DE3888144T2

DE3888144T2 - Gehirn-Neuron schützendes Mittel, enthaltend eine Dihydropyridin-Verbindung.

Info

Publication number: DE3888144T2
Application number: DE3888144T
Authority: DE
Inventors: Tomoyuki Kuwaki; Takaharu Ono; Hisashi Satoh
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-12-29
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2008-12-23
Also published as: CA1333995C; EP0322747A2; EP0322747B1; KR970009077B1; DE3888144D1; KR890009397A; EP0322747A3

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung einer Dihydropyridin- Verbindung der Formel:
worin R¹ eine Nitrophenylgruppe ist und R², R³ und R&sup4; jeweils eine gleiche oder verschiedene (C&sub1;-C&sub6;)Alkylgruppe sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zur Herstellung eines Medikaments zum Schützen eines Gehirnneurons gegen zerebrale Ischämie, infolge einer zerebrovaskulären Erkrankung, in Säugetieren, einschließlich Menschen.
Die Dihydropyridin-Verbindung der Formel [I], die in dieser Erfindung verwendet wird, ist eine bekannte Verbindung, die im Britischen Patent Nr. 2 036 722 beschrieben ist. Im Hinblick auf ihre pharmakologischen Wirkungen wurde gefunden, daß die Verbindung nützlich ist, als antianginöses oder antihypertensives Mittel wegen ihrer Ca²&spplus;-Antagonist-Aktivität oder als ein die zerebrale Zirkulation verbesserndes Mittel oder ein antiarteriosklerotisches Mittel, und im Namen des vorliegenden Anmelders sind Patente angemeldet (Japanische Patentanmeldung Nr. 161648/1987 und Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 155327/1986).
Es ist ein Ziel dieser Erfindung ein Medikament bereitzustellen, das durch seine Ca²&spplus;-antagonistische Aktivität den Abbau zerebraler neurozytoskeletaler Proteine infolge einer intrakraniellen ischämischen Störung inhibiert, und insbesondere ein Gehirnneuron-schützendes Mittel bereitzustellen, das auf der oben erwähnten inhibitorischen Wirksamkeit gründet.
Das Gehirnneuron schützende Medikament gemäß dieser Erfindung enthält als aktiven Bestandteil eine Dihydropyridin-Verbindung der Formel [I] oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Bezugnehmend auf die Formel [I], schließt die Nitrophenylgruppe von R¹ 2-Nitrophenyl, 3-Nitrophenyl und 4-Nitrophenyl ein, und bevorzugt ist 3-Nitrophenyl. Die (C&sub1;-C&sub6;)Alkylgruppe von R², R³ oder R&sup4; ist eine Alkylgruppe, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl und Hexyl, und bevorzugt eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Das bevorzugteste Beispiel von R² ist Isopropyl und von R³ und R&sup4; Methyl.
Das pharmazeutisch verträgliche Salz der Dihydropyridin- Verbindung der Formel [I] kann jedes nichttoxische Salz sein, wie Salze mit den gewöhnlichen anorganischen Basen, wie Alkalimetalle (zum Beispiel Natrium, Kalium, etc.), Erdalkalimetalle (zum Beispiel Calcium, Magnesium, etc.), Ammonium usw. und Salze mit gewöhnlichen organischen Basen, wie organische Amine (zum Beispiel Triethylamin, Pyridin, Picolin, Ethanolamin, Triethanolamin, Dichlorhexylamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, etc.).
Obwohl sich die zuvor genannte Dihydropyridin-Verbindung [I] oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nützlich als antianginöses Mittel, antihypertensives Mittel, die zerebrale Zirkulation verbesserndes Mittel oder antiarteriosklerotisches Mittel erweist, ergab die weitere Erforschung, daß die genannte Verbindung oder das Salz eine Gehirnneuron-schützende Wirkung besitzt, die als Wirkung ihrer Pharmakologie bislang unbekannt war.
