DE2258495C3

DE2258495C3 - Polymerisationsprodukte des Kunitz-Inhibitors, Verfahren zur Herstellung dieser Produkte und diese Produkte enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2258495C3
Application number: DE19722258495
Authority: DE
Inventors: Claude Chaville Raby; Edgar Dr. Bures-Sur-Yvette Sach
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1971-11-29
Filing date: 1972-11-29
Publication date: 1979-10-31
Also published as: JPS4864169A; FR2161791A1; FR2161791B1; DE2258495B2; GB1415335A; DE2258495A1

Description

Plasminogen/Plasmin-Systems sicherzustellen.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des Kunitz-Polyinhibitors, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Kunitz-lnhibitor in Salzlösung mit einem Proteinkupplungsmittel umsetzt, das funktioneile Gruppen aufweist, die mit den am Kunitz-Inhibitor vorhandenen Gruppen reagieren können.

Man erhält ausgezeichnete Ergebnisse, wenn man als Kupplungsmittel Glutaraldehyd verwendet

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Polymerisation in einer auf einen pH-Wert zwischen 3 und 7, vorzugsweise 3 und 4 gepufferten Lösung, wobei die Glutaraldehyd-Konzentration des Mediums zwischen 0,1 und 5%, vorzugsweise zwischen 0,1 und 1% liegt.

Es wurde festgestellt, daß die Kunitz-Inhibitor-Konzeniration des Mediums keine besondere Wirkung auf den Endpolymerisationsgrad hat. Aus Gründen der Praxis verwendet man Kunitz-Inhibitor-Konzentrationen, die zwischen 1 und 10% liegen.

Vorzugsweise arbeitet man in Lösungen, die mit Natriumacetat oder Natriumborat gepuffert sind. Wenn der pH-Wert und die Konzentration des Glutaraldehyds innerhalb der oben angegebenen bevorzugten Bereiche liegen, so ergibt es sich, daß die molare Konzentration des Puffermittels keinen bemerkenswerten Einfluß auf den Verlauf der Reaktion hat. Wenn man bei einem pH-Wert oberhalb 4 arbeitet, ist man bestrebt, das Puffermittel in relativ geringen molaren Konzentrationen zu verwenden, die, wenn man als Puffermitiel Natriumacetat verwendet, insbesondere 0,1 m nicht übersteigen sollen.

Unter den gleichen Bedingungen verliert der Zeitfaktor ebenfalls an Bedeutung, so daß die Reaktion unterbrochen werden muß, bevor die ersten Anzeichen einer Gelbildung in dem Medium auftreten. Die Reaktionsdauern können sich daher z. B. von 5 Minuten bis 24 Stunden erstrecken.

Zur Isolierung der löslichen Polymerisationsprodukte aus der Reaktionsmischung verwendet man in vorteilhafter Weise eine Fraktionierung durch Säulenchromatographie, ζ. B. durch Filtration der Mischung über ein

I" Gel von der Art eines Molekularsiebe, worauf man in einer weiteren Stufe die aufgefangenen Fraktionen einer Gefriertrocknung unterzieht

Diese Polymerisationsprodukte des Kunitz-Inhibitors sind ebenfalls in dem physiologischen Serum (0,9%) und

ι ί in einer 5%igen Glucoselösung löslich.

Zur Erläuterung und ohne die Erfindung dadurch berschränken zu wollen, sei gesagt, daß das Molekulargewicht der löslichen Polymerisationsprodukte des Kunitz-Inhibitors sich zwischen etwa 12 000 und 13 000 bis etwa 80 000 bis 150 000 erstreckt

Man kann natürlich auch unlösliche Polymerisationsprodukte des Kunitz-Inhibitors herstellen, die man leicht dann erhält, wenn man bei höheren pH-Werten und Glutaraldehyd-Konzentrationen als den oben

2> angegebenen z. B. bei pH-Werten oberhalb 7 und Glutaraldehyd-Konzentrationen oberhalb 5% arbeitet.

Die in der Zeichnung dargestellte F i g. 1 zeigt die

graphische Darstellung einer chromatographsichen Fraktionierung eines die Polymerisationsprodukte des

so Kunitz-Inhibitors enthaltenden Mediums.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern, ohne sie jedoch /u beschränken.

Beispiel 1

Man bringt 300 mg hochgereinigten Kunitz-Inhibitor in 30 ml einer 0,2 m Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,0 in Lösung. Anschließend gibt man 0,6 ml einer 25%igen Glutaraldehydlösung hinzu.

Nachdem man 4'/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt hat, fraktioniert man die Reaktionsmischung, indem man eine Filtration über Gel durchführt. Hierzu verwendet man ein Gel, das im Handel unter der Bezeichnung »Sephadex G-75« bekannt ist, in einer Kolonne mit den Abmessungen 4 χ 100 cm, das mit einer 0,2 m Ammoniumacetatlösung auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht wurde.

Man fängt Fraktionen von 10 ml auf, deren optische Dichte man bei 280 nm und deren Inhibitoraktivität gegenüber Trypsin man durch Rücktitration mit Trypsinlösungen mit bekanntem Titer, z. B. gemäß dem in »La Pharmacopee Frangaise, VIII. Edition, Seite 1240« beschriebenen Verfahren bestimmt.

Die graphische Aufzeichnung der Fraktionierung dieser Lösung ist in der F i g. 1 gezeigt, auf der

a) die Änderung der bei 280 nm bestimmten optischen Dichte D(oder die Transmission) des Eluats und

b) die mit 1 bis 5 numerierten Fraktionen, in denen eine Antitrypsinaktivität vorhanden ist, in Abhängigkeit von dem Volumen (in ml) des durch die Kolonne hindurchgetretenen Elutionsmittels aufgetragen ist.

Es ist festzustellen, daß die Fraktionen 1 bis 3 eine trypsininhibierende Wirkung entfalten. Ihre Stellung in •ίο dem Chromatogramm (Elutionsvolumen) erlaubt es festzustellen, daß es sich um Fraktionen von mehr oder weniger stark polymerisiertem Kunitz-Inhibitor handelt. Die Polymerisationsprodukte der Fraktion 2 (Molekulargewicht etwa 20 000) scheinen im wesentli-4") chen aus Trimeren des Kunitz-Inhibitors zu besteheii, während die Produkte der Fraktion 3 (Molekulargewicht etwa 12 000 bis 13 000) aus Dimeren zu bestehen scheinen. Es ist festzuhalten, daß es sich in den beiden Fällen wahrscheinlich um Mittelwerte der Polymerisationsgrade handelt. Im folgenden sind die Titer der einzelnen Fraktionen angegeben (ausgedrückt als Protease-inhibierende Einheiten pro mg des trockenen Produktes, u/mg).

