn der Immunisierung zeigten 37 von 42 Freiwilligen eine positive Hautreaktion gegenüber Kreuzkrautantigen. Eine Hautempfindlichkeit von 3+ und 4+ trat während der 4 Wochen nach den negativen Hautreaktionen innerhalb von 3 Wochen ein. Einmal aufgetrejolieb die Hautreaktion stark positiv, solange die Immunisierung fortgesetzt wurde.

Die Entwicklung und das Auftreten von Kreuzkraut-IgG-AntikÖrpern wurde durch ihre Fähigkeit gemessen, radioaktiv-markiertes Antigen zu binden, durch passive Hämagglutination durch mercapto-äthanol-beständige Agglutinine und durch Radioimmunoelektrophorese₀ IgG-Antikörper wurden ungefähr 2 Monate nach Beginn der Injektion mit ansteigend zunehmenden !Ditern nachweisbar» IgG- und Reagin-Antikörper blieben nebeneinander ■bestehen, aber die Konzentration der Reagin-Antikörper war

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unabhängig von den IgG-Antikörpern. Wenn das Injektionsprogramra unterbrochen wurde, verschwanden die hautsensibilisierenden Antikörper (IgE) innerhalb von 4 Monaten aus dem Kreislauf. Den Patienten wurde durch Plasmapherese Blut entnommen und das erhaltene Plasma fraktioniert und mit Hilfe der Cohn-Fraktionierung gereinigt, um gereinigtes Antikreuzkrauthyperimmun-IgG zu erhalten, das frei war von spezifischen IgM- und hautsensibilisierenden (IgE) Antikörpern. Das Produkt wurde mit Salzlösung verdünnt und für das unten beschriebene Verfahren in einer Konzentration von 16 fo, enthaltend 250 /Ug spezifische Kreuzkraut-IgG-Antikörper pro ml, verwendet.

Cohn—Fraktionierung

Die gereinigten spezifischen Hyperimmun-IgG, die frei waren von nachweisbaren»IgM- und IgE-Antikörpern (d.h. nachweisbar durch die oben erwähnte Immunoelektrophorese und das RAGT-Yerfahren) können bequem erhalten werden durch Cohn-Praktionierung oder andere geeignete Verfahren, bei denen man gereinigtes IgG erhält. Das folgende im einzelnen beschriebene 5stufige Verfahren ist typisch für eine bevorzugte Fraktionierung.

a) Menschliches Plasma (Antikreuzkrauthyperimmun , gewonnen von nicht allergischen geimpften Patienten wie oben beschrieben) wurde auf O⁰C gehalten und mit Äthanol (5,3 ml/l Plasma) vermischt bis zu einem Gehalt von 0,5 i° Alkohol in dem Plasma. Das alkoholische Plasma wurde zentrifugiert (Sharpies Nr. 16) bei 0⁰C und die Ausläufe der Zentrifuge zusammengegeben, mit Pufferlösung (Natriumacetattrihydrat, 54,43 g, 114»46 ml Eisessig, 11 Wasser) auf pH 7,2 eingestellt und 350 ml Äthanol pro 1 gepuffertes Plasma bei -5°C zugegeben, um ein Gemisch, enthaltend 25 $ Alkohol,zu erhalten. Nach 30 min langem Stehen wurde das Produkt bei -6°C mit einer Geschwindigkeit von 30 l/h und Zentrifuge zentrifugiert·

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b) Der entstehende niederschlag wurde in Wasser (1 kg auf 8 1 Wasser) bei O bis 1°C gelöst und der pH-Wert mit Puffer auf 4s8 eingestellt_β Es wurde destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 l/kg niederschlag zugegeben* Der pH-Wert wurde durch 3 h langes Mischen bei 1®C auf 4_S8 gehaltene Bei 0®C und einem pH-Wert von 4_S8 wurde Natriumchlorid zugegeben^ um eine lonenstärke von 0_?08 zu erhalten® 92 ml Äthanol pro 1 Lösung wurden augegeben_s wobei eine Erwärmung oder Eisbildung vermieden wurde (0 bis -2°0). Das Produkts, das getzt 8 $ Alkohol enthielte, wurde 50 min bei ■=2⁰G vermischt;, zentrifugiert (20 l/h) und der Auslauf ge-