Es wurde bestätigt, daß die Dihydropyridin-Verbindung [I] zerebrovasodilatorische Wirkung, zerebrale durchblutungssteigernde Wirkung und den Gehirnenergiestoffwechsel verbessernde Wirkung besitzt, und man erwartete, daß sie klinisch wirksam gegen zerebrale Ischämie infolge zerebrovaskulären Erkrankungen ist. Worauf es jedoch bei zerebralen ischämischen Störungen letztlich wirklich ankommt, ist eine Beeinträchtigung der zerebralen Nervenzellen und es wurde als notwendig angesehen, unter diesem Gesichtspunkt Untersuchungen durchzuführen. Gemäß Yamashita et al. [Neurochemistry 24, 31-33 (1985)], wurde gefunden, wenn eine vorübergehende ischämische Störung des Gehirns bei einer Wüstenspringmaus hervorgerufen wurde, und nach der Aufarbeitung die intrakraniellen Proteine fraktioniert und quantifiziert wurden, daß nur bestimmte mit Ca²&spplus; assoziierte Proteine (nachfolgend beschrieben) vermindert wurden, daß die obigen Änderungen in einem sehr frühen Stadium, das dem Einsetzen der Ischämie folgt, beobachtet wurden, und daß diese Änderungen für eine lange Zeit anhielten, im Gegensatz zu einer anfängli-chen Verbesserung im Gehirnenergie-Stoffwechsel, was mit den histopathologischen Befunden konsistent war. Es ist folglich bereits klar, daß Änderungen in bestimmten Proteinen nur in enger Zeitabhängigkeit mit ischämischen Störungen gefunden werden. Andererseits ergaben die von den vorliegenden Erfindern betriebenen Studien im Hinblick auf die pharmakologische Wirkungen der Dihydropyridin-Verbindung [I], daß diese spezifisch die Zufuhr von extrazellulärem Ca²&spplus; in die zerebralen Nervenzellen beim Einsetzen der Ischämie inhibiert, und daß als Resultat der Abbau der zerebralen neurozytoskeletalen Proteine inhibiert wird, um die Nervenzellen zu schützen. Wenn sich also eine ischämische Schädigung im Gehirn entwickelt, steigt die Ca²&spplus;-Konzentration in den zerebralen Nervenzellen, dadurch steigt die Aktivität von Calpain (oder CANP: calciumaktivierte neutrale Protease), was vermutlich zum Abbau von neurozytoskeletalen Proteinen, wie MAP-2 (Mikrotubus-assoziiertes Protein-2) und Calspectin führt. Während der obige Anstieg der Ca²&spplus;-Konzentration die Folge des Zuflusses von Ca²&spplus; aus der extrazellulären Umgebung ist, wurde gefunden, daß die Dihydropyridin-Verbindung [I] den obigen Abbau der Proteine durch Hemmung des Zuflusses von extrazellulärem Ca²&spplus; inhibiert.
Obwohl das Prinzip dieser Wirkung der Dihydropyridin-Verbindung [I] das der Wirkung als Ca²&spplus;-Antagonist ist - sie inhibiert, wie oben erwähnt den Zufluss von extrazellulärem Ca²&spplus; in die zerebralen Nervenzellen - ergab die weitere Untersuchung der jetzigen Erfinder, daß Nicardipin und Nimodipin, die auch als Ca²&spplus;-Antagonisten bekannt sind, äußerst schwach in diesen phar-makologischen Wirkungen waren. Auf diese Weise variieren die bisher als Ca²&spplus;-Antagonisten bezeichneten Substanzen in der chemischen Struktur und haben nichts miteinander gemeinsam, und es wird in Betracht gezogen, daß, obwohl sie als Ca²&spplus;-Antagonisten klassifiziert werden, diese Substanzen ihre jeweiligen pharmakologischen Wirkungen entsprechend ihrer charakteristischen chemischen Struktur zeigen.
Die oben erwähnte spezifische Ca²&spplus;-antagonistische Wirkung der Dihydropyridin-Verbindung [I] wurde hauptsächlich als prophylaktischer Effekt bei experimentellen ischämischen Schädigungen bestätigt. Folglich wurde, wie aus den folgenden pharmakologischen Tests ersichtlich, der prophylaktische Effekt der Verbindung [I] in zwei verschiedenen Anordnungen untersucht, nämlich:
(A) Die Verbindung wurde 1 Stunde vor der ischämischen Behandlung verabreicht und
(B) Die Verbindung wurde wiederholt verabreicht, nicht nur 1 Stunde vor der ischämischen Behandlung, sondern auch einmal pro Tag an vier aufeinanderfolgenden Tagen nach der ischämieschen Behandlung. Basierend auf den Ergebnissen dieser Experimente wurde ein weiteres Experiment in der folgenden Anordnung durchgeführt:
(C) Die Verbindung wurde nicht vor der ischämischen Behandlung verabreicht, sondern zum ersten mal nach der ischämischen Behandlung. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die oben erwähnte spezifische Ca²&spplus;-antagonistische Wirkung sogar bei der dritten Anordnung (C) eintrat. Während die zuerst erwähnten beiden Anordnungen hauptsächlich entworfen worden waren, um die prophylaktische Effizienz zu demonstrieren, wurde mit der dritten Anordnung (C) beabsichtigt, die Effektivität für die prognostische Verbesserung nach Einsetzen einer ischämischen Störung (zum Beispiel zerebraler Schlaganfall) zu zeigen, und die obigen drei Experimente ergaben, daß die Dihydropyridin-Verbindung [I] sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch nützlich bei ischämischen Störungen ist.
Das Gehirnneuron-schützende Mittel entsprechend dieser Erfindung kann oral oder anders an Säugetiere, einschließlich Menschen in herkömmlichen Dosierungsformen, wie Kapseln, Mikrokapseln, Tabletten, Granulat, Puder, Pastillen, Pillen, Salben, Zäpfchen, Injektion, Syrup, etc. verabreicht werden.
Das Gehirnneuron-schützende Mittel dieser Erfindung kann durch übliche pharmazeutische Verfahren unter Verwendung der organischen und /oder anorganischen Träger oder Hilfsmittel, die gewöhnlich im dem Stand der Technik verwendet werden hergestellt werden, zum Beispiel Exzipienten wie Sucrose, Stärke, Mannit, Sorbit, Lactose, Glucose, Cellulose, Talk, Calciumphosphat, Calciumcarbonat, etc.; Bindemittel wie Cellulose, Methylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Polypropylpyrrolidon, Gelatine, Gummiarabikum, Polyethylenglykol, Sucrose, Stärke, etc.; Desintegrierende Mittel wie Stärke, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylstärke, Natriumhydrogencarbonat, Calciumphosphat, Calciumcitrat, etc.; Gleitmittel wie Magnesiumstearat, Aerosil, Talk, Natriumlaurylsulfat, etc.; geschmacksverbessernde Zusätze wie Zitronensäure, Menthol, Glykokoll, Orangenpulver, etc.; Konservierungsstoffe wie Natriumbenzoat, Natriumbisulfit, Methylparaben, Propylparaben, etc.; Stabilisatoren wie Zitronensäure, Natriumcitrat, Essigsäure, etc.; Suspensionsmittel wie Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Aluminiumstearat, etc.; Dispersionsmittel wie Hydroxypropylmethylcellulose, etc.; Verdünnungsmittel wie Wasser, etc.; Salbengrundlagen wie Kakaobutter, weißes Petrolatum, Polyethylenglykol, etc.; usw.
Die Dosierung der Dihydropyridin-Verbindung [I] hängt ab vom Körpergewicht und/oder Alter des Patienten, der Ernsthaftigkeit der Erkrankung und/oder verschiedener anderer Faktoren, wie der Methode der Verabreichung. Gewöhnlich wird jedoch 0,1 bis 1000 mg, und bevorzugt 0,5 bis 200 mg pro Tag auf oralen Weg verabreicht. Die wirksame Dosis pro Kilogramm Körpergewicht wird aus dem Bereich von 0,001 bis 20 mg und bevorzugt 0,01 bis 2 mg ausgewählt.
Um die Nützlichkeit der Dihydropyridin-Verbindung [I] oder des pharmazeutisch verträglichen Salzes in dem Gehirneuronschützenden Mittel dieser Erfindung zu belegen, werden im folgenden die pharmakologischen Daten der Verbindung präsentiert.

