PT655089E - Efeitos dos filamentos da actina sobre a estrutura e a lise dos coagulos de fibrina - Google Patents

Description

Descrição “Efeitos dos filamentos da actína sobre a estrutura e a lise dos coágulos de fibrina”

Campo da invenção A presente invenção descreve genericamente métodos terapêuticos e de diagnóstico para tratar pacientes com lesões teciduais em que a actína extracelular livre está associada aos coágulos de sangue. A presente invenção descreve um método para pesquisar a quantidade de actína existente num coágulo de fibrina. O método consiste em determinar invitro a quantidade de actína no coágulo, por incubação desse coágulo in vitro com proteínas que se ligam à actína. A invenção visa especificamente a incubação de tais coágulos na presença da proteína gelsolina que se liga à actína do plasma e na presença da proteína que se liga à vitamina D. A invenção também tem por objecto descrever métodos para remover a actína dos coágulos de sangue in vivo, mediante a administração de proteínas que se ligam à actína a pacientes com coágulos de sangue.

Antecedentes da invenção

As lesões dos tecidos dão origem à activação de uma cascata de coagulação, levando à deposição de fibrina. Durante os fenómenos inflamatórios, moléculas que normalmente não se encontram no plasma podem penetrar no espaço extracelular, afectando potencialmente a coagulação do sangue. Algumas dessas moléculas podem resultar da acção das proteases celulares sobre os constituintes normais do plasma (v.g. o fibrinogénio), da libertação de grânulos dc cclulas inflamatórias ou do desmembramento das membranas celulares do plasma.

Estudos exaustivos sobre os efeitos dos produtos de degradação do fibrmogénio sobre a formação de coágulos de fibrina (Shen et al., J. Biol. Chem. 252:6184 (1977)) vieram proporcionar informação importante sobre os mecanismos segundo os quais os fenómenos inflamatórios originam alterações no processo de coagulação do sangue. As moléculas que alteram a formação do gel de fibrina e a estrutura dos coágulos (Dahll et al., Thromb. Haemost. 35:17,1 (1976); Carr e Gabriel, J. Lab. Clin Med 96:985 (1980); Gabriel et al., J. Lab. Clin Med 707:545 (1983); Chow et al., Thromb. Res. 29:243 (1983); Cair et al.,J. Lab. Clin Med 110:141 (1987); Kamykowski et al., Biophys. Chem. 13:25 (1981); Procyk e King, Biopolymers 29:559 (1990)) podem desempenhar uma função na determinação da eficácia hemostática dos coágulos de fibrina e também na sua capacidade para mediarem a fibrinólise dependente da fibrina (Suenson e Petersen, Biochim. Biophys. Acta §70:510 (1986); Dhall et al., Thrombos Haemostas 49:42 (1983)).

As lesões dos tecidos dos animais dão origem à libertação de actina dentro do espaço extracelular, incluindo a corrente sanguínea. A actina é a proteína mais abundante existente nas células dos animais, constitui entre 10% e 20% das proteínas de muitas células nucleadas e constitui 30% das proteínas das células dos músculos. Cada molécula de actina liga-se a uma molécula de ATP e auto-organiza-se com outras moléculas do mesmo tipo, dando origem à formação de filamentos compridos num processo em que a moléculas de ATP é hidrolisada para dar origem a uma molécula de ADP. Embora aproximadamente metade da actina das células não musculares seja a actina F (forma de actina filamentosa, de tipo bastonete de hélice dupla, que é constituída a partir de monómeros da actina G), as condições tónicas dos fluídos extracelulares favorecem a polimerização da actina, pelo que virtualmente seria de prever qne toda a actina no sangue libertada a partir das células que estão a perecer polimerizasse, dando origem a filamentos (Lind et al., Am. Rev. Respir. Dis. 735:429-434 (1988)). Em soluções purificadas, na ausência de proteínas que encurtem os filamentos, os filamentos de actina podem atingir facilmente comprimentos de vários micra. No entanto, nos casos em que algumas fiacções da actina libertada a partir de células lesionadas sejam irreversivelmente desnaturadas ou mesmo ligadas a uma das proteínas que se ligam à actina intracelular, conforme se disse antes, tal actina deveria permanecer monomérica. A actina tem sido encontrada em concentrações micromolares no plasma ou no soro de animais ou de seres humanos que sofreram diversos tipos de lesões teciduais (Smith et al., J. Lab. Clin. Med. 770:189 (1987); Smith et al, Am. J. Pathol. 730:261 (1988); Smith et al., Blood 72:214 (1988); Goldschmidt-Clermont et al., Gastroenterology 94:1454 (1988); Lee et al., Hepatology 7:825 (1987); Lee et al., Circ. Shock 28:249 (1989); Lind et al., Am. Rev. Resp. Dis. 735:429 (1988)). In vitro, esta proteína globular organiza-se em filamentos de tipo bastonete com um comprimento de muitos micra e in vivo altera-se rapidamente, assumindo modificações entre formas monoméricas e poliméricas, segundo um processo que é regulado no citoplasma por diversas proteínas que se ligam à actina (Stossel et al., Ann. Rev. Cell Biol. 7:353 (1985)). Quando acrescentados a soluções de fibrinogénio, os filamentos de actina podem interferir com o processo da formação dos coágulos de fibrina, impedindo espacialmente a difusão das protofibrilas de fibrina em feixes (Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta 547:151 (1985)).

Devido à existência de grandes quantidades de actina nas células, a libertação de actina a partir das células moribundas proporciona a quantidade de actina suficiente para que haja um efeito significativo no microambiente, aumentando a viscosidade do fluido do plasma extracelular, capturando as células, por meio de outros efeitos tóxicos ainda não identificados, e modificando, conforme se explica adiante, as propriedades físico-químicas dos coágulos de fibrina. A infusão de actina extracelular livre é tóxica para os tecidos dos animais e em especial para os sistemas renal e cardiopulmonar (Harper et ai, Clin Res 36:625A 81988); Haddad et d, Proc. Natl. Acad Sei USA §7:1381-1385 (1990)). A insuficiência renal aguda é uma complicação de lesões musculares e as infusões de actina nos ratos induzem um aumento transitório dos níveis de NUS (o mesmo que BUN) e de creatinina, consistente com α insuficiência renal.