c) Der Auslauf von b)_s der auf =2⁰C gehalten wurde ₉ wurde mit 0_?5 m Hatriumbicarbonatlösung auf pH 6₉8 gebracht und Äthanol und natriumchlorid bis zn einer Alkoholkonzentra*= tion von 25 % und einer lonenstärke von O₉IO zugegeben_o Die Lösung wurde 30 min bei =5®G gerührt und mit einer G-eschwin= digkeit von 50 bis 55 l/h zentrifugiert_o

d) Der durch Zentrifagieren in Stufe o) erhaltene iiieder·= schlag wurde in Wasser "bei O⁰G gelöst (1 kg/10 1) uziä mit Puffer auf pH 4?8 gebrachte J3i3 Lösung wurde 6 h bei 0®ö vermischt und 18 1 Wasser bei 1°ö/kg ITiefi-sx-selilsg der Stufe

0) zugegeben ο Der pH~¥®Et iriurcl® Mit Q₉ 5 si MatriMafoieasbonat auf 5s 1 eingestellt enä KatrlmaekloEiö Ms zn einer Ionen= stärke ύόώ. Oρ01 angegeben,, Bel O Ms 1°0 i-aixae Zthanol (218 ml/l l'ösmig) sEgegeben₉ während öle temperatur der Sg= sung Tfosi 0 aKa =5^θ0 ©saieörigt «ιιεοΘο jjss Ife^avlzx,<; öas getst 1? $ Alkohol enthielt _s "yuröe 30 min b©i -5°G gszW&o-'G vaiä bcsi «5 °Ö %e-ßtriftagiert _o

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Das Äthanol wurde zugegeben, während die Temperatut auf -6⁰C gehalten wurde und nach 24 h langem Stehen bei -6,5°C wurde das Produkt bei -6,5°C mit einer Geschwindigkeit von 25 l/h zentrifugiert. Der entstehende Niederschlag, der das gewünschte gereinigte allergenspezifische Hyperimmun-IgG ist, das frei ist von nachweisbarem allergenspezifischem IgM und IgE, kann direkt zu einer injizierbaren isotonischen Lösung verarbeitet werden,oder er kann gelagert oder nach üblichen Gefriertrocknungsverfahren in ein Pulver umgewandelt werden, das später mit Salzlösung, Stabilisator, Sterilisierungsmitteln usw. je nach Wunsch zubereitet werden kann.

Verfahren zur Bestimmung des Immunoglobulin-G-Titers

Im folgenden ist ein typisches Verfahren zur Bestimmung des Immunoglobulin-G-Titers eines Vergleichs-Antikreuzkraut-Serums (Schaf) und zum Vergleich menschliches Antikreuzkrautglobulin-G angegeben: Verschiedene Mengen (in einem Bereich abgestufter Verdünnungen) von radioaktiv markiertem Kreuzkrautantigen-E wurden mit Anti-S-Schafserum bei 37°C 2 h inkubiert und anschließend 24 h bei 4⁰C Die Röhrchen, die die maximale Niederschlagsmenge enthielten (bestimmt durch den Grad der Trübung) wurden als im Gleichgewichtsbereich angesehen (wobei die Mengs an reagierenden speziiischen Antikörpern und Antigen gleich war). Die Niederschlage aus diesen Röhrchen wurden gewaschen und das Gesamtgewicht des Proteins in der Probe nach dem Lowry-Verfaiiren bestimmt. Das Gewicht das Antigen-E-Proteins (entsprechend der beobachteten Radioaktivitätsmenge in der Probe) wurde von dem Gesamtgewicht der Probe rjubtrahiert, wobei nan die Menge an kreuzkrautspezifischem Antikörper in der Probe erhielt. Dieser Wert wurde als Vergleich, angewandt zur Berechnung des Antigen-Ε-(Kreuzkraut )-Anti körpertiters des Schefgnti3erums in Gewicht pro Volumeneinhei .;„ Zum Vergleich war de der Antikörpertiter des Sohafantiserums auch durch Autors.aiographie und passive Hamagglutination gemessen. Durch diesen Vergleich konnten die Ergebnisse der beiden zuletzt genannten Bestimmungsverfahren