Fraktion 1: 15 000 u/mg

Fraktion 2: 25 000 u/mg
Fraktion 3: 40 000 u/mg.

Die Fraktion 4 besteht aus dem Kunitz-Inhibitor, der bo nicht reagiert hat und zeigt einen Titer ähnlich dem ursprünglichen Titer (50 000 u/mg) oder einen noch höheren Wert.

Die Fraktion 5, die stark gelb gefärbt ist, enthält Glutaraldehyd.

h5 Die aus den Fraktionen 2 und 3 erhaltenen Polymerisatprodukte können durch direkte Gefriertrocknung dieser Fraktionen ohne vorhergehende Dialyse erhalten werden.

Beispiel 2

Man bringt 3 g hochgereinigten Kunitz-lnhibitor in ml einer 0,1 m Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,0 in Lösung. Man gibt 0,6 ml einer 25%igen Glutaraldehydlösung hinzu.

Nach 1 stündigem Rühren bei Raumtemperatur unterwirft man die Reaktionsmischung einer Gelfiltration. Man verwendet dazu das Gel »Sephadex G-75«, das in einer Kolonne mit den Abmessungen 3 χ 150 cm angeordnet ist und mit einer 0,2 m Ammoniumacetatlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt ist.

Man fängt Fraktionen von etwa 10 ml auf. Im folgenden sind die Titer der drei ersten Fraktionen und die Gewichte des gewonnenen Produktes angegeben;

Fraktion 1: 34 mg eines Produktes mit einem Titer

von etwa 21 000 u/mg
Fraktion 2: 714 mg eines Produktes mit einem

Titer von etwa 26 000 u/mg
Fraktion 3: 1,227 g eines Produktes mit einem

Titer von etwa 40 000 u/mg.

Die in diesen Fraktionen enthaltenen Polymerisatprodukte können direkt, ohne vorhergehende Dialyse, durch Gefriertrocknung erhalten werden.

20 Was die vierte Fraktion betrifft, so ist zu sagen, daß sie aus dem monomeren Kunitz-lnhibitor besteht und 0,889 g des Monomeren mit einem Titer von etwa 60 000 u/mg umfaßt.

Die fünfte Fraktion enthält Glutaraldehyd.

Beispiel 3

Im folgenden sind die Ergebnisse verschiedener Untersuchungsreihen angegeben, mit denen die bevorzugten Verfahrensbedingungen für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von löslichen Kunitz-Polyinhibitoren ermittelt wurden.

Zunächst sind für jede Reihe die Verhältnisse der verwendeten Reaktionsteilnehmer und andere bei jedem Experiment der gleichen Reihe angewandten Bedingungen angegeben, worauf der Parameter genannt ist, der variiert wurde; wonach in der Tabelle der Zustand des Reaktionsmediums oder der erhaltenen »Lösung« bei Beendigung der Untersuchung eingefügt ist.

Die Abkürzungen »Lsg.«, »undef.« und »Nied.« stehen für die Worte »Lösung«, »undefinierbar« bzw. »Niederschlag«.

Reihe a
Bedingungen:

pH
Lsg.

Kunitz-lnhibitor 10%
Glutaraldehyd 0,5%
Puffer: Natriumacetat 0,1 m oder Natriumborat 0,1 m

Zeit 15 Min. -25 C

Änderung des pH-Wertes des Puffers

4 5

klar

undef.

7
undef.

Nied.

9
Nied.

Reihe b
Bedingungen:

pH
Lsg.

Kunitz-lnhibitor 10%

Glutaraldehyd 0,5 %

Puffer: Natriumacetat 0,1 m oder

Natriumborat 0,1 m Zeit 60 Min. -25 C
Änderung des pH-Wertes des Puffers

4 5

klar

undef.

7
Nied.

Reihe c
Bedingungen:

pH
Lsg.

Kunitz-lnhibitor 10%
Glutaraldehyd 0,5%

Puffer: Natriumacetat 0,1 m oder Natriumborat 0,1 m

Zeit3Std. -25 C

Änderung des pH-Wertes des Puffers 4 5

klar

undef.

7
Nied.

Reihe d
Bedingungen:

Molariliit
!.sy.

Kiinit/.-lnhihitor 10%

Glutiiraldehyd 0.5%

pH-Wert 4

/eil 15 Min. -25 <"

Änderung der Mnlaritiil des Nalriuniacetal-Pull'ers

0.025 m 0,05 m 0,1m 0,2 m 0,5 m

klar klar klar klar klar

Reihe c

Bedingungen: Kunitz-Inhibilor 10%

Gluturuldchyd 0,5%

pH-Wert 6

Zeit 15 Min. -25 C

Änderung der Molariliit des Nalriumacelat-PulTers

Molarilät O,O25m 0,05 m 0,1m 0,2 m 0,5 m

l.sg. klar klar klar Nicd. Nied.

Reihe Γ
Bedingungen:

pH-Wcrl4

Glularaldchyd 0,5%

I'ulTcr: Natriumacetat 0,1 m

Zeil 15 Min. -25 C

Änderung der Konzentration des Kunitz-Inhibitors

Kumt/ Γ	pH-Wert 4	10%	C"	1%	4Vt,	1,5%	2%	2,5%	nach
¹K, 5 %	Kunilz-Inhibitor 1	klar		klar	klar	klar	klar	klar	ι. 30 Min.
Lsg. klar klar				Gel bildung	Gelbildung		Gelbildung Gelbildung	10%
Reihe g				nach 20 Min	nach		nach	Gclbildung
Bedingung:	10%			60 Min.		45 Mir
	Puffer: Natriumacetat 0,1 m		5%
	Zeil 15 Min. - 25				Gelbildung

	Änderung der Glutaraldchyd-Konzentration
Glutaraldchyd	0,1% 0,5%
l.sg.	klar klar



Glutaraldchyd	3%
Lsg.	klar
	Gelbildung
	nach 25 Min.

Die im folgenden angegebenen pharmakologischcn Untersuchungen dienen zum Nachweis der Eigenschaften der Kunil7-Polyinhibitorcn.

A) Hypokoaguliercnde Eigenschaften

Zur Klarheit der folgenden Ausführungen seien in schematischer Weise die Hauplstufen des Gerinnungsverfahren?, in Erinnerung gerufen, das normalerweise in Gegenwart eines hydrophilen Mittels oder unter dem Einfluß einer Benetzbarkeit ausgelöst wird, die im Bereich der hydrophoben Gefäßwandungen, z. B. durch eine Verwendung oder eine anormale Gewebeveränderung hervorgcfurcn wird.

Das Gerinnungsverfahren umfaßt im wesentlichen drei aufeinanderfolgende Stufen:

1. Die Thromboplastinbildung oder die Bildung der Prothrombinase, die durch die Wechselwirkung der Blutplasma- und Blutzellfaktoren in Gegenwart von Ca⁴ +-Ionen hervorgerufen wird, wobei diese Kette von enzymatischen Reaktionen durch Aktivierung der hydrophoben Oberflächen durch sogen. »Kontakte-Faktoren in Gang gebracht wird;

2. Die Thrombinbildung oder die Umwandlung des Prothrombine in Thrombin unter der Einwirkung der Prothrombinascn und

5. die Fibiinbildiing, mit anderen Worten die durch Thrombin hervorgerufene Hydrolyse der löslichen llliilfibrinngens zu unlöslichem Fibrin.

Die Wirkung der Kunitz-Polyiiihibitoren auf die Blutgerinnung wurde in situ nach dem Thromboelasioiiraphie-Verfahren an hliilpliitlchenreichcn I'lasmapraparaten durchgeführt, die in Röhrchen mil wasserabslo-Iteiulen Wandungen, insbesondere aus mit Silikon beliandeliein Cilas vorlagen und die zur Bildung von C lielaten der in dem Plasma vorhandenen Kalziumionen mit Trinatiiiimeilrat versetzt waren. Unier diesen Bedingungen weiden die in den Präparaten enthaltenen Kont.iktl.iktoreu minimal aktiviert und die Präparate gerinnen (in Abwesenheit von ionisiertem Kal/ium) nicht, so daß das (jcriiiuiingsveil'.ihrcn durch Kal/ium-/iiliihiung, /.1J. durch Zugabe von Kalziumchlorid, ausgelöst weiden kann.

Die bei den Versuchen verwendeten Plasmapraparate enthielten 0,5 ml bluiplättchenreiehes Plasma, das mit 0.1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung versetzt war, die 50 bis 4000 Protease-Inhibitoreinheiten pro ml (u/ml) des Kunit/Polyinhibilors enthielten, dessen antikoagulierende Wirkung untersucht werden soll.

Das Prinzip des Verfahrens besteht darin, die Gerinnungszeiten des Plasmas dieser Präparate mit denen von Vergleichspraparalen gleicher Zusammensetzungen, die jedoch frei von dem antikoagulierenden Mittel sind, gemäß dem Verfahren, das in »Biologie des Hemorragies et des Thromboses« von C. R a b y - Masson I'd. Paris 19bb, Seilen 18b - 188, beschrieben ist, zu vergleichen.

Zur Klarheit sei darauf hingewiesen, daß dieses Verfahren die Viskosiiats/unahme eines ßlutpräparates im Verlauf der Gerinnung zur Bestimmung verwendet. Das Prinzip dieses Verfahrens besteht darin, daß man das Gefäß, das das /u untersuchende Präparat enthält, einer oszillierenden Drehbewegung unterzieht und die Wirkung der Gerinnung auf einen Zylinder untersucht, der an einem Torsionsfaden aufgehängt ist und in das Präparat eintaucht. Wenn die Gerinnung beginnt, überträgt das in dem Behälter enthaltene Plasma seine Schwingungsbewegungen auf den Zylinder.

Als Zeitpunkt / = 0 der Gerinnung wird der Augenblick betrachtet, da man die für die Gerinnung verantwortlichen Faktoren durch Zugabe von Ca⁺ ♦ Ionen unter den oben angegebenen Bedingungen aktiviert.

Dyr Ausdruck »r« steht für die Latenzzeit, die dem wirklichen Beginn der Gerinnung vorausgeht,
die Buchstaben »am« stehen für die Maximalamplitude der Schwingungen des Zylinders,

der BuchstabewA:« steht für das Zeitintervall zwischen dem Augenblick, da der Zylinder zu schwingen beginnt und dem Augenblick, da die Amplitude der Bewegung gleich ist der maximalen Amplitude, die man unter den gleichen Bedingungen mit einem keine Blutplättchen enthaltenen Plasma erzielt

Die »Gesamtgerinnungszeit« eines Präparates wird durch die Summe r+ k definiert (die im allgemeinen bei einer normalen Probe 25 bis 35 mm beträgt).

Gemäß dem oben angegebenen Verfahren bestimmt man optisch und photographisch die erreichten maximalen Winkelstellungen des Zylinders in Abhängigkeit von der Zeit, wobei die erhaltenen Kurven im allgemeinen die Form von Stimmgabeln annehmen.

Die Untersuchungen wurden mit Hilfe des aus der Fraktion 2 des Beispiels 2 isolierten Polymerisatproduk

tes der Fraktion 2 des Beispiels 2, das ein Molekulargewicht von etwa 65 000 aufwies (Fraktion A) und des Dinieren des Kunitz-Inliibiiors (Fraktion IJ) in Form einer Fraktion i, das bei einem identischen Verfahren isoliert wurde, und in der Fig. 1 angegeben ist, durchgeführt.

Die Aktivität tier Kiinilz. Poltinhibitorcn Λ und IJ winden nacheinander bestimmt:

in bezug auf die Gesamigerinniing der Plasma der fraglichen All,

im Vergleich zu denen des Gliilaraldchyds und des klassischen Kiiiiil/-Inhibitors,
und jeder Phase der Gerinnung.

1. Untersuchung der Wiikuiigdes Kimiiz-

Pulyinhibitors A auf die Koagiilieibaikcil

iles Plasmas in vitro

a) Untersuchung der Wirkung auf verschiedene
Piaparate,die aus der gleichen Probe herstammen

Zunächst wurden verschiedene Untersuchungen durchgeführt, um die Koagulierbarkeit von Plasmas, die reich an Blulplättchen sind und die aus der gleichen Probe herstammen, in Abhängigkeit von der Konzentration des KunitzPolyinhibitors A festzustellen.

Uei den verwendeten Präparaten lagen die Konzentrationen an dem Polymerisatprodukt zwischen 100 ii/nil und 4000 u/ml, was bei einem Erwachsenen therapeutischen Dosen von 250 000 u bis K)OOOOOOu entspricht.

Iu der folgenden Tabelle I sind die Werte r I- k, die proportional zur Geiinmingszeit sind und die Werte der maximalen Amplituden am die für jedes dieser Präparate und für die Vergleiehspraparatc erhalten wurden, angegeben.

Tabelle I

	Vergleichspriiparat	r"	«""nini
1)	Präparat enthallend	27	44
	K)O u/ml Produkt A
	200 u/ml Produkt A	31	45
	500 u/ml Produkt A	35	45
	Vcrgleichspräparat	41	43
2)	Präparat enthaltend	30	46
	1000 u/ml Produkt A
	2000 u/ml Produkt A	45	49
	Vergleichspriiparat	72	47
3)	Präparat enthaltend	26	51
	3000 u/ml Produkt A
	Vergleichspräparat	52	52
4)	Präparat enthaltend	32	50
	4000 u/ml Produkt A
	117	42

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß der polymerisierte Kunitz-Inhibitor eine deutliche hypokoagulierende Wirkung auf die Plasmagerinnung ausübt

Andererseits zeigen die erhaltenen Ergebnisse, daß die durch die erfindungsgemäßen Polymerisatprodukte ausgeübte hypokoagulierende Wirkung in Abhängigkeit von der Konzentration des Polymerisatproduktes variiert Man kann feststellen, daß diese Wirkung bereits bei Konzentrationen von 500 u/ml des Polymerisatproduktes beträchtlich ist und man besonders zufriedenstel-

lende Ergebnisse erreicht, wenn die Konzentration des Polymerisatproduktes 2000 ti/nil beträgt. Diese Konzentration entspricht einer therapeutischen Dosis von 5 000 000 u, was im Fall des Monomeren der in der Therapie verwendeten minimalen Dosis entspricht.

b) Änderungen der Koagiilierlxirkcit in
Abhängigkeit von der \rl des Plasmas

Man verwendet Präparate, die fünf bluipliitichenreiche Plasmas a, b, c, d und e enthalten, die aus verschiedenen Proben stammen. Man bestimmt die Koagulierbarkeit dieser Präparate, deren Kon/entrationen an dem Polynierisatproduki Λ entweder 2000 u/nil oder 3000 u/nil betragen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle Il zusammengefaßt.

Tabelle Il	2(XM) u/ml	*'· A₁₁₁₁₁₁**	"'"mm
	20(M) u/nil	2¹> 70	45 52
Vergleich a Präparat a enthaltend	2000 u/nil	29 62	45 44
Vergleich b Präparat h enthaltend	2000 u/ml	JO 100	54 52
Vergleich e Präparat c enthaltend	2000 u/nil	28 69	50 52
Vergleich d Präparat d enthaltend	3000 u/nil	JO 51	53 49
Vergleich e Präparat e enthaltend	3(MX) u/ml	24 86	55 46
Vergleich a Präparat a enthaltend	3000 u/nil	27 102	60 59
Vergleich b Präparat b enthaltend		27 54	53 55
Vergleich c Präparat c enthaltend

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die durch das Polymerisatprodukt A ausgeübte antikoagulierende Wirkung von der Art des Plasmas abhängt. Diese Ergebnisse ändern sich in Abhängigkeit von der spontanen Koagulierbarkeit des verwendeten Plasmas, die eine Folge des Fibringehaltes des Blutplättchengehaltes und des Gehaltes an Faktor 13 in dem Plasma ist.

In allen Fällen zeigen die erhaltenen Ergebnisse die antikoagulierenden Eigenschaften des erfindungsgemäßen Polymerisatproduktes.

2.IJ ntersuchung der wirkung des Poiymerisat-

produktes B auf die Plasma-Koagulierbarkeit

unter Anwendung der gleichen Untersuchung

wie der oben beschriebenen

(an unterschiedlichen Plasmas)

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 111 zusammengefaßt.

Tabelle III

"'"mn

Vergleichspräparat 40 55

Präparat enthaltend 90

1000 u/ml

2) Vergleichspräparat M 56 Präparat enthaltend 100 52 2000 u/ml

Vergleichspräparat 36 58

Präparat enthaltend 91 55 2000 u/ml

Vergleichspräparal 37 59

Präparat enthaltend 77 56 2000 u/ml

3) Vergleichspräparal 44 45 Präparat enthaltend 79 44 3000 u/ml

4) Vergleichspräparat 40 44 Präparat enthaltend 72 47 4000 u/ml

Es ist festzustellen, daß bei den Plasmas, die bei diesen Untersuchungen verwendet wurden, die erhaltenen Werte r+ k im Fall der Vergleichspräparate geringfügig die obere Grenze übersteigen, die im Normalfall erreicht wird. |edoch ist aus diesen Ergebnissen ersichtlich, daß das Polymerisatprodukt B in allen Fällen eine sehr deutliche hypokoagulierende Wirkung auf die verwendeten Plasmas ausübt. Wie im Fall der Untersuchungen, die mit dem Polymerisatprodukt A durchgeführt wurden, ändert sich die hypokoagulierende Wirkung des Polymerisaiproduktes B in Abhängigkeit von der Art des Plasmas und der Konzentration des Polymerisat produktes.

3. Vergleich der Wirkung der Kunitz-

Polyinhibitoren A und B mit den Produkten,

von denen sie sich ableiten

a) Wirkung von Glutaraldehyd auf die Plasma-Koagulierbarkeit in vitro

Es wurde die Gerinnungszeit von Vergleichspräparaten, die 0,5 ml blutplättchenreiches Plasma und 0,1 ml einer isotonischen Chloridlösung enthielten und Präparaten, die 0,5 ml blutplättchenreiches Plasma und 0,1 ml einer 0,5%igen Glutaraldehydlösung enthielten, bestimmt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Vergleich
Präparat enthaltend 0,1 ml

50
48

1) Vergleichspräparat 35 60

Präparat enthaltend 60 60

1000 u/ml

Glutaraldehyd
Vergleich 34

Präparate enthaltend 0,1 ml 30
_b5 Glutaraldehyd

Vergleich 55

Präparate enthaltend 0,1 ml 51
Glutaraldehyd

54 53

55 55

53

13

Diese Ergebnisse zeigen, daß Glutaraldehyd praktisch keine antikoagul· rende Wirkung auf die verwendeten Plasmapräpara; - ausübt. Ils scheint eher die Gerinnung /u beschleunigen.

b) Verglcichsuntcrsuchungen.die mit Hilfe

des Kunitz-Inhibitors und der erfindungsgemäßen Polymerisatprodukte hinsichtlich der

Plasmagerinnung durchgeführt wurden

Die Vergleichspräparatc stammen aus 0,5 ml blutplättchenreichem Plasma und 0,1 ml einer isotonischen C'hloridlösung.

Zunächst vergleicht man die Gerinnungszeiten von Präparaten, die mit dem unter dem Namen »Iniprol« im Handel erhältlichen Kunitz-lnhibitor erreicht wurden mit den Zeiten, die sich bei Präparaten ergaben, die mit dem Polymerisatprodukt A behandelt worden waren. Die Konzentrationen an »Iniprol« und dem Polymerisatprodukt A in den zu untersuchenden Präparaten, ausgedrückt als Antiprotcase-Einheiten sind identisch und nehmen von 100 u/ml auf 3000 u/ml zu.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V

'■ + λ,ιιΐτ

Vergleich Priiparal enthaltend KK) u/ml Iniprol KK) u/ml Produkt A	27 27 31
Präparat enthaltend 200 u/ml Iniprol 200 u/ml Produkt A	31 35
Präparat enthaltend 500 u/ml Iniprol 5(H) u/ml Produkt A	34 41
Vergleich Präparat enthaltend KK)O u/ml Iniprol KMK) u/ml Produkt A	29 38 48
Vergleich Priiparal enthaltend 2000 u/ml Iniprol 2000 u/ml Produkt A	29 41 70
Vergleich Präparat enthaltend 2000 u/ml Iniprol 20(10 u/ml Produkt A	29 50 62
Vciglcich Präparat enthalten«! 2000 u/ml Iniprol 2000 u/ml Produkt A	30 36 100
Ycigleieh Präparat enthaltend 2000 u/ml Iniprol 2000 u/ml Produkt Λ	28 44 69
Yeigleieh Präparat enthaltend 2000 u/ml Iniprol 200(1 u/ml Piodukt Λ	30 36 51

44

48 45

43 45

45 43

56

52 56

45 52 45

47 44 54

56

52

50

52 52 53

52 49 <"»ηιη.

Vergleich 27
"> Präparat enthaltend

3000 u/ml Iniprol 48

3000 u/ml Produkt A 102

Vergleich ■ 24
Präparat enthaltend

3000 u/ml Iniprol 24

3000 u/ml Produkt A 86

Vergleich 27
Präparat enthaltend

3000 u/ml Iniprol 34

' 3000 u/m! Produkt A 54

60

55 59

55

55 46 53

54 55

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Polymerisatprodukt eine antikoagulicrende Wirkung enifaltel, die der von Inipro überlegen ist. Dieser Unterschied ergibt sich insbesondere bei Inhibitorkonzentrationen von gleich oder größer 1000 u/ml.

In der im folgenden angegebenen Tabelle Vl sind die Ergebnisse angegeben, die sich bei der Durchführung der gleichen Vc gleichsunlcrsuchungen, wie der zuvor beschriebenen, ergaben, wobei jedoch das Polymerisalprodukt B verwendet wurde. Die Konzentrationen an dem monomeren und dem dimeren Produkt waren gleich und betrugen 2000 u/ml.

Tabelle VI

r+

44

1) Vergleich
Präparat enthaltend
2000 u/ml Iniprol
2000 u/ml Produkt B

2) Vergleich

4(i Präparat enthaltend
2000 u/ml Iniprol
2000 u/ml Produkt H

3) Vergleich
Präparat enthaltend

■n 2000 u/ml Iniprol

2(K)O u/ml Produkt B

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß selbst die kleinsten Polymerisate des Kunitz-Inhibitors eine -,ο außergewöhnlich deutliche antikoagulicrende Wirkung entfallen.

4. Wirkung der Kunilz-Polyinhibitoren auf die verschiedenen Phasen der Gerinnung

37	49
48	50
36	58
42	57
91	55
37	59
42	58
77	56

a) Wirkung auf die libiinbilduiig:

Man untersucht die Wirkung der Polymerisalproduktc A und B auf die Stufe der l'ibrinbildung, indem man die Thrombin/eil (verdünnt) bestimmt. Da/u vermischt man die oben angegebenen Citrat- oder Oxalat-Präparate, die jeweils aus 1 ml Plasma bestehen, das mit 2000 Einheilen des Kunit/Polyinhibilors in 0.1 ml Lösung versetzt ist. bei 37' C mit einer geeigneten Menge verdünnten Thrombins. Nach dem Versetzen dieser Präparate mit Kalzium bestimmt man die Zeil, die bis zum Gerinnen abläuft.

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind im folgenden angegeben:

Thrombin-Zeit
(verdünnt)

Vergleich

Präparat enthaltend 2000 u
des Produktes A

Präparat enthaltend 2000 u
des Produktes B

24 Sekunden

25 Sekunden

Quick-Wert

Vergleich

Präparat enthaltend 2000 u
des Produktes A

Präparat enthaltend 2000 u
des Produktes B

17 Sekunden
17,5 Sekunden

17 Sekunden

Aus diesen Ergebnissen ist festzustellen, daß die erfindungsgemäßen Polymerisaiprodukle nicht auf die Stufen der Thrombin- und Fibrin-Bildung einwirken.

c) Wirkung auf die Thromboplastin-Bildung:

Man verwendet nicht-aktivicrte Plasmapräparate und untersucht die Gerinnung dieser Präparate thrombelastographisch, indem man die Aktivität der für die Gerinnung verantwortlichen Faktoren oder der Kontaktfaktoren in Gegenwart oder in Abwesenheit der erfindungsgemäßen Polymerisatprodukte auslöst.

Die Messungen wurden mit Hilfe der im folgenden angegebenen Präparate durchgeführt:

Die Gerinnungszeiten r+k, die an verschiedenen Präparaten ermittelt wurden, sind in der folgenden Tabelle VII zusammengefaßt:

Tabelle VII

Vergleich a
(nicht aktiviert)

Vergleich b
(aktiviert)

24
18 Präparat c
Präparat d
Präparat e
Präparat f

54 57 38 45

Diese Ergebnisse zeigen, daß die eriindungsgemäßen Polymerisatprodukte keinen Einfluß auf die Thrombin-Zeit ausüben.

b) Wirkung auf die Thrombin- und Fibrin-Bildung:

Man untersucht eine gegebenenfalls vorliegende Wirkung der Polymerisationsprodukte A und B auf die zwei Stufen des Gerinnungsverfahrens, indem man den Quick-Wert der oben angegebenen Präparate bestimmt.

Man vermischt die Citrat- oder Oxalat-Präparate bei 37°C mit einer kalziumhaltigen Thromboplastinlösung und bestimmt die Zeit (Quick-Wert), der bis zur 2> Ausbildung des ersten Fibrinfädchens abläuft.

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind im folgenden angegeben:

30

¹⁽¹ a = Vergleichspräparat, das aus einem

mit Silikon behandelten Glasröhrchen entnommen wurde und 1 ml natives blutplättchenreiches Plasma enthielt;

b = Vergleichspräparat identisch mit dem zuvor genannten, das aus einem Röhrchen aus normalem Glas entnommen wurde und das Ca⁺⁺-Ionen enthält, die die »Kontakt«-I-aktoren des Plasmas aktivieren; c und d = Plasmapräparale, die aus rni! Silikon behandelten Glasröhrchen entnommen waren und die 100 -.· des Produktes A bzw. 100-,-des Produktes B enthalten;

e und f = Plasmapräparate, die aus normalen Glasröhrchen entnommen worden waren und die mil 100 ν des Produktes A bzw. 100 '-.· des Produktes B versetzt waren.

Vergleichspräparat a, das aus 1 ml Plasma besteht, das in einem mit Silikon behandelten Glas enthalten ist. so daß das Präparat nicht aktiviert wird, Vergleichspräparat b mit identischer Zusammensetzung wie das Vergleichspräparat a, das jedoch in einem normalen Glasrohr enthalten ist. so daß die Kontaktfaktoren aktiviert werden,

Präparate c, d, e und f, die in wasserabstoßenden Glasröhrchen (c und d) und nicht-wasserabstoßenden Glasröhrchen (e und f) enthalten sind und wobei die Präparate c und e in 100 )· des Produktes A pro ml und die Präparate d und f mit 100 γ des Produktes B pro ml versetzt sind.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Polymerisatprodukte die Aktivierung der Faktoren verlangsamen, die für die Gerinnung verantwortlich sind und deren Wirkung abschwächen, wenn sie bereits aktiviert sind. Sie wirken daher ebensogut vor wie nach der Einwirkung der Kal/iumioncn in der Stufe der Thromboplastinbildung.

B) Inhibierende Eigenschaften des Kunitz-

Polyinhibitors hinsichtlich Pankreas-Kallikicin

und Plasmin

Die Untersuchungen zur Ermittlung dieser Eigenschaften wurden mit Hilfe einer Fraktion des Kunitz-Polyinhibitors mit einem miltelren Molekulargewicht von 14 000 durchgeführt, die einen Titer von 44 000 u/mg aufwies. Diese Fraktion besteht überwiegend aus Dimeren und ist aufgrund dieser Tatsache ein analoges Produkt zu der zuvor erwähnten Fraktion B.

Die gleichen Untersuchungen wurden mil dem nichl-polymerisierten Kiinitz-Inhibilor unter identischen Unlersuchungsbcdingungen wiederholt.

Bei der Untersuchung der fraglichen Wirkungen wurden die folgenden Analysenverfahren verwandt:

a) Bestimmung von Trypsin

Tabelle VIII

Die Bestimmung erfolgt auf einem synthetischen Substrat, bestehend aus Benzoyl-L-aginin-Äthylester mit Hilfe eines titrimetischen Verfahrens unter Anwen- i dung eines pH-Meßgerätes. 20 μΜοΙ des obenerwähnten Esters werden in 0,1 ml Wasser gelöst, worauf man 0,9 ml eines Boratpuffers (0.0015 in), der Kalziumchlorid (CaCI>) in einer Konzentralion von 0,02 m enthält, hinzugibt und die Mischung mit Chlorwasserstoffsäure in auf einen pH-Wert von 0,8 bringt.

Man hält das Medium unter einen Stickstoffstrom bei 25 C. Dann gibt man 10μg Trypsin, gelöst in 0,001 n Chlorwasserstoffsäure, hinzu. Man titriert die freigesetzte Acidität bei einem pH-Wert von 8,0 mit Hilfe von ι "> 0,01 η Natriumhydroxydlösung.

Die inhibierende Wirkung des Inhibitor? ergibt sich als Verminderung der Menge des hydrolysierten Substrats {bestimmt bei 37" C nach einer Inkubationszeit von 3 Minuten) im Vergleich zu derjenigen, die man in .'» Gegenwart gleicher Trypsinmengen jedoch in Abwesenheit des Inhibitors erzielt.

b) Bestimmung von Kallikrein

Die Bestimmung erfolgt unter den gleichen Bedingun- r> gen wie den oben angegebenen in Gegenwart von 5 ng Kallikrein, gelöst in einem Puffer z. B. 0,05 m Tris-(hydroxymeihylj-aminomelhan (der im folgenden als »Tris« bezeichnet wird) und der Natriumchlorid in einer Konzentralion von 0,25 in enthält und der mit so Essigsäure auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht wurde.

Wie zuvor ergibt sich die Inhibierung aus dem Unterschied der Aktivität des Kallikreins als solchem und der des Kallikreins, das in Gegenwart des Inhibitors (während 3 Minuten bei 37 C) inkubiert wurde. s">

c) Bestimmung des Plasmins

Man verdünnt eine Slandardplasmin-Lösung, die lOuCTA/ml enthält, zehnmal mit einem Tris-Puffer (0,06 m), der 0,09 m NaCl einhält und einen pH-Wert in von 7,5 aufweist.

Die Volumen von 0,4 bzw. 0,8 ml dieser verdünnten Lösung werden mit den oben erwähnten Tris/NaCl-Puffer auf 2,5 ml aufgefüllt. Zu diesen verdünnten Lösungen gibt man 2,5 ml einer Kaseinlösung, die 1,4 g Kasein in π 100 ml Tris/NaCl-Puffer enthält. Man rührt und inkubiert bei 37°C.

Nach Zeitintervallen von 2 Minuten und 32 Minuten werden aliquote Anteile von 2 ml aus jedem Röhrchen entnommen und in 3 ml 0,5 m Perchlorsäure einge- w bracht. Man rührt und zentrifugiert den gebildeten Niederschlag während 15 Minuten bei +4°Cab.

Man bestimmt dann die Absorption der überstehenden Flüssigkeiten bei 275 mm, indem man entsprechende Flüssigkeiten als Vergleichsproben verwendet, die man 2 MinuteYi nach der Inkubierung entnommen hat.

Definitionsgemäß setzt 1 uCTA Plasmin 0,1 Mikroäquivalente Tyrosin pro Minute frei. Die Inhibierung des Plasmins ergibt sich durch die Reduktion der Aktivität des Plasmins in Gegenwart des Inhibitors im Vergleich wi zu der Aktivität, die sich ergibt, wenn man das Plasmin als solches (während 3 Minuten bei 37°C) inkubiert.

In der folgenden Tabelle VIII sind die Ergebnisse dieser Untersuchungen zusammengefaßt, wobei die inhibierende Wirkung des Polymerisatproduktes hin- ir> sichtlich Trypsin, Pancreas-Kallikrein und Plasmin als Prozentsatz der inhibierenden Wirkung des monomeren Kunitz-Inhibitors angegeben sind.

Trypsin Pankreas-Kallikrein

Plasmin

Polymerisatprodukt 81,5% 75% 52,1%

Kunitz-Inhibitor 100% 100% 100%

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß das Polymerisatprodukt im Vergleich zu dem Kunitz-Inhibitor geringere Antitrypsin-, Antikallikrein- und Antiplasmin-Wirkungen zeigt. Es ist auch festzustellen, daß die Aniiplasmin-Wirkung mit der Polymerisation schneller abnimmt als die beiden anderen Wirkungen, die unter Berücksichtigung der Fehlergrenzen in gleichem Maße abnehmen.

C) Anaigetische Wirkung des
Kunitz- Polyinhibitors

Es ist festzustellen, daß der Kunitz- Poly inhibitor auch eine beträchtliche analgeiische Wirkung zeigt, was sich mit Hilfe des »Kontraktionstests mit Essigsäure« zeigen läßt.

Man verabreicht Mäusen auf intrapritonealcni Wege cine Essigsäurelösung (6%o) in einer 10"/oigen Gummilösung. Diese Substanz führt zu Konvulsionen und es wird die Anzahl der hervorgerufenen Konvulsionen gezählt.

Der Kunitz-Polyinhibitor wird auf intraperitonealem Wege 60 Minuten vor der Injizicrung der Essigsäure verabreicht. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Verminderung der Anzahl der Konvulsionen an 15 behandelten Mausen im Vergleich zu J Vergleichsmäusen angegeben, die nicht mit Kunitz-Polyinhibitor behandelt wurden.

Im folgenden sind die mit dem Kunitz-Polyinhibitor erhaltenen Ergebnisse angeführt:

Anzahl der injizierten
Einheiten

"/» der Verminderung

50000 ulP/kg
25 00OuI P/kg

-22%
-15%

Die bei diesem Verfahren beobachtete anaigetische Wirkung ist eine Antibradykinin-Wirkung.

D) Untersuchung der Verträglichkeit
des Kunitz-Polyinhibitors

a) DL 50 bestimmt durch intravenöseVerabreichung an Mäuse

Die Untersuchungen der akuten Toxizität wurden mit Kunitz-Polyinhibitor durchgeführt, dessen Molekulargewicht etwa 14 000 betrug, d. h. mit einem Polymerisatprodukt, das analog zu dem der Fraktion 3 des Beispiels 1 war. Dieses Polymerisat zeigt, wenn es auf intravenösem Wege an Mäuse verabreicht wird, eine DL 50 die höher liegt als 8 000 000 Einheiten pro kg Körpergewicht.

b) Verträglichkeit bei intravenöser
Verabreichung an Hunde

Die Untersuchung erfolgte an Beagles in einem Aller Min etwa 8 Monaten und einem Gewicht von 15 bis 18 kg. Den Hunden wurde in betäubtem Zustand (Pentothai) Kunitz.-Polyinhibitor-Dosen von 200 000 bis

900 000 Einheiten/kg in einer oder mehreren Injektionen verabreicht

Diese Injektionen führten zu keinen chemisch signifikanten Veränderungen des alveolären Kohlendioxyddruckes, der Atemfrequenz und des Atemvolunisns, der Herzfrequenz sowie der Rektaltemperatur. Die erste Injektion führte bei gewisser' Hunden zu einer Absenkung des Arteriendrucks, was jedoch durch vorhergehende Behandlung mit Phenergan und Atropin verhindert werden kann.

Die Untersuchung der biologischen und hämatologischen Parameter zeigt unter den oben angegeben Untersuchungsbedingungen die hypokoakulierende Wirkung des Kunitz-Polyinhibitors, ohne signifikante Wirkungen auf die Anzahl der Thrombocyten, selbst bei denjenigen Hunden, bei denen sich eine gewisse Absenkung des Arteriendruckes ergab.

c) Untersuchung der Wirkungen auf das
zentrale Nervensystem von Kanincuen

Diese Untersuchung wurde an 6 männlichen Kaninchen mit einem durchschnittlichen Gewicht von 2,5 kg durchgeführt.

Die Tiere wurden an einem ruhigen Ort in Käfigen gehalten und es wurde die kortikale Reaktivität mit Hilfe von Geräuschreizungen und schwachen Schmerzreizungen (Reizung der Nervenenden der Haut des Rückens mit Hilfe einer Kocher-Pinzette) untersucht.

Die intravenöse Injektion von JOO 000 u/kg des Kiinitz-Polyinhibitors führten bei den an diesen Kaninchen durchgeführten Elektrokorlikogramn;en und Elektrokardiogrammen zu keinen signifikanten Veränderungen.

Diese Untersuchungen zeigen, daß das Polymerisatprodukt des Kunitz-Inhibitors die ausgezeichnete Vertraglichkeit des Monomeren beibehalten hat.

Die Erfindung ergibt aufgrund der löslichen Kunitz-Polyinhibitoren einen merklichen Fortschritt insbesot: dere im Bereich der Therapie der Schockzustände im Verlauf derer sich unter Einhaltung unterschiedlicher Zeitabläufe vasomotorische Störungen und eine Hyper's koakulation ergeben, die insbesondere mit Anoxie-Ischäiiie-Phänomenen und irreversible Veränderungen dieser Zustände ergeben. Die Polymerisatprodukte sind, obwohl sie alle Eigenschaften des monomeren Kunitzinhibitors beibehalten, aufgrund der Tatsache, daß ihre

ι« Antiplasminwirkung geringer ist, daß die Antikallikran-Aktivität im wesentlichen gleich bleibt und die hypokoagulierendc Wirkung verstärkt ist. bei der Verwendung weniger kritisch.

Dieser Fortschritt ist um so stärker /u bewerten.

Ij wenn man berücksichtigt, daß die traumatischen oder ■chirurgischen Schocks ein sofortiges Handeln verlangen, das den Ärzten kaum Zeit läßt, die Dosierungen und Verträglichkeiten zu ermitteln, ohne die die Verwendung des monomeren Kunitz-Inhibitors zu Gefährdungen führen kann.

Die Verabreichung der erfindungsgemaßeti Arzneimittel wird aufgrund ihrer starken Löslichkeil in wäßrigem Medium unterstützt. Sie kann daher direkt durch intravenöse Injektion oder durch Perfusion einer

-'"> Lösung des Kuniiz-Polyinhibitors in einem flüssigen pyrogenfreien Medium, das für diese Verabreichung geeignet ist, insbesondere mit Hilfe einer isotonischen Salzlösung oder Glukoselösung erfolgen. Die tägliche Doseriung kann sich zwischen etwa 4 Millionen und

κι etwa 30 Millionen Einheiten des Wirkstoffs erstrecken.

Hinsichtlich ties Kunitz-lnhibiiors sei auf das von Paul D. Boy er herausgegebene Werk »The Enzymes« (Band III, 3 Auflage, Academic Press 1971) insbesondere auf das von Michael Lafkowski und Toben W.

r> Sealock verfaßte Kapitel »Protein, Proteinase and ilnhibitor-Molecular-Aspects« (Seite 375-47 J) verwiesen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Polymerisations- oder Kondensationsprodukte des Kunitz-Inhibitors. ϊ

2. Produkt gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mehrere Kunitz-Inhibitor-Moleküle enthält, die durch Kupplung mit einem Kupplungsmittel miteinander verbunden sind.

3. Produkt gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn- n> zeichnet, daß das Kupplungsmittel von Glutaraldehyd abgeleitet ist

4. Produkt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ein so niedriges Molekulargewicht aufweist, daß es löslich ist ι >

5. Produkt gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht etwa 12 -13 000 bis etwa 80 -15 000 beträgt

6. Produkt gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht etwa 12 000 bis >o 14 000 beträgt.

7. Produkt gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht etwa 20 000 beträgt

8. Produkt gemäß Anspruch 6, dadurch gekenn- >> zeichnet, daß das Molekulargewicht etwa 65 000 beträgt.

9. Verfahren zur Herstellung der Polymerisatprodukte des Kunitz-Inhibitors, dadurch gekennzeichnet, daß man den Kunitz-Inhibitor bei Raumtemperatur in Salzlösung mit einem Proteinkupplungsmittel umsetzt, das mehrere funktioneile Gruppen aufweist, die mit denen des Kunitz-Inhibitors reagieren können.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekenn- r> zeichnet, daß des Kupplungsmittel Glutaraldehyd ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einer Pufferlösung durchgeführt wird, deren pH-Wert zwischen 3 und 7 liegt. 4»

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einer Pufferlösung durchgeführt wird, dessen pH-Wert zwischen etwa 3 und etwa 4 liegt und die Konzentration des Glutaraldehyds in dem Medium zwischen etwa 0,1 ■»> und 5% gehalten wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Glutaraldehyd-Konzentration des Mediums zwischen 0,1 und 1% liegt.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 und ίο 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Anfangskonzentration des Kunitz-Inhibitors in dem Medium zwischen etwa 1 und etwa 10% liegt.

15. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff ein Polymerisatprodukt des Kunitz-In- r> hibitors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält.

16. Arzneimittel gemäß Anspruch 15 zur intravenösen Verabreichung oder zur Perfusion, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff ein Produkt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder ein t>o Verfahrensprodukt der Verfahren der Ansprüche 9 bis 14 in einer sterilen und pyrogenfreien isotonischen Salz- oder Glucoselösung enthält.

Die Erfindung betrifft Produkte, die sich bei einer Umwandlung des wohlbekannten Polypeptids ergeben, das den Kunitz-Inhibitor ausmacht (Siehe auch Seite 32, Abs. 4).

Es ist bekannt, daß der Kunitz-inhibitor die Aktivität einer gewissen Anzahl von Enzymen, wie Plasmin, Trypsin, Chymotrypsin, die der Kallikreine, die der Tripeptidasen der Phlyctänflüssigkeit etc. hemmt

Er greift auch in andere Enzymsysteme ein, ohne daß seine Wirkungsweise genauer bekannt ist

Aufgrund der Vielfältigkeit seiner Wirkung gibt es Fälle, bei denen die Anwendung dieses Inhibitors in der Therapie gefährlich wird und eine gewisse Anzahl von biologischen Untersuchungen erfordert, die nur in sehr gut ausgerüsteten Laboratorien durchgeführt werden können. Zum Beispiel kann es unvermeidlich werden, durch Untersuchungen, die in der gängigen Praxis wenig verbreitet sind, sicherzustellen, daß der Inhibitor injiziert werden kann, ohne daß seine anlifibrinolytische Wirkung zu Gefährdungen führt Dies ist insbesondere bei der Pathologie des Schocks der Fall.

Im Verlaufe von Schockzusländen ist immer eine Aktivierung des Koagulationssystems und eine für die Aufrechterhaltung der Fluidität des Blutes erforderliche fibrinoly tische Reaktion zu beobachten. Man unterstützt andererseits und vielleicht ausgehend von der Hyperkoagulation eine Freisetzung von Bradykinien durch Aktivierung des Kallikreinogen/Kallikrein-Systems.

Der Kunitz-Inhibitor wirkt bei diesem Syndrom in verschiedenen Bereichen und seine beträchtliche Antiplasminaktivität ist insbesondere dann nicht erwünscht, wenn die fibrinolytische Wirkung aufrechterhalten werden soll, um Fibrinbildungen zu verhindern, die die Kapillargefäße verstopfen und Ischämiezustände hervorrufen können.

Ziel der Erfindung ist es daher, ein Arzneimittel bereitzustellen, das für gewisse Syndrome u. a. Störungen des Gerinnungs/Lyse-Systems und insbesondere für die Behandlung von Schockzuständen besser geeignet ist.

Das erfindungsgemäße Produkt besteht aus einem Polymeren oder einem Kondensationsprodukt, das mehrere Moleküle des Kunitz-Inhibitors enthält, die gegebenenfalls über Kupplungsgruppen, wie diejenigen, die sich von Glutaraldehyd ableiten, miteinander verbunden sind.

Die so erhaltenen neuen Produkte, die der Einfachheit halber im folgenden »Polymerisationsprodukte des Kunitz-Inhibitors« oder »Kunitz-Polyinhibitoren« bezeichnet werden, finden besonderes Interesse in der Therapie und dabei insbesondere die löslichen Polymerisationsprodukte.

Es ist insbesondere allgemein festzustellen, daß diese Polymerisationsprodukte und insbesondere die löslichen Produkte dieser Art im Vergleich zu dem Kunitz-Inhibitor eine verstärkte hypokoagulierende Wirkung und eine verminderte Antiplasminwirkung entfalten, während die Antikallikrein-Wirkung im wesentlichen äquivalent bleibt

Diese verschiedenen Aktivitäten sind daher bei dem Kunitz-Polyinhibitor in der Weise verändert, daß dieser bei gewissen Behandlungen, insbesondere bei denen die die Pathologie der Schocks betrifft, in günstiger Weise verwendet werden kann. Bei diesen Syndromen führt ii. a. die Verstärkung der antikoagulierenden Wirkung /u einem Arzneimittel von noch größerem Wert, das in der Lage ist, gleichzeitig die Steuerung des Kallikreinogen/Kallikrein-Systems und in gewissem Maße des