Além disso, uma vez que cada molécula de actina extracelular num filamento está associada a uma molécula de ADP, a presença de actina extracelular no sangue tem tendência a induzir ou a fazer aumentar a agregação de plaquetas, de uma forma que pode não ser vantajosa para o hospedeiro (Lind et d., Am. Rev. Respir. Dis. 735:429-434 (1988); Scarborough et d., Biochem. Biophys. Res. Commun. 700:1314-1319(1981)). Há inúmeras proteínas que se associam naturalmente com a actina (para um estudo sobre proteínas que se ligam à actina leia-se a obra de Stossel et d., Am Rev. Cell Biol. 7:353-402 (1985); Pollard et d., Am. Rev. Biochem. 55:987-1035 (1986)). No entanto, há duas proteínas, a gelsolina (também designada por “brevina” e “factor despolimerizante da actina”) e a proteína de ligação à vitamina D (também designada por globulina GC) (PLD, o mesmo que DBP) sobre as quais se presume que sejam responsáveis fundamentalmente pela ligação da actina extracelular (Janmey et d., Blood 70:529-530 (1987)). O plasma do sangue dos mamíferos contém concentrações micromolares destas duas proteínas que se ligam à actina com elevada afinidade. (Janmey e Lind, Blood 70:524 (1987)). As proteínas que se ligam à actina com elevada afinidade ligam-se à actina com um factor Kd inferior a IO"8. Tanto a gelsolina como a PLD se ligam à actina no soro e possuem uma actividade despolimerizante da actina. A PLD liga-se preferencialmente à actina monomérica, ao passo que a gelsolina se liga preferencialmente aos filamentos de actina. O documento WO-A-9115770 descreve um método para fazer baixar a concentração de actina livre no plasma de animais, o qual consiste em administrar-lhes proteínas que se ligam à actina (v.g. a gelsolina). A gelsolina é uma proteína multifuncional que se liga à actina, obtida a partir do citoplasma e dos fluidos extracelulares dos mamíferos. A gelsolina do plasma difere da gelsolina celular apenas pelo facto de ter mais 25 aminoácidos no terminal amino da molécula, sendo as duas gelsolinas o produto de um único gene. A gelsolina do plasma possui três locais de ligação da actina e liga-se com elevada afinidade quer à actina G quer à actina F. A gelsolina do plasma liga-se a uma segunda molécula de actina com uma afinidade superior àquela com que se liga a uma primeira molécula de actina e assim forma prefe-rencialmente mais complexos de tipo 2:1 do que complexos de tipo 1:1 e liga-se aos filamentos melhor do que aos monómeros. Quando acrescentada à actina F, a gelsolina do plasma vai cindir o filamento de uma forma não proteolítica e continua ligada a uma extremidade do filamento recém-formado. Se estiverem presentes moléculas de gelsolina livres, estas vão cindir o filamento de actina sucessivamente, até haver apenas complexos de actina:gelsolina 2:1, assim despolimerizando rapidamente o filamento.

As moléculas de gelsolina livres e combinadas (com a actina) diferem entre si pelas suas propriedades funcionais. Embora a gelsolina livre possa cindir os filamentos de actina, os complexos de actina:gelsolina não conseguem realizar tal acção. A principal função da gelsolina no plasma consiste em cindir os filamentos de actina. Se houver mais gelsolina do que actina, apenas se irão formar complexos de gelsolina:actina; se o excesso de actina for bastante superior, aparecem oligómeros de actina livre e complexos de gelsolina:actina. A cisão provocada pela actina ocorre por meio de uma clivagem não pro- teolítica da ligação não covalente entre moléculas adjacentes de actina (subunidades). A actividãde divisora da gel solina é activada pelo Ca micromolar e demonstrou-se já que é inibida pelos compostos fosfatidil-inositol-bisfosfato (PIP2) e fosfatictil-inositol-monofosfato (P1P). Uma vez que as concentrações do Ca2+ extracelular são de ordem milimolar e tendo em conta que os fluidos extracelulares normalmente não contêm nem PIP nem PIP2 numa forma que iniba a gelsolina, então a gelsolina do plasma é constitutivamente activa nos fluidos extracelulares.

Por outro lado, a proteína que se liga à vitamina D (PLD) possui um único local de ligação da actina e liga-se apenas à actina monomérica (Van Baelin et al., J Biol. Chem. 255:2270 (1980); Haddad, J.G., Arch Biochem. Biophys. 213:538 (1982)). Tanto a gelsolina do plasma como a PLD servem para remover a actina da circulação (Lind et al., J. Clin Invest. 78:136 (1986); Harper et al., J. Clin. Invest. 79:1365 (1987); Goldschmidt-Clermont et al., J. Clin. Invest. Si :1519 (1988)). Recentemente comprovou-se que a PLD evita as tromboses microvasculares, mediante a injecção de actina monomérica em animais de laboratório (Haddad et al.,Proc. NatlAcad Sei. USA S7:1381 (1990)). Assim, a gelsolina do plasma e a PLD constituem um sistema de defesa concebido para proteger o hospedeiro contra os efeitos nocivos da actina libertada na circulação.

Foi já sugerido que a ligação de actina extracelular à gelsolina ou à PLD confere protecção contra a formação da actina F na circulação e pode ser eventualmente o mecanismo segundo o qual a actina é seleccionada para ser removida da corrente sanguínea (Lind et al., J. Clin. Invest 78:736-742 (1986); Sanger et al., Clin Res. 3&.625A (1988)). Por exemplo, sabe-se que os complexos de actina:gelsolina circulantes aparecem a seguir a lesões pulmonares induzidas pelo ácido oleico em coelhos c gatos (Smith et al., Am. J. Path. 130:261-261 (1988)) e na hemólise induzida nos coelhos com fenil-hidrazina (Smilh et al., Blood 72:214-218, (1988)). Na prática clínica vcrifica-sc que os níveis de gelsolina são diminutos em pacientes que padeçam da síndroma das dificuldades respiratórias dos adultos (SDRA) (Lind et al., Am. Rev. Respir. Dis. 138:429-434 (1988)) e no plasma de pacientes com uma infecção aguda de malária provocada por M. falcipamm (Smrth et al., Blood 72:214-218 (1988)), sendo detectáveis complexos de gelsolina: actina no sangue de tais pacientes. Além disso, foram observados complexos de actina com PLD no plasma de pacientes com necrose hepática fulminante (Young et al., J. Lab. Clin. Med 7/0:83 (1987). Também foi já sugerido que é possível detectar, uma vez que é excedida a capacidade das proteínas do plasma para se ligarem à actina livre extracelular, a formação de filamentos intravasculares e lesões endoteliais (Harper et al., Clin. Res. 36:625A (1988); Haddad et al., Proc. Natl. Acad Sei. 57:1381-1389 (1990)). A gelsolina foi já clonada (Kwiatkowski et al., Nature 323:455-458 (1986); Kwiatkowski et al., J. Cell Biol. 700:375-384 (1988) e foram já identificados os fragmentos da proteína natural que conservam a capacidade para se ligarem à actina (Byran, J., J. Cell Biol. 706:1553-1562 (1988); Yin et al., J. Cell Biol. 707:465a (1988), resumo n° 2616); Kwiatkowski et al., J. Cell

Biol. 705:1717-1726 (1989); Way et al., J. Cell Biol. 709:593-605 (1989)). A PLD também foi já clonada (Cooke et al., J. Clin. Invest. 76:2420-2424 (1985); Yang et al, Proc. Natl.

Acad Sei. USA 52:7994-7998 (1985)). A hemostase depende de um equilíbrio entre a formação e a dissolução de coágulos constituídos por redes de fibrina e proporções variáveis de outras proteínas do plasma e células do sangue. Estas redes formam-se por polimerização de monómeros de fibrina, dando origem a protofibrilas, e pela subsequente associação lateral das protofibrilas, dando origem a feixes, o que tem lugar numa mistura complexa (e potencialmente variável) de outras proteínas. Uma vez que a formação de coágulos de fibrina é sensível aos efeitos das macromoléculas que impedem a difusão das cadeias poliméricas em crescimento, há inúmeras moléculas fisiologicamente importantes, tais como IgG, fibronectina, albumina, gjicosamino-giicanos, etc. (Cair e Gabriel, J. Lab. Clin. Med 96:985 (1980); Gabriel et al., J. Lab. Clin Med. 101:545 (1983); Cair et al., J Lab. Clin. MecL 110:141 (1987); Cair et al., J. Lab. Clin. Med 107:199 (1986); Cair et al., Thromb. Res. 45:539 (1987); Carr et al., Biochemistry 28:1384 (1989)) que alteram a estrutura dos geles de fibrina.