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ausgedrückt werden als Gewicht spezifischer Antikörper pro Volumeneinheit Schafserum. Die Titer des Humanantikreuzkrautimmunoglobin-G, die nach den letzten Verfahren gemessen worden waren, konnten dann als Gewicht pro Volumeneinheit (/Ug/ml) angegeben werden, bezogen auf die beschriebene Eichung mit Hilfe von Schafantiserum-Standard.

Beispiel 2 s Verfahren zur Behandlung von nicht-allergischen

licht allergischen, nicht behandelten Personen wurde jeweils einefDosis der oben beschriebenen Antikreuzkraut-IgG-Zubereitung intramuskulär injiziert. Dosen des ^-Globulins \vurden eine ¥och.e vor_s gleichzeitig mit und 1, 2 und 4 ¥ochen nach Beginn der Injektion des Kreuzkrautallergens verabreicht, das anschließend einmal pro Woche injiziert wurde (wässrige Auszüge von kurzem Kreuzkraut, 200 bis 5000 P.H.TJ. pro Injektion i_om_o)o Es zeigte sich, daß die Verabreichung des Hyper-■imrüun~£T^ragl°bulins vor, gleichzeitig mit und sogar 1 bis 2 Wochen nach dem Beginn der Allergeninjektion die Bildung von hautsensibilisierenden Kreuzkrautanitkörpern bei nicht allergischen Individuen permanent verhinderte» Die 4 Monate., nach dieser Behandlung erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

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Tabelle 1 Immunreaktion bei normalen Personen 4 Monate nach, der Verabreichung von Antikreuzkraut-IgG

Zeit der Antikreuzkraut -I gG-Ver a brei chung

Antikreuzkraut-IgG-Reaktion Antikreuskraut-IgE-Reoktion

Auto- Passive

radio- Häraagglugraphie tination

Antigenb in-Sung Hautreaktion

1 Woche vor dem Antigen (3)*

gleichzeitig mit dein Antigen (3)

1 Woche nach dem Antigen (3)

2 Wochen nach dem Antigen (3)

4 Wochen nach dem Antigen (3)

kein Globulin (Antigenvergleich) (3)

keine Behandlung (6)

1 :1

1:384	34
1:192	29
1 :384	37
1:192	30
1:192	28

1:4

13

Anzahl der Personen

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In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Autoradiograpiiie und der Hautreaktion abgestuft von negativ (--) bis positiv (+++). Die Autoradiographie ist ein Maß für die Dichte des IgG-Bandes, während die Hautreaktionsfahiglceit bewertet wird durch die Größe der Quaddel nach der intrakutanen Injektion O

Einigen der Freiwilligen wurden anschließend wöchentlich Dosen von Kreuzkrautallergen bis zu 2 Jahre lang verabreicht« Während dieser Zeit entwiekelten diese Personen keine Reagin-Antikörper_o Die Yerglelchspersonen₅ d_eh₀ die Personen, denen kein Hyperimmun-=· ^-globulin verabreicht worden war, wurden innerhalb von 4 Viochen nach Beginn der Injektion hautempfindliche Die Bildung von IgG--blockierenden Antikörpern wurde nicht beeinflußt durch die Verabreichung des Hyρerimmun- ^T-globulinso