Test-Verbindung

6-Cyano-5-methoxycarbonyl-2-methyl-4-(3-nitrophenyl)-1,4- dihydropyridin-3-carbonsäureisopropylester (im folgenden als Dihydropyridin-Verbindung A bezeichnet).
Diese Verbindung wurde zur Verwendung in Polyethylenglykol 400 (PEG 400) gelöst.

Verfahren

[A] Prophylaktischer Effekt der Dihydropyridin-Verbindung A

(1) Abbau der zytoskeletalen Proteine in einem Gehirn- Ischämie-Modell

Eine Wüstenspringmaus wurde in Rückenlage fixiert und der Medianschnitt wurde in der Halsregion unter lokaler Betäubung durchgeführt. Dann wurden die bilateralen gemeinsamen Kopfarterien vorsichtig abgestreift ohne den Vagus und die parallel laufenden Sympathikusnerven zu verletzen. Dann wurde jede gemeinsame Kopfarterie mit einer kleinen Klammer blockiert, und nach einem Intervall von 5, 10 oder 15 Minuten wurden die Klammern entfernt. Das Tier wurde sofort dekapitiert, 4 Tage oder 1 Woche nach Entfernung der Klammern, und das Gehirn wurde isoliert. Unbehandelte Tiere dienten als Kontrollen, und Tiere, die sich einer Scheinoperation unterzogen (die nur die Abstreifprozedur beinhaltete), wurden auch untersucht. Das isolierte Gehirn wurde unter Eiskühlung in den Frontalcortex (oberer 2/3, annähernd korrespondierend zur ersten bis fünften Schicht, 80 mg), Striatum ( 20 mg) und den Hippocampus ( 50 mg) durchtrennt, und jede Portion wurde im 4-fachen Volumen (v/w) 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) homogenisiert. Jedes Homogenat wurde bei 100000 G für 30 Minuten zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Gleiche Teile dieser überstehenden Flüssigkeiten wurden der SDS-Polyarylamidgel(5%)- Elekrophorese unterworfen, und die Proteine, nämlich MAP-2 (MW: 250-260 K), Calspectin (MW: 230-240 K) und Clathrin (MW: 180 K) wurden durch Messung der Absorptionen bei 560 nm mit einem Densitometer (CS-930, Shimazu) quantifiziert, und das Verhältnis jedes Proteins zum gesamten wasserlöslichen Protein (genau: die Integralsumme der Absorptionsbereiche) wurde berechnet. Zusätzlich wurde der relative Prozentgehalt zum Wert der unbehandelten Kontrollgruppe berechnet.

(2) Effekt der Dihydropyridin-Verbindung A auf den Abbau der zytoskeletalen Proteine ischämisch

Zwei Reihen von Experimenten wurden durchgeführt. In der ersten Reihe wurde die Dihydropyridin-Verbindung A [0, 0,01, 0,1 und 1 mg/kg] eine Stunde vor dem Verschluß subkutan verabreicht, und nach 5 Minuten der Ischämie wurde die Reperfusion durchgeführt. Eine Stunde nach der Reperfusion wurde das Tier durch Dekapzitation getötet und das Gehirn entfernt. In der zweiten Serie wurde die Dihydropyridin-Verbindung A [0, 0,1, 1 und 10 mg/kg] 1 Stunde vor Beginn einer 5-Minuten-Ischämie ähnlich subkutan verabreicht, und danach wurde die gleiche Dosis einmal am Tag für 4 aufeinanderfolgende Tage subkutan verabreicht (insgesamt 5 mal). Eine Stunde nach der letzten Verabreichung (fünfter Tag) wurde das Tier dekapitiert und das Gehirn isoliert. Das isolierte Gehirn wurde wie oben beschrieben der Fraktionierung und Elektrophorese unterworfen.

(3) Calciumabhängiger Abbau löslicher zytoskeletaler Proteine

Das gesamte Gehirn eines unbehandelten Tieres wurde homogenisiert und zentrifugiert, und Aliquote der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurden bei 37ºC für 60 Minuten unter den folgenden 3 Bedingungen, nämlich in Gegenwart von 2 mM Calciumchlorid oder 1,4 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)- N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA) oder in der Abwesenheit jeglichen Additivs inkubiert. Die Inkubate wurden jeweils der Elektrophorese und Densitometrie zur Quantifizierung der Proteine unterworfen.

[B] Therapeutischer Effekt der Dihydropyridin-Verbindung A

Eine Wüstenspringmaus wurde in der Rückenlage fixiert, und der Medianschnitt wurde unter lokaler Betäubung in der Halsregion durchgeführt. Dann wurden vorsichtig ohne den parallelen Vagus und die Symphatikusnerven zu verletzen, die bilateralen gemeinsamen Kopfarterien abgestreift. Jede gemeinsame Kopfarterie wurde mit einer kleinen Klammer für 5 Minuten abgeklemmt, und die Klammer wurde entfernt. Das Tier wurde nach 1 Stunde oder 4 Tagen dekapitiert, und das Gehirn wurde isoliert. Tiere mit der Scheinoperation dienten als Kontrollen und unbehandelte Tiere wurden auch verwendet. Das isolierte Gehirn wurde in der gleichen Weise wie im Verfahren (1) behandelt und untersucht.
Der Dosierunszeitplan war wie folgt:
In einem Experiment wurde die Dihydropyridin-Verbindung A (0,1 mg/kg) 0, 10 oder 30 Minuten nach der 5-Minuten-Ischämie subkutan verabreicht, und das Tier wurde 1 Stunde nach Vervollständigung der Ischämie zur Isolierung des Gehirns dekapitiert. In einem anderen Experiment wurde die Dihydropyridin-Verbindung A (0, 1 oder 10 mg/kg) 0, 10, 30 oder 60 Minuten nach Vervollständigung der Ischämie subkutan verabreicht, und dann weiter in der gleichen Dosis einmal am Tag für vier aufeinanderfolgende Tagen (insgesamt 5 Dosen) subkutan verabreicht. Das Tier wurde 1 Stunde nach der letzten Verabreichung dekapitiert (fünfter Tag) und das Gehirn wurde isoliert. Jedoch erhielt in beiden Experimenten die Trägersubstanzgruppe den Träger nur sofort nach der Ischämie. Das isolierte Gehirn wurde in der beschriebenen Weise fraktioniert und der Elektrophorese unterworfen.

Ergebnisse

[A] Prophylaktischer Effekt der Dihydropyridin-Verbindung A

(1) Abbau der zytoskelettalen Proteine im Gehirn-Ischämie- Modell

Elektrophoretisch wurde MAP-2 als 2 Banden im molekularen Gewichtsbereich von 250-260 Kilodalton (K), Calspectin als 3-4 Banden im Bereich von 230-240 K und Clathrin als einfache Bande bei 180 K nachgewiesen. Diese Ergebnisse waren in vollständiger Übereinstimmung mit den von Nishimura und Yamashita et al. übermittelten Daten, die mit den jeweiligen Antikörpern Immunblotting durchführten. Unter den Bedingungen der vorliegenden Studie waren die obigen drei Proteine die einzigen bei denen gefunden wurde, daß sie Änderungen in der Konzentration unterlagen, und eine Summe dieser war nicht mehr als 5% des gesamten Proteins.
Wenn die Dauer der Ischämie von 5 bis 10 bis 15 Minuten variiert wurde, und die jeweilige Proteinkonzentration 1 Woche nach der Ischämie analysiert wurde, wurde gefunden, daß im Falle der 5-Minuten-Ischämie nur MAP-2 und Calspectin abnahmen und keine Änderung bei Clathrin stattfand. Im Falle der 10-Minuten- Ischämie nahmen die 3 Proteine im Cortex und Striatum ab, insbesondere MAP-2 und Calspectin. Andererseits traten keine Änderungen im Hippocampus auf. Im Falle der 15-Minuten-Ischämie nahmen MAP-2 und Calspectin in allen Gehirnbereichen ab, nicht jedoch Clathrin. MAP-2 und Calspectin tendierten dazu merklich abzunehmen, als die Dauer der Ischämie anstieg, jedoch wurde keine klare Abnahme von Clathrin beobachtet. Die Sterblichkeitsrate war 0/5 (0%) für die 5-Minuten-Ischämie, 8/17 (47%) für die 10-Minuten-Ischämie und 31/33 (94%) für die 15-Minuten- Ischämie, und die meisten Tiere starben innerhalb von 24 Stunden nach der Ischämie.
Die Dauer der Ischämie wurde auf 5 Minuten fixiert und die jeweiligen Proteine wurden sofort 4 Tage oder 1 Woche nach der Ischämie quantifiziert. Die 5-Minuten-Dauer der Ischämie wurde ausgewählt, weil die 10-Minuten- und längere Dauern der Ischämie zur Beurteilung des Effekts im Hinblick auf die oben erwähnten Sterblichkeitsraten als ungeeignet angesehen wurden. Sofort nach 4 Tagen nach der Ischämie nahm jedes Protein in allen Gehirnbereichen ab, obwohl es einige Ausnahmen gab. Nach einer Woche waren nur MAP-2 und Calspectin vermindert, sie lagen aber in geringeren Anteilen vor, verglichen mit denen der sofortigen Ischämie oder 4 Tage danach; weiterhin zeigte Clathrin keine wesentliche Verminderung.
Der Effekt von Calcium oder EGTA, welches ein calciumchelatisierendes Mittel ist, auf die wässerlösliche Gehirnfraktion von Normaltieren, dies ist die Abnahme des jeweiligen Proteins in vitro, wurde untersucht. MAP-2 und Calspectin fand man deutlich vermindert in der Gegenwart von Calcium, während Clathrin eine geringe Änderung zeigte. MAP-2 zeigte selbst in der Abwesenheit von Calcium oder EGTA schwache Abnahmen. Da MAP-2 als hitzeresistentes Protein bekannt ist, kann diese geringe Abnahme von MAP-2 eine Folge der Spurenmenge von endogenem Calcium sein, das in den Lösungen enthalten war.

(2) Effekt auf die ischämische Abnahme der zytoskeletalen Proteine

Die Ergebnisse der Quantifizierung des jeweiligen Proteins eine Stunde und 4 Tage nach der Ischämie ergaben, daß die Dihydropyridin-Verbindung A die Abnahme von MAP-2 in allen Gehirnbereichen signifikant inhibiert. Die Verbindung inhibiert signifikant die Abnahmen von Calspectin im Hippocampus bei einer Stunde nach der Ischämie und im Hippocampus und Cortex 4 Tage nach der Ischämie. Die Verbindung hatte keine Wirkung auf die Abnahme von Clathrin. Obwohl der wirksame Dosierungsbereich 0,01 - 10 mg/kg war, zeigte sich keine nennenswerte Verbesserung des Effekts bei 1 mg/kg und höheren Dosen, und es schien, daß der Effekt ein Maximum innerhalb des Bereiches von 1 bis 10 mg/kg erreicht hatte. Die Abnahmen der drei Proteine in der Trägersubstanzgruppe tendierten dazu größer im Striatum und Hippocampus als im Cortex zu sein und der inhibitorische Effekt der Dihydropyridin-Verbindung A tendierte dazu stärker im Striatum zu sein. Ein Vergleich der Proteinkonzentration bei einer Stunde nach der Ischämie mit der bei 4 Tage nach der Ischämie in der Trägersubstanzgruppe zeigte, daß die drei Proteine unverändert blieben oder dazu neigten schwach vermindert zu sein. Die Abnahme der Proteine war weiter fortgeschritten bei 4 Tagen und der Unterschied zum Normalwert war größer, und dies legte nahe, daß die Effekte der Dihydropyridin-Verbindung A leicht untersucht werden würden 4 Tage nach der Ischämie. Der inhibitorische Effekt der Dihydropyridin-Verbindung A zeigte jedoch keinen offenen Unterschied zwischen einer Stunde nach der Ischämie (einfache Dosierung) und nach 4 Tagen (5 wiederholte Dosierungen).
Die obigen experimentellen Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden. Während die Dihydropyridin-Verbindung A die Abnahmen von MAP-2 und Calspectin inhibierte, die als durch CANP zersetzt gelten, hatte sie keinen Einfluß auf die Abnahme von Clathrin, das unabhängig von Calcium ist. Dieser Befund legt nicht nur den prophylaktischen Effekt der Dihydropyridin- Verbindung A gegen eine ischämische Störung des Gehirns nahe, sondern legt auch nahe, daß der Calciumzufluß in die Nervenzellen bei ischämischen Zuständen auftritt.

Vergleich mit Referenzsubstanzen

Zum Vergleich der Wirkung der Dihydropyridin-Verbindung A mit den Wirkungen von Nimodipin und Nicardipin, die konventionelle Ca²&spplus;-Antagonisten sind, wurde ein Experiment gemäß der Prozedur nach Methode (1) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 3 zusammengefaßt. Als Trägersubstanz wurde durchweg PEG-400 verwendet. Es ist aus den Tabellen ersichtlich, daß, während die Wirkungen von Nimodipin und Nicardipin extrem schwach sind, nur die Dihydropyridin-Verbindung A eine signifikant potentere Wirkung zeigt.

[B] Therapeutischer Effekt der Dihydropyridin-Verbindung A

Die Ergebnisse der Quantifizierung des jeweiligen Proteins bei einer Stunde nach der Ischämie sind in Tabelle 4 gezeigt. Bei der Dosis von 1 mg/kg inhibiert die Dihydropyridin-Verbindung A, die sofort nach der Ischämie verabreicht wurde, signifikant die Abnahme von MAP-2 in allen drei Gehirnbereichen, und sogar wenn sie 10 Minuten nach der Ischämie verabreicht wurde, inhibiert sie signifikant die Abnahme von MAP-2 im Hippocampus. Gegen die Abnahme von Calspectin war die Dihydropyridin-Verbindung A nur im Hippocampus wirksam, und dieser Effekt wurde sogar beobachtet wenn sie 30 Minuten nach der Ischämie verabreicht wurde. Die Dihydropyridin-Verbindung A hatte keine Wirkung auf die Abnahme von Clathrin.
Die Ergebnisse der Quantifizierung der jeweiligen Proteine bei 4 Tage nach der Ischämie sind in Tabelle 5 gezeigt. Im Striatum wurde die Abnahme von MAP-2 in den 1 mg/kg/Tag- und 10 mg/kg/Tag-Gruppen, die die erste Dosis sofort nach der Ischämie oder 10 Minuten nach der Ischämie erhielten und in der 10 mg/kg/Tag-Gruppe, die die erste Dosis 30 Minuten nach der Ischämie erhielten, signifikant inhibiert. Im Hippocampus wurde die Abnahme von MAP-2 in beiden 1 mg/kg/Tag- und 10 mg/kg/Tag- Gruppen, in denen die Verabreichung sofort bis 60 Minuten nach der Ischämie begonnen wurde, signifikant inhibiert.
Basierend auf den obigen Resultaten ist es klar, daß die Dihydropyridin-Verbindung A wirksam gegen die Abnahme von MAP-2 im Hippocampus war, obwohl das Intervall zwischen der Ischämie und dem Beginn der Verabreichung vergleichsweise lang war. Andererseits, bezogen auf den Striatum und den Frontalcortex, erscheint es bevorzugt, daß die Dihydrapyridin-Verbindung A so früh wie möglich verabreicht werden sollte. Tabelle 1 Effekt auf die Proteinkonzentration bei einer Stunde nach der Ischämie (% des Normalwertes) Gehirnbereich Dosis (mg/kg) n MAP-2 Calspectin Clathrin Cortex Scheinoperationskontrolle Trägersubstanzkontrolle Dihydropyridin-Verbindung A Nimodipin Nicardipin Corpus Striatum Hippocampus Jeder Wert stellt den Durchschnitswert dar ± S.E. =, = =: P< 0,05, 0,01 (verglichen mit der Scheinoperationkontrollgruppe) *; * *: P< 0,05, 0,01 (verglichen mit der Trägerkontrollgruppe) Tabelle 2 Effekt auf die Proteinkonzentration bei 4 Tagen nach der Ischämie (% des Normalwertes) Gehirnbereich Dosis (mg/kg) n MAP-2 Calspectin Clathrin Cortex Scheinoperationskontrolle Trägersubstanzkontrolle Dihydropyridin-Verbindung A Nimodipin Nicardipin Corpus Striatum Hippocampus Jeder Wert stellt den Durchschnitswert dar ± S.E. =, = =: P< 0,05, 0,01 (verglichen mit der Scheinoperationkontrollgruppe) *; * *: P< 0,05, 0,01 (verglichen mit der Trägerkontrollgruppe) Tabelle 3 Effekt auf die Abnahmen der zytoskeletalen Proteine in einem 5- Minuten-Ischämie-Reperfusion-Wüstenspringmaus-Modell Frontal-Cortex Striatum Hippocampus Gesamtscore MAP-2 Calspectin Chlathrin Dihydropyridinverbindung A Nimodipin Nicardipin +: Statistisch signifikant -: Nicht wirksam Links: Dosiert 1 Stunde vor der Ischämie und getötet durch Dekapitation 1 Stunde nach der Ischämie. Rechts: Dosiert 1 Stunde vor der Ischämie für 4 aufeinanderfolgende Tage und getötet durch Dekapitation 1 Stunde nach dem letzten Dosieren. Tabelle 4 Effekt der Dihydropyridin-Verbindung A (1mg/kg Gruppe) auf ischämischen Abnahmen der Gehirnproteine (Getötet durch Dekapitation 1 Stunde nach 5-Minuten-Ischämie) [% des Normalwertes] Gehirnbereich Zeit der Verabreichung (Zeit in Minuten nach der Ischämie) n MAP-2 Calspectin Clathrin Cortex Corpus Striatum Hippocampus Scheinoperationskontrolle Trägersubstanzkontrolle Jeder Wert stellt den Durchschnittswert ± S.E. dar * : P< 0,05 (verglichen mit der Scheinoperationskontrollgruppe) ** : P< 0,01 (verglichen mit der Trägersubstanzkontrollgruppe) Tabelle 5 Effekt der Dihydropyridin-Verbindung A (1, 10 mg/kg/Tag x 5) auf die ischämische Abnahme der Gehirnproteine (getötet durch Dekapitation 5 Tage nach der 5-Minuten-Ischämie) [% des Normalwertes] Gehirnbereich Zeit der Verabreichung (Zeit in Minuten nach der Ischämie) n MAP-2 Calspectin Clathrin Cortex Striatum Hippocampus Scheinoperationskontrolle Trägersubstanzkontrolle Trägergruppe Jeder Wert stellt den Durchschnittswert ± S.E. dar * : P< 0,05 (verglichen mit der Scheinoperationskontrollgruppe) ** : P< 0,01 (verglichen mit der Trägersubstanzkontrollgruppe)

[Beispiele]

Beispiel 1

Dihydropyridin-Verbindung A 100 g
Hydroxypropylmethylcellulose 500 g
Die Dihydropyridin-Verbindung A wurde in absolutem Ethanol (5 l) gelöst, gefolgt von der Zugabe von Hydroxypropylmethylcellulose, um eine Suspension zu erhalten. Das organische Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt, um eine feste Dispersion zu ergeben.

Beispiel 2

Dihydropyridin-Verbindung A 100 g
Hydroxypropylmethylcellulose 500 g
Sucrose 9,4 kg
Die Sucrose wurde zu einer Suspension gegeben, die die Dihydropyridin-Verbindung A und Hydroxypropylmethylcellulose in absolutem Ethanol (5 l) enthielt, und die Mischung wurde gerührt. Das organische Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt, um eine feste Dispersion zu ergeben. Diese Zusammensetzung wurde routinemäßig in feines Granulat verarbeitet.

Beispiel 3

Dihydropyridin-Verbindung A 100 g
Hydroxypropylmethylcellulose 500 g
Lactose 6,87 kg
Hydroxypropylcellulose mit einem niedrigen Substitutionsgrad 1,5 kg
Magnesium-Stearat 30 g
Zu einer Suspension der Dihydropyridin-Verbindung A und Hydroxypropylmethylcellulose in absolutem Ethanol (5 l) wurde Lactose und Hydroxypropylcellulose mit einem niedrigen Substitutionsgrad gegeben und die resultierende Mischung wurde gerührt. Das organische Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt, um eine feste Dispersion zu erhalten. Diese Zusammensetzung wurde routinemäßig zu Granulat verarbeitet, und nach Zugabe von Magnesiumstearat wurden daraus durch ein übliches pharmazeutisches Verfahren Tabletten hergestellt. Jede Tablette enthielt 2 mg der Dihydropyridin-Verbindung A.

Beispiel 4

Jede der nach Beispiel 3 hergestellten Tablette wurde mit einer Beschichtungs-Zusammensetzung filmbeschichtet, die aus Hydroxypropylmethylcellulose (5,1 mg), Titandioxid (1,6 mg), Polyethylenglykol 6000 (0,8 mg), Talk (0,4 mg) und gelbem Eisenoxid (0,1 mg) bestand, um eine filmbeschichtete Tablette zu erhalten, die 2 mg der Dihydropyridin-Verbindung A enthielt.

Claims

1. Verwendung der Dihydropyridin-Verbindung der Formel:

worin R¹ eine Nitrophenylgruppe ist und R², R³ und R&sup4; jeweils eine gleiche oder verschiedene (C&sub1;-C&sub6;)Alkylgruppe sind, oder eines pharmazeutisch verträgliches Salz davon zur Herstellung eines Medikamentes zur Verbesserung der Resistenz von Gehirnneuronen in Säugetieren, einschließlich Menschen, gegen eine Schädigung, die aus Ischämie resultiert.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Dihydropyridin-Verbindung 6-Cyano-5-methoxycarbonyl-2-methyl-4-(3-nitrophenyl)-1,4-dihydropyridin-3-carbonsäureisopropylester ist.