Muitas destas substâncias são constituintes normais do plasma e podem explicar parcialmente as diferenças comprovadas entre os coágulos do plasma e aqueles que são formados a partir do fibrinogénio purificado. Estudos destes efeitos sobre os coágulos de fibrina vieram levantar a hipótese de haver mecanismos segundo os quais os fenómenos inflamatórios conduzem a alterações no processo da coagulação do sangue (Carr, M.E., Thromb. Haemost. 59:535 (1988)).

Os coágulos que se formam em locais de lesões teciduais são no entanto provavelmente diferentes daqueles que se formam a partir do plasma normal e podem conter proteínas libertadas a partir de plaquetas, leucócitos, células endoteliais ou outros tipos de células lesionadas e também proteínas de fase aguda. Apesar de muita da investigação anterior sobre tendências hemorrágicas e trombóticas, observadas em pacientes que padecem de diferentes forma de lesões teciduais ter incidido sobre a desregulação dos sistemas coagulantes e fíbrinolíticos, genericamente conhecidos pela designação de coagulação intravascular disseminada; pouca atenção foi prestada à estrutura e à função dos coágulos que se formam em tais pacientes, os quais poderiam ser alterados por meios clinicamente significativos. As mudanças conformacionais nos coágulos de fibrina, por exemplo, podem fazer com que passem a ser mais sensíveis à destruição ocasionada por forças mecânicas, quer existam naturalmente na rede vascular ramificada quer sejam impostas por meio de aparelhos médicos, tais como os oxigenadores membranares ou os ventiladores mecânicos. Em alternativa, as alterações da estrutura dos coágulos pode afectar a sua sensibilidade à plasmina proteica fibrinolítica, fazendo com que passem a ser mais resistentes à acção da plasmina, de uma forma análoga à que foi já descrita para um paciente com uma disfibrinogenemia congénita (Carrell et cd., Blood 02:439 (1983)). A possibilidade de a actina e talvez outras proteínas intracelulares libertadas durante traumas teciduais poderem exercer esses efeitos é sugerida pelo facto de se ter descoberto que o material libertado a partir de plaquetas altera simultaneamente a estrutura e a lise de coágulos de fibrina in vitro (Dhall et cd., Thrombos Haemostas 49:42 (1983)).

Sabe-se que a actina dificulta a sequência normal dos fenómenos de coagulação do sangue e fibrinolíticos. Descobertas recentes sobre a interaeção da actina com as proteínas fibrinolíticas permitem concluir que a actina pode afectar eventualmente a estrutura e a actividade do gel de fibrina. A actina é capaz de favorecer a formação de plasmina quando acrescentada a soluções que contenham Glu-plasminogénio e t-PA (Lind e Smith, J. Biol. Chem. 266:17673 (1991)). No entanto, quando coágulos que contêm actina são colocados num banho de lise que contém plasminogénio e t-PA, a lise dos coágulos é inibida. Embora experiências efectuadas com proteínas purificadas sugiram que a actina é um inibidor plasmínico não competitivo (Lind e Smith, J. Biol. Chem. 266:5212» (1991)), um certo efeito da actina sobre a estrutura dos coágulos de fibrina também pode ser responsável por uma parte dos seus efeitos inibitórios sobre a lise dos coágulos. Já anteriormente foi demonstrado que a actina interactua com a fibrina (Laki e Muszbek, Biochim. Biophys. Acta 371:519 (1974)) c pode reticular-se com ela in vitro por acção do factor XDIa (Mui e Ganguly, Am. J. Physiol. 233:H346 (1977)). Foi já assinalado que os filamentos de actina alteram a estrutura dos coágulos de fibrina, daí resultando a formação de coágulos finos e menos turvos. A adição da gelsolina, que é uma proteína que encurta os filamentos de actina, contraria este efeito, significando isso que os filamentos de actina interactuam com as fibrilas de fibrina, inibindo a sua associação lateral (Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta841:\5\ (1985)). A reologia dos coágulos de fibrina é pois um aspecto importante do seu funcionamento fisiológico. A presente invenção tem por base a descoberta dos efeitos da actina sobre as propriedades mecânicas dos coágulos de fibrina.

Considera-se de valor clínico um ensaio que possa ser utilizado para avaliar a quantidade de actina nos coágulos de fibrina in vivo, particularmente se tiver ocorrido uma vasta lesão tecidual. Tal método pode ser utilizado como meio de diagnóstico para a determinação dos regimes terapêuticos necessários para contrariar o efeito da actina extracelular livre em pacientes lesionados. Também se considera de importância terapêutica um regime de tratamento que remova a actina de um coágulo que a contenha, com a finalidade de restituir aos coágulos in vivo as suas propriedades viscoelásticas normais.

Descrição das figuras

Figura 1. Efeito da actina F sobre a reologia da fibrina. Aumento do módulo de Young dinâmico (G’) a seguir à adição de trombina ao fibrinogénio, medido pelas deformações tangenciais oscilatórias com amplitude de deformação de 2% e frequência angular de 10 rad/s (1,6 Hz). Trabalhou-se com uma concentração de fibrinogénio de 2,0 mg/mL e com uma concentração da actina em mg/mL com a seguinte identificação: 0 (círculos em branco); 0,2 (triângulos em branco); 0,4 (triângulos a cheio); 1,0 (círculos a cheio). Todas as soluções continham NaCl 150 mM, CaCh 2,2 mM, ATP 150 μΜ, MgCl2 1,9 mM a pH 7,4. Juntou-se actina G ao fibrinogénio e decorridos 10 segundos acrescentou-se também 0,1 unidades de NIH/mL de trombina.

Figura 2. Eliminação do endurecimento esforçado dos geles de fihrina por acção da actina F. Módulo de elasticidade tangencial dos geles de fibrina com concentrações variáveis de actina F aos valores indicados, medido num intervalo de variação de deformações para uma frequência angular constante de 10 rad/s (1,6 Hz). As condições de rcacção e os significados dos símbolos estão indicados na legenda da figura 1.

Figura 3. A segmentação da actina F por acção da gelsolina inverte o seu efeito sobre o endurecimento esforçado e a histerese da fibrina. Está indicado o módulo elástico tangencial G’ para medições a 10 rad/s num intervalo de amplitudes de deformação que vai aumentando progressivamente desde 1% até 37% (A) ou 30% (B e C) (círculos em branco). A seguir à deformação para a amplitude máxima do esforço, efectuou-se a repetição das medições de G’ para amplitudes do esforço máximo sequencialmente decrescentes para se avaliar a recuperação das amostras após a deformação (círculos a cheio). Os três painéis mostram os resultados obtidos apenas com fibrina à razão de 2 mg/mL (A); fibrina mais actina F à razão de 0,2 mg/mL (B); e fibrina mais oligómeros de actina (complexos de actinargelsolina a 3:1) (C). Outras condições relevantes estão indicadas na legenda da figura 1.

