DE2410203A1 - Verfahren zur isolierung von dipeptidestern aus ihren rohgemischen - Google Patents
Verfahren zur isolierung von dipeptidestern aus ihren rohgemischenInfo
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Description
G. D. Searle & Co. Skokie, 111., V.St.A.
Verfahren zur Isolierung von Dipeptid-Estern aus ihren Roh gemischen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues und vorteilhaftes Verfahren zur Isolierung bestimmter Dipeptid-Ester
aus ihren Rohgemischen.
Die betrachteten Dipeptid-Ester besitzen die allgemeine Formel
H9NCHCONHCHCOOr
CH2 CH2 (I)
1 I
COOH X
worin X einen Phenyl- oder einen p-Hydroxyphenylrest und R
einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen bedeuten
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und die stereochemische Konfiguration L-L ist» Diese Verbindungen sind, wie in den US-PSs 3 ^92 131, 3 475
und 3 Ti^ 139 beschrieben, als Süßstoffe von Interesse.
Wie in diesen Patentschriften beschrieben, können die Dipeptid-Ester durch Umsetzen eines Asparaginsäure-Derivates
mit dem geeigneten Amxnosäurealkylester und,
falls vorhanden, anschließende Entfernung der Schutzgruppen an den Amino- und/oder Carboxyfunktionen hergestellt werden.
Die in der vorstehend aufgeführten Strukturformel durch
den Rest R dargestellten Alkylreste können ein Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Pehtyl-, Hexyl- oder Heptylrest
oder die verzweigtkettigen Isomeren derselben sein.
Die bevorzugten Dipeptid-Ester der Formel I, deren Isolierung die vorliegende Erfindung insbesondere betrifft,
sind der L-OAsparaginyl-L-phenylalanin-methylester
und der L-G-Asparaginyl-L-tyrosin-methylester-
Seit ihr Wert als Süßstoffe erstmals beschrieben wurde, wurden verschiedene Verfahren zur Herstellung der Dipeptid-Ester
der Formel I vorgeschlagen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der vorstehend genannten
Dipeptid-Ester umfaßt die Umsetzung eines stark sauren Salzes von L-Asparaginsäureanhydrid : mit dem
geeigneten Aminosäureester..Als spezifisches Beispiel
wurde L-Asparaginsäureanhydrid-hydrochlorid mit L-Phenylalanin-methylester
in Äthylacetat oder 1,2-Diehloräthan umgesetzt. Dieses Anhydridsalz ist leicht durch
Reaktion von Asparaginsäure mit Phosphortrichlorid in einem geeigneten Alkancarbonsäure-Medium, z.B. Propion-
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säure erhältlich. Nach Vervollständigung der Kupplungsreaktion
wird das Produkt mit Wasser extrahiert. Der pH-Wert des wässrigen Extraktes wird auf den isoelektrischen
Punkt des Dipeptid-Esters eingestellt. Der nicht umgesetzte Aminosäureester wird durch Extraktion mit
einem in Wasser nicht löslichen organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, entfernt und die wässrige
Schicht wird konzentriert, wobei das Roh-Produkt erhalten wird, welches eine Vielzahl von Verunreinigungen,
z.B. den entsprechenden ß-Dipeptid-Ester, das Tripeptid,
das durch Umsetzung des Dipeptid-Esters mit einem weiteren Molekül Asparaginsäureanhydrid ( d.h. a-Asparaginylasparaginylphenylalanin-methylester)
gebildet wird, das Diketopiperazin, das durch innere Kondensation des
Dipeptid-Esters gebildet wird, freie Asparaginsäure,-a-Asparaginy!phenylalanin
und ß-Asparaginy!phenylalanin enthält. Diese Verunreinigungen sind schwierig zu entfernen.
Die Reinigung und Isolierung des gewünschten Dipeptidesters wird typischerweise durch mühsame, zeitaufwenige
und kostspielige Verfahren, wie fraktionierte Kristallisation und Elektrodialyse erreicht.
Kürzlich wurde gefunden, daß,wenn ein Rohgemisch, das
L-a-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester und die bei
dessen Herstellung gebildeten Verunreinigungen (d.h.
der ß-Dipeptid-Ester und andere vorstehend erwähnte Verunreinigungen) enthält, aus einem wässrigen Lösungsmittel
,enthaltend Chlorwasserstoff oder Bromwasserstoff
im Überschuß^in Bezug auf den L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester,
umkristallisiert wird, der L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
in Form eines Säureadditionsalzes, im wesentlich frei von den entsprechenden ß-Isomeren auskristallisiert. Diese Verbesserung
bei der Isolierung von L-a-Asparaginyl-L-
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phenylalanin-methylester wird in den GB-PS 1 326 473 und
1 339 101 beschrieben. Obgleich das Salz, z.B. L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester-hydroChlorid,
mit den anderen,vorstehend erwähnten Verunreinigungen verunreinigt
bleibt, macht seine Befreiung von den ß-Isomeren es zu einem besonders wünschenx\rerten Produkt, aus
welchem der gewünschte Dipeptid-Ester gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zu isolieren ist.