Beispiel 3ό Verfahren zur Behandlung allergischer Personen

licht behandelten, gegen Kreuzkraut empfindlichen Patienten (Patienten A bis E₉ Tabelle 2) wurden jeweils 10 ml Antikreuzkraut~Ig& (entsprechend Beispiel 1 oben) entweder in •einer einzigen Dosis oder in zwei Dosen im Abstand you eines Woche unmittelbar vor des. Beginn der Kreuzkraut jaliresseito doho vor Mitt© Juli verabreicht_o Einer Gruppe von Vergleichspatienten (Patienten P Me H) wurde normales (f^QloOulln ge=· gebeiic, das keine Kreuzkraut «Antikörper enthielt _o Die Unter= suchung xirarde als Doppelblindvessuch durchgeführt₀ Den Patienten wurd© i7or der TasabreielHmg von latikren Blut ©atnommeia vmä. ©raemt am ΈίιΆβ üei? dfgai?esssi·^ OktoTb@Eo M© S(32?a ä®r Pat

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auf öle Gesamtmenge IgE^AntiköEpera uirfcsrsuchte Eie alsse sind In Sabell© 2 a

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Tabelle 2

IgE-Immunreaktion bei gegen Kreuzkraut empfindlichen Individuen während der Jahreszeit

nach der Behandlung mit Antikreuskraut-IgG

Patient Behandlung

-J.
VD

A B C D E P G H I J K

Il

Immun-IgG Immun-IgG Immun-IgG Immun-IgG Immun-IgG Norma1-IgG Normal-IgG Normal-IgG nicht behandelt nicht behandelt nicht behandelt nicht behandelt nicht behandelt Gesamt IgE (Einheiten/ml)* Kreuzkraut-IgE (Einheiten/ml)**

vor der Jan- nach der reszeit Jahreszeit

360

175

21

290

214

295

84

87

730

1250

115

47

87

vor der Jah	nach der Jah
reszeit	reszeit
344	282
76	76
43	35
220	210
50	60
150	385
22	80
20	137
120	350
1182	2855
29	140
15	44
16	42

* 1 Einheit Gesamt-IgE entspricht ungefähr 1/3 bis 1/2 ng Gesamt-IgE

1 Einheit Kreuzkraut-IgE entspricht ungefähr 1/3 bis 1/2 ng Kreuzkraut-IgE

Die Patienten A bis E, die Anikreuzkraut-IgG erhalten hatten, zeigten keine Zunahme des Gehaltes an Kreuzkraut~XgE-Antikörpern -während der KreuzkrautJahreszeit. Die Vergleichspersonen ¥ Ms M zeigten einheitlich eine 2- Ms 5fache Zunahme der Konzentration an Antikreuzkraut-IgE während der Kreuzkrautjahreszeito Die Verabreichung von kreuzkrautblockierenden IgG-Antikörpern beeinflußte danach die Bildung von Reagin-IgE-Kreuzkrautanitkörpernο Die klinische Reaktion dieser Patienten während der Kreuzkrautsaison war im wesentlichen proportional der Menge an verabreichtem Kreuzkrauthyperimmun-IgG. Es zeigte sich_s daß nach Ausschluß des erv/arteten Placeboeffekts Patienten, die zwei 10ml-Injektion von Kreuzkrauthyperimmun-XgG vor der entsprechenden Jahreszeit erhalten hatten, sich besser fühlten als Patienten, die Placebo oder eine Injektion des Immunoglobulins erhalten hatten.

Beispiel 4s Kombinierte IgG-Behändlung und schnelle Desensi-

Hicht behandelten allergischen Patienten (Patienten AA bis AK) •wurden intramuskulär 10 ml Antikreuzkraut-IgG (entsprechend Beispiel 1 oben) injiziert und in unterschiedlichen ZeitintervaIlen nach dieser Injektion wurde eine rasche Desensibilisierung mit Kreuzkrautextrakt durchgeführt₃ sodaß die maximal verträglichen Dosen von Kreuzkraut innerhalb einer Desensibilisierungszeit von 6 bis 8 h erreicht wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 3 angegeben.

