DE69329652T2

DE69329652T2 - Auswirkungen von aktinfilamenten auf die struktur und lyse von fribringerinnseln

Info

Publication number: DE69329652T2
Application number: DE69329652T
Authority: DE
Inventors: A. Janmey; A. Lamb; E. Lind; P. Stossel
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 1992-08-14
Filing date: 1993-08-13
Publication date: 2001-06-13
Anticipated expiration: 2013-08-14
Also published as: CA2142121C; EP0655089B1; DK0655089T3; DE69329652D1; WO1994004704A1; ATE197478T1; ES2151517T3; JPH08500488A; PT655089E; US5691160A; EP0655089A1; CA2142121A1; GR3034823T3; EP0655089A4

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft im Allgemeinen therapeutische und diagnostische Verfahren zur Behandlung von Patienten mit Gewebeverletzungen, in denen freies extrazelluläres Aktin mit Blutgerinnseln einhergeht. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der in einem Fibringerinnsel vorhandenen Aktinmenge. Das Verfahren beinhaltet die Quantifizierung in vitro der Aktinmenge im Gerinnsel durch Inkubation des Gerinnsels in vitro mit aktinbindenden Proteinen. Die Erfindung betrifft speziell die Inkubation dieser Gerinnsel in Gegenwart der Plasma-Aktinbindenden Proteine Gelsolin und Vitamin-D- Bindungsprotein. Die Erfindung betrifft zudem Verfahren zur Entfernung von Aktin aus Blutgerinnseln in vivo durch Verabreichen von aktinbindenden Proteinen an Individuen mit Blutgerinnseln.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gewebeverletzung bewirkt die Aktivierung der Gerinnungskaskade, was die Ablagerung von Fibrin hervorruft. Wahrend der Entzündungsereignisse können Moleküle, die sich gewöhnlich nicht im Plasma befinden, in den Extrazellularraum gelangen, so dass die Blutgerinnung potentiell beeinflusst wird. Einige dieser Moleküle können aus der Wirkung zellulärer Proteasen auf normale Plasmabestandteile (z. B. Fibrinogen), der Freisetzung von Granula inflammatorischer Zellen oder der Zerstörung zellulärer Plasmamembranen hervorgehen. Gründliche Untersuchungen über die Auswirkungen von Fibrinogen-Abbauprodukten aufdie Fibringerinnselbildung (Shen et al., J. Biol. Chem. 252 (1977) 6184) haben wichtige Information über die Mechanismen erbracht, durch die Entzündungsereignisse zu Veränderungen im Prozess der Blutgerinnung führen. Moleküle, die die Fibringelbildung und Gerinnselstruktur verändern (Dhall et al., Thromb. Haemost 35 (1976) 737; Carr und Gabriel, J. Lab. Clin. Med. 96 (1980) 985; Gabriel et al., J. Lab. Clin. Med. 101 (1983) 545; Chow et al., Thromb. Res. 29 (1983) 243; Carr et al., J. Lab. Clin. Med. 110 (1987) 747; Kamykowsky et al., Biophys. Chem. JJ3 (1981) 25; Procyk und King, Biopolymers 29 (1990) 559), können eine Rolle bei der Bestimmung der hämostatischen Wirksamkeit von Fibringerinnseln sowie ihrer Fähigkeit zur Vermittlung der fibrinabhängigen Fibrinolyse spielen (Suenson und Petersen, Biochim. Biophys. Acta 870 (1986) 510; Dhall et al., Thrombos. Haemostas. 49 (1983) 42).
Verletzung von Tiergeweben bewirkt die Freisetzung von Aktin in den extrazellulären Raum, einschließlich den Blutstrom. Aktin ist das häufigste Protein in Tierzellen und macht 10-20% des Proteins vieler Zellen mit Zellkern und 30% des Proteins von Muskelzellen aus. Aktinmoleküle binden jeweils ein ATP-Molekül und lagern sich zu langen Filamenten zusammen, wobei ATP zu ADP hydrolysiert wird. Etwa die Hälfte des Nicht- Muskelzellen-Aktins ist zwar F-Aktin (die doppelhelikale stäbchenförmige Aktin- Filamentform, die aus G-Aktinmonomeren aufgebaut wird), jedoch begünstigen die Ionenbedingungen der Extrazellulärflüssigkeiten die Aktinpolymerisation, so dass praktisch sämtliches aus absterbenden Zellen ins Blut abgegebenes Aktin erwartungsgemäß zu Filamenten polymerisiert (Lind et al., Am. Rev. Respir. Dis. 138 (1988) 429-434). In gereinigten Lösungen können die Aktinfilamente in Abwesenheit von filamentverkürzenden Proteinen leicht einige um lang werden. Sollten jedoch einige aus verletzten Zellen freigesetzte Aktinfraktionen irreversibel denaturiert werden oder anderweitig an eines der nachstehend erörterten intrazellulären aktinbindenden Proteine gebunden werden, bleibt dieses Aktin monomer.
Aktin ist in mikromolaren Konzentrationen im Plasma oder Serum von Tieren und Menschen, die eine Vielzahl von Typen von Gewebeverletzungen erleiden, gefunden worden (Smith et al., J. Lab. Clin. Med. 110 (1987) 189; Smith et al., Am. J. Pathol. 130 (1988) 261; Smith et al., Blood 72 (1988) 214; Goldschmidt-Clermont et al., Gastroenterology 94 (1988) 1454; Lee et al., Hepatology 7 (1987) 825; Lee et al., Circ. Shock 28 (1989) 249; Lind et al., Am. Rev. Resp. Dis. 138 (1988) 429). In vitro assembliert dieses globuläre Protein zu stäbchenförmigen Filamenten mit vielen um Länge, und in vivo wechselt es rasch zwischen monomeren und polymeren Formen, ein Prozess, der im Cytoplasma durch eine Reihe von aktinbindenden Proteinen reguliert wird (Stossel et al., Ann. Rev. Cell Biol. I (1985) 353). Aktinfilamente können den Prozess der Fibringerinnselbildung bei Zugabe zu Fibrinogen-Lösungen stören, indem die Diffusion von Fibrin-Protoffbrillen in Bündel sterisch gehindert wird (Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta 841 (1985) 151).
Aufgrund der großen Menge Aktin in Zellen liefert die Freisetzung von Aktin aus sterbenden Zellen hinreichend Aktin, so dass eine signifikante Auswirkung auf die Mikroumgebung erhalten wird, indem die Viskosität der extrazellulären Flüssigkeiten von Plasma vergrößert wird, indem Zellen gefangen werden, durch andere, noch nicht identifizierte toxische Auswirkungen und wie nachstehend erörtert durch Ändern der physikochemischen Eigenschaften von Fibringerinnseln. Die Infusion von extrazellulärem freiem Aktin ist für tierische Gewebe, und insbesondere für Nieren- und kardiopulmonäre Systeme toxisch (Harper et al., Clin. Res. 36 (1988) 625A; Haddad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, (1990) 1381- 1385). Akutes Nierenversagen ist eine Komplikation von Muskelverletzung, und Aktininfusionen in Ratten verursachen transiente Anstiege der BUN- und Kreatinin-Menge, was mit einem Nierenversagen übereinstimmt.
Da überdies jedes extrazelluläre Aktinmolekül in einem Filament mit einem ADP- Molekül verbunden ist, kann das Vorliegen von extrazellulärem Aktin im Blut die Plättchenaggregation auf eine Weise induzieren oder verstärken, die für den Wirt nicht vorteilhaft sein kann (Lind et al., Am. Rev. Respir. Dis. 138 (1988) 429-434; Scarborough et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 100 (1981) 1314-1319).
Es gibt viele Proteine, die natürlich mit Aktin verbunden sind (für einen Überblick über aktinbindende Proteine, siehe Stossel et al., Ann. Rev. Cell Biol. I (1985) 353-402; Pollard et al., Ann. Rev. Biochem. 55 (1986) 987-1035). Zwei Proteine, Gelsolin (ebenfalls als "Brevin" und aktindepolymerisierender Faktor" bezeichnet) und Vitamin-D-bindendes Protein (ebenfalls als Gc-Globulin (DBP) bezeichnet) sind wahrscheinlich primär für die Bindung von extrazellulärem Aktin verantwortlich (Janmey et al., Blood 70 (1987) 529- 530).
Säugerblutplasma enthält mikromolare Konzentrationen dieser beiden Proteine, die Aktin mit hoher Affinität binden (Janmey und Lind, Blood 7 0 (1987) 524). Hochaffine aktinbindende Proteine binden Aktin mit einem Kd-Wert von weniger als 10'8. Sowohl Gelsolin als auch DBP binden an Aktin im Serum und haben Aktin-Depolymerisationsaktivität. DBP bindet vorzugsweise an monomeres Aktin, wohingegen Gelsolin vorzugsweise Aktinfilamente bindet.
WO-A-9115770 offenbart ein Verfahren zur Senkung der Konzentration an freiem Aktin im Plasma von Tieren, umfassend die Verabreichung von aktinbindenden Proteinen, bspw. Gelsolin. Janmey et al. (Biochim. Biophys. Acta 841 (2) (1985) 151-158) berichten, dass Gelsolin Aktinfilamente spaltet, wodurch der Einbau von Aktin in Fibringerinnsel gehemmt wird.
Gelsolin ist ein multifunktionelles aktinbindendes Protein, das aus Säuger- Cytoplasma und extrazellulären Flüssigkeiten erhalten wird. Plasma-Gelsolin unterscheidet sich von zellulärem Gelsolin nur durch zusätzliche 25 Aminosäuren am Aminoterminus des Moleküls, und beide Gelsoline sind das Produkt eines einzigen Gens. Plasma-Gelsolin hat drei aktinbindende Stellen und bindet mit hoher Affinität an entweder G- oder F-Aktin.
Plasma-Gelsolin bindet ein zweites Aktinmolekül mit einer höheren Affinität als es ein erstes Aktinmolekül bindet, und bildet somit vorzugsweise 2 : 1-Komplexe statt 1 : 1- Komplexe und bindet eher Filamente als Monomere. Bei Zugabe zu F-Aktin spaltet das Plasma-Gelsolin das Filament auf nicht-proteolytische Weise und bleibt an ein Ende des neu gebildeten Filamentes gebunden. Sind freie Gelsolinmoleküle zugegen, spalten sie das Aktinfilament erfolgreich, bis nur 2 : 1-Aktin-Gelsolin-Komplexe zugegen sind, wodurch das Filament rasch depolymerisiert wird.
Freie und (mit Aktin) komplexierte Gelsolin-Moleküle unterscheiden sich hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften. Freies Gelsolin kann zwar Aktinfilamente spalten, Aktin-Gelsolin-Komplexe können dies jedoch nicht.
Die Hauptfunktion von Gelsolin im Plasma ist die Spaltung von Aktinfilamenten. Ist Gelsolin gegenüber Aktin im Überschuss vorhanden, ergeben sich nur Gelsolin-Aktin- Komplexe; Ist Aktin in starkem Überschuss vorhanden, gibt es freie Aktin-Oligomere und Gelsolin-Aktin-Komplexe. Die Aktinspaltung erfolgt durch nicht-proteolytische Spaltung der nicht-kovalenten Bindung zwischen benachbarten Aktinmolekülen (Untereinheiten). Die Spaltungswirkung von Gelsolin wird durch mikromolare Mengen Ca²&spplus;&spplus; aktiviert, und es hat sich herausgestellt, dass sie durch Phosphatidylinositolbisphosphat (PIP&sub2;) und Phosphatidylinositolmonophosphat (PIP) gehemmt wird. Da extrazelluläre Ca²&spplus;&spplus;-Konzentrationen in millimolaren Mengen vorliegen, und extrazelluläre Flüssigkeiten gewöhnlich kein PIP oder PIP&sub2; in einer Gelsolin-hemmenden Form enthalten, ist das Plasma-Gelsolin in extrazellulären Flüssigkeiten konstitutiv aktiv.
Vitamin-D-bindendes Protein (DBP) hat dagegen eine einzelne Aktinbindungsstelle und bindet nur an monomeres Aktin (Van Baelin et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2270; Haddad, J. G., Arch. Biochem. Biophys 213 (1982) 538). Sowohl Plasma-Gelsolin als auch DBP dienen der Klärung von Aktin aus dem Kreislauf (Lind et al., J. Clin. Invest. 78 (1986) 736; Harper et al., J. Clin. Invest. 79 (1987) 1365; Goldschmidt-Clermont et al., J. Clin. Invest. 8 J (1988) 1519). Es ist vor kurzem gezeigt worden, dass DBP mikrovaskuläre Thrombosen, die durch Injektion von monomerem Aktin in Versuchstiere hervorgerufen werden, verhindert (Haddad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1381). Plasma-Gelsolin und DBP stellen somit ein Verteidigungssystem dar, das den Wirt gegen schädliche Auswirkungen von in den Kreislauf abgegebenem Aktin schützen soll.
Es ist vorgeschlagen worden, dass die Bindung von extrazellulärem Aktin an Gelsolin oder DBP vor F-Aktin-Bildung im Kreislauf schützt und derjenige Mechanismus sein kann, durch den Aktin zur Entfernung aus dem Blutstrom anvisiert wird (Lind et al., J. Clin. Invest. 78 (1986) 736-742; Sanger et al., Clin. Res. 36 (1988) 625A). Bekanntlich werden zirkulierende Aktin-Gelsolin-Komplexe nach einer ölsäureinduzierten Lungenverletzung in Kaninchen und Katzen (Smith et al., Am. J. Path. 130 (1988) 261-267) und bei phenylhydrazininduzierter Hämolyse bei Kaninchen (Smith et al., Blood 72 (1988) 214-218) gefunden. Im klinischen Rahmen sind Gelsolin-Mengen bei Patienten mit akuter respiratorischer Insuffizienz (ARDS) (Lind et al., Am. Rev. Respir. Dis. 138 (1988) 429-434) und im Plasma von Patienten mit einer akuten Falciparum-Malaria-Infektion gesenkt (Smith et al., Blood 72 (1988) 214-218), und im Blut dieser Patienten sind Gelsolin-Aktin-Komplexe nachweisbar. Zudem wurden Komplexe von Aktin mit DBP im Plasma von Patienten mit fulminanter Lebernekrose beobachtet (Young et al., J. Lab. Clin. Med. 110 (1987) 83). Man hat auch vorgeschlagen, dass intravaskuläre Filamentbildung und Endothelverletzung nachgewiesen werden kann, sobald die Fähigkeit von Plasmaproteinen, an extrazelluläres freies Aktin zu binden, überschritten wird (Harper et al., Clin. Res. 36 (1988) 625A; Haddad et al., Proc. Natl. Acad. Sci 87 (1990) 1381-1389).
Gelsolin wurde cloniert (Kwiatkowski et al., Nature 323 (1986) 455-458; Kwiatkowski et al., J. Cell Biol. 106 (1988) 375-384), und Fragmente des nativen Proteins, welche die Fähigkeit zur Aktinbindung beibehalten, wurden identifiziert (Bryan, J., J. Cell Biol. 106 (1988) 1553-1562; Yin et al., J. Cell. Biol. 107 (1988) 465a, Übers. Nr. 2616; Kwiatkowski et al., J. Cell. Biol. 108 (1989) 1717-1726; Way et al., J. Cell Biol. 109 (1989) 593-605). DBP ist ebenfalls cloniert worden (Cooke et al., J. Clin. Invest. 76 (1985) 2420-2424; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7994-7998).