Figura 4. Ligação dos filamentos e complexos de actina aos geles de fibrina. Foram acrescentadas quantidades diversas de actina F por si só, marcada com rodamina (círculos em branco), ou de actina, polimerizada na presença de PLD (círculos a cheio) ou de gelsolina (triângulos), ao fibrinogénio (2 mg/mL; 6 μΜ) em T7 (NaCl 100 mM, Tris 50 mM-Cl a pH 7,4) antes da formação dos coágulos por adição de 1,7 unidades de NIH/mL de trombina. A proporção molar entre a PLD e a actina foi de 2:1 e a proporção molar entre a gelsolina e a actina foi de 1:2 (triângulos a cheio) ou de 1:12 (triângulos em branco). Removeu-se da solução a actina ligada, enrolando o coágulo insolúvel numa pipeta de vidro, e mediu-se a quantidade de actina associada ao coágulo em função da diferença entre a fluorescência da amostra antes e após a remoção do coágulo, conforme descrito no texto.

Figura 5. Efeito do Ca2+ e do comprimento dos filamentos de actina sobre a ligação da actina à fíbrina. Polimerizou-se a actina com diversas proporções molares de gelsolina para produzir filamentos com comprimentos médios variáveis entre 34 nm e 2,7 μιη. Misturou-se 6 μΜ de actina polimerizada com 6 μΜ de fibrinogénio em soluções que continham NaCl 100 mM e Tris 50 mM-Cl a pH 7,4, na presença (círculos a cheio) ou na ausência (círculos em branco) de CaCh 3 mM e mediu-se a actina ligada à fibrina a seguir à adição de 1,7 unidades de MH/mL de trombina, conforme descrito no texto.

Figura 6. Imagens dos coágulos de fibrina que contêm actina, obtidas por fluorescência confocal (a, c, e, ge h) e contraste de fase (b, d e f). A adição de actina F, marcada com rodamina, ao fibrinogénio, antes da formação de coágulos induzida pela trombina, originou filamentos marcados de forma fluorescente (painel a). A correspondente imagem por contraste de fase (painel b) comprova que a fluorescência da actina marcada se co-localiza com as cadeias de fibrina. A incubação de actina-rodamina conjuntamente com gelsolina (painéis c e d), antes da formação dos coágulos, teve como resultado uma marcação fluorescente reduzida da rede de fibrina. Na ausência de trombina não é possível analisar com um microscópio confocal (painel e) os filamentos de actina fluorescentes. A correspondente imagem por contraste de fase (painel f) comprova que não houve formação de coágulos de fibrina. A inibição da poli- merização da actina por acção da PLD originou uma marcação fluorescente reduzida das cadeias de fibrína (painel g). Demonstra-se a especificidade da interacção da actina com a fihrina no painel h que ilustra a ausência de fibrína fluorescente quando se juntou fluorescema-avidina ao fíbrinogénio antes da formação dos coágulos induzida pela trombina (painel h). Os painéis c e g estão correlacionados com os dados que ilustram a ligação reduzida dos monómeros de actina, combinados de forma complexa com a gelsolina e a PLD, aos geles de fibrína (ver as figuras 4 e 5). A barra horizontal de escala no painel h é de 9 pm para todos os painéis.

Figura 7. Efeito do comprimento dos filamentos de actina sobre a reologia da fibrína durante o desmembramento (lise) dos coágulos com plasmina. Aumento e diminuição do módulo dinâmico de deformação angular (G’), medido com o pêndulo de torção, da fibrína por si só (círculos em branco) ou da fibrína com actina (círculos a cheio) em função do tempo. A concentração do fibrinogénio foi de 3 mg/mL e a concentração da actina F foi de 0,25 mg/mL. Os painéis A e B mostram os resultados obtidos respectivamente na ausência e na presença de gelsolina numa proporção molar de 1:12 relativamente à actina. Todas as soluções contêm NaCl 140 mM, Tris 20 mM-Cl, MgCk 2 mM, CaCk 2,5 mM a pH 7,4 com 0,4 unidades de ΝΓΗ/mL de trombina e 0,3 unidades/mL de plasmina

Figura 8. Efeito da gelsolina externa sobre a libertação da actina a partir dos coágulos de fibrína. Os coágulos contendo fibrína e actina foram preparados em tubos de vidro por adição de 1,5 unidades de NIH/mL de trombina As concentrações do fibrinogénio e da actina marcada com rodamina foram de 6 pM (respectivamente 2,0 mg/mL e 0,25 mg/mL). Uma vez formados, os coágulos foram removidos com pipetas de vidro e mergulhados em banhos que continham tampão B (círculos em branco) ou tampão B + gelsolina à razão de 0,2 mg/mL (2 pM) (círculos a cheio). Mediu-se a libertação da actina a partir dos coágulos em função da 14 fluorescência libertada no meio de imersão, conforme descrito no texto. A fluorescência máxima foi obtida a seguir ao desmembramento (lise) dos coágulos com plasmina à razão de 1,3 unidades/ /mL no momento maicaao peia sera.

Descrição abreviada da invenção A presente invenção tem por base a conjectura do inventor que presume que a administração de compostos que se ligam à actina, ou dos seus derivados biologicamente activos, a pacientes após lesões teciduais irá conferir protecção aos outros tecidos saudáveis, graças à restituição das propriedades viscoelásticas normais dos coágulos que contenham actina. Assim sendo, constitui um objecto da presente invenção proporcionar um método para fazer baixar os níveis de actina em coágulos formados na corrente sanguínea e no espaço extracelular de um animal. É pois um objecto da presente invenção proporcionar um método para libertar a actina nos coágulos que contenham actina formados in vivo. Constitui um outro objecto da presente invenção proporcionar tratamentos terapêuticos que possam ser utilizados para tratar um animal para lhe conferir protecção contra lesões teciduais secundárias que venham a ocorrer devido aos níveis anormais de actina, de tal modo que se formem in vivo coágulos com propriedades viscoelásticas modificadas. A presente invenção também se fundamenta no facto de o inventor ter descoberto que os filamentos de actina capturados nos coágulos de fibrina podem ser eliminados dos coágulo por incubação na presença de uma proteína que se liga à actina, sendo depois quantificados. Assim sendo, a presente invenção também tem por finalidade proporcionar um procedimento de importância terapêutica potencial em que se isola o plasma de pacientes com lesões teciduais. se uenuite a formação dc coágulos c sc cfcctua subseauentemente a incubação dos coágulos na presença de uma proteína que se iiga à actina. sendo depois auantincaaa a ac;. assim libertada. Este procedimento constitui um protocolo dc análise paro se avaliar a quantidade de actina capturada nos coágulos de fibrina in vivo no plasma de pacientes com diversos tipos de lesões teciduais.

Constitui pois um objecto da presente invenção proporcionar um método para avaliar com rigor as propriedades de coágulos em pacientes in vivo, possuindo esses pacientes vastas lesões teciduais, mediante a quantificação da quantidade de filamentos de actina aprisionados nesses coaguios.

Descrição das variantes preferenciais

Com o intuito de elucidar de forma mais clara e consistente a memória descritiva e as reivindicações anexas, incluindo o significado atribuído a determinados termos, apresenta-se seguidamente um conjunto de definições.

Composto que se liga à actina. A expressão “composto que se liga à actina” designa qualquer composto e em especial qualquer proteína (ou péptido) que seja capaz de se ligar à actina de modo a modificar qualquer das inúmeras funções da actina, incluindo a supressão da capacidade dos monómeros de actina para polimerizarem em filamentos, e que seja praticamente isento de contaminantes naturais que se associem com esse composto quer in vivo (num hospedeiro procariótico ou eucariótico) quer in vitro (como resultado de uma síntese química) Tais compostos englobam, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as proteínas extracelulares de ligação à actina, tais como a gelsolina e a PLD, e as proteínas intracelulares de ligação à actina, tais como aquelas que são as mais abundantes nas células - - .-í««n,n miosmas. troponuosinas. oroniiiia e cofiiina) c aouelas ouc são as maia abundantes em células não musculares. Os compostos que se ligam à actina, abrangidos no âmbito dos métodos da presente invenção, também compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os seleccionados entre a) compostos que se ligam à actina e que predominantemente sequestram monómeros de actina, ou seja, ligam os monómeros num complexo que é resistente à polimerização (por exemplo, PLD, profilina, depactina, cofUina e DNase I); b) compostos que se ligam à actina e que sequestram monómeros e possuem actividade fragmen-tadora dos filamentos (por exemplo, gelsolina, vilina, fragmina e severina); c) compostos que se ligam à actina e que predominantemente bloqueiam as extremidades dos filamentos de actina e impedem as trocas de monómeros com essa extremidade (por exemplo, proteína de remate, actinina β e acumentina); e d) moléculas não proteicas que se ligam à actina e que possuem tais efeitos sobre a actina (por exemplo, citocalasina ou os seus derivados biologicamente activos que bloqueiam as extremidades dos filamentos de actina).

Se desejado, é possível administrar ao paciente esses compostos sob a forma de um sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Fenómeno trombótico. A expressão “fenómeno trombótico” designa qualquer doença vascular em que a oclusão vascular, a trombose, o enfarte ou outra perturbação biológica tenha como resultado uma fíbrinólise.

Coágulo que contém actina. A expressão “coágulo que contém actina”, para os propósitos da presente invenção, designa um coágulo de acordo com a definição imediatamente apresentada a seguir, em que o coágulo contém filamentos de actina e/ou monómeros de actina nas fibras de coágulo ou filamentos de actina aprisionados nos interstícios da rede de fibrina. A actina contida no coágulo pode ser o resultado de um aprisionamento, de uma ligação covalente ou de outros tipos de ligações, tais como as pontes de hidrogénio, as ligações iónicas e outros tipos não covalentes de Ínteracções físico-químicas. A actina também pode estar contida no coágulo, simplesmente pelo facto de ter ficado aprisionada.

Coágulo. O termo “coágulo”, com o significado que lhe é atribuído na presente invenção, designa uma massa macia, não rígida e insolúvel que se forma com o aspecto de geles de sangue. O termo coágulo aplica-se particularmente à tãse coagulada do sangue, sob a forma de uma massa macia, coerente, com o aspecto de uma geleia avermelhada resultante da conversão do fihnnogénio em fibrina, ficando pois os eritródtos (e os outros elementos formados) aprisionados dentro do plasma coagulado. O coágulo pode ser formado no interior ou no exterior do corpo. Alguns coágulos têm um aspecto amarelado devido à evasão dos eritrócitos antes de ter lugar a coagulação. Este tipo de coagulação pode ocorrer quando os coágulos se formam fora do corpo. Os coágulos sanguíneos também podem ser coágulos de tipo externo, ou seja, os coágulos formados do lado de fora de um vaso sanguíneo. Os coágulos internos são aqueles que se formam dentro de um vaso sanguíneo. Os coágulos musculares podem ser formados por coagulação do plasma muscular. Um coágulo de sangue também pode ser constituído por fibrina e plaquetas. No caso de se formar deste modo, o coágulo recebe a designação de coágulo limpo ou descorado.

Lesão tecidual. Para efeitos da presente invenção a expressão “lesão tecidual” designa uma lesão de um tecido que resulte em trombose. Tais lesões compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, pneumonias, traumas, enfartes do miocárdio ou enfartes de qualquer outro órgão, mas em particular os enfartes do miocárdio, uma vez que o coração contém quantidades significativas de actina As lesões provocadas por colisões e esmagamentos também são relevantes para a presente invenção, uma vez que os músculos do esqueleto contêm quantidades significativas de actina. O tipo de lesão que é relevante para a presente invenção é aquele em que a lesão liberta actina no espaço extracelular através dos hematócitos ou através de células fixas de tecidos c também α que resulta da libertação de materiais tromboplásticos que levam à formação de coágulos de fibrina em tais zonas, pelo que os coágulos de fibrina vão aprisionar a actina. Em geral, a lesão celular visada pela presente invenção é uma lesão em que há inflamação e lesão celular e também a formação de coágulos, pelo que a lesão celular pode ser a fragmentação de neutrófílos ou de plaquetas no sangue ou a danificação de órgãos fixos, tais como o coração ou o fígado.

Animal. O termo “animal” designa todos os animais em que a acumulação de actina livre ou dos filamentos de actina na corrente sanguínea ou no espaço extracelular seja prejudicial para a fisiologia do animal. Em primeiro lugar, entre tais animais refere-se os seres humanos; no entanto, não se pretende com isto limitar o âmbito da presente invenção, pois nela se contempla o tratamento de todo e qualquer animal que possa tirar proveito do efeito benéfico da invenção.

Quantidade eficaz. A expressão “quantidade eficaz” de um composto que se liga à actina designa a quantidade suficiente para libertar a actina de um coágulo, associado à actina, formado num animal com uma lesão tecidual.

Uma quantidade eficaz de um composto que se liga à actina é também uma quantidade suficiente para reduzir ou para eliminar a quantidade de actina existente num coágulo que contenha actina in vivo.

Praticamente isento de contaminantes naturais. Diz-se que um material é “praticamente isento de contaminantes naturais” se tiver sido suficientemente purificado para ser libertado de materiais com os quais está normal e naturalmente associado antes de tal purificação. Como exemplos de conlamiiiantes naturais com os quais podem estar eventualmente associados os compostos que se ligam à actina refere-se: os péptidos que não se ligam à actina, os hidratos de carbono, os péptidos glicosilados, os lípidos, as membranas, etc.. Diz-se que um material está praticamente isento de contaminantes naturais se tais contaminantes, que normal e naturalmente se encontram associados a essa substância in vivo ou in vitro, forem praticamente inexistentes numa amostra desse material. A expressão “praticamente inexistentes” significa que tais contaminantes estão completamente ausentes ou estão presentes em concentrações tão baixas que a sua presença (1) não interfere com o efeito desejado do agente activo (no caso vertente, o composto que se liga à actina) na preparação, quando tal preparação for incubada com o coágulo de fibrina que contém actina a que diz respeito a presente invenção. A expressão “praticamente inexistentes” também significa que tais contaminantes estão totalmente ausentes ou estão presentes em concentrações tão baixas que a sua presença não interfere com o efeito terapêutico desejado do agente activo (no caso vertente, o composto que se liga à actina) na preparação, quando essa preparação for administrada a um animal, e não façam mal ao animal em consequência da administração da referida preparação.

Administração. O termo “administração” designa a introdução de compostos que se ligam à actina em qualquer animal por meios adequados conhecidos na especialidade médica, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a administração por via entérica e por via parentética (v.g. intravenosa).

Tratamento. O termo “tratamento” designa a administração de compostos que se ligam à actina a um paciente para efeitos que abrangem também a profilaxia, a melhoria, a prevenção ou a cura de doenças associadas à actina.

Incubação. O termo “incubação” designa a introdução de compostos que se ligam à

Sal farmaceuticamente aceitável. A expressão “sal fannaceuticamente aceitável” designa os sais de compostos da presente invenção que sc ligam à actina. Tais sais podem ser formados a partir de ácidos ou bases aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, por exemplo, os ácidos sulfurico, clorídrico, nítrico, fosfórico, etc. ou a partir de bases tais como os hidróxidos de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos, os hidróxidos de amónio, os hidróxidos de alquil-amónio, etc..

Veículo fannaceuticamente aceitável. A expressão “veículo fannaceuticamente aceitável” designa os solventes, veículos, diluentes e quejandos, utilizáveis como aditivos para as preparações dos compostos da invenção que se ligam à actina, de modo a constituírem um veículo ou um adjuvante para a administração de tais compostos.

Fragmento. O termo “fragmento” designa uma parcela de uma molécula que proporciona um segmento de um composto que se liga à actina e que é capaz de se ligar a monómeros da actina; este termo designa os fragmentos que se ligam à actina e que são obtidos a partir de qualquer fonte, por exemplo, a partir de sequências peptídicas que ocorram naturalmente, sequências peptídicas sintéticas ou sintetizadas por via química e sequências peptídicas construídas por técnicas da engenharia genética. Além disso, se tal fragmento for um péptido, então o fragmento de um péptido de uma tal proteína que se liga à actina compreende também qualquer variante da proteína que se liga à actina.

Variante. O termo “variante” de um composto, tal como um composto que se liga à actina, designa um composto cuja estrutura e actividade biológica são praticamente idênticas às do composto natural ou de um seu fragmento. A actividade biológica dos compostos da presente invenção é a sua capacidade para se ligarem à actina e para a modificarem, dando origem a uma forma tal que possa ser libertada a partir de um coágulo de fibrina in vitro. Tal modificação pode ser o resultado da ligação dos compostos per si ou o resultado dc uma rcacção química ou enzdmática em consequência de uma tal ligação.

Derivado funcional. A expressão “derivado funcional” de um composto que se liga à actina designa ura derivado que possui uma actividade biológica que é praticamcnte idêntica à actividade biológica do composto que se liga à actina. A expressão “praticamente idêntico” significa que a actividade é quantitativamente diferente mas é qualitativamente igual. Por exemplo, um derivado funcional de uma proteína que se liga à actina, de acordo com a presente invenção, pode conter a mesma estrutura de aminoácidos de uma proteína que se liga à actina, mas possui também outras modificações, tais como as modificações pós-traducionais, por exemplo, fosfolípidos ligados ou hidratos de carbono ligados de forma covalente, dependendo isso da necessidade de tais modificações para a obtenção de bons resultados nos ensaios de diagnóstico ou nos tratamentos terapêuticos. Tal como aqui utilizada, tal expressão designa também um derivado químico de um composto que se liga à actina. Tais derivados podem melhorar a solubilidade, a absorção, o período biológico de semi-vida e outros parâmetros do composto. Os derivados também podem fazer baixar a toxicidade da molécula ou eliminar ou atenuar qualquer efeito secundário indesejável da molécula, etc.. Os derivados, e de fonna especifica os radicais químicos capazes de intervir indirectamente em tais efeitos, estão descritos na publicação Remington ’s Pharmaceutical Sciences (1980). Os procedimentos para acoplar tais radicais a uma molécula são perfeitamente conhecidos na especialidade. A expressão “derivado funcional” abrange “fragmentos”, “variantes”, “análogos” ou “derivados químicos” de uma molécula.

Análogo. O termo “análogo” dos compostos que se ligam à actina, de acordo com a presente invenção, designa um composto cuja actividade é praticamcnte idêntica à dc qualquer composto natural que se ligue à actina ou a um seu fragmento. Por exemplo, um análogo de uma proteína que se ligue à actina c uma proteína que não possui a mesma sequência de aminoácidos da proteína que se liga à actina, mas que é suficientemente homóloga de uma proteína que se liga à actina, de forma a conservar a actividade biológica de tal proteína que se liga à actina.

Os requerentes descobriram que há dois tipos de interacções actina-fibrina. Uma interacção relativamente não específica é devida ao aprisionamento dos filamentos de actina dentro do gel de fibrina, e há um tipo mais específico de ligação que ocorre mesmo quando os filamentos de actina são mais curtos do que o tamanho médio dos poros do gel de fibrina. A adição da proteína que se liga à vitamina D, devido ao facto de se ligar aos monómeros de actina e de impedir a sua polimerização em filamentos de actina, tem sobre a quantidade de actina ligada aos coágulos um efeito que se assemelha ao da gelsolina do plasma. Ambas as proteínas inibem a ligação, fundamentando a ideia de que os coágulos de fibrina aprisionam os filamentos de actina. Uma diminuição do conteúdo de qualquer das proteínas no plasma, na vizinhança de um coágulo em formação, poderia ter provavelmente como resultado um aumento das quantidades de actina associada ao coágulo. Não é surpreendente o facto de haver alguma actina que se liga à fibrina, mesmo quando se encontram presentes concentrações equimolares de tais proteínas que se ligam à actina, uma vez que está implicada uma interacção específica entre a actina e a fibrina devido à interligação da actina com a fibrina por acção do factor Xma (mui e Ganguly, Am. J. Physiol. 233:H346 (1977)).

As propriedades reológicas dos coágulos que contêm actina são diferentes das correspondentes propriedades dos coágulos de fibrina pura, conforme seria de prever quando sc mistura conjuntamente duas redes filamentosas que se tocam entre si. Investigadores anteriores demonstraram que as propriedades reológicas das redes de actina e de fíbrina diferem quantitativa e qualitativamente e que é difícil prever a viscoelasticidade de uma mistura de dois desses polímeros (Janmey et al., J. Cell. Biol. 773:155-160 (1991); Janmey et al., J. Rheol. 27:135 (1983)). Os requerentes descobriram que a incorporação de actina num coágulo de fíbrina leva ao desaparecimento de uma das suas propriedades invulgares, o endurecimento da cadeia, sendo perdida a sua capacidade para suportar grandes deformações sem uma mudança estrutural. Assim, os coágulos que contêm actina são mais frágeis do que aqueles que a não contêm. A adição de gelsolina, que isola a rede de actina, evita este efeito, sugerindo que a fragilidade dos coágulos de actina/fíbrina é devida mais às interaeções espaciais entre os dois tipos de filamentos do que à ligação directa actina/fibrina. Dito de forma abreviada, a actina pode ser incorporada nos coágulos de fíbrina sem comprometer as suas propriedades físicas, desde que os filamentos não sejam muito compridos. A gelsolina exerce portanto um efeito protector sobre os coágulos de fíbrina quando acrescentada à actina antes de o coágulo de fíbrina se ter formado. Ao encurtar os filamentos de actina, a gelsolina faz diminuir a quantidade de actina associada ao coágulo e mantém as propriedades reológicas desse coágulo. Além do mais, a gelsolina é capaz de encurtar o comprimento dos filamentos de actina aprisionados num coágulo de fíbrina, permitindo que haja muito mais actina associada ao coágulo, a efluir para fora do coágulo. Esta experiências também confirmam que a actina associada ao coágulo inibe a fíbrinólise mediada pela plasmina. Assim sendo, a remoção da actina de um coágulo, por acção da gelsolina do plasma, pode ser considerada benéfica na medida em que ajuda a repor os mecanismos homeostáticos que regulam a formação e a dissolução dos coágulos.

Em consequência, a presente invenção tem por objecto proporcionar um método para remover ou reduzir a actina existente num coágulo in vivo, mediante a administração de quantidades eficazes de uma proteína que se liga à actina. De acordo com uma variante preferencial, administra-se a um paciente que necessite de tratamento a gelsolina, a PT-D ou os seus fragmentos que se ligam à actina ou uma combinação de gelsolina e de PLD e/ou dos seus fragmentos que se ligam à actina.

De acordo com uma variante, efectua-se a administração de quantidades eficazes de compostos que se ligam à actina, por forma a libertarem a actina associada aos coágulos in vivo, contrariando consequentemente o efeito do excesso de actina extracelular sobre a formação de coágulos in vivo. A expressão “quantidades eficazes de compostos que se ligam à actina” designa as quantidades para as quais os efeitos tóxicos da actina extracelular livre são, no mínimo, melhorados. Os efeitos tóxicos da actina extracelular livre, no que diz respeito à presente invenção, são os efeitos tóxicos resultantes de alterações que prejudiquem as propriedades viscoelásticas ou o ritmo de destruição (lise) de coágulos in vivo. A expressão “excesso de actina extracelular” designa uma quantidade de actina extracelular que excede a capacidade das proteínas que se ligam à actina para se ligarem à actina e a eliminarem dos fluídos extracelulares, sem que haja lesões teciduais supervenientes ou efeitos tóxicos secundários. A expressão “lesão tecidual ou efeitos tóxicos secundários” designa a lesão de um tecido ou os efeitos tóxicos induzidos em tecidos, órgãos e células saudáveis, devido à presença de coágulos que contenham actina, normalmente devido a uma lesão tecidual primária que tenha ocorrido noutro ponto do corpo.

Nos métodos da presente invenção, a infusão de compostos que se ligam à actina, tais como a gelsolina, a PLD ou os seus fragmentos que se ligam à actina, dá origem a uma redução ou à remoção completa da actina dos coágulos que contenham actina in vivo.

Os compostos que se ligam à actina podem ser conjugados quer quimicamente quer por técnicas da engenharia genética α fragmentos de outros agentes que permitam encaminhar os compostos que se ligam à actina para um local desejado de actuação. Em alternativa, há outros compostos que podem ser conjugados quer quimicamente quer por técnicas da engenharia genética com outros compostos que se ligam à actina ou com os seus fragmentos activos, de modo a realçarem ou a conferirem outras propriedades a tais compostos que se ligam à actina, em especial as propriedades que intensifiquem a capacidade desses compostos para favorecerem a supressão dos efeitos tóxicos da actina. Por exemplo, uma vez que a actina favorece a coagulação do sangue intravascular e inibe a fibrinólise, conjugando um activador plasminogénico tecidual e/ou um agente anti-trombina, tal como a hirudina ou os seus fragmentos activos, com o composto que se liga à actina, é possível encaminhar um agente fibrinolítico para locais onde lesões teciduais libertaram actina que favoreceu a formação de coágulos que se ligam à actina.

As quantidades e os regimes de administração dos compostos que se ligam à actina podem ser determinados facilmente pelos médicos especializados no tratamento de doenças relacionadas com a actina e de lesões de tecidos e inflamações. De um modo geral, a dosagem aplicada num tratamento com um composto que se liga à actina irá variar em função de diversos parâmetros tais como: o tipo utilizado de composto que se liga à actina, idade, saúde, doenças que se pretenda tratar, tipos de tratamentos simultâneos se os houver, frequência do tratamento e a natureza do efeito pretendido, intensidade das lesões teciduais, género, duração dos sintomas e contra-indicações se as houver e ainda irá depender de outras variáveis que têm de ser ajustadas pelo médico assistente. As quantidades administradas podem ser doseadas em uma ou várias aplicações para se obter os resultados pretendidos.

As quantidades doseadas podem ser calculadas conforme a seguir se descreve. A concentração normal de gelsolina no sangue é de 2,4 μΜ (2,4 pmol/L) e a concentração normal da PLD no sangue é de 5 μΜ (5 prnol/L). A capacidade normal da gelsolina para se ligar à actina é de 4,8 μΜ. Assim, o valor total da capacidade de ligação à actina (CLA) do sangue c aproximadamerrte de 9,8 pmol/L. O volume do sangue é 6% da massa total e consequentemente uma pessoa com 701¾ contém 4,2 L de sangue e portanto possui uma CLA (4,2 L x 7,5 pmol/L) de 31,5 pmol. Uma vez que a PLD e a gelsolina se encontram distribuídas homogeneamente pelo espaço extracelular (o que constitui 10% da massa corporal), então o corpo possui uma CLA (7,5 x 7) igual a 52,5 pmol.

Pode ser desejável administrar entre 32 e 53 pmol de um composto que se liga à actina (ou 0,46 pmol/kg de massa corporal) para cobrir a complexação ou o esgotamento total da CLA endógena. Uma vez que 42,5 mg de actina correspondem a 1 pmol e tendo em conta que há 4,86 mg de actina por cada grama de músculos do esqueleto, cada grama de músculo contém 0,114 pmol de actina, ou a destruição de 460 g de músculos poderiam neutralizar toda a CLA corporal. No entanto, atendendo a que os efeitos tóxicos da actina são presumivelmente locais (v.g., a inibição da lise dos coágulos), sequestrados ou cineticamente determinados (v.g., a actina atravessa um órgão mais depressa do que as proteínas de ligação a neutralizam), é provável que uma dose teoricamente mínima tenha de ser ajustada no sentido dos valores mais altos para se conseguir obter efeitos terapêuticos cineticamente favoráveis. Por exemplo, o efeito cinético pode ser importante, uma vez que a hemólise de cerca de metade da eritrona, que deveria libertar apenas 4,2 pmol de actina, reduz a concentração da gelsolina no plasma a metade (Smith et al, Blood 72:214-2181 (1988)), sugerindo a existência de um equilíbrio lento entre os compartimentos extravasculares e sanguíneos. Pelo contrário, um estado tera-peuticamente eficaz, capaz de decompor os depósitos locais de actina, apenas pode ser conseguido por um estímulo transitório com uma concentração elevada de moléculas que se liguem à actina.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados em qualquer veículo farmacológico adequado para administração. Tais compostos podem ser administrados em qualquer forma que permita obter condições profilácticas, paliativas, preventivas ou curativas de lesões de tecidos de seres humanos e animais.

As preparações de proteínas que se ligam à actina, de acordo com a presente invenção, para administração parentética, compreendem solventes, suspensões e emulsões estéreis de tipo aquoso ou não aquoso. Como exemplos de solventes não aquosos refere-se os seleccionados entre propileno-glicol, polietileno-glicol, óleos de origem vegetal, óleos de peixe e ésteres orgânicos injectáveis. Os veículos aquosos são seleccionados entre água, soluções, emulsões ou suspensões em água e álcool, incluindo os veículos salmos e parentéticos tamponados para fins médicos, entre os quais se salienta a solução de cloreto de sódio, a solução de dextrose de Ringer, a solução de cloreto de sódio mais dextrose, a solução de Ringer com lactose ou óleos estáveis. Os veículos par administração intravenosa são fluídos e reconstituintes nutrientes e também reconstituintes de electrólitos, tais como aqueles que têm por base a solução de dextrose de Ringer e outros que tais.

As proteínas da presente invenção que se ligam à actina também podem ser administradas por meio de bombas, ou de uma forma de libertação prolongada, em especial quando a lesão primária é prolongada ou retardada, em vez de ser aguda. Como exemplo de uma lesão primária que frequentemente é prolongada ou é atrasada, em vez de ser de tipo agudo, refere-se o enfarte do miocárdio em que a lesão do músculo cardíaco não é revelada (ou persiste) até alguns dias após o ataque cardíaco primário. As moléculas da presente invenção que se ligam à actina também podem ser administradas a órgãos específicos, com uma elevada concentração, recorrendo para tal a calctercs convcnicntemente inseridos, ou mediante a administração de tais moléculas como parte de uma molécula quimérica (ou complexa) concebida para atingir órgãos específicos. A administração numa forma de libertação controlada é mais conveniente para o paciente quando lhe forem prescritas injecções repetidas durante períodos prolongados. Por exemplo, é desejável administrar as proteínas da presente invenção que se ligam à actina numa forma de libertação sustentada quando os métodos da invenção estiverem a ser utilizados para tratar uma doença genética ou crónica que tenha por base uma disfunção associada à actina, de modo a maximizar o conforto do paciente.

As proteínas da presente invenção que se ligam à actina podem ser utilizadas em formas de dosagem tais como comprimidos, cápsulas, saquinhos de pó ou soluções líquidas para administração oral, se a actividade biológica da proteína não for destruída pelo processo digestivo e se as características do composto permitirem que seja absorvido através das paredes do tecido intestinal.

As composições farmacêuticas da presente invenção são fabricadas de um modo conhecido per si, por exemplo, executando os procedimentos convencionais de mistura, granulação, produção de drageias, dissolução, liofilização ou processos semelhantes. As composições da presente invenção, quando utilizadas por si sós, são úteis para combater as lesões fisiológicas induzidas pela actina, quer sejam crónicas quer seja agudas. As composições da presente invenção comandam os mecanismos próprios do corpo de modo a que possam enfrentar o excesso de actina, regulando-os ao seu potencial máximo. Numa forma de dosagem intravenosa, as composições da presente invenção têm um início de acção suficientemente rápido para serem úteis na resolução dos casos agudos de potenciais lesões de tecidos.

Além disso, uma versão de fraca potência é útil para resolver doenças ligeiras ou crónicas associadas à actina.

Por outro lado, as composições da presente invenção constituem reagentes excelentes para análises laboratoriais dos níveis de actina na corrente sanguínea ou nos tecidos extracelulaies de um animal. É possível administrar quantidades eficazes de uma proteína que se liga à actina, em particular a PLD, a gelsolina ou o seu fragmento activo, sendo todas estas substâncias praticamente isentas de contaminantes naturais, a um paciente que tenha tido um grave enfarte do miocárdio ou que tenha sido vítima de outro fenómeno trombótico num determinado momento e durante um período suficiente para que se tenha revelado a lesão provocada ao coração ou aos tecidos. A quantidade do péptido que é necessário administrar pode ser determinada depois de se estudar a razão entre a gelsolina total e a gelsolina ligada existentes no plasma do paciente, para assim se determinar a fracção da gelsolina total que tenha sido já saturada com a actina libertada pelas células cardíacas moribundas e para se calcular a quantidade necessária para se induzir, a valores mínimos, a capacidade suficiente de ligação à actina para repor essa razão nos níveis existentes nos indivíduos saudáveis. Além do mais, é possível observar de perto os indicadores de lesões renais, tais como os níveis de NUS e de creafinina e é possível ajustar no sentido de valores mais elevados, se necessário, a dose da molécula que se liga à actina, se tais indicadores revelarem que pode vir a ter lugar uma lesão renal.

Assim, a presente invenção pode ser utilizada para administrar aos animais compostos que se liguem à actina em níveis suficientes para a) evitar a formação de filamentos de actina e/ou b) fazer passar os filamentos de actina a um estado monomérico “estável”, em quantidades suficientes para tratar e/ou evitar os efeitos fisiológicos indesejáveis da acumulação ou da libertação da actina livre na corrente sanguínea.

As moléculas particulares que se ligam à actina, as quais são objecto dos métodos da presente invenção, são proteínas purificadas que se ligam a actina natural ou recombinante e outras moléculas não proteicas que se ligam à actina e os seus fragmentos biologicamente activos, caracterizando-se todas estas substâncias pela presença de domínios exclusivos de ligação à actina que possuem a actividade biológica de serem capazes de sequestrar a actina numa forma monomérica ou de rapidamente provocarem a desagregação ou a despolimerização dos filamentos de actina ou de cobrirem locais sobre a actina livre que sejam tóxicos para as células hospedeiras. Os domínios individuais de ligação à actina que possuam esta actividade biológica também podem ser produzidos por métodos sintéticos, enzimáticos, proteolíticos, químicos ou do ADN recombinante.

Os métodos da presente invenção baseiam-se parcialmente na descoberta imprevista efectuada pelos requerentes que concluíram que os coágulos de fibrina contendo filamentos de actina, quando incubados na presença de gelsolina, que é uma proteína de ligação à actina, acabam por libertar a actina no meio de incubação a partir do qual se quantificou a actina.

De acordo com uma variante preferencial, a gelsolina, a PLD ou os seus fragmentos que se ligam à actina ou uma combinação de gelsolina e de PLD e/ou dos seus fragmentos que se ligam à actina são incubados in vitro com um coágulo que contenha actina.

De acordo com uma variante, faz-se a administração de níveis eficazes de compostos que se ligam à actina por forma a que seja libertada a actina associada aos coágulos formados in vitro a partir do plasma de pacientes com lesões teciduais. A expressão “níveis eficazes” de compostos que se ligam à actina qualifica os níveis a que a actina associada aos coágulos pode ser libertada e medida, permitindo pois fazer o diagnóstico dos efeitos de uma quantidade excessiva de actina extracelular sobre a formação de coágulos in vivo. Diz-se que a âctina extracelular é “excessiva” sempre que a quantidade de actina extracelular exceda a capacidade das proteínas do plasma para se ligarem à actina eliminando-a dos fluídos extracelulares sem lesões teciduais secundárias ou sem efeitos tóxicos.

De acordo com uma variante preferencial da invenção, retira-se plasma de um paciente que tenha tido uma lesão tecidual e deixa-se formar coágulos m vitro. As condições preferenciais para a formação de coágulos estão descritas no exemplo V. Depois retira-se os coágulos do recipiente onde foram formados e deixam-se a incubar com quantidades cada vez maiores de mna proteína que se ligue à actina, de preferência a gelsolina ou a PLD. Dissolve-se o coágulo em DSS ou ureia ou em qualquer outro agