DE2347220B2

DE2347220B2 - L-cystin-bis- eckige klammer auf 2,2-bis-(2-chloraethyl)-hydrazid eckige klammer zu -dihydrobromid, verfahren zu seiner herstellung und dieses enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2347220B2
Application number: DE19732347220
Authority: DE
Original assignee: Institut po Biochimia pn Ban, Sofia
Priority date: 1972-09-26
Filing date: 1973-09-19
Publication date: 1977-10-20
Also published as: BG17877A1; US3897494A; DE2347220A1; SU983125A1; DD110035A5; JPS5617342B2; DE2347220C3; GB1381833A; CH609677A5; JPS5040523A; HU170709B

Description

C!

CII, Cl

-S-CH₂-CH-C
NH,

NH N

C)

H, CH, Cl

-2HBr

Ihre Herstellung erfolgt durch Umsetzung von (2-chloräthyl)-hydrazid] durch Behandlung mit einer

N.N'-Bis-benzyloxy-carbonyl-L-cystin-dichlorid mit Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig. Die Reaktio-

l,l-Bis-(2-chloräthyl)-hydrazin in Essigsäureäthylester nen verlaufen nach folgendem Schema

und darauffolgende Abspaltung der Schutzgruppe aus (Z = OCOCHjCeHi):
dem erhaltenen Benzyloxycarbonylcystin-bis-[2,2-bis-

CH₂ S -

CHNIIZ

CC)CI

H, N N(CH₂CH₂CM)₂

HBrZCH₁CC)OH

CH₂ S-CHNH, -HBr CC)NHN(CH,CH,CU CM₂-S-CHNHZ

CONHN(Ch₂CH₂CI)₂
CH, --SH

f CHNH₂ -HBr

CC)NHN(CH₂CH₂CD₂

Oxydation beim Kontakt mit der Luft

Das nach Einwirkung von HBr/Eisessig erhaltene Produkt weist in bezug auf seinen Schmelzpunkt die folgende Besonderheit auf: Unmittelbar nach der Isolierung schmilzt es im Intervall von 145 bis I47"C, nach Stehen und nach Berührung mit dem Sauerstoff der Luft bei Zimmertemperatur erhöht sich der Schmelzpunkt allmählich bis auf den Endwert von 167 bis 169°C. Diese Besonderheil des Produkts ist auf eine teilweise Reduktion des Disulfids bis zum entsprechenden Thiol, L-Cystein-[2-bis-(2-chloräthyl)-hydrazid]-hydrobromid, bei der Einwirkung von HBr/Eisessig zurückzuführen.

Alle experimentell-onkologischen, pharmakologischen und biochemischen Untersuchungen wurden mit frisch hergestelltem Produkt durchgeführt.

L-Cystin-bis-[2,2-bis-(2-chloräthyl)-hydrazid]-dihydrobromid wurde auf Antitumoraktivität gegen Transplantationstumoren bei Mäusen und Ratton basierend auf den Methoden von jungstand, Ciutsche und Wohlrabe, Arzneimittelforschung 2!, 404 (1971), und Ger an, Greenberg, Macdonald, Schumacher und Abbot, Cancer Chcmother. Rcd. 3. 121 part 3 (1972), untersucht. Zu diesem Zweck wird eine wäßrige Lösung dieser Verbindung intraperitoneal bei den festen Tumoren und subkutan bei den Ascitcs-Tumoren verabreicht. Die Kontrolltiere werden auf dieselbe Weise mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt. Für jede Untersuchung werden je 6 Versuchs- und Kontrolltiere verwendet. Die Behandlung der Tiere beginnt 4 bis 5 Tage nach der Transplantation des Tumors. Bis zur Tötung der Tiere (I Tag nach Beendigung der Behandlung), wenn die Auswertung der Ergebnisse der Behandlung erfolgt, wurde keine Sterblichkeit bei den behandelten Tieren festgestellt. Die Unterschiede im Überleben der Versuchs- und Kontrolltiere sind statistisch zuverlässig bei Berechnung nach dem Sludent-Fisher-Moschkowski-Verfahren.

Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt ferner eine antibakterielle Wirkung gegen Sarcinae lutea und die Staphylococcen-Mutanten UF-2 und LJF-3. Zum Beispiel inhibiert sie das Wachstum von Sarcinae lutea und der Staphylococcen-Mutanten LJF-2 und UF-3 entsprechend 97 Prozent und 100 Prozent bei einer

Konzentration von I μΜ,ηιΙ und des Staphylococcen-Mutanten UF-3 100 Prozent bei einer Konzentration von 0,5 i'M/ml. Die erfindungsgemäße Verbindung unterdrückt die Entwicklung auch einiger transplantabler Geschwulste bei Versuchstieren.

Es wurde eine Reihe von Versuchen an 72 männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 150 bis 210 g und 48 männlichen Mäusen mit einem Gewicht von 16 bis 22 g durchgeführt.

Die Ratten wurden in 9 Gruppen eingeteilt, wobei jede Gruppe aus 8 Ratten bestand. Auf drei Gruppen Ratten wurde subkutan durch Fragmente Karzinosarkom 256 von Walker (KS-Walker) transplantierl, auf drei andere Gruppen wurde Lymphosarkom von P1 i s s (LS-Pliss) und auf die letzten drei Gruppen Sarkom von Yoshida (S-Yoshida) iransplantiert. Die Tiere wurden intraperitoneal einmal am Tat; mit der Lösung der erfindungsgemaßen Verbindung behandelt. Die Behandlung setzte am 5. Tag nach der Transplantation ein, die Tumore bei Betastung die Größe eines Es wurden folgende Kennwerte ermittelt:

Durchschnittliches Gewicht der Tumoren, durchschnittliche Durchmesser der Tumoren (am 5. und am 9. Tag nach der Transplantation und am Tag der Tötung),

durchschnittliches Gewicht der Tiere (vor der Behandlung und bei der Tötung ohne Tumore), durchschnittliche Lebensdauer (nur bei EAT).

Die Unterdrückung (Inhibierung) des Tumorwachstums (UTW) wurde nach folgender Formel bestimmt:

TK — TV
-"_fk~-· 100,

eines -^(I

Linsenkorns aufwiesen. Die Arbeitslösungen der untersuchten Verbindung mit einer Konzentration von 0,5 Prozent in physiologischer Kochsalzlösung wurden täglich »ex tempore« vorbereitet. Die Kontrollgruppen wurden mit derselben Menge an physiologischer Kochsalzlösung behandelt, bei KS-Walker und LS-Pliss wurde die Behandlung mit der erfindungsgemaßen Verbindung im Laufe von 8 Tagen täglich fortgesetzt, bei S-Yoshida ebenfalls täglich, jedoch im Laufe von 10 Tagen. Die erfindungsgemäße Verbindung wurde in Dosen von 10 mg/kg für die ersten zwei Tumore und 5 mg/kg für den dritten Tumor verabreicht. Die Tiere wurden 24 Stunden nach der letzten Applikation

getötet. . ....

Die Mäuse wurden in sechs Gruppen eingeteilt, wobei jede Gruppe aus 8 Mäusen bestand. Auf drei Gruppen wurde subkutan durch Fragmente Sarkom-180 von Krocker und auf drei andere Gruppen intraperitoneal EAT (Ehrlich Ascites-Tumor) trar.splanliert. Bei S-180(eine solide Form) wurde die Behandlung mit der erfindungsgemaßen Verbindung am 5. Tag nach der Transplantation in einer Dosis von 10 mg/kg intraperitoneal begonnen und täglich im Laufe von 10 Tagen durchgeführt. Die Tiere wurden 24 Stunden nach der letzten Verabreichung getötet. Bei EAT begann die Behandlung 24 Stunden nach der Transplantation in derselben Dosis wie bei S-180, jedoch subkutan appliziert, täglich im Laufe von 10 Tagen. Die Tiere wurden nicht getötet. Die Lösungen der erfindungsgemäßen Verbindung mit einer Konzentration von 0,1 Prozent in physiologischer Kochsalzlösung wurden jedes Mal »ex tempore« zubereitet.

wobei TK und TV das Durchschnittsgewicht der Tumore entsprechend in der Kontroll- und Versuchsgruppe darstellen.

Die statistische Bearbeitung der Ergebnisse ist mit Hilfe des Kriteriums T von Student-Fisher durchgeführt worden. Die Grenzen der Zuverlässigkeit der Durchschnittswerte wurden bei P = 0,05 festgeiH stellt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die erfindungsgernäße Verbindung (Tabelle 1) zeigte bei S-Yoshida (100 Prozent) einen ausgeprägten Antitumoreffekt mit vollem Regreß der .V) Tumore, bei LS-Pliss (89,6 Prozent) und bei KS-Walker (75,6 Prozent). Bei S-180 ist LfTWgleich 80 Prozent und bei EAT wird eine Verlängerung des Lebens der Versuchstiere im Vergleich zu den Kontrolltieren nicht beobachtet. Unter dem Einfluß der erfindungsgemäßen (5 Verbindung gingen die Änderungen der Durchmesser der Tumoren parallel mit der Gewichtsabnahme der Tumoren. Die Gewichtsabnahme des Körpers bei den Vers'ichsgruppen beträgt 13,8 Prozent, 13,7 Prozent und 11,5 Prozent. Es wurde eine verhältnismäßig hohe Sterblichkeit bei KS-Walker und bei LS-Pliss (25 Prozent) beobachtet.

Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt gegenüber S-Yoshida den stärksten ausgeprägten Antitumoreffekt und einen wenig schwächeren Effekt auf LS-Pliss und KS-Walker. Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt keinen Antitumoreffekt auf EAT. Es muß aber in Betracht gezogen werden, daß die angewandten Dosierungen die LDw (50 bis 75 mg/kg) bei KS-Walker und LS-Pliss etwas überschreiten. Die Tatsache, daß bei denselben Dosen eine lOprozentige Abnahme des Körpergewichts bei den Versuchstieren auftritt, weist ebenso darauf hin, daß sie toxisch sind.

Tabelle 1

HinlluB der crfindungsgcmäBen Verbindung auf Transphinlationstumorc

Nr. Tumor
Stamm

Dosis f mg/ky pro Tag)

Änderung im durchschnittlichen Durchmesser des Tumors (mm)

Änderung im durchscliniiilichen (icwicht der Tiere (g und 7»)

Durch- Sterblich- UTW Durchschnitt-

lih Lb

schnittliches keil
Gewicht des
Tumors

(g)

liehe Lebcnsdauer

(%) (Tage)

KS-Walker 10 ■ 8 Tage 6,1-<»«),() ,¹^,¹⁶'*⁶

256 solide Form '

desgleichen Konirolle 7,2 -15,1-16,') 'J⁷-⁵"'·⁸⁷'⁵

7,88

2/8
0 + 8

76,6 -

Tabelle 1

IUnHuB der erlmdungsgcmälkn Verbindung auf Transplanlalionstumore

Nr.	Tumor	Dosis (ηιμ/kg	Änderung im	Änderung im	Durch	Sterblich- UTW Ourchschniii	des	iicne lA'lien-,
	Stamm	pro lau)	durchschnitt	durchschnitt	schnittliches Keil		dauer
			lichen Durch	lichen (ie-	(ieu.ii lit
			messer des	wicht der	I uinois
			Tumors	Tiere		2/8	(%) (lage)
			(mm)	(g und "/„)	(g)		89,6 -
3	LS-PMs=,	10-8 Tage	7,5-8.5-13,7	181.2-156,2	0,75	1/8
	solide Form			[-13,7]			—
4	desgleichen	Kontrolle	-13,5-521,5	187,5-181,4	7,23
				[-3,2]		0/8
5	S-Yoshida	5 · 10 Tage	_	171,2-147,5		0/8	100 -
	solide Form			[-13.8]	0		- -
6	desgleichen	Kontrolle	_	177,5-185	12,54
				1+ 7,21		0/8
7	S-180	10 · 10 Tage	5,3-12,8-14,8	17-17,1			80 -
	solide Form			[+ 0,1]	3.1	0/8
8	solide Form	Kontrolle	5,4-12.2-17,0	17-19,3		-
				[+ 13,5]	4,2	-	12,1
9	EAT	10 · 10 Tage	-	-	-	13,7
10	desgleichen	Kontrolle	-	-	-

Vergleichende Angaben über die cytostatische Wirkung von L-Cystin-bis-[2,2-bis-(2-chloräthyl)-hydrazid]-dihydrobromid (A), Cyclophosphamid (B) und Sarcolysin (C).

I. Hemmende Wirkung bei Mäusen (ip)

A: Gesamtdosis 80mg/kg für eine lOtägige Anwendung

B: Gesamtdosis 35 mg/kg für eine 4tägige Anwendung C: Gesamtdosis 30 mg/kg für eine 15tägige Anwendung

Tumorart

Hemmung in %
Λ Β

Myeloma P-C	100	93,6	99,6
(MOPC-21)	100
Ca Sa Walker	100
Ly Sa Pliss	100	84	50
Sa Yoshida	80	96,4	99,6
Sa 180(Krocker)
Sa Yensen

III. Hemmung der Biosynthese der NS

(Veranschaulicht durch den Einbau von 3 H-Thymidin in die RNS und die DNS in vitro und in vivo).

Das folgende Beispiel erläutert die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung.

H. LDso (einmalige intraperitoneale Applikation)

A: 50bis 75 mg/kg
B: 100 bis 150 mg/kg
C: 17 bis 23 mg/kg

Die erfindungsgemäße Verbindung weist keine ho kumulativen Eigenschaften bei der Anwendung auf, die bei Cyclophosphamid und Sarcolysin nicht außer Acht zu lassen sind.

Es muß betont werden, daß die obengenannten Angaben für die tumorwachstumshemmende Wirkung fts der erwähnten drei cytostatischen Präparate nicht ganz einwandfrei sind, da sie sich auf untereinander nicht identische transplantable Tumoren beziehen.

Hemmung	des Einbaues in %	DNS
	RNS	70
A:	60	75
B:	60	50
C:	52

Beispiel

aJiN.N'-Bis-benzyloxycarbonylJ-L-cyslin-bis-[2,2-bis-(2-chloräthyl)-hydrazid]

Eine Lösung von 5 g Ν,Ν'-Bis-benzyloxycarbonyl-L-cystin-dichlorid in 50 ml wasserfreiem Essigsäureäthylester wird mit 6,5 g l,l-Bis-(2-chloräthyl)-hydrazin versetzt. Nach 12stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur bildet sich ein kristallines Produkt, das filtriert, nacheinander mit Essigsäureäthylester und Wasser gewaschen, getrocknet und aus Äthanol-Wasser umkristallisiert wird. Ausbeute 5,7 g (72,4 Prozent) F. 191 bis 192° C.

C₃₀H₄OCl₄N₆O₆S₂ (786,6):

Ber.: N 10,68, S 8,15, Cl 18,03;
gef.: N 10,76, S 7,78, Cl 18,04.

bJL-Cystin-bis-^^-bis-'^-chloräthyn-hydrazid]-dihydrobromid

5,0 g der gemäß Verfahrensstufe- a) erhaltenen Verbindung werden bei Raumtemperatur mit 35 ml

)prozentiger Bromwasserstofflösung in Eisessig beindelt. Zunächst wird das Produkt gelöst, wobei sich tensiv Kohlendioxid entwickelt und ein Niederschlag jsetzt. Es wird mit wasserfreiem Äther vollständig :fällt und das feste Produkt filtriert und mehrmals mit ockenem Äther gewaschen. Ausbeute 3,9 g (91,2 Prozent). F. 167
hygroskopisch.

bis 169°C. Die Substanz ist stark

C₁₄H₃₀Br₂CUN₆O₂S₂ (680,2):

Ber.: N 12,36, S 9,43, Halogen (Cl+ Br) 44,35; gel·. N 12,48, S 9,22, Halogen (Cl + Br) 44,70.

Claims

Patentansprüche:

1. L-Cystin-bis-r2,2-bis-(2-chloräthyl)-hydrazid]-dihydrobromid.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an ^c.ich bekannter Weise Ν,Ν'-Bis-benzyIoxycarbonyl-L-cystin-dichlorid mit l,l-Bis-(2-chloräthyl)-hydrazin in Essigsäureäthylester umsetzt und die Benzyloxycarbonylgruppe mit Bromwasserstoff in Eisessig abspaltet.

3. Arzneimittel, enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1 als Wirkstoff.

Die Erfindung betrifft L-Cystin-bis-[2,2-bis-(2-chloräthyl)-hydrazid]-dihydrobromid, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie dieses enthaltende Arzneimittel mit

Cl --CH, "CH,

NNH
/' \

Cl CH, CH, C CH -CII,

C) NH,

antibakterieller und Antitumorwirkung. Die erfindungsgemäße Verbindung hat die Formel