Im Kontrast zu den schwierigen und aufwendigen Isolierungsverfahren,
welche hierfür notwendig sind, wurde überraschend gefunden, daß der gewünschte Dipeptid-Ester
durch Anwendung eines IsolierungsVerfahrens, welches
das Partitionieren des Rohgemisches zwischen Wasser und einem geeigneten Alkanol und die Isolierung des Dipeptid-Esters
aus der Alkanolschicht umfaßt, leicht aus dem den Dipeptid-Ester enthaltenden Rohgemisch isoliert
werden kann. Die Bedingungen der Partitionierungsstufe müssen derart sein, daß die Alkanollösung sich als
diskrete Schicht abtrennt. Daher sind die Alkanole mit geringer Wasserlöslichkeit, wie n-Butylalkohol, Isobutylalkohol,
sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol,
n-Amylalkohol, sek.-Amylalkohol, Isoamylalkohol und
tert.-Amylalkohol besonders bevorzugt. Vor dem erf.indungsgemäßen
Verfahren wurden die zum Extrahieren verwendeten Alkohole gegebenenfalls mit wässrigen anorganischen
Salzlösungen ins Gleichgewicht gebracht. Wasserlösliche Alkanole, wie Methanol, Äthanol, n-Propylalkohol
und Isopropylalkohol können ebenfalls in Kombination mit anorganischen Salzen, die zur Herabsetzung
der Löslichkeit der Alkanole in der wässrigen Schicht zugesetzt wurden, verwendet werden. Geeignete anorganische
Salze sind Natriumchlorid, Natriumsulfat und Natriumhydrogendiphosphat.
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Zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugte Alkanole sind jene, welche' zusätzlich
zu der begrenzten Wasserlöslichkeit ebenfalls einen relativ hohen Grad an Flüchtigkeit aufweisen. Jene Alkohole,
deren Siedepunkte nahe 100 C liegen, sind somit besonders vorteilhaft aufgrund der Tatsache, daß sie
leicht entfernt werden, womit sie zur Bequemlichkeit und zum ökonomischen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
betragen.
Für die Verwendung in der Partitionierungsstufe ist n-Butylalkohol ein besonders bevorzugter Alkanol. Es
wurde gefunden, daß auch der Zusatz von Methanol zu dem n-Butylalkohol/Wasser-System die Extraktion des
Dipeptid-Esters in die n-Butylalkoholschicht wesentlich
erhöht. Das Methanol kann während der Herstellung des Rohgemisches, welches zu trennen ist, zugesetzt
werden oder es kann dem Rohgemisch in Kombination mit dem V/asser oder n-Butylalkohol während der Partitionierungsstufe
zugesetzt werden.
Die Beobachtung, daß die Dipeptid-Ester aus wässrigen Lösungen mit den vorstehend genannten Alkanolen extrahiert
werden können, ist besonders im Hinblick auf die Tatsache, daß jene Ester in ihrer reinen Form nicht
erkennbar in diesen Alkanolen löslich sind, überraschend. Es ist ebenfalls überraschend, daß die gewünschten
Dipeptid-Ester zusammen mit einer kleinen Menge der unerwünschten ß-Isomeren ( wenn ß-Isomere
im zu partitionierenden Rohgemisch vorliegen) selektiv extrahiert werden, wobei die vorstehend genannten
Verunreinigungen für die meisten Fälle in der wässrigen Schicht verbleiben. Das ß-Isomare wird, wenn es vorliegt,
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aufgrund seiner größeren Löslichkeit in der Alkanollösung oder alternativ durch wässrige Umkristallisation
leicht entfernt. ■
Die Temperatur, bei welcher die Partitionierungsstufe durchgeführt wird, ist nicht kritisch, obgleich das Verfahren
geeigneterweise bei etwa 20 - 6O°C durchgeführt werden kann. Ähnlich ist es nicht notwendig, den pH-Wert
des Gemisches während der Extraktion - zu kontrollieren, obgleich das Verfahren vorzugsweise bei oder nahe am
isoelektrischen Punkt des Dipeptid-Esters durchgeführt wird. ·
Offensichtlich wird, wenn das Rohgemisch, das den Dipeptid-Ester enthält, in Form des Dipeptid-Ester-Säureadditionssalzes
und der während seiner Herstellung gebildeten Verunreinigungen vorliegt, dann der Dipeptid-Ester
z.B. durch Neutralisation des Dipeptid-Estersalzes mit einer geeigneten Base vor der Partitionierungsstufe
regeneriert. Das so gebildete anorganische Salz, z.B. Natriumchlorid, wird während der Partitionierungsstufe
entfernt.
Nach der Partitionierung wird der gewünschte Dipeptid-Ester,
der in der Alkanolschicht verbleibt, isoliert. Die Isolierung kann geeigneterweise durch partielle Konzentration
der Alkanollösuhg, gefolgt von Abtrennung des so gebildeten kristallinen Dipeptid-Esters bewirkt
werden. Alternativ kann die Alkanolschicht zur Trockne konzentriert und anschließend aus Wasser umkristallisiert
werden. Eine weitere wünschenswerte Maßnahme zur Bewirkung der Isolierung umfaßt die Ionenaustauschbehandlung
der Alkanolschicht« Der Ionenaustauscb.be-
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handlung schließt sich am günstigsten einepartielle Konzentrierung
der resultierenden Lösung und die Abtennung der gebildeten kristaLlinen Dipeptid-Ester an. Die Isolierung
kann ebenfalls durch Konzentrierung der Alkanolschicht unter gleichzeitigem Zusatz von Wasser bis der
Alkanol azeotrop destilliert, gefolgt von Ionenaustauschbehandlung
und Kristallisation des Dipeptid-Esters aus der wässrigen Schicht erreicht werden.
Als Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens werden
die Dipeptid-Ester in hoher Reinheit und hoher Ausbeute erhalten. Die bisher zur Bewirkung der Reinigung notwendigen
mühsamen Verfahren werden auf diese Art und Weise vermieden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung. In diesen Beispielen
sind die Temperaturen in 0C angegeben.
Eine Suspension von 10 g L-Asparaginsäure in 40 ml
Propionsäure wurde bei Raumtemperatur unter Rühren mit 3,8 g Phosphortrichlorid versetzt und das Rühren wurde
etwa 1 und 1/2 Stunde bei dieser Temperatur fortgesetzt. Nach Beendigung dieser Zeit wurden 5 g Essigsäureanhydrid zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde
etwa 8 Stunden weiter bei Raumtemperatur gerührt. Die vom Reaktionsgemisch abgetrennten Kristalle wurden filtriert,
mit Äther gewaschen und getrocknet, wobei Lr-Asparaginsäureanhydrid-hydrochlorid erhalten wurde.
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Eine Suspension von 2 g L-Asparaginsäure in 10 ml
Propionsäure wurde bei Raumtemperatur unter Rühren mit 2,1 g Phosphortribromid versetzt und das Rühren des
Reaktionsgemisches wurde etwa 1 und 1/2 Stunde fortgesetzt. Am Ende dieser Zeit wurden 1,8 g Essigsäureanhydrid
zugesetzt- und das Rühren wurde etwa 7 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das abgetrennte kristalline
Produkt wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet, wobei L-Asparaginsäureanhydrid-hydrobromid
erhalten wurde.
Eine Suspension bestehend aus 10,8 g L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid,
200 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser wurde durch Zusatz von 4,6 g Natriumbicarbonat
neutralisiert. Die Äthylacetat-Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschließend unter
vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Der so erhaltene L-Phenylalanin-methylester wurde in 100 ml
Äthylacetat gelöst und 4,9 g L-Asparagirisäureanhydridhydrobromid
wurden unter Rühren bei -50 C zugesetzt.
Das Rühren wurde etwa 40 Minuten fortgesetzt. Am Ende dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser
extrahiert. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und durch Zusatz von konzentrierter Salzsäure auf pH 4,7
angesäuert. Die angesäuerte wässrige Lösung wurde anschließend mehrere Male bei 500C mit n-Butylalkohol,der
mit einer wässrigen Natriumchloridlösung, die durch Auflösen von 11,68 g Natriumchlorid in 1.300 ml V/asser
hergestellt wurde, ins Gleichgewicht gebracht wurde, extrahiert. Die Alkahoiextrakte wurden vereinigt und
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anschließend unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert,
wobei d&s Rohprodukt erhalten wurde. Die
Umkristallisation dieses Materials aus Wasser ergab L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester.
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt,mit der
Ausnahme, daß der n-Butylalkohol nicht mit wässrigem Natriumchlorid ins Gleichgewicht gebracht wurde. Wurde
nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gearbeitet, so wurde in ähnlicher Weise L-cc-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
erhalten.
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt und der
wässrige Extrakt des Reaktionsgemisches, welcher einen pH-Wert von 5,6 aufwies, wurde direkt mit n-Butylalkohol
bei diesem pH-Wert extrahiert. Wurde entsprechend den nachfolgenden, im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gearbeitet,
so wurde L-cx-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
erhalten.
Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei
als Extraktionslösungsmittel n-Butylalkohol verwendet wurde, der wie in diesem Beispiel beschrieben, mit
wässriger Natriumchloridlösung vorher ins Gleichgewicht, gebracht wurde. Die Extraktion wurde statt bei 5O°C
bei Raumtemperatur durchgeführt. Wurde nach den nachfolgendeo,
in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren weitergearbeitet, so wurde L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
erhalten.
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— ΊΟ —
Wurde in dem Verfahren von Beispiel 3 eine äquivalente Menge L-Asparaginsäureanhydrid-hydroehlorid substituiert
und wurde nach den nachfolgenden,in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gearbeitet? so wurde L-ct-Asparaginyl-L-phenylalanin-methy!ester
erhalten.
Die Substitution einer äquivalenten Menge von L-Tyrosinmethylester
im Verfahren von Beispiel 3 ergab L-ct-Asparaginyl-L-tyrosin-methylester.
Wurde das Verfahren von Beispiel 3 wiederholt, wobei der
n-Butylalkohol durch Isopropy!alkohol substituiert wurde
und der wässrigen Schicht Natriumchlorid zugesetzt wurde, so daß die Konzentration etwa 11 % betrug, so wurde
L-cx-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester erhalten.
2,3 kg L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester-hydrochlorid
tdie Analyse ergab 66,3 g (1.525 g) L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester,
9,79 % Chlor, 1,6 % (36,8 g) Diketopiperazin, 5,3 % o-Asparaginy!phenylalanin,
2,0 % ß-Asparagxnylphenylalanin und 2,3 %
o-Asparaginylasparaginylphenylalanin-methylester 3, gerührt
in 64 1 n-Buty!alkohol und 6 1 Wasser» wurde mit
etwa 3a2 1 10 %-iger wässriger Natriumcarbonatlösung
behandelt, bis der pH-Wert etwa 4,7 betrug. Das resultierende,
unter Rühren befindliche Gemisch wurde auf 600C erhitzt, das Rühren wurde unterbrochen und eine
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60,90kg Alkoholschicht (die Analyse ergab 1.368 g L-α-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
und 110 g Diketopiperazin) wurde von einer unteren 1,00 kg wässrigen Schicht dekantiert'. Die 60", 90 kg n-Butylalkoholschicht
wurde durch eine Karr-Säule mit etwa 5,08 cm Durchmesser
unter Verwendung einer Mittelpunktbeschxckung bei einer Geschwindigkeit von 21S6 kg/Stunde geleitet. Eine
Lösung von n-Butylalkohol^die mit Wasser bei 50°C ins
Gleichgewicht gebracht wurde, wurde in den Boden der Säule bei einer Geschwindigkeit von 8,0 kg/Stunde gepumpt
und Wasser wurde in den Oberteil (top) der Säule bei einer Geschwindigkeit von 5,3 kg/Std. gepumpt. Die
Menge der Alkoholschicht, die-aus dem oberen Abfluß (top exit) entfernt wurde, betrug 85,80 kg, während aus
dem unteren Ausfluß (bottom exit) der Säule 3,8 kg an Wasserschicht entfernt wurden. Die Analyse der 85,80 kg
n-Butylalkoholschicht zeigte, daß es 2,02 g Peststoffe
pro 100 g der Lösung enthält und zeigte weiterhin l,8l % Chlor, 1.381,3 g L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
(90,6 % des L-ct-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylesters
waren ursprünglich im Ausgangsmaterial vorhanden) und -69,3 g Diketopiperazin. Die qualitative
DünnschichtChromatographie zeigte, daß a-Asparaginylasparaginyl-phenylalanin-methylester
und Diketopiperazin vorhanden waren.
^97,6 g des entsalzten n-Butylalkohol/Wasser-Gemisches,
das vorstehend erhalten wurde, wurde durch eine Ionenaustauschersäule (hergestellt durch Umwandlung von
Dowex 1-X2-Harz in seine Acetatform durch aufeinanderfolgende Stufen von Waschen mit V/asser, Waschen mit
2,0 m Natriumhydroxidlösung, Waschen mit Wasser, Waschen von 1,0 m Essigsäure, Waschen mit destilliertem Wasser
und Waschen mit ins Gleichgewicht gebrachtem 1.920:370
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h-Butylalkohol:destilliertem Wasser) bei 26°C innerhalb
einer Zeitspanne von 2 1/4 Stunden geleitet. Die Säule wurde anschließend 2 mal mit 80 ml Portionen
n-Butylalkohol , der mit Wasser ins,Gleichsgewicht gebracht
wurde, gewaschen, wobei 637*4 g Eluate erhalten
wurden. Die Adsorbate wurden mit 0,5 m wässriger Natriumchloridlösung eluiert.
Die aus der Ionenaustauschersäule erhaltenen Alkoholeluate (637,4 g)wurden unter Rühren unter vermindertem
Druck eingedampft, bis das resultierende Gewicht der Aufschlämmung etwa 75 % des ursprünglichen Gewichts
und die innere Temperatur 40°C betrug. Das resultierende Gemisch, 477,3 g,wurde gerührt und anschließend etwa
10 Stunden bei Raumtemperatur abgestellt. Die ausge-· fällten Kristalle von L-cc-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester
wurden aufgefangen und bei 400C auf ein konstantes Gewicht von 4,69 g (entsprechend etwa 58
#-iger Ausbeute, bezogen auf die Menge von L-cc-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
in dem entsalzten n-Butylalkohol/Wasser-Gemisch) getrocknet.
Die vereinigten Mutterlaugen und Waschlaugen, die 488,3 g wogen, wurden unter vermindertem Druck eingedampft,
wobei 298,4 g einer Aufschlämmung mit einer inneren Temperatur von 37°C erhalten wurden. Die Aufschlämmung
wurde etwa l6 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt, was in einer Ausfällung eines zweiten Kristallanschusses
resultierte. Die Kristalle wurden abgetrennt, mit n-Butylalkohol gewaschen und bei 40°C zu einem konstanten Gewicht
von 2,11 g (entsprechend etwa einer 26 #-igen
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Ausbeute, bezogen auf die Menge von L-<x-Asparaginy 1-L-phenylalanin-methy!ester
in dem entsalzten n-Butylalkohol/Wasser-Gemisch)
getrocknet -
587j6 g L-α-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester-hydroehlorid
£die Analyse ergab 77,5 % (455,4 g) L-α-Asparaginy
1-L-phenylalanin-methylest er, 9,53 % Chlor, 2,4 %
(14,1 g ) Diketopiperazln, 2,4 % Asparaginy!phenylalanin
und eine Spur cc-Asparaginylasparaginylphenylalaninmethylester]
und 58 g Natriumchlorid wurden bei Raumtemperatur zu 14 1 Wasser zugesetzt. Das resultierende
Gemisch wurde durch Zusatz von 10 #-iger wässriger Natriumcarbonat-Lösung auf pH 3,5 eingestellt und anschließend
auf 500C erhitzt. Zusätzliche 10 %-ige wässrige Natriumcarbonat-Lösung wurde zugesetzt, um
den pH-Wert des Gemisches auf 4,84 einzustellen. Anschließend wurden 2,7 1 Wasser zugesetzt, wobei 18,26 kg
einer Lösung, die 455 g L-a-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester,
2,68 Mol Chlorid, 9,8 g Diketopiperazin, 9,8 g Asparaginyl-phenylalanin und eine Spur a-Asparaginylasparaginyl-phenylalanin-methylester
enthielt, erhalten wurden.
4 kg n-Butylalkohol wurde bei 5O0C mit destilliertem
Wasser ins Gleichgewicht gebracht und anschließend auf eine Karr-Extraktionssäule (Karr reciprocating plate
extraction column) mit einem Durchmesser von 5,08 cm gebracht. Die vorstehend hergestellte Lösung, die
L-α-Asparaginy1-L-phenylalanin-methylester enthielt,
wurde innerhalb von etwa 2 und 1/2 Stunde bei einer Geschwindigkeit von 7,45 kg/Std. in das Zentrum der
Säule gebracht. Zusätzlich wurden 250 ml heißes Wasser
am Ende zur Klärung der Linien angewandt. Zur gleichen Zeit wurden 8,45 kg V/asser bei 5O°C bei einer
Geschwindigkeit von 3,31 kg/Std. in den oberen Teil der Säule und 45,5 kg von 50°C, das mit n-Butylalkohol ins
Gleichgewicht gebracht wurde, bei einer Geschwindigkeit von 19,95 kg/Std. in den unteren Teil der Säule gebracht.
Das Wasser wurde, wenn es sich angesammelt hatte, am Boden der Säule abgesaugt und den n-Butylalkohol
ließ man am oberen Teil der Säule überfließen. Am Ende von etwa 2 2/3 Stunden wurde die Hin- und Herbewegung
(reciprocation) der Platten unterbrochen und die Butylalkohol- und wässrigen Schichten, die sich
gebildet hatten, wurden abgetrennt bzw. den n-Butylalkoholausfluß
und dem wässrigen Ausfluß aus der Säule zugesetzt. Auf diese-Art und Weise wurden 47.kg n-Butylalkohol-Lösung,
die 388 g L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester,
0,01 Mol Chlorid, 3,1 g Diketopeperazin, weniger als 0,5 g Aspargxny!phenylalanin und. kein
a-Asparaginylasparaginyl-phenylalanin-methylester enthielt,
erhalten. Der wässrige Ausfluß wog 28,05 kg und enthielt 53,8 g L-a-Asparaginyl_phenylalanin-methylester,
2,66 Mol Chlorid, 7,0 g Diketopiperazin, 9>3 g Asparaginyl-phenylalanin
und eine Spur a-Asparaginylasparaginylphenylalanin-methylester.
45,4 kg der,wie vorstehend beschrieben, bei der Extraktion
unter Verwendung der Karr-Säule erhaltenen 4.7 kg
n-Butylalkohollösung wurden über 3 1 eines Anion-Ionenaustauscherharzes
in der Acetatform geleitet, wobei sowohl die Säule als auch die Beschickungslösung für
den Versuch auf 50°C gebracht wurden. Die Behandlung wurde innerhalb einer Zeitspanne von 3 Stunden und 10
Minuten durchgeführt und umfaßte ein Waschen bei 50°C mit 10 kg eines gesättigten n-Butylalkohol-Wassergeinisches
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Die resultierende alkoholische Lösung wog 50a73 kg und
enthielt 102,8 % (276 g) L-a-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester
0,12 % Diketopiperazin und 0,08 % Natriumionen. Das Harz wurde mit 930 1 einer 0,5 molaren
Natriumchloridlösung, gefolgt von 12 1 destilliertem Wasser gestrippt,wobei 20,M kg einer Lösung erhalten
wurden,die 0 % L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester,
0,32 % Diketopiperazin, 27,3 % Natriumionen und 11,2 % Chlorid enthielt.
Eine 47,26 kgrPortion der 50,73 kg wiegenden n-Butylalkohöllosung,
die wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde, wurde mit entfärbender Holzkohle behandelt und
anschließend filtriert. Ein 1.107,7 g wiegender aliquoter
Teil des klaren Filtrates wurde durch ein 3 Stunden andauerndes unter vermindertem Druck und unter
Rühren durchgeführtes Einengen bei 380C kristallisiert,
wobei 520,5 g. einer schnell kristallisierenden Aufschlämmung erhalten wurden. Die Aufschlämmung wurde
2 Stunden bei Raumtemperatur abgestellt. Die Kristalle wurden anschließend abfiltriert und zuerst mit n-Butylalkohol
und anschließend mit Methanol gewaschen. Das resultierende Material wurde getrocknet, wobei 5sO6 g
L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester, entsprechend
84 % der gesamtensin dem aliquoten Teil, der zur Kristallisation
verwendet wurde, vorliegenden Feststoffe erhalten wurden.
Phenylalanin-methylester, der durch Neutralisation von 43,0 g Phenylalanin-methylester-hydrochlorid erhalten
wurde, wurde mit 375 ml 1,2-Dichloräthan und 15 ml
Methanol vereinigt. Die resultierende Lösung wurde unter
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Rühren auf -2O°C gekühlt und Kohlendioxidgas wurde unter Aufrechterhaltung der Temperatur bei -200C durch
die Lösung geblasen. Nach etwa 15 Minuten wurden 7,58 Teile L-Asparaginsäureanhydrid-hydrochlorid schnell zugesetzt.
Das Rühren wurde 1,5 Stunden fortgesetzt und anschließend wurden 175 ml heißes Wasser (etwa 650C)
zugesetzt. Nach 10 Minuten wurde eine Lösung von 2,85 g Natriumcarbonatmonohydrat in 75 ml Wasser zugesetzt,
um den pH-Wert auf 5,9 zu bringen. Das unter Rühren befindliche Gemisch wurde anschließend bei 52°C erhitzt
und die obere wässrige Schicht wurde durch Zusatz von 10 %-iger wässriger Natriumcarbonat-monohydrat-LÖsung
bei einem pH-Wert von 5*7 gehalten. Die wässrige Schicht wurde anschließend 6 mal bei 5O0C mit 40 ml -Portionen
warmem 1,2-Dichloräthan extrahiert. Die 1,2-Dichlor-*
äthan-extrahierte wässrige Schicht wurde bei etwa 5O0C unter vermindertem Druck eingedampft, bis sein Gewicht
17^,6 g betrug und der L-a-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester
kristallisierte.
Das kristallisierende eingedampfte wässrige Gemisch wurde bei 500C einmal mit einer I50 ml-Portion und
anschließend 1J mal mit 100 ml-Portionen n-Butylalkohol
extrahiert. Die vereinigten n-Butylalkohol-Extrakte
wurden unter Rühren bei etwa 6O0C eingedampft, bis sich
weiße Kristalle bildeten. Anschließend wurde das feste Material abgetrennt, mit heißem n-Butylalkohol gewaschen
und unter vermindertem Druck bei 35 C getrocknet, wobei 10,13 g eines weißen Feststoffes erhalten wurden. Dieser
Feststoff wurde in einer minimalen Menge heißem Wasser aufgelöst und das heiße Gemisch wurde anschließend filtriert
und 4 j 5 Stunden bei 0°C gekühlt. Die gebildeten weißen Kristalle wurden aufgefangen, mit Eiwasser gewaschen
und bei 560C unter vermindertem Druck zu einem konstanten Gewicht von 7,01 g getrocknet. Die Mutter-
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laugen wurden zu einer dick-flüssigen Aufschlämmung
eingedampft, die anschließend durch Erhitzen auf dem Dampfbad gelöst wurde. Die resultierende Lösung wurde
3,5 Stunden bei O0C gekühlt und filtriert. Das Gewicht dieser 2. Kristallisation betrug 1,87 g.
1.295 g L-ci-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylesterhydroehlorid
tdie Analyse ergab 35»9 % L-<x-Asparaginy 1-L-phenylalanin-methylester,
0,9 % Asparaginy!phenylalanin, 2,6 % CL-Asparaginylasparaginyl-phenylalaninmethylester,
eine Spur Asparaginsäure, 1,2 % Diketopiperazin und 12,1 % Chloridion 3 wurden bei Raumtemperatur
einem Gemisch aus 12 1 Wasser und 1.260 ml Methanol zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde
durch Zusatz von 10 #-iger wässriger Natriumcarbonatlösung
auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und anschließend auf 500C erhitzt. Der pH-Wert wurde anschließend
durch Zusatz von 10 %-lgev wässriger Natriumcarbonatlösung
auf pH 4,78 eingestellt und anschließend wurdeft.1,65 1 Wasser zugesetzt. Auf diese Weise wurden
18 1 einer Lösung, die 465 g L-α-Asparaginy1-L-phenylalanin-methylester,
4,42 Mol Chlorid, 15,5 g Diketopiperazin,
5,2 g Asparaginyl-phenylalanin und 33,7 g a-Asparaginylasparaginyl-phenylalanin-methylester enthielt
, erhalten.
Eine Karr-Säule mit einem Durchmesser von etwa 5,08 cm
wurde mit ins'Gleichgewicht gebrachtem n-Butylalkohol
gefüllt. Die ,,wie vorstehend beschrieben, hergestellte
Lösung, die L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
enthielt, wurde innerhalb von 2 Stunden bei einer Geschwindigkeit von 9,0 kg in das Zentrum der Karr-Säule
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gebracht. Zur gleichen Zeit wurden 7>O kg 5Q0C heißes
Wasser bei einer Geschwindigkeit von 3,36 kg/Std. in
den oberen Teil der Säule und 70 kg' 5O0C warmer ins
Gleichgewicht gebrachter n-Butylalkohol bei einer Ge-
,(bottom) schwxndxgkext von 33,6 kg/Std. xn den unteren Teil'der
Säule gebracht. Die n-Buty!alkohol- und wässrigen Ausflüsse
wurden in der, im zweiten Abschnitt von Beispiel 11 beschriebenen Art erhalten- Auf diese Art und Weise
wurden 75 kg einer n-Butylalkohol-Lösung erhalten, die
im wesentlichen allen.im Ausgangsmaterial vorhandenen
L-cc-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester, 0,09 Mol
Chlorid, 8 g Diketopiperazin, 3 g Asparaginyl-phenylalanin
und 5 g a-Asparaginylasparaginyl-phenylalaninmethy!ester
enthielt. Der wässrige Ausfluß wog 23,5 kg und enthielt 4 g L-a-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester,
3,90 Mol Chlorid, 4 g Diketopiperazin, 2 g Asparaginyl-phenylalanin und 11 g Q--Asparginylasparaginyl-phenylalanin-methylester
.
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Claims (11)
1. Verfahren zur Isolierung eines Dipeptid-Esters der
allgemeinen Formel
H0NCHCONHCHCOOr
?H2 ?H2 (I)
COOH X
worin X einen Phenyl- oder einen p-Hydroxyphenylrest
und R einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen bedeuten
und die stereochemische Konfiguration L-L ist, aus einem Rohgemisch, das diesen Dipeptid-Ester enthält,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Rohgemisch zwischen Wasser und einem geeigneten Alkanol partitioniert
und den Dipeptid-Ester aus der Alkanolschicht isoliert.
2. Verfahren zur Isolierung von L-tx-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
aus dem diese Verbindung enthaltenden Rohgemisch, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,daß
man das Rohgemisch zwischen Wasser und einem geeigneten Alkanol partitioniert und den L-a-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester
aus der Alkanolschicht isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkanol n-Butylalkohol verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkanol n-Butylalkohol verwendet
und dem n-Butylalkohol-AJasser-System Methanol zusetzt.
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5- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Partitionierung bei etwa 500C
durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Partitionierung bei Raumtemperatur
durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung die Kristallisation des
Dipeptid-Esters aus der Alkanolschicht umfaßt.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung die Ionenaustauschbehandlung
der Alkanolschicht umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung die Ionenaustauschbehandlung
der Alkanolschicht und die anschließende Kristallisation des Dipeptid-Esters umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung die partielle Konzentration
der Alkanolschicht und die anschließende Abtrennung des gebildeten kristallinen Dipeptid-Esters
umfaßt.
11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Rohgemisch verwendet, das durch Neutralisation
von rohem L-ct-Asparaginyl-L-ph'enylalanin-methylester-hydrochlorid
erhalten wurde.
Für
G. D. Seatfle & Co.
(Dr. H.Jl/VoIff)
Rechtsanwalt
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33792773A | 1973-03-05 | 1973-03-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2410203A1 true DE2410203A1 (de) | 1974-09-12 |
Family
ID=23322619
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19742410203 Withdrawn DE2410203A1 (de) | 1973-03-05 | 1974-03-04 | Verfahren zur isolierung von dipeptidestern aus ihren rohgemischen |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS49117445A (de) |
| CA (1) | CA1027112A (de) |
| CH (1) | CH599124A5 (de) |
| DE (1) | DE2410203A1 (de) |
| GB (1) | GB1435481A (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0027319A2 (de) * | 1979-09-27 | 1981-04-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur reduktiven Ausscheidung von Schutzgruppen und dieses Verfahren verwendendes Herstellungsverfahren |
| EP0128694A2 (de) * | 1983-06-08 | 1984-12-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Scheidung von Methylester von alpha-L-Aspartyl-L-Phenylanin durch Kristallisation |
| EP0514938A1 (de) * | 1991-05-23 | 1992-11-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Herstellung von Alpha-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylesterchlorhydrat |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5140069B1 (de) * | 1971-07-09 | 1976-11-01 |
-
1974
- 1974-02-25 CA CA193,344A patent/CA1027112A/en not_active Expired
- 1974-03-04 DE DE19742410203 patent/DE2410203A1/de not_active Withdrawn
- 1974-03-04 JP JP2506974A patent/JPS49117445A/ja active Pending
- 1974-03-04 GB GB960374A patent/GB1435481A/en not_active Expired
- 1974-03-05 CH CH310674A patent/CH599124A5/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0027319A2 (de) * | 1979-09-27 | 1981-04-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur reduktiven Ausscheidung von Schutzgruppen und dieses Verfahren verwendendes Herstellungsverfahren |
| EP0027319A3 (en) * | 1979-09-27 | 1981-06-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for reductive elimination of protecting groups and preparative process using such method |
| EP0128694A2 (de) * | 1983-06-08 | 1984-12-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Scheidung von Methylester von alpha-L-Aspartyl-L-Phenylanin durch Kristallisation |
| EP0128694A3 (de) * | 1983-06-08 | 1986-11-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Scheidung von Methylester von alpha-L-Aspartyl-L-Phenylanin durch Kristallisation |
| EP0514938A1 (de) * | 1991-05-23 | 1992-11-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Herstellung von Alpha-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylesterchlorhydrat |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB1435481A (en) | 1976-05-12 |
| CH599124A5 (de) | 1978-05-12 |
| JPS49117445A (de) | 1974-11-09 |
| CA1027112A (en) | 1978-02-28 |
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