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Tabelle 3

Wirkung der Verabreichung von spezifischem IgG auf die Kreuzkrautempfindlichkeit allergischer Personen

Maximale Antigendosis, die während der Patient Behandlung schnellen Desensibilisierung vertragen wird

0,2 ml/1:33
0,4 ml/1:100
0,2 ml/1:100
0,2 ml/1:100
0,4 ml/1:10 000 0,2 ml/1:10 000

igen 0,1 ml/1:10 000

0,1 ml/1:10 000 0,1 ml/1:10 000 0,2 ml/1:10 000 · 0,2 ml/1:10 000

	AA	IgG 7 Tage vor dem Antigen	Placebo
^£}	AB	Il	Il
αο *■»	AC AD	It Il	Il
ο	AE	IgG 48 h vor dem Antigen
2	AP	Il
(Si	AG	IgG gleichzeitig mit dem A
	AH	Il
	AI
	AJ
	AK

"²¹ " 24H219

Die Patienten AI, AJ und AK, die Placebo (Salzlösung) erhalten hatten, konnten nur kleine Dosen von Kreuzkrautantigen (0,2 ml 1:10 000) während der ersten 8 h der schnellen Desensibilisierung vertragen. Ebenso wurden nur kleine Dosen des Antigens vertragen, wenn die Patienten Hyperimmun-?fglobulin gleichzeitig mit oder 48 h vor dem Antigen erhalten hatten (Patienten AE, Ai¹, AG und AH). Im deutlichen Gegensatz zu diesen Ergebnissen war die Wirkung von Hyperimmun- ^-globulin, wenn es eine Woche vor der Desensibilisierung verabreicht wurde. Unter diesen Bedingungen konnten die Patienten (AA, AB, AC und AD) leicht extrem hohe Dosen Kreuzkraut vertragen (Dosen, die üblicherweise von den meisten Patienten selbst nach einer langen Therapie von 1 Jahr oder darüber nicht vertragen werden).

Um das Anhalten dieser Verträglichkeit sicherzustellen, wurde die Kreuzkrauttherapie bei den Patienten AA, AB, AÜ und AD fortgesetzt. Es konnte gezeigt werden, daß diese Patienten große Dosen Kreuzkrautantigen bis zu 3 Monaten nach der ersten schnellen Desensibilisierung vertrugen. Außerdem waren diese Patienten vollständig widerstandsfähig gegenüber einer provozierenden Belastung der Hase mit Kreuzkrautpollen und ihre Leukozyten waren gegenüber der Histaminfreisetzung durch Kreuzkraut nicht reaktionsfähig.

- Patentansprüche -

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Claims (6)

Patentansprüche

1. Mittel zur I&raunoregulation von Pollenallergie,

dadurch gekennzeichnet ,

daß es ein pollenailergenspezifisches Humanhyperimmunglobulin der Gruppe Irauiunoglobulin G aus Blut von allergenspezifisch-behandelten nicht allergischen Spendern enthält,wobei das Globulin frei ist von nachweisbaren pollenallergenspezifischen IgII- und I^-Antikcrpern.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net , daß das Allergen Kreuzkraut ist und das gereinigte Globulin einen Tiber von mindestens 250 /Ug Kreuzkraut-IgG-Antikörper pro ml Globulin besitzt.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet ,.daß das Allergen eine Kombination von Antigenen und das entstehende Globulin ein entsprechendes polyvalentes Globulin ist.

4. Mittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch g e k e η η zeichnet , daß das Hyperimmun-^T-globulin der Immunoglobulinklasse G komplexiert ist mit dem spezifischen Pollenallergen.

5. Verfahren zur Herstellung der Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man einem nicht allergischen Spender Pollenallergen in einer Dosis verabreicht, die ausreicht, eine Hyperimmunreaktion

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in dem Blut des Spenders gegen das Allergen hervorzurufen, v/orauf man

dieses Byperinraiunblut von dem Spender gewinnt und fraktioniert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeieh net , daß man dem Spender eine Reihe von Dosen eines injizierbaren Mittels, enthaltend das Allergen, verabreicht.

7· Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch g e k e η η zeichnet ,daß man dem Spender Kreuzkrautantigen mit einem Antigen-E-Gehalt von 200 bis 5000 Protein-Stickstoff -Einheit en pro Injektion verabreicht.

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