Hämostase hängt von einem Ausgleich zwischen Bildung und Auflösung von Gerinnseln, die aus Fibrin-Netzwerken und verschiedenen Anteilen anderer Plasmaproteine und Blutzellen zusammengesetzt sind, ab. Diese Netzwerke bilden sich durch Polymerisation von Fibrin-Monomeren in Protoffbrillen, und die nachfolgende laterale Vereinigung von Protoffbrillen zu Bündeln, die in vivo in einem komplexen (und potentiell variablen) Gemisch anderer Proteine stattfindet. Da die Fibringerinnselbildung gegenüber den Auswirkungen von Makromolekülen, die die Diffusion der wachsenden Polymerstränge behindern, empfindlich ist, verändert eine Reihe physiologisch wichtiger Moleküle, wie IgG, Fibronektin, Albumin, Glycosaminoglycanen, usw. (Carr and Gabriel, J. Lab. Clin. Med. 96 (1980) 985; Gabriel et al., J. Lab. Clin. Med. 101 (1983) 545; Carr et al., J. Lab. Clin. Med. 110 (1987) 747; Carr et al., J. Lab. Clin. Med. 107 (1986) 199; Carr et al., Thromb. Res. 45 (1987) 539; Carr et al., Biochemistry 28 (1989) 1384) die Struktur von Fibringelen. Viele dieser Substanzen sind normale Plasmabestandteile und können teilweise die beobachteten Unterschiede zwischen Plasmagerinnseln und den aus reinem Fibrinogen gebildeten erklären. Untersuchungen dieser Wirkungen auf Fibringerinnsel haben Mechanismen nahegelegt, durch die Entzündungsereignisse Veränderungen im Prozess der Blutgerinnung bewirken (Carr, M. E., Thromb. Haemost. 59 (1988) 535).
Gerinnsel, die sich an Stellen von Gewebeverletzung ausbilden, unterscheiden sich jedoch wahrscheinlich von solchen, die aus normalem Plasma erzeugt werden, und können Proteine, die aus Blutplättchen, weißen Zellen, Endothelzellen oder anderen Typen verletzter Zellen freigesetzt werden, sowie Akutphase-Proteine enthalten. Ein Großteil der vorangegangenen Untersuchung von Neigungen zu Blutung und Thrombose, welche in Patienten auftreten, die an unterschiedlichen Formen von Gewebeverletzung leiden, hat sich zwar auf die Dysregulation der Gerinnungs- und Fibrinolysesysteme konzentriert, die allgemein als disseminierte intravaskuläre Koagulation bekannt ist, jedoch wurde der Struktur und der Funktion der in diesen Patienten gebildeten Gerinnsel wenig Aufmerksamkeit geschenkt, die auf klinisch relevante Weisen verändert werden könnten. Fibringerinnsel können aufgrund von Konformationsänderungen bspw. anfälliger gegen Zerstörung durch mechanische Kräfte sein, unabhängig davon, ob sie natürlich in der Gefäßverästelung auftritt oder durch medizinische Geräte ausgeübt wird, wie Membranoxygenatoren oder mechanische Ventilatoren. Alternativ können Veränderungen der Gerinnselstruktur ihre Empfindlichkeit gegenüber dem fibrinolytischen Proteinplasmin beeinflussen, was sie gegenüber der Plasmin-Wirkung beständig macht, und zwar auf analoge Weise, wie für einen Patienten mit kongenitaler Dysfibrinogenämie beschrieben (Carrell et al., Blood 62 (1983) 439). Die Möglichkeit, dass Aktin und möglicherweise andere intrazelluläre Proteine, die während eines Gewebetraumas freigesetzt werden, diese Wirkungen hervorrufen, wird durch den Befund unterstützt, dass aus Blutplättchen freigesetztes Material sowohl die Struktur als auch die Lyse von Fibringerinnseln in vitro verändert (Dhall et al., Thrombos Haemostas 49 (1983) 42).
Aktin beeinträchtigt bekanntlich den normalen Ablauf von Blutgerinnungs- und Fibrinolyseereignissen. Neuere Befunde hinsichtlich der Wechselwirkung von Aktin mit Fibrinolyseproteinen zeigen, dass Aktin die Struktur und Funktion von Fibringel beeinträchtigen kann. Aktin kann bei Zugabe zu Lösungen mit Glu-Plasminogen und t-PA die Plasminbildung fördern (Lind und Smith, J. Biol. Chem. 266 (1991) 17673). Werden aktinhaltige Gerinnsel in einem Lysebad mit Plasminogen und t-PA untergebracht, wird jedoch die Gerinnsel-Lyse gehemmt. Experimente mit gereinigten Proteinen legen zwar nahe, dass Aktin ein nicht-kompetitiver Plasmin-Inhibitor ist (Lind und Smith, J. Biol. Chem. 266 (1991) 5273), eine Wirkung von Aktin auf die Fibringerinnselstruktur kann jedoch ebenfalls einige seiner inhibitorischen Wirkungen auf die Gerinnsel-Lyse erklären.
Zuvor wurde gezeigt, dass Aktin mit Fibrin interagiert (Laki und Muszbek, Biochim. Biophys. Acta 371 (1974) 519 und kann durch die Wirkung des Faktors XIIIa in vitro damit vernetzt werden (Muy und Ganguly, Am. J. Physiol. 233 (1977) H346). Es ist beschrieben worden, dass Aktinfilamente die Fibringerinnselstruktur verändern, was die Bildung feiner, weniger trüber Gerinnsel hervorruft. Die Zugabe von Gelsolin, einem Protein, das Aktinfilamente verkürzt, hebt diese Wirkung auf, was zeigt, dass Aktinfilamente sich mit Fibrinfibrillen verdrillen, so dass ihre laterale Verknüpfung behindert wird (Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta 841(1985) 151.
Die Rheologie von Fibringerinnseln ist somit ein wichtiger Aspekt für ihr physiologisches Funktionieren. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung der Wirkungen von Aktin auf die Fibringerinnsel mit mechanischen Eigenschaften.
Ein Test, der zur Bestimmung der Menge an Aktin in Fibringerinnseln in vivo verwendet werden kann, insbesondere wenn eine starke Gewebeverletzung erfolgt ist, ist von klinischem Wert. Ein solches Verfahren kann zur diagnostischen Bestimmung therapeutischer Dosierungsschemata verwendet werden, die nötig sind, um der Wirkung von freiem extrazellulärem Aktin in verletzten Patienten entgegen zu wirken. Ein Behandlungsschema, das Aktin aus einem aktinhaltigen Gerinnsel entfernt, ist ebenfalls von therapeutischer Bedeutung hinsichtlich der Wiederherstellung der normalen viskoelastischen Eigenschaften der Gerinnsel in vivo.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1. Wirkung von F-Aktin auf die Fibrin-Rheologie. Anstieg des dynamischen Speichermoduls (G1) nach Zugabe von Thrombin zu Fibrinogen, gemessen durch oszillatorische Scherdeformationen von 2% Dehnungsamplitude und Winkelfrequenz von 10 RAD/sec (1,6 Hz). Die Fibrinogen-Konzentration betrug 2,0 mg/ml, und die Aktin-Konzentration in mg/ml war gleich 0 (offene Kreise); 0,2 (offene Dreiecke); 0,4 (ausgefüllte Dreiecke); und 1,0 (ausgefüllte Kreise). Sämtliche Lösungen enthielten 150 mM NaCl, 2,2 mM CaCl&sub2;, 150 uM ATP, 1,9 mM MgCl&sub2;, pH-Wert 7,4. G-Aktin wurde zu Fibrinogen gegeben, und 0,1 NIH-Units/ml Thrombin wurden 10 sec später zugegeben.
Fig. 2. Aufhebung der Streckhärtung durch F-Aktin in Fibringelen. Das Schermodul von Fibringelen mit verschiedenen Konzentrationen F-Aktin bei den gezeigten Konzentrationen, die über einen Bereich von Dehnungen bei einer konstanten Winkelfrequenz von 10 Rad/sec (1,6 Hz) gemessen wurden. Die Reaktionsbedingungen und die Bedeutungen der Symbole sind in der Legende zu Fig. 1 angegeben.
Fig. 3. Verkürzung von F-Aktin durch Gelsolin kehrt seine Wirkung aufdie Streckhärtung und Hysterese von Fibrin um. Das Schermodul G' ist für die Messungen bei 10 Rad/sec über einen Dehnungsamplituden-Bereich, ausgehend von 1% und ansteigend auf 37% (A) oder 30% (B und C) (offene Kreise), gezeigt. Nach der Deformation bei der maximalen Dehnungsamplitude wurden die Messungen von G' bei allmählich sinkenden maximalen Dehnungsamplituden wiederholt, um die Erholung von Proben nach der Deformation (ausgefüllte Kreise) zu gewährleisten. Die drei Schaubilder zeigen die Ergebnisse für 2 mg/ml Fibrin allein (A); Fibrin plus 0,2 mg/ml F-Aktin (B) und Fibrin plus Aktin- Oligomeren (3 : 1 Aktin:Gelsolin-Komplexe) (C). Die übrigen Bedingungen sind in der Legende zu Fig. 1 angegeben.
Fig. 4. Bindung von Aktin-Filamenten und Komplexen an Fibringele. Verschiedene Mengen Rhodamin-markiertes F-Aktin allein (offene Kreise) oder Aktin, das in Gegenwart von DBP (ausgefüllte Kreise) oder Gelsolin (Dreiecke) polymerisierten, wurden zu Fibrinogen (2 mg/ml; 6 uM) in T7 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH-Wert 7,4) vor der Gerinnselbildung durch Zugabe von 1,7 NIH-Units/ml Thrombin gegeben. Das Molverhältnis von DBP zu Aktin betrug 2 : 1, und das Molverhältnis von Gelsolin zu Aktin war entweder 1 : 2 (ausgefüllte Dreiecke) oder 1 : 12 (offene Dreiecke). Das gebundene Aktin wurde durch Aufspulen des unlöslichen Gerinnsels auf eine Glaspipette aus der Lösung entfernt, und die Menge des an das Gerinnsel gebundenen Aktins wurde aus dem Untrerschied zwischen der Fluoreszenz der Probe vor und nach der Entfernung des Gerinnsels wie im Text beschrieben gemessen.
Fig. 5. Wirkung von Ca2+ und Aktin-Filamentlänge auf die Bindung von Aktin an Fibrin. Aktin wurde mit verschiedenen Gelsolin-Molverhältnissen polymerisiert, um Filamente mit durchschnittlicher Länge von 34 nm bis 2,7 um zu erzeugen. 6 uM des polymerisierten Aktins wurden mit 6 uM Fibrinogen in Lösungen mit 100 mM NaCl und 50 mM Tris-Cl, pH-Wert 7,4, entweder mit (ausgefüllte Kreise) oder ohne (offene Kreise) 3 mM CaCl&sub2; gemischt, und das an Fibrin gebundene Aktin nach Zugabe von 1,7 NIH-Units/ml Thrombin wurde wie im Text beschrieben gemessen.
Fig. 6. Konfokale Fluoreszenz- (a, c, e, g und h) und Phasenkontrastbilder (b, d und f) aktinhaltiger Fibringerinnsel. Die Zugabe von Rhodamin-markiertem F-Aktin zu Fibrinogen vor der Thrombin-induzierten Gerinnselbildung ergab fluoreszenzmarkierte Filamente (Schaubild a). Das entsprechende Phasenkontrastbild (Schaubild b) zeigt, dass sich die Fluoreszenz von markiertem Aktin an der gleichen Stelle wie die Fibrin-Stränge befindet. Die Inkubation von Rhodamin-Aktin mit Gelsolin (Schaubilder c und d) vor der Gerinnselbildung ergab eine geringere Fluoreszenzmarkierung des Fibrin-Netzwerks. In Abwesenheit von Thrombin können die fluoreszierenden Aktinfilamente nicht mit dem konfokalen Mikroskop aufgelöst werden (Schaubild e). Das entsprechende Phasenkontrastbild (Schaubild f) zeigt, dass kein Fibringerinnsel entstanden ist. Die Hemmung der Aktinpolymerisation durch DBP ergab eine reduzierte Fluoreszenzmarkierung der Fibrinstränge (Schaubild g). Die Spezifität der Wechselwirkung von Aktin mit Fibrin wird in Schaubild h gezeigt, welches das Fehlen von fluoreszierendem Fibrin zeigt, wenn Fluorescein-Avidin vor der Thrombin-induzierten Gerinnselbildung zu Fibrinogen gegeben wurde (Schaubild h). Die Schaubilder c und g entsprechen Daten, welche die schwächere Bindung von mit Gelsolin und DBP komplexierten Aktinmonomeren an Fibringele zeigt (siehe Fig. 4 und 5).Der Maßstab in Schaubild h = 9 um gilt für alle Schaubilder.
Fig. 7. Wirkung der Aktinfilament-Länge auf die Fibrin-Rheologie während der Gerinnsel-Lyse mit Plasmin. Anstieg und Absinken des in einem Torsionspendel gemessenen dynamischen Schermoduls (G') von Fibrin allein (offene Kreise) oder Fibrin mit Aktin (ausgefüllte Kreise) als Funktion der Zeit. Die Fibrinogenkonzentration betrug 3 mg/ml, und die F-Aktin-Konzentration betrug 0,25 mg/ml. Die Schaubilder A und B zeigen Ergebnissse bei Fehlen bzw. Vorhandensein von Gelsolin bei einem 1 : 12-Molverhaltnis in Bezug auf Aktin. Sämtliche Lösungen enthalten 140 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl, 2 mM MgCl&sub2;, 2,5 mM CaCl&sub2;, pH-Wert 7,4 mit 0,4 NIH-Units/ml Thrombin und 0,3 Units/ml Plasmin.
Fig. 8. Wirkung von externem Gelsolin auf die Aktinfreisetzung aus Fibringerinnseln. Gerinnsel mit Fibrin und Aktin wurden in Glasröhren durch Zugabe von 1,5 NIH- Units/ml Thrombin hergestellt. Die Konzentration sowohl von Fibrinogen als auch von Rhodamin-markiertem Aktin betrug 6 uM (2,0 mg/ml bzw. 0,25 mg/ml). Die Gerinnsel wurden direkt nach ihrer Entstehung mit Glaspipetten entfernt und in Bädern mit Puffer B (offene Kreise) oder Puffer B + 0,2 mg/ml (2 uM) Gelsolin (ausgefüllte Kreise) getränkt. Die Freisetzung von Aktin aus dem Gerinnsel wurde wie im Text beschrieben als in das Badmedium abgegebene Fluoreszenz gemessen. Die maximale Fluoreszenzfreisetzung wurde nach Gerinnsel-Lyse mit 1,3 Units/ml Plasmin zu dem mit einem Pfeil gekennzeichneten Zeitpunkt erhalten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erwägung der Erfinder, dass die Verabreichung von aktinbindenden Verbindungen oder biologisch aktiven Derivaten davon an Individuen nach Gewebeverletzung andere gesunde Gewebe schützt, indem normale viskoelastische Eigenschaften aktinhaltiger Gerinnsel wiederhergestellt werden. Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Verringerung der Aktinmengen in Gerinnseln, die im Blutstrom und im extrazellulären Raum eines Tiers entstanden sind. Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Freisetzung von Aktin in aktinhaltigen Gerinnseln, die in vivo entstanden sind. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung therapeutischer Behandlungen, die sich zur Behandlung eines Tiers zum Schutz gegen sekundäre Gewebeverletzung verwenden lassen, welche aufgrund anomaler Aktinmengen auftreten, so dass aktinhaltige Gerinnsel mit veränderten viskoelastischen Eigenschaften in vivo gebildet werden.
Die vorliegende Erfindung beruht auch auf der Entdeckung der Erfinder, dass sich in Fibringerinnseln gefangene Aktinfilamente aus dem Gerinnsel durch Inkubation in Gegenwart eines aktinbindenden Proteins eluieren und quantifizieren lassen. Die vorliegende Erfindung betrifft folglich auch ein Verfahren von potentieller therapeutischer Bedeutung, wobei Plasma aus Patienten mit Gewebeverletzung isoliert wird, sich Gerinnsel bilden können, und die Gerinnsel dann in Gegenwart eines aktinbindenden Proteins inkubiert werden, und das daraus freigesetzte Aktin quantifiziert wird. Dieses Verfahren liefert einen Test zur Bestimmung der Menge an Aktin, die in vivo in Fibringerinnseln im Plasma von Patienten mit verschiedenen Gewebeverletzungstypen gefangen worden ist.
Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur genauen Bestimmung der Eigenschaften von Gerinnseln in Patienten in vivo, wobei die Patienten starke Gewebeverletzung aufweisen, durch Quantifizieren der Menge an Aktinfilamenten, die in diesen Gerinnseln gefangen sind.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Zur Bereitstellung eines klareren und schlüssigeren Verständnisses der Beschreibung und der Ansprüche, einschließlich der Bedeutung, die diesen Begriffen gegeben werden soll, werden die nachstehenden Definitionen gegeben.
Aktinbindende Verbindung. "Aktinbindende Verbindung" soll jede Verbindung und insbesondere jedes Protein (oder Peptid) umfassen, das Aktin binden kann, so dass alle der zahlreichen Aktinfunktionen, einschließlich der Unterdrückung der Fähigkeit von Aktinmonomeren zur Polymerisation zu Filamenten, modifiziert werden, und welche im Wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist, die eine solche Verbindung entweder in vivo (in einem prokaryotischen oder eukaryotischen) Wirt oder in vitro (als Ergbnis einer chemischen Synthese) begleiten. Diese Verbindungen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf extrazelluläre aktinbindende Proteine, wie Gelsolin und DBP, und intrazelluläre aktinbindende Proteine, wie die häufigsten in den Zellen (bspw. Myosine, Tropomyosine, Profilin und Cofilin) sowie die häufigsten in Nicht-Muskelzellen. Aktinbindende Verbindungen im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren umfassen ebenfalls, sind jedoch nicht beschränkt auf a) aktinbindende Verbindungen, die vorwiegend Aktinmonomere sequestrieren, d. h. Monomere in einem Komplex binden, der gegenüber Polymerisation beständig ist (bspw. DBP, Profilin, Depaktin, Cofilin und DNase I); b) aktinbindende Verbindungen, die Monomere sequestrieren und Filament-spaltende Aktivität besitzen (bspw. Gelsolin, Villin, Fragmin und Severin); c) aktinbindende Verbindungen, die vorwiegend die Enden von Aktinfilamenten blockieren und den Austausch von Monomeren mit diesem Ende verhindern (bspw. Capping-Protein, β-Aktinin und Acumentin); und d) aktinbindende Nichtprotein- Moleküle, die solche Wirkungen auf Aktin haben (bspw. Cytochalasin oder biologisch aktive Derivate davon, die die Enden von Aktinfilamenten blockieren).
Diese Verbindungen können dem Individuum - wenn gewünscht - in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes verabreicht werden.
Thrombose-Ereignis. Der Begriff "Thrombose-Ereignis" soll jeden vaskulären Zustand bedeuten, bei dem Gefäßverschluss, Thrombose, Infarkt oder eine andere biologische Störung eine Fibrinolyse herbeiführt.
Aktinhaltiges Gerinnsel. "Aktinhaltiges Gerinnsel" soll für den erfindungsgemäßen Zweck ein Gerinnsel gemäß der direkt nachfolgenden Definition bedeuten, wobei das Gerinnsel Aktinfilamente und/oder Aktinmonomere auf der Gerinnselfaser oder Aktinfilamente in den Zwischenräumen des Fibrin-Netzwerks enthält. Das im Gerinnsel enthaltene Aktin kann das Ergebnis von Einfangen, kovalenter Bindung und anderen Bindungstypen, wie Wasserstoff-, Ionen- und anderen nicht-kovalenten Typen physikalisch-chemischer Wechselwirkung sein. Aktin kann ebenfalls im Gerinnsel als Folge von bloßem Einfangen enthalten sein.
Gerinnsel. Der Begriff "Gerinnsel" bedeutet für erfindungsgemäße Zwecke eine weiche, nicht-starre unlösliche Masse, die beim Gelieren von Blut entsteht. Der Begriff betrifft insbesondere die geronnene Blutphase; die weiche, kohärente geleeartige rote Masse, die aus der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin hervorgeht, wodurch die roten Blutzellen (und andere gebildeten Elemente) im geronnenen Plasma gefangen werden. Das Gerinnsel kann entweder im oder außerhalb des Körpers entstehen. Einige Gerinnsel erscheinen aufgrund der sich vor der Gerinnselbildung absetzenden Erythrocyten gelb. Dieser Gerinnseltyp tritt auf, wenn sich Gerinnsel außerhalb des Körpers ausbilden. Blutgerinnsel können auch Gerinnsel vom externen Typ sein, die sich außerhalb eines Blutgefäßes bilden. Inteme Gerinnsel bilden sich innerhalb eines Blutgefäßes. Muskelgerinnsel können durch Gerinnung von Muskelplasma entstehen. Ein Blutgerinnsel kann auch aus Fibrin und Blutplättchen bestehen. Ein so entstandenes Gerinnsel wird als gewaschenes oder weißes Gerinnsel bezeichnet.
Gewebeverletzung. Der Begriff "Gewebeverletzung" ist für den erfindungsgemäßen Zweck eine Gewebeverletzung, die zur Thrombose führt. Diese Verletzungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Pneumonie, Trauma, Myokardinfarkt oder jeder Organinfarkt, jedoch insbesondere Myokardinfarkt, da das Herz erhebliche Mengen Aktin enthält. Quetschungsverletzungen sind ebenfalls für die vorliegende Erfindung von Bedeutung, da der Skelettmuskel erhebliche Mengen Aktin enthält. Der Verletzungstyp, der für die vorliegende Erfindung von Bedeutung ist, ist der Typ Verletzung, der Aktin in den extrazellulären Raum über Blutzellen oder feste Gewebezellen freisetzt, sowie die Freisetzung von thromboplastischen Materialien, die die Fibringerinnsel an diesen Stellen verursachen, so dass das Fibringerinnsel das Aktin einfängt. Die Zellverletzung, welche die Erfindung betrifft, ist gewöhnlich eine Verletzung, bei der sowohl Entzündung und Zellverletzung als auch Gerinnselbildung auftritt, so dass die Zellverletzung eine Fragmentierung von Neutrophilen oder Blutplättchen im Blut oder Beschädigung fester Organe, wie Herz oder Leber, sein kann.
Tier. Der Begriff "Tier" soll sämtliche Tiere umfassen, bei denen die Ansammlung von freiem Aktin oder Aktinfilamenten im Blutstrom oder im extrazellulären Raum die Physiologie des Tieres schädigt. Unter diesen Tieren sind Menschen vorherrschend; die Erfindung ist jedoch nicht so einschränkend, und es liegt innerhalb der erfindungsgemäßen Erwägung, sämtliche Tiere zu behandeln, die die vorteilhafte Wirkung der Erfindung erfahren können.
Wirksame Menge. Eine "wirksame Menge" einer aktinbindenden Verbindung reicht aus, um Aktin aus einem Gerinnsel mit gebundenem Aktin freizusetzen, das in einem Tier mit Gewebeverletzung entstanden ist.
Eine wirksame Menge einer aktinbindenden Verbindung reicht auch aus, um die Aktinmenge, die sich in einem aktinhaltigen Gerinnsel in vivo befindet, zu reduzieren oder zu eliminieren.
Im Wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen. Ein Material ist sozusagen "im Wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen", wenn es im Wesentlichen von Materialien gereinigt ist, die sich gewöhnlich und natürlicherweise vor einer solchen Reinigung darin befinden.
Beispiele für natürliche Verunreinigungen, mit denen aktinbindende Verbindungen einher gehen können, sind: nichtaktinbindende Peptide, Kohlehydrate, glycosylierte Peptide, Lipide, Membranen, usw. Ein Material ist sozusagen im Wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen, wenn diese Verunreinigungen, die gewöhnlich und natürlicherweise mit der Substanz in vivo oder in vitro auftreten, im Wesentlichen in einer Probe des Materials fehlen, "Im Wesentlichen fehlen" bedeutet, dass diese Verunreinigungen entweder vollständig fehlen oder in solch geringen Konzentrationen vorhanden sind, dass ihre Gegenwart (1) die gewünschte Wirkung des Wirkstoffs (hier die aktinbindende Verbindung) im Präparat, wenn ein solches Präparat mit dem aktinhaltigen Fibringerinnsel, welches die vorliegende Erfindung betrifft, inkubiert wird, nicht stört.
"Im Wesentlichen fehlend" bedeutet auch, dass diese Verunreinigungen entweder vollständig fehlen oder in solch geringen Konzentrationen vorhanden sind, dass ihre Gegenwart die gewünschte therapeutische Wirkung des Wirkstoffs (hier die aktinbindende Verbindung) im Präparat nicht stört, wenn ein solches Präparat an ein Tier verabreicht wird, und dem Tier als Folge der Verabreichung des Präparates nicht schadet.
Verabreichung. Der Begriff "Verabreichung" bedeutet, die Einführung der aktinbindenden Verbindungen an jedes Tier durch irgend ein im medizinischen Fachgebiet bekanntes Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf enterale und parenterale (z. B. intravenöse) Verabreichung.
Behandlung. Der Begriff "Behandlung" oder "Behandeln" umfasst die Verabreichung der aktinbindenden Verbindungen an ein Individuum für Zwecke, welche Prophylaxe, Linderung, Vorbeugung oder Heilung aktinabhängiger Störungen umfassen.
Inkubation. Der Begriff "Inkubation" soll die Einführung aktinbindender Verbindungen umfassen.
Pharmazeutisch verträgliches Salz. Der Begriff "pharmazeutisch verträgliches Salz" soll Salze der erfindungsgemäßen aktinbindenden Verbindungen umfassen. Diese Salze können aus pharmazeutisch verträglichen Säuren oder Basen hergestellt werden, wie bspw. Säuren, wie Schwefel-, Salz-, Salpeter-, Phosphorsäure usw., oder Basen, wie Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxide, Ammoniumhydroxide, Alkylammoniumhydroxide usw.
Pharmazeutisch verträgliches Vehikel. Der Begriff "pharmazeutisch verträgliches Vehikel" soll Lösungsmittel, Träger, Verdünnungsmittel und dergleichen umfassen, die als Additive zu Präparaten erfindungsgemäßer aktinbindender Verbindungen verwendet werden, so dass ein Träger oder Hilfsstoff zur Verabreichung dieser Verbindungen bereit gestellt wird.
Fragment. Der Begriff "Fragment" soll einen Abschnitt eines Moleküls umfassen, der ein Segment einer aktinbindenden Verbindung bereitstellt, die Aktinmonomere binden kann; der Begriff soll aktinbindende Fragmente umfassen, die aus irgendeiner Quelle hergestellt sind, wie bspw. aus natürlich vorkommenden Peptidsequenzen, synthetischen oder chemisch synthetisierten Peptid-Sequenzen und genetisch veränderten Peptidsequenzen. Ist dieses Fragment ein Peptid, soll zudem ein Fragment eines Peptids eines solchen aktinbindenden Proteins eine Variante des aktinbindenden Proteins umfassen.
Variante. Eine "Variante" einer solchen aktinbindenden Verbindung soll eine Verbindung betreffen, die hinsichtlich der Struktur und der biologischen Aktivität entweder der nativen Verbindung oder einem Fragment davon ähnelt.
Die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre Fähigkeit zur Bindung von Aktin und zur Modifikation in eine Form, dass es von einem Fibringerinnsel in vitro freigesetzt werden kann. Diese Modifikation kann das Ergebnis der Bindung der Verbindungen an sich sein oder das Ergebnis einer chemischen oder enzymatischen Reaktion, die durch eine solche Bindung zustande kommt.
Funktionelles Derivat. Ein "funktionelles Derivat" einer aktinbindenden Verbindung ist ein Derivat, dessen biologische Aktivität der biologischen Aktivität der aktinbindenden Verbindung im Wesentlichen ähnelt. Eine "im Wesentlichen ähnliche Aktivität" ist quantitativ unterschiedlich, qualitativ jedoch gleich. Ein funktionelles Derivat eines erfindungsgemäßen aktinbindenden Proteins hat bspw. das gleiche Aminosäure-Grundgerüst wie ein aktinbindendes Protein, enthält jedoch andere Modifikationen, wie posttranslationale Modifikationen, wie bspw. gebundene Phospholipide oder kovalent verknüpfte Kohlenhydrate, je nach der Notwendigkeit dieser Modifikationen für die Durchführung des Diagnosetests oder der therapeutischen Behandlung Der Begriff wie er hier verwendet wird, soll auch ein chemisches Derivat einer aktinbindenden Verbindung umfassen. Diese Derivate können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit usw. der Verbindung verbessern. Die Derivate können auch die Toxizität des Moleküls senken oder jegliche unerwünschte Nebenwirkung des Moleküls usw. eliminieren oder abschwächen. Derivate und spezifisch chemische Einheiten, die solche Wirkungen verursachen, sind in Remingtons Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. Die Verfahren zur Kupplung dieser Einheiten an ein Molekül sind im Fachgebiet bekannt. Der Begriff "funktionelles Derivat" soll die "Fragmente", "Varianten", "Analoga" oder "chemischen Derivate" eines Moleküls umfassen.
Analogon. Ein "Analogon" der erfindungsgemäßen aktinbindenden Verbindungen soll eine Verbindung betreffen, deren Funktion entweder der nativen aktinbindenden Verbindung oder einem Fragment davon im Wesentlichen ähnelt. Ein Analogon eines aktinbindenden Proteins ist bspw. ein Protein, das nicht die gleiche Aminosäure-Sequenz wie das aktinbindende Protein hat, das jedoch zu einem aktinbindenden Protein ausreichend homolog ist, so dass die biologische Aktivität eines solchen aktinbindenden Proteins beibehalten wird.
Die Anmelder haben entdeckt, dass es zwei Typen von Aktin-Fibrin- Wechselwirkungen gibt. Eine relativ unspezifische Wechselwirkung beruht auf dem Einfangen von Aktinfilamenten innerhalb des Fibringels, und ein spezifischerer Bindungstyp tritt auf, selbst wenn die Aktinfilamente kürzer als die durchschnittliche Porengröße des Fibringels sind. Die Zugabe von Vitamin-D-bindendem Protein, das Aktinmonomere bindet und sie vor der Polymerisation zu Aktinfilamenten bewahrt, hat eine Wirkung auf die an das Gerinnsel bindende Aktinmenge, die der Wirkung von Plasma-Gelsolin ähnelt. Beide Proteine hemmen die Bindung, was die Idee unterstützt, dass Fibringerinnsel Aktinfilamente einfangen. Die Senkung des Plasmagehaltes jedes Proteins in der Nähe eines entstehenden Gerinnsels bewirkt daher möglicherweise steigende Mengen von mit Gerinnsel einhergehendem Aktin. Es überrascht nicht, dass etwas Aktin an Fibrin bindet, selbst wenn äquimolare Konzentrationen dieser aktinbindenden Proteine zugegen sind, da eine spezifische Wechselwirkung zwischen Aktin und Fibrin durch die Vernetzung von Aktin an Fibrin durch den Faktor XIIIa (Mui und Ganguly, Am. J. Physiol. 233 (1977) H346) angedeutet wird.
Die rheologischen Eigenschaften der aktinhaltigen Gerinnsel unterscheiden sich von denen reiner Fibringerinnsel, wie man es erwartet, wenn zwei miteinander verzahnte FiIament-Netzwerke miteinander vermischt werden. Frühere Forscher haben gezeigt, dass die rheologischen Eigenschaften von Aktin- und Fibrin-Netzwerken sich quantitativ und qualitativ voneinander unterscheiden und die Viskoelastizität eines Gemischs dieser beiden Polymere schwierig voherbestimmbar ist (Janmey et al., J. Cell. Biol. 113 (1991) 155-160; Janmey et al., J. Rheol., 27 (1983) 135). Die Anmelder haben entdeckt, dass der Einbau von Aktin in ein Fibringerinnsel das Verschwinden eines seiner unüblichen Eigenschaften, Streckhärtung, bewirkt und die Fähigkeit verringert, starken Verformungen ohne Strukturveränderung zu widerstehen. Gerinnsel mit Aktin sind somit spröder als solche ohne. Die Zugabe von Gelsolin, das das Aktin-Netzwerk in ein SoI umwandelt, verhindert diese Wirkung, was nahelegt, dass die Sprödigkeit von AktinMbringerinnseln eher auf sterischen Wechselwirkungen zwischen den beiden Filament-Typen beruht, als auf direkter AktirFibrin-Bindung. Zusammengefasst kann Aktin in Fibringerinnsel eingebaut werden, ohne dass ihre physikalischen Eigenschaften beeinträchtigt werden, so lange die Filamente nicht zu lang sind.
Gelsolin übt somit eine Schutzwirkung auf Fibringerinnsel aus, wenn es vor der Entstehung des Fibringerinnsels zu Aktin gegeben wird. Gelsolin verringert durch Verkürzung von Aktin die Menge des mit dem Gerinnsel einher gehenden Aktins und hält die rheologischen Eigenschaften des Gerinnsels aufrecht. Gelsolin kann zudem in einem Fibringerinnsel eingefangene Aktinfilamente verkürzen, so dass ein Großteil des Gerinnsel-assoziierten Aktins aus dem Gerinnsel diffundieren kann. Diese Experimente bestätigen auch, dass Gerinnsel-assoziiertes Aktin die Plasmin-vermittelte Fibrinolyse hemmt. Die Entfernung von Aktin aus einem Gerinnsel durch Plasma-Gelsolin kann daher insofern als vorteilhaft angesehen werden, als es die Wiederherstellung der homöostatischen Mechanismen unterstützt, die die Gerinnsel-Bildungund Auflösung regulieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher folglich ein Verfahren zur Entfernung oder Verringerung von Aktin in einem Gerinnsel in vivo durch Verabreichung wirksamer Mengen eines aktinbindenden Proteins. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Gelsolin, DBP, oder deren aktinbindende Fragmente oder eine Kombination aus Gelsolin, DBP und/oder deren aktinbindenden Fragmenten dem Individuum, das eine Behandlung benötigt, verabreicht.
Bei einer Ausführungsform werden wirksame Mengen der aktinbindenden Verbindungen verabreicht, so dass das mit den Gerinnseln einher gehende Aktin in vivo freigesetzt wird und somit der Wirkung von übermäßigem extrazellulärem Aktin auf die Gerinnsel- Bildung in vivo entgegen wirkt. "Wirksame Mengen der aktinbindenden Verbindungen" bedeutet eine Menge, bei der die toxischen Wirkungen von freiem extrazellulärem Aktin auf ein Minimum reduziert sind. Die toxischen Wirkungen von freiem extrazellulärem Aktin sind hinsichtlich der vorliegenden Erfindung solche toxischen Wirkungen, die das Ergebnis schädlicher Veränderungen der viskoelastischen Eigenschaften oder der Lyserate von Gerinnseln in vivo sind. "Übermäßiges extrazelluläres Aktin" bedeutet eine Menge des extrazellulären Aktins, die die Fähigkeit aktinbindender Proteine, Aktin aus extrazellulären Flüssigkeiten ohne sekundäre unbeabsichtigte Gewebeschädigung oder toxische Wirkungen zu binden und zu entfernen, übersteigt. "Sekundäre Gewebeschädigung oder toxische Wirkungen" steht für einen Gewebeschaden oder toxische Wirkungen, die in ansonsten gesunden Geweben, Organen und Zellen darin aufgrund vorhandener aktinhaltiger Gerinnsel auftreten, und zwar gewöhnlich als Folge einer primären Gewebeverletzung an anderer Stelle im Körper.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren bewirkt eine Infusion aktinbindender Verbindungen, wie Gelsolin, DBP oder aktinbindenden Fragmenten davon, eine Abnahme oder eine vollständige Beseitigung von Aktin aus aktinhaltigen Gerinnseln in vivo.
Aktinbindende Verbindungen können entweder chemisch oder durch gentechnische Manipulation mit Fragmenten oder anderen Mitteln verbunden werden, die ein Targeting dieser aktinbindenden Verbindungen zu einer gewünschten Wirkungsstelle ermöglichen. Alternativ können andere Verbindungen entweder chemisch oder durch genetische Manipulation an eine andere aktinbindende Verbindung oder ein aktives Fragment davon gebunden werden, so dass zusätzliche Eigenschaften dieser aktinbindenden Verbindung verstärkt oder verliehen werden, insbesondere Eigenschaften, die die Fähigkeit der Verbindung zur Beseitigung der toxischen Wirkungen des Aktins verstärken. Da Aktin bspw. die intravaskuläre Blutgerinnung fördert und die Fibrinolyse hemmt, kann man durch Verknüpfen des Gewebe- Plasminogen-Aktivators und/oder eines Antithrombins, wie Hirudin oder aktiven Fragmenten davon, mit der aktinbindenden Verbindung ein fibrinolytisches Mittel an Stellen leiten, an denen eine Gewebeverletzung Aktin freigesetzt hat, was die Entstehung aktinbindender Gerinnsel fördert.
Mengen und Schemata zur Verabreichung aktinbindender Verbindungen lassen sich leicht vom Fachmann auf dem klinischen Gebiet der Behandlung aktinabhängiger Störungen, Gewebeverletzung und Entzündung bestimmen. Die Dosierung der Behandlung mit der aktinbindenden Verbindung variiert gewöhnlich in Abhängigkeit von Erwägungen wie: dem Typ der eingesetzten aktinbindenden Verbindung; dem Alter; der Gesundheit; den zu behandelnden Leiden; gegebenenfalls der Art einer gleichzeitigen Behandlung, die Häufigkeit der Behandlung und die Art der gewünschten Wirkung; dem Ausmaß der Gewebeschädigung; dem Geschlecht; der Dauer der Symptome und gegebenenfalls Gegenanzeigen, und anderen Variablen, die vom jeweiligen Arzt eingestellt werden müssen. Die Dosierung lässt sich bei einer oder mehreren Anwendungen verabreichen, so dass die gewünschten Ergebnisse erhalten werden.
Die Dosierung lässt sich auf folgende Weise berechnen. Die normale Blut-Gelsolin- Konzentration beträgt 2,4 uM (2,4 umol/l) und die normale BIut-DBP-Konzentration beträgt 5 um (5 umol/l). Für Gelsolin beträgt die normale Aktinbindungskapazität 4,8 uM. Die Blut- Aktin-Gesamtbindungsaktivität (ABC) beträgt etwa 9,8 umol/l. Das Blutvolumen beträgt 6% des Körpergewichts, folglich hat eine 70 kg schwere Person 4,2 l Blut und somit (4,2 l · 7,5 umol/l) 31,5 umol ABC. Da DBP und Gelsolin im extrazellulären Raum (der 10% des Körpergewichts ausmacht) verteilt sind, enthält der Körper (7,5 · 7) 52,5 umol ABC.
Es kann gewünscht sein, zwischen 32 und 53 umol einer aktinbindenden Verbindung (oder 0,46 umol/kg Körpergewicht) zu verabreichen, so dass eine vollständige Komplexierung oder Verarmung von endogenem ABC abgedeckt wird. Da 42,5 mg Aktin 1 umol entsprechen und da 4,86 mg Aktin pro g Skelettmuskel vorliegen, enthält jedes g Muskel 0,114 umol Aktin, oder 460 g Muskelzerstörung können das gesamte Körper-ABC neutralisieren. Da jedoch die toxischen Wirkungen von Aktin vermutlich örtlich (bspw. Hemmung der Gerinnsel-Lyse), sequestriert oder kinetisch bestimmt sind (bspw. dringt Aktin schneller durch ein Organ als Bindungsproteine es neutralisieren), ist es wahrscheinlich, dass eine theoretische Minimaldosis nach oben eingestellt werden muss, um kinetisch günstige therapeutische Wirkungen zu erzielen. Die kinetische Wirkung kann bspw. wichtig sein, da die Hämolyse von etwa der Hälfte des Erythrons, die nur 4,2 umol Aktin freisetzen sollte, die Plasma- Gelsolin-Konzentration akut um die Hälfte reduziert (Smith et al., Blood 72 (1988) 214- 2181), was die langsame Äquilibrierung zwischen extravaskulären und Blutkompartimenten nahelegt. Im Gegensatz dazu lässt sich ein therapeutisch wirksamer Zustand, der örtliche Aktinablagerungen aufbrechen kann, nur durch einen transienten Impuls einer hohen Konzentration an aktinbindenden Molekülen erzielen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich in jedem geeigneten pharmakologischen Träger zur Verabreichung verabreichen. Sie lassen sich in jeder beliebigen Form verabreichen, die prophylaktisch, palliativ, vorbeugend oder heilend auf die Gewebeverletzung bei Menschen und Tieren wirkt.
Präparate der erfindungsgemäßen aktinbindenden Proteine zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungsmittel, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl, Fischöl und injizierbare organische Ester. Wässrige Träger umfassen Wasser, Wasser-Alkohol-Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzösung, und gepufferte medizinische parenterale Vehikel, einschließlich Natriumchlorid- Lösung, Ringer-Dextrose-Lösung, Dextrose plus Natriumchlorid-Lösung, Ringer-Lösung, die Lactose enthält, oder feste Öle. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeits- und Nährstoff-Nachfüllungen, Elektrolyt-Nachfüllungen, bspw. auf der Basis von Ringer-Dextrose, und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen aktinbindenden Proteine können auch mittels Pumpen oder in Depotform verabreicht werden, insbesondere, wenn die primäre Verletzung verlängert oder verzögert statt akut ist. Ein Beispiel, bei dem die primäre Verletzung oft verlängert oder verzögert statt akut ist, ist ein Myokard-Infarkt, bei dem die Beschädigung des Herzmuskels bis zu Tagen nach dem primären Herzanfall nicht zutage tritt (oder andauert). Die erfindungsgemäßen aktinbindenden Moleküle können auch an spezifische Organe in hohen Konzentrationen mittels geeignet eingeführter Katheter abgegeben werden, oder indem diese Moleküle als Teil eines chimären Moleküls (oder Komplexes) bereitgestellt werden, das zur Anvisierung spezifischer Organe ausgelegt ist.
Die Verabreichung in Depot-Form eignet sich stärker für den Patienten, wenn wiederholte Injektionen für längere Zeitspannen indiziert sind. Es ist bspw. wünschenswert, die erfindungsgemäßen aktinbindenden Proteine in Depot-Form zu verabreichen, wenn die erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung einer genetischen oder chronischen Erkrankung auf der Basis einer aktinabhängigen Störung verwendet werden, um den Komfort des Patienten zu maximieren.
Die erfindungsgemäßen aktinbindenden Proteine können in Dosierungsformen, wie Tabletten, Kapseln, Pulverpäckchen oder flüssigen Lösungen zur oralen Verabreichung eingesetzt werden, wenn die biologische Aktivität des Proteins nicht durch den Verdauungsprozess zerstört wird und wenn die Eigenschaften der Verbindung derart sind, dass sie über das Darmgewebe absorbiert werden kann.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden auf an sich bekannte Weise, bspw. durch herkömmliches Mischen, Granulieren, Dragee-Herstellung, Auflösen, Lyophilisieren oder ähnliche Verfahren, hergestellt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden an und für sich bei der Bekämpfung von Aktin-induzierter physiologischer Schädigung unabhängig davon, ob sie chronisch oder akut ist, verwendet. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bewirken, dass die körpereigenen Mechanismen zur Bekämpfung von überschüssigem Aktin im Blutstrom oder in extrazellulären Geweben ihr maximales Potential erhalten. Bei einer intravenösen Dosierungsform setzt die Wirkung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ausreichend schnell ein, so dass sie sich zur sofortigen Behandlung eines potentiellen Gewebeschadens eignen.
Zudem eignet sich eine schwache Version zur Behandlung schwacher oder chronischer aktinabhängiger Störungen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen stellen zudem notwendige Reagenzien für den Labortest von Aktinmengen in einem Blutstrom oder in den extrazellulären Geweben eines Tiers bereit.
Wirksame Mengen eines aktinbindenden Proteins, insbesondere DBP, Gelsolin oder eines aktiven Fragments davon, welche im Wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen sind, lassen sich an einen Patienten verabreichen, der einen schweren Myokardinfarkt oder ein anderes thrombotisches Ereignis für einen Zeitpunkt und eine Zeitdauer hatte, während der sich ein Herz- oder Gewebeschaden zeigte. Die Menge des zu verabreichenden Peptides lässt sich nach der Untersuchung des Verhältnisses von gesamtem zu gebundenem Gelsolin im Plasma des Patienten bestimmen, so dass die Gesamtfraktion an Gelsolin bestimmt wird, die bereits mit Aktin gesättigt ist, welches durch die sterbenden Herzzellen freigesetzt wird, und Berechnen derjenigen Menge, die bei einem Minimum genügend Aktinbindungskapazität bereit stellt, dass dieses Verhältnis wieder auf Werte zurück gestellt wird, die bei gesunden Individuen auftreten. Zudem können Indikatoren für Nierenschädigung, wie die BUN- und die Kreatininmengen des Patienten genau überwacht und die Dosis des aktinbindenden Moleküls nötigenfalls höher eingestellt werden, wenn diese Indikatoren anzeigen, dass eine Nierenschädigung erfolgen könnte.
Die vorliegende Erfindung kann somit zur Verabreichung aktinbindender Verbindungen an Tiere in Mengen verwendet werden, die ausreichen, dass entweder a) eine Aktinfilament-Bildung verhindert wird und/oder b) Aktinfilamente in einen "stabilen" monomeren Zustand verarbeitet werden, in Mengen, die ausreichen, dass ungewünschte physiologische Wirkungen der Anreicherung von freiem Aktin oder der Abgabe in den Blutstrom verhindert werden.
Die jeweiligen aktinbindenden Moleküle, die den erfindungsgemäßen Verfahren unterliegen, sind gereinigte native und rekombinante aktinbindende Proteine und andere nichtproteinartige aktinbindende Moleküle und deren biologisch aktive Fragmente, die durch das Vorhandensein einzigartiger Aktinbindungsdomänen gekennzeichnet sind, die die biologische Aktivität aufweisen, dass sie Aktin in einer monomeren Form sequestrieren können, oder Aktinfilamente rasch disaggregieren oder depolymerisieren oder Stellen auf freiem Aktin bedecken, die für Wirtszellen toxisch sind. Einzelne aktinbindende Domänen, die diese biologische Aktivität besitzen, können auch durch synthetische, enzymatische proteolytische, chemische oder rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren beruhen ebenfalls teilweise auf der unerwarteten Entdeckung der Anmelder, dass ein Fibringerinnsel mit Aktinfilamenten, wenn es in Gegenwart des aktinbindenden Proteins, Gelsolin, inkubiert wird, quantifizierbares Aktin in das Inkubationsmedium freisetzt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Gelsolin, DBP oder aktinbindende Fragmente davon oder eine Kombination von Gelsolin und DBP und/oder aktinbindenden Fragmenten davon in vitro mit dem aktinhaltigen Gerinnsel inkubiert.
Bei einer Ausführungsform werden wirksame Mengen der aktinbindenden Verbindungen verabreicht, so dass das mit den in vitro gebildeten Gerinnseln einher gehende Aktin aus dem Plasma von Individuen mit Gewebeverletzung freigesetzt wird. "Wirksame Mengen" der aktinbindenden Verbindungen sind Mengen, in denen sich das mit dem Gerinnsel einher gehende Aktin freisetzen und messen lässt und somit die Diagnose der Wirkungen von übermäßigem extrazellulärem Aktin auf die Gerinnselbildung in vivo ermöglicht. "Übermäßiges" extrazelluläres Aktin ist eine derartige Menge an extrazellulärem Aktin, die die Fähigkeit der Plasmaproteine, Aktin aus extrazellulären Flüssigkeiten ohne sekundäre Gewebeschädigung oder toxische Wirkungen zu binden und zu klären, überschreitet.
Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird Plasma einem Individuum mit Gewebeverletzung entnommen, und man ermöglicht die Gerinnselbildung in vitro. Die bevorzugten Bedingungen für die Gerinnung sind in Beispiel V beschrieben. Die Gerinnsel werden dann aus dem Behälter, in dem sie entstanden sind, entfernt und mit steigenden Mengen an aktinbindendem Protein, vorzugsweise Gelsolin oder DBP, inkubiert. Das Gerinnsel wird in SDS oder Harnstoff oder einem anderen bekannten solubilisierenden Mittel gelöst und dann einer Gelelektrophorese unterworfen. Die Gele können auf Polyacrylamid oder irgend einem anderen Gelmedium beruhen, von dem der Fachmann weiß, dass sich damit Proteine effektiv trennen lassen. Nach der Gelelektrophorese erfolgt ein Western-Blot-Verfahren, und das gegebenenfalls aus dem Gerinnsel freigesetzte Aktin wird mit anti-Aktin-Antikörper nachgewiesen. Zur Bestimmung der Menge an Gelsolin, die zur Freisetzung des Aktins im Gerinnsel nötig ist, werden verschiedene Mengen Gelsolin zu verschiedenen Gerinnseln gegeben, um die Menge zu bestimmen, die zur Freisetzung der Mehrheit oder des gesamten Aktins aus dem Gerinnsel notwendig ist. Die Gelsolin- Konzentration, bei der die Aktinfreisetzung vollständig ist oder ein Plateau erreicht, wird als wirksam angesehen. Anschließend kann das Inkubationsmedium aus dem Verfahren, bei dem das maximal wirksame aktinbindende Protein zugegeben worden ist, zur Quantifizierung der Menge an Aktin, die aus dem Gerinnsel freigesetzt worden ist, durch Immunfällung der Aktinbindungs-Protein-Aktin-Komplexe im Inkubationsmedium verwendet werden. Nach der maximalen Freisetzung von Aktin aus den Gerinnseln kann die Aktinmenge durch Zugabe von exogenem aktinbindendem Protein, bspw. Gelsolin oder DBP, vollständig titriert werden. Anti-Aktinbindungs-Antikörper, wie anti-Gelsolin oder anti-DBP können zur Immunfällung und anschließenden Quantifizierung der Komplexe verwendet werden. Alternativ können anti-Aktin-Antikörper zum Nachweis des in das Inkubationsmedium abgegebenen Aktins durch Immunfällung eines Aktin-anti-Aktin-Antikörper-Komplexes verwendet werden.
Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird ein Gerinnsel in einem kleinen Chromatographie-Röhrchen erzeugt. Durch das Röhrchen wird eine Aktinbindungsprotein-Lösung, vorzugsweise Gelsolin oder DBP oder deren Fragmente, aufgebracht. Das Eluat wird dann durch Standard-Elisa gemessen, oder das aktinbindende Protein wird immungefällt und das Vorliegen von Komplexen mit Aktin wird durch Gelelektrophorese, vorzugsweise Polyacrylamid-Gelelektrophorese, untersucht. Die Parameter sind nachstehend beschrieben.
Fibrinogen wird in einer Konzentration zwischen 0,1-10,0 mg/ml, vorzugsweise 2-3 mg/ml, hergestellt. Der pH-Wert liegt zwischen 6 bis 8,5 und beträgt vorzugsweise 7,4. Die Ionenstärke liegt zwischen 50 und 500 mM und beträgt vorzugsweise 100 mM. Der Puffer ist ein Imidazol- oder Tris-Puffer. Die Calcium-Konzentration liegt zwischen 0,1-10 mM und beträgt vorzugsweise etwa 0,3 mM. Die ATP-Konzentration beträgt 10 uM bis 10 mM. Etwa 0,5 ml Fibrinogen wird auf eine Chromatographiesäule mit 1 cm Durchmesser gegeben und kann ein ca. 1 mm Gerinnsel bilden, indem 0,01-10 NIH-Units, vorzugsweise 0,1 NIH- Units pro ml Thrombin dazu gegeben werden. Das derart erzeugte Gerinnsel ist mechanisch stark genug, dass es ohne Kollabieren einerFlüssigpermeation standhält, und porös genug, dass die Permeation in einer Rate von etwa 0,2 ml/min. erfolgt. Die Gerinnselbildung dauert etwa 1 bis 10 min. Nach der zehnfachen Gerinndungsdauer wird ein Druck zwischen 1 und 10 cm auf das Chromatographie-Röhrchen angelegt. Die Menge Inkubationspuffer wird dann eingestellt, bis die Fließgeschwindigkeit etwa 0,2 ml/min beträgt. Der Druck wird durch Beobachten des Gerinnsel-Meniskus eingestellt. Beginnt der Meniskus des Gerinnsels zu kollabieren wird der Druck leicht verringert. Die Flüssigkeit kann somit das Gerinnsel im vorstehend beschriebenen Puffer durchdringen. Der Puffer enthält zuerst kein Gelsolin. Der Puffer wird verwendet, um unspezifisch gebundenes Protein aus dem Gerinnsel zu waschen. Dann wird Gelsolin zum Puffer gegeben, und der gelsolinhaltige Puffer wird in etwa 1 bis 5 min durch das Gerinnsel gewaschen. Die eluierten Fraktionen werden auf Aktin untersucht, indem die Fraktionen auf ein Gel, insbesondere SDS-Polyacrylamid aufgetragen werden, und mit anti-Aktin-Antikörper einem Immunoblotting unterworfen werden. Die Gelsolin- Konzentration liegt zwischen 50 nM und 5 uM, vorzugsweise zwischen 1 und 5 uM.
Bei einem alternativen Test, lässt sich ein Test auf Lyse durch Plasmin zur Bestimmung der Menge und Rate von Aktin verwenden, die durch ein aktinbindendes Protein, vorzugsweise Gelsolin oder DBP, von den Gerinnseln frei gesetzt wird. Da Aktin die Lyse auf Plasmin-Basis hemmt, kann die Geschwindigkeit der Gerinnsel-Lyse dann als Maß für die Aktinfreisetzung verwendet werden. Die Lyse-Geschwindigkeit wird erhöht, wenn Aktin aus einem aktinhaltigen Gerinnsel entfernt wird. In Fällen, in denen dieser Test-Typ verwendet wird, entstehen in den Chromatographie-Röhrchen wie vorstehend beschrieben Gerinnsel oder werden den Röhrchen entnommen und in Puffer mit oder ohne aktinbindendes Protein, vorzugsweise Gelsolin oder DBP, inkubiert.
Alternative Verfahren zur Bestimmung des aus einem Gerinnsel freigesetzten Aktins nutzen die Parameter der Streckhärtung. Streckhärtung kann durch Verfahren gemessen werden, die eingehend in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind. Die Streckhärtung ist in aktinhaltigen Gerinnseln geringer und kann wieder erhalten werden, wenn Aktin aus den Gerinnseln freigesetzt wird. Die Freisetzung von Aktin in Gerinnseln lässt sich durch die in den Beispielen beschriebenen rheologischen Messungen quantifizieren.
Aktinbindende Proteine, die im Wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen sind, lassen sich aus ihren natürlichen oder rekombinanten Quellen gemäß im Fachgebiet herkömmlicher Bedingungen und Techniken, die vorher zur Isolation dieser Proteine verwendet wurden, wie Extraktion, Fällung, Chromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese oder dergleichen, isolieren und reinigen.
Der Fachmann kann die Aktinbindungsdomäne(n) einer aktinbindenden Verbindung mittels im Fachgebiet bekannter Techniken ohne übermäßige Experimente identifizieren, und diese Domänen sind bei den erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt. Derivate der nativen aktinbindenden Proteine oder Derivate rekombinant hergestellter aktinbindender Proteine können durch proteolytische Spaltung des aktinbindenden Volllängenproteins mit gewöhnlichen Proteasen, wie bspw. Trypsin, Chymptrypsin und Subtilisin hergestellt werden. Affinitätschromatographie mit von Aktin hergeleiteten Harzen lassen sich zur Untersuchung dieser Fragmente auf ihre Aktinbindungsfähigkeit verwenden.
Wenn die Identifizierung von Verbindungen oder Fragmenten davon mit aktinspaltender Aktivität gewünscht ist, können diese Verbindungen oder Fragmente auch mittels im Fachgebiet bekannter Techniken hergestellt werden, bspw. indem die Depolymerisationsrate von Pyren-markiertem F-Aktin beobachtet wird.
Diese Fragmente können bspw. durch ihre Homologie zu anderen bekannten Aktinbindungs- oder Aktinspaltungsdomänen identifiziert werden, wobei sich vorhersagen lässt, dass die Funktion der Homologie folgt. Severin, Gelsolin und Villin und insbesondere die Aminosäurereste 40-351 von Severin und die Aminosäurereste 63-383 von Gelsolin zeigen bspw. eine starke Homologie in der Domäne, die für die F-Aktin-spaltende Aktivität verantwortlich ist.
Die N-terminale Hälfte von Gelsolin bspw. ein N-terminales tryptisches Fragment, das als CT45 bekannt ist, kann F-Aktin spalten und enthält zwei Aktinbindungsstellen. Eine dieser Stellen befindet sich in einem chymotryptischen Fragment, CT15 N (menschliche Gelsolinreste 24-150), das die Enden von Aktinmonomeren und -Filamenten mit hoher Affinität bindet; die andere Stelle befindet sich im benachbarten Fragment CT28 N (Reste 15M06), das in einer Polyphosphoinositid-regulierten Weise an die Seite von F-Aktin bindet. Keines der Fragmente spaltet Aktinfilamente selbst. Das kleinste Gelsolinpolypeptid, das F-Aktin spalten kann, umfasst die Reste 25-165 von Plasma-Gelsolin.
Verbindungen, wie aktinbindende Proteine, sind unter den Arten zudem hochkonserviert, und können leicht in große Mengen aus nichtmenschlichem (Rind, Schwein) Plasma und/oder Muskelgeweben isoliert werden, und Fragmente dieser Proteine lassen sich chemisch oder enzymatisch durch im Fachgebiet bekannte Techniken herstellen. Diese aktinbindenden Verbindungen lassen sich somit einem Individuum verabreichen, welches die erfindungsgemäßen therapeutischen Verfahren benötigt, ohne dass eine schwere Immunantwort hervor gerufen wird.
Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung beschreiben die nachstehenden Beispiele weiter die Materialien und Verfahren, die zur Durchführung der Erfindung verwendet werden. Die Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.

Beispiele

Materialien. - Fibrinogen (Mosher und Blout, J. Biol. Chem. 248 (1973) 6896) und Gelsolin (Chaponnier et al., J. Cell. Biol. 103 (1986) 1473) wurden aus menschlichem Blutplasma, und Aktin aus Kaninchen-Skelettmuskel mittels vorher beschriebener Verfahren (Janmey et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 8357) gereinigt. Aktin wurde mit Pyren- Iodacetamid oder Tetramethylrhodamin-5-(und 6)-iodacetimid (T-488, Molecular Probes, Eugene, OR) wie anderwärts beschrieben (Symons und Mitchinson, J. Cell. Biol. 114 (1991) 503) markiert. Vitamin-D-bindendes Protein wurde entweder aus menschlichem Blut durch Affinitätschromatographie mittels Aktin-Sepharose (Haddad et al., Anal. Biochem. 146 (1985) 96) hergestellt oder von Calbiochem (San Diego, CA) bezogen. Beide Materialien zeigten ähnliche Affinität für Aktin auf der Basis ihrer Fähigkeit zur Hemmung der Aktinpolymerisation, wie gemessen durch Änderungen der Fluoreszenz von pyrenmarkiertem Aktin. Thrombin aus menschlichem Plasma (T-6759, Sigma, St. Louis, MO) und Plasmin (810655 Kabi Vitrum, Franklin, OH) wurden mit Wasser auf 100 Units/ml bzw. 10 Units/ml verdünnt und sofort eingefroren. Aliquots wurden aufgetaut, bei 4ºC gehalten und innerhalb von 10 Std. verwendet. Rhodamin-markiertes Phalloidin wurde von Molecular Probes, Fluorescein-markiertes Avidin von Enzo Diagnostics NY und DNase I von Boehringer Mannheim (Indianapolis, HSI) erhalten.

Beispiel I - Viskoelastizitätsmessungen

Die viskoelastischen Eigenschaften von Fibringelen wurden durch rheologische Messungen mit entweder einem Rheometrics Instrument oder einem Torsionspendel bestimmt. Das Prinzip hinter diesen Messungen ist, dass sich eine viskoelastische Probe - wenn eine Kraft in einer Richtung parallel zur Vorderseite einer Probe (eine Scherkraft oder Spannung = Kraft/Fläche, angegeben in Einheiten von Pa = 10 Dyn/cm²) ausgeübt wird - zu einem Ausmaß (die Dehnung, eine einheitlose Quantität) deformiert, die von der Größenordnung der Spannung und der Zeitdauer der ausgeübten Spannung abhängt. Ein Teil der Deformationsenergie wird im Material elastisch gespeichert, und ein Teil wird durch langsame viskose Bewegung der Probe abgegeben, was zu einer irrepararablen Deformation nach Beendigung der Spannung führt. Diese viskoelastischen Eigenschaften können quantitativ durch das Schermodul beschrieben werden: das Verhältnis Spannung zu Dehnung, welches selbst eine Funktion der Zeit und für einige Materialien und Deformationsgrade auch eine Funktion der Dehnung ist. Oft werden Speicher- und Verlust- (Viskositäts-)-Schermodule gemessen, indem oszillierende Deformationen ausgeübt werden, und dann werden die Schermodule, bezeichnet als G' für das Speicher- und G" für das Verlust-Modul, aus der Größe und der Phasenverschiebung zwischen oszillierenden Spannungen und Dehnungen berechnet.
Die Rheometrics-Vorrichtung übt eine oszillierende Scherverformung auf eine Probe aus, die zwischen einem Konus und einer Platte eingespannt ist, und sie ermöglicht Messungen des elastischen Speichermoduls G' als Funktion der Zeit, Frequenz oder Deformationsamplitude. Das Torsionspendel kann entweder das dynamische Schermodul aus der freien Oszillation oder die Scher-Compliance (Verhältnis von Spannung zu Dehnung) aus Messungen der Verformung (Spannung) messen, wenn eine konstante Seher-Spannung auf eine scheibenförmige Probe ausgeübt wird, die zwischen den Platten des Pendels gehalten wird. Die Prinzipien des Betriebsweise dieser beiden Geräte sind andernorts beschrieben (Janmey et al., Biochemistry 27 (1988) 8218; Janmey, P., J. Biochem. Biophys. Meth. 22 (1991) 41).
In beiden Geräten wird das Fibrin- oder Fibrin/Aktin-Gel zwischen den Platten des Rheometers gebildet, indem 400 ul-800 ul einer Proteinlösung direkt nach der Zugabe von Thrombin auf die untere Platte gegeben werden, so dass die Fibrinpolymerisation gestartet wird. Die Thrombinkonzentration wurde so ausgewählt, dass eine Gerinnungsdauer von wenigen Minuten erhalten wurde, was so viel Zeit ermöglichte, dass die Probe vor dem Eintreten der Gerinnung im Rheometer untergebracht werden konnte. Die Messungen wurden gewöhnlich eine min nach Unterbringung der Probe zwischen den Platten gestartet, und die Gerinnungsdauer betrug etwa 3 min. Die Messungen der Spannungsabhängigkeit wurden an 90 min oder mindestens für das 50fache der Gerinnungszeit gealterten Proben vorgenommen, so dass die Gerinnselbildung fast vollständig war und während des Verlaufs dieser Messungen unverändert blieb. Wenn Aktin oder Aktin/Gelsolin-Komplexe zur Fibrinogen- Lösung gegeben wurden, wurde G-Aktin zuerst zu F-Aktin in Gegenwart oder Abwesenheit von Gelsolin durch 1 stündige Inkubation in Puffern mit 2 mM MgCl&sub2; und 150 mM KCl polymerisiert.
Viskoelastische Eigenschaften von Fibrin-Aktin-Gelen. Das Vorhandensein von Aktinfilamenten während der Polymerisation von Fibrinogen beeinträchtigt stark die mechanischen Eigenschaften des Fibringel-Netzwerks. Die Fig. 1 zeigt die Wirkung auf das Schermodul, ein Maß für die elastische Beständigkeit des Gerinnsels gegenüber Verformugsspannungen, wenn steigende Mengen F-Aktin in das Gerinnsel eingebaut werden. F- Aktin vergrößert das Schermodul in einem Ausmaß, das von der Aktinkonzentration abhängt. Die Viskoelastizität der Aktinfilamente selbst kann für einen Teil des vergrößerten Schermoduls verantwortlich sein, jedoch resultiert eine signifikante Komponente auch aus der Veränderung der Fibringelstruktur, die durch Hemmung der vorstehend beschriebenen Protofflament-Bündelung verursacht wird (Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta 841 (1985) 151). Die Wirkung von F-Aktin ist das Verfeinern des Gerinnsels, und es wird erwartet, dass feinere Gerinnsel niedrigere Schermodule als gröbere Gerinnsel haben, da sie dünnere Filamente enthalten. Feine Gerinnsel können jedoch auch höhere Schermodule aufweisen, wenn die Hemmung der Fibrinbündelbildung mit einem Anstieg der Anzahl an Verzweigungspunkten gekuppelt ist (Roberts et al., Biorheology K) (1973) 29; Rosser et al., Biophys. Chem. 7 (1977) 153), und höhere Schermodule für feinere Gerinnsel wurden für Fibrin beschrieben, das in Gegenwart von IgG polymerisiert wurde (Gabriel et al., J. Lab. Clin. Med. m (1983) 545).
Eine der auffälligsten viskoelastischen Eigenschaften von Fibringelen ist, dass sie streckhärtend sind; ihr Elastizitätsmodul steigt mit steigenden Verformungsamplituden. Die Fig. 2 zeigt, dass diese Eigenschaft der Fibrinrheologie, die für seine physiologische Funktion als biegsamer aber bruchbeständiger hämostatischer Pfropf entscheidend sind, nahezu vollständig durch lange F-Aktin-Filamente eliminiert ist.
Aktin hemmt nicht nur die Streckhärtung von Fibrin, es verringert auch die Wiederherstellung der Elastizität der Gerinnsel. Die Fig. 3A zeigt die nahezu vollständige Reversibilität des Schermoduls, die auftritt, wenn ein Fibringel zuerst stufenweise bis zu einer starken Maximaldehnung verformt wird und dann in aufeinanderfolgenden kleineren Verformungen gedehnt wird. Die Reproduzierbarkeit von G' nach diesen starken Verformungen zeigt den hohen Elastizitätsgrad dieser Gele und ihre Beständigkeit gegenüber mechanischem Versagen, selbst wenn sie stark verformt werden. Das Vorhandensein von sogar einer geringen Menge (0,2 mg/ml) F-Aktin reduziert den Grad der Streckhärtung und bewirkt irreversible Abnahmen des Schermoduls von etwa 40% nach dem Dehnen, was zeigt, dass Fibrin/Aktin-Gele durch Verformungen in einem Bereich, der in vivo vorkommen kann, beschädigt werden (Fig. 3B). Dieses Phänomen erfordert lange Aktinfilamente, da bei der Verkürzung der Aktinfilamente durch Gelsolin wieder eine Streckhärtung beobachtet wird und die Wiederherstellung der Elastizität auf Werte nahe denen von nur Fibrin ansteigt ( Fig. 3C).

Beispiel II - Bindungsexperimente

Die an Fibrin gebundene Menge Aktin wurde durch den Verlust der Lösungsfluoreszenz nach dem Einbau von Rhodamin-markiertem Aktin in 2 mg/ml Fibringerinnsel gemessen. Die Gerinnsel wurden in Borsilikat-Glasgewebekulturröhrchen durch Zugabe von 1,7 MH-Units/ml Thrombin zu 2 mg/ml Fibrinogen in T7 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH-Wert 7,4) mit F- Aktin, polymerisiert in Puffer B (20 mM Tris, 0,5 mM ATP, 0,2 mM DTT, 0,2 mM CaCl&sub2;,150 mM KCl, 2 mM MgCl&sub2;, pH-Wert 7,4), gebildet. Die Fibringelierung erfolgte innerhalb von 10 min. und die Gerinnsel wurden 1-2 Std. bei 24ºC inkubiert. Die unlöslichen Gerinnsel, die > 97% des Gesamtfibrins enthielten, wurden durch Aufwickeln auf eine Glaspipette entfernt, und die Fluoreszenz der restlichen Lösung wurde bestimmt. Die Fluoreszenz wurde vor und nach der Gerinnselbildung mit einem Perkin Elmer LS-5B Luminescence Spectrometer mit Anregung bei 547 nm und Emission bei 573 nm bestimmt. Vorhergehende Sedimentationsuntersuchungen des Rhodamin-markierten Aktins zeigten, dass 15% der Gesamtfluoreszenz nichtgebunden oder an nicht-funktionelles Aktin gebunden war, und dieser Wert wurden von allen Messwerten subtrahiert. Der Prozentsatz des an das Fibringerinnsel gebundenen Gesamtaktins wurde berechnet als % gebunden = 100 (FL&sub0; - FL&sub1;), wobei FL&sub0; = Anfangsfluoreszenz vor der Fibrin-Polymerisation und FL&sub1; = Fluoreszenz der Lösung minus Fibringerinnsel.
Fibrin-Aktin-Bindung. Bindungstests zeigten, dass die Menge des an Fibringerinnsel gebundenen Aktins von der Länge der zugegebenen Aktinfilamente abhängt (Fig. 4). Bei Fehlen aktinverkürzender Proteine scheint die Bindung unsättigbar zu sein, und das Molverhältnis von Aktin zu Fibrin im Gerinnsel ist größer als 1 : 1 bei den gezeigten höchsten Aktinkonzentrationen. Dieser Befund beruht wahrscheinlich auf der Tatsache, dass Aktinfilamente, die in Abwesenheit spezifischer aktinbindender Proteine polymerisiert sind, gewöhnlich Filamentlängen von mehreren Mikron Länge erzielen (Pollard und Cooper, Annu. Rev. Biochem. 55 (1986) 987), und sie können nicht nur an das Fibringerinnsel binden, sondern sich darin verfangen (Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta 841 (1985) 151). Wenn die Filamentlänge von einem Molverhältnis von 1 : 12 von Gelsolin beschränkt ist (was zu Filamenten mit Gelsolin-Cap führt, deren durchschnittliche Länge 32 nm beträgt (Janmey et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 8357)), scheint die Bindung bei einem Molverhältnis von 2 : 3 von Aktin zu Fibrin-Untereinheiten eine Grenze zu erreichen (Fig. 4). Wird Aktin vor der Polymerisation durch Inkubation von Aktin-Monomeren mit dem Aktinmonomer-bindenden Protein DBP bewahrt (Fig. 4), wird die an das Gerinnsel gebundene Aktinmenge stark gesenkt, jedoch nicht vollständig eliminiert. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn Aktin durch DNase I vor der Polymerisation bewahrt wurde, die mit Aktinmonomeren feste Komplexe bildet, Aktin jedoch an einer anderen Stelle als DBP bindet (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legen nahe, dass lange Aktinfilamente zwar unspezifisch im entstehenden Fibringerinnsel gefangen werden können, die spezifische Bindung kurzer Filamente und komplexierter Monomere aber ebenfalls erfolgt. Diese Bindung wird als spezifisch angesehen, da sowohl kurze (32 nm) Aktinfilamente als auch Komplexe von Aktinmonomeren und DBP an Gerinnsel binden, deren durchschnittliche Porengrößen mehrere Mikron Durchmesser aufweisen (Rosser et al., Biophys. Chem. 7 (1977) 153). Die Affinität von Aktinmonomeren oder Filamentfragmenten für das Fibringel lässt sich schwer genau bestimmen, da das Vorliegen von Aktin die Struktur der Matrix, an die es bindet, stört (Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta 841 (1985) 151), jedoch legen die Daten von Fig. 4 nahe, dass die Affinität ausreichend hoch ist (Kd < 1 uM), dass sie bei den m vivo wahrscheinlich vorkommenden Konzentrationen von Fibrin und Aktin signifikant ist.
Die Wirkung der Filamentlänge auf die Menge des in das Gerinnsel eingebauten F-Aktins ist genauer in Fig. 5 gezeigt. Bei diesem Experiment wurde eine konstante Menge Aktin (12 uM; 0,5 mg/ml) in Gegenwart verschiedener Mengen Gelsoh'n polymerisiert und zu 6 uM Fibrinogen (2,0 mg/ml) vor der Zugabe von Thrombin gegeben. Da jedes Gelsolin ein Filament hervorbringt und abdeckt, und unter diesen Lösungs-Bedingungen kein ungecapptes Filament existiert, ist die durchschnittliche Anzahl Aktinuntereinheiten pro Filament gleich dem Aktin:Gelsolin-Verhaltnis (Janmey et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 8357), und die durchschnittliche Länge wird aus dem Befund berechnet, dass 370 Untereinheiten in einem Mikron Filament vorliegen (Hanson and Lowy, J. MoI. Biol. 6 (1963) 46). Aufgrund dieser Berechnung reicht die durchschnitth'che Länge der in der Lösung des polymerisierenden Fibrinogens vorhandenen Aktinfilamente von 34 nm bis 2,7 um. Mehr als 80% des Gesamt-Aktins banden an das Gerinnsel, wenn die durchschnitÜiche Filamentlänge sehr lang war, jedoch banden sogar sehr kurze Aktinfilamente, die sich bei hohen Gelsolin:Aktin-Verhaltnissen bildeten, signifikant. Die Bindung kürzerer Filamente als 300 nm hing überdies nicht von ihrer Länge ab, was nahelegt, dass die Wechselwirkung nicht vollständig auf dem Einfangen des Filamentes in den Poren des Fibringels, sondern von einer spezifischen Wechselwirkung zwischen Aktin und Fibrin abhängt. Diese Ergebnisse bestätigen, dass Aktin teilweise unabhängig von sterischen Wechselwirkungen an Fibrin bindet. Die Fig. 5 zeigt ebenfalls, dass die Bindung von F-Aktin an Fibrin nicht von Änderungen der Fibrin-Struktur abhängt, die durch miUimolare Calcium-Ionenkonzentrationen verursacht wird.

Beispiel III - konfokale Mikroskopie

2 mg/ml Fibrinogen wurden mit 6 uM Rhodamin-Aktin in Gegenwart oder Abwesenheit von Gelsolin oder DBP bei Molverhältnissen zu Aktin von 1 : 4 bzw. 2 : 1 gemischt. Die Fibrin-Polymerisation wurde durch Zugabe von 0,1 Units/ml Thrombin gestartet, und 10 ul jeder Lösung wurde auf einem Objektträger in einer Feuchtkammer, bestehend aus einem angefeuchteten Filterpapier in einer zugedeckten Petrischale, untergebracht. Etwa 5 min nach Zugabe von Thrombin, eine Zeit, die etwa der Gerinnungszeit entspricht, wurde ein Deckgläschen auf die Probe gelegt und die Ränder mit Nagellack verschlossen. Bei einem Kontroll-Experiment wurden 10 uM Fluorescein-markiertes Avidin mit Fibrinogen gemischt und die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin gestartet. Eine Minute nach der Herstellung der Objektträger wurden die Proben mit einem an ein Zeiss-Axiovert-Mikroskop angeschlossenen konfokalen Rasterlasermikroskop Bio-Rad MRC 600 untersucht. Zur Abbildung wurde ein 100X (NA 1.3) Plan-Neofluar-Objektiv verwendet und die konfokale Öffnung wurde auf minimale Weite eingestellt. Dies unterstützte die Eliminierung der Fluoreszenz oberhalb und unterhalb der Brennebene, wodurch die Auflösung verstärkt wurde und die Sichtbarmachung einzelnder Fibrinstränge ermöglicht wurde. Die gleiche Laser- Einstellung, Verstärkung und Bildeinstellungen wurden für alle Proben verwendet. Dies ermöglichte einen genaueren Vergleich der Fluoreszenz-Intensitäten.
Fluoreszenz-Mikroskopie. Die konfokale Mikroskopie aktinhaltiger Fibringerinnsel wurde zur direkten Bestimmung der Wechselwirkung von Aktin mit Fibrin durchgeführt. Die Fig. 6a zeigt ein typisches Fluoreszenzbild, erhalten bei Zugabe von Rhodamin-markiertem F- Aktin zu einer Fibrinogen-Lösung vor der Gerinnselbildung, und die Fig. 6b zeigt das entsprechende Phasenkontrast-Bild der Fibrin-Stränge. Die Fluoreszenz des markierten F-Aktins stimmt mit der Struktur des Fibrin-Netzwerkes überein, was die direkte Verbindung von Rhodamin-Aktin mit Fibrin zeigt. Ähnliche Bilder wurden mittels Fluorescein-markiertem F-Aktin erhalten (Daten nicht gezeigt). Die Übereinstimmung zwischen F-Aktin- und Fibrin-Strängen legt nahe, dass sich diese Polymere seitlich aneinander lagern und nicht vollständig durch eine rein unspezifische sterische Überlappung wechselwirken. Wird die Aktinfilament-Länge durch Gelsolin auf 32 nm verkürzt, ist die Fluoreszenz-Markierung des Fibrin-Netzwerkes viel schwächer (Fig. 6c), und es werden einige Bereiche heller Fluoreszenz beobachtet, die Punkten hoher Dichte im Phasenkontrast entsprechen (Fig. 6d). Diese Bereiche können Stellen darstellen, an die kurze Aktinfilamente binden oder im Gerinnsel gefangen sind. Das F-Aktin-Netzwerk ohne Fibrin lässt sich durch konfokale Mikroskopie nicht sichtbar machen, da die unter diesen Bedingungen gebildeten dünnen (9 nm) Aktinfilamente keine Bündel bilden (Janrney et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 8357), und daher ein zu feines Netzwerk erzeugen, das sich mittels konfokaler Mikroskopie nicht auflösen lässt (Fig. 6e und f). Die Inkubation von Rhodamin- Aktin mit DBP vor der Gerinnselbildung verringerte signifikant die Intensität der Fluoreszenzmarkierung von Fibrin, jedoch war noch ein bestimmtes Fluoreszenz-Muster, das mit den Fibrinsträngen übereinstimmte, sichtbar (Fig. 6 g). Diese Ergebnisse stimmen mit den Daten in den Fig. 4 und 5 überein, die eine verringerte, aber noch messbare Bindung von komplexierten Aktin-Monomeren an Fibringerinnsel zeigen. Die Spezifität der Bindung von F-Aktin an Fibrin wird durch den Befund unterstützt, dass wenn Fluorescein-Avidin anstelle von Rhodamin-markiertem F-Aktin vor der Gerinnselbildung zu einer Fibrinogenlösung gegeben wird, keine Fluoreszenzmarkierung der Fibrinstränge erfolgt (Fig. 6 h).

Beispiel IV - Fibrinolyse-Experimente

Aktinhaltige Fibringerinnsel wurden durch zwei unterschiedliche Verfahren lysiert. Beim ersten wurde Fibrin mit oder ohne Aktin durch Zugabe einer relativ hohen Konzentration an Thrombin und einer relativ geringen Konzentration an Plasmin polymerisiert, die so ausgewählt waren, dass die Gelbildung nahezu beendet war, bevor ein signifikanter Abbau von entweder Fibrin oder Fibrinogen erfolgen konnte, wobei das Verfahren von Shen et al. befolgt wurde (Shen et al., J. Biol. Chem. 252 (1977) 6184). Die Fibringele wurden in einem Torsionspendel polymerisiert, und die rheologischen Eigenschaften der Gerinnsel wurden sowohl während der Gerinnselbildung als auch bei der Auflösung gemessen. Die Proben enthielten 3 g/l Fibrin, 0,42 NIH-Units/ml Thrombin und 0,3 CU/ml Plasmin in Lösungen, die 140 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, 2 mM MgCl&sub2;, 2,5 mM CaCl&sub2;, pH-Wert 7,4, enthielten.
Beim zweiten Verfahren wurden Fibringerinnsel (6 uM), mit 6 uM filamentösem Rhodamin-Aktin in Borsilikatglas-Kulturröhrchen durch Zugabe von Thrombin gebildet. Die Gerinnung wurde durch Zugabe von Thrombin (Endkonzentration 0,8 MH-Units/nü) gestartet. Die Gerinnsel wurden 2 Std. bei Raumtemperatur gehalten und dann vorsichtig aus den Röhrchen entfernt und in einem gleichen Volumen Puffer B (2 mM Tris, 0,5 mM ATP, 2 mM CaCl&sub2;, 0,2 mM DTT, 150 mM KCl, 2 mM MgCl&sub2;, pH-Wert 7,4) in Gegenwart oder Abwesenheit physiologischer Mengen Gelsolin (2 uM) getränkt. Die das Gerinnsel umgebende Lösung wurde in verscheidenen Zeitabständen entfernt, und die Fluoreszenz wurde gemessen, um die Menge an Rhodamin-Markierung zu messen, die aus dem Gerinnsel freigesetzt wurde.
Wirkung der Aktin-Filamente auf die Lyse von Fibringerinnseln. Der Einbau von Aktin in ein Fibringerinnsel bewirkt die Hemmung seiner Lyserate durch Plasmin, wie gemessen durch die Freisetzung radioaktiver Fibrinfragmente (Lind und Smith, J. Biol. Chem. 266 (1991) 5273), die nach mehreren Stunden am stärksten wahrnehmbar ist. Da der Verlust der Strukturintegrität eines Gerinnsels (wie es durch sein Elastizitätsmodul angezeigt wird) eine der ersten Folgen der Lyse ist (Shen et al., J. Biol. Chem. 252 (1977) 6184), führten wir die in Fig. 7 gezeigten Experimente durch, um zu bestimmen, ob sich die Wirkung von Aktin auf die Gerinnsellyse zu einem früheren Zeitpunkt nachweisen lässt. Der Einbau langer (Fig. 7A) und kurzer (Fig. 7B) Aktinfilamente in Fibringele verzögerte sowohl den Anstieg des Schermoduls während der Gerinnselbildung als auch die plasmininduzierte Abnahme des Schermoduls während der Lyse. Die Auswirkungen der eingebauten (sowohl Fibrin-gebundenen als auch sterisch gefangenen) Aktinfilamente wurde 20 min nach Beginn der Lyse sichtbar. Die Wirkungen des Aktin-Einbaus in ein Gerinnsel bewirken eine schnellere Änderung der physikalischen Eigenschaften des Gerinnsels unter lytischen Bedingungen, als durch die Rate der Freisetzung von Fibrinfragmenten in das Lysebad angezeigt wird. Viskoelastizitäts-Kontrollmessungen verifizierten, dass F-Aktin selbst im zeitlichen Verlauf dieser Experimente nicht durch Plasmin abgebaut wurde (Daten nicht gezeigt).

Beispiel V - Elution von Aktin aus Fibringerinnseln

Da es von potentieller therapeutischer Bedeutung ist, zu wissen, ob in Fibringerinnsel gefangene Aktinfilamente aus dem Gerinnsel eluiert werden können, wurden aktinhaltige Gerinnsel in Gegenwart oder Abwesenheit von Plasma-Gelsolin inkubiert. Gereinigtes Fibrinogen wurde in einer Konzentration zwischen 2 und 3 mg/ml in einem Imidazol- oder Tris-Puffer hergestellt. Der pH-Wert betrug 7,4. Die Ionenstärke betrug nicht mehr als 150 mM und im Optimalfall 100 mM. Calcium war zu 0,3 mM zugegen. Aktin war in einer Konzentration von 6-20 uM zugegen. ATP war zu 10 uM - 10 mM zugegen. Es war dann möglich, ein 1 mm Gerinnsel in einer Chromatographie-Säule mit 1 cm Durchmesser zu bilden, indem die Säule verstopft, mit 0,5 ml Fibrinogen-Lösung gefüllt und das Fibrinogen mit etwa 1/10 einer NIH-Einheit pro mm Thrombin geronnen wurde. Auf diese Weise war das Gerinnsel nach seiner Bildung mechanisch so gefestigt, dass es einer Rüssigpermeation ohne Kollabieren widerstand, und porös genug, dass es eine Flüssigpermeation in einer Rate von etwa 0,2 ml pro min. ermöglichte.
Das Fibrinogengerinnsel bildete sich in etwa 1 bis 10 min. Nach der 10-fachen Gerinnungszeit wurden zwischen 1 und 10 cm Druck an das Chromatographie-Röhchen angelegt. D. h. die zur Permeation des Gerinnsels verwendete Flüssigkeit wurde ungefähr zwischen 1 und 10 cm oberhalb des Gerinnsels gehalten. Der Spiegel des Inkubationspuffers wurde dann eingestellt, bis die Fließgeschwindigkeit etwa 0,2 ml pro min betrug. Der Meniskus des Gerinnsels wurde auf Kollabieren überwacht. Der Druck wurde durch Überwachen des Gerinnselmeniskus überwacht. Puffer konnte durch das Gerinnsel permeieren. Der Puffer war identisch zu dem, in dem Fibrinogen gelöst war (der Puffer, in dem das Gerinnsel erzeugt wurde). Dieser Puffer enthielt kein Gelsolin. Unspezifisch gebundenes Protein wurde mit dem Puffer vom Gerinnsel abgewaschen. Dann wurde Gelsolin zum Puffer gegeben und etwa 1 bis 5 min durch das Gerinnsel gewaschen. Das in dem Gerinnsel enthaltene Aktin wurde durch Gelsolin gespalten und eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immuno-Blotting mit anti-Aktin-Antikörper auf Aktin untersucht. In früheren Experimenten wurde Fluoreszenz-markiertes Aktin spektralphotometrisch überwacht. Durch dieses Verfahren ließ sich etwa 80% des im Gerinnsel gehaltenen Gesamt-Aktins entfernen, indem es mit Lösungen permeabel gemacht wurde, die zwischen 1 und 5 uM Gelsolin enthielten.
Wie in Fig. 8 gezeigt, bewirkte die Inkubation der Gerinnsel, die Rhodamin-Aktin in physiologischen Konzentrationen (2 uM) des Plasma-Gelsolins enthielten, einen Verlust des meisten Aktins aus den Gerinnseln. Da die Fluoreszenz von Rhodamin-markiertem F- Aktin höher ist als diejenige von freiem Rhodamin oder Rhodamin-Aktin-Monomeren, wird die Menge an Markierung, die in das Medium abgegeben wird, etwas durch die Fluoreszenz des Mediums, verglichen mit derjenigen der anfangs markierten F-Aktin-Lösung, unterschätzt. Die Menge an markiertem Aktin, die am Gerinnsel gebunden bleibt, stimmt mit den in Fig. 2 gezeigten Ergebnissen überein. Die Elution aus den Gerinnseln stellte zudem die Empfänglichkeit gegenüber Plasmin-vermittelter Lyse, wie optisch bewertet wurde, wieder her. Die Untersuchung nach 18 Std. ergab makroskopische Überbleibsel derjenigen Gerinnsel, die Plasma-Gelsolin nicht ausgesetzt waren, wohingegen Gerinnsel, die in Plasma- Gelsolin enthaltenden Lösungen inkubiert worden waren, vollständig aufgelöst waren. Der Verlust von Gerinnsel-assoziiertem Rhodamin zeigt keine vollständige Lyse, sondern eher die Spaltung des Rhodamin-markierten terminalen Dipeptids von Aktin durch Plasmin (Mornet und Ue, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 3680).

Claims

1. Verfahren zum Eluieren und Quantifizieren von Aktin in einem aktinhaltigen Gerinnsel, umfassend die Schritte:

(1) Entnahme von Plasma aus einem Individuum mit Gewebeverletzung;

(2) Ermöglichen, dass das Plasma in vitro ein Gerinnsel bildet;

(3) Isolieren des in (2) entstandenen Gerinnsels;

(4) Inkubieren des Gerinnsels in flüssigem Medium mit einer aktinbindenden Verbindung;

(5) Quantifizieren der Menge Aktin in diesem Medium.

2. Verwendung von mindestens einer aktinbindenden Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglich Vehikel zur Herstellung eines Arzneimittels zur Reduzierung der Aktinmenge in einem aktinhaltigen Gerinnsel in einem Individuum mit dem aktinhaltigen Gerinnsel.

3. Verwendung von mindestens einer aktinbindenden Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel zur Herstellung eines Arzneimittels zur Wiederherstellung der normalen viskoelastischen Eigenschaften und der Empfänglichkeit gegenüber plasminvermittelter Lyse von Gerinnseln, die in einem Individuum nach Gewebeverletzung entstanden sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die aktinbindende Verbindung Gelsolin oder ein aktives Fragment davon ist.

5. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 4, wobei das aktive Fragment das Chymotrypsin-Fragment CT45 ist.

6. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 4, wobei das aktive Fragment die Aminosäurereste 25 bis 165 von Gelsolin enthält.

7. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 4, wobei das aktive Fragment die Aaminosäurereste 1 bis 260 von Gelsolin enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die aktinbindende Verbindung Vitamin-D-bindendes Protein oder ein aktives Fragment davon ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei eine aktinbindende Verbindung Gelsolin oder ein aktives Fragment davon ist und eine weitere aktinbindende Verbindung Vitamin-D-bindendes Protein oder ein aktives Fragment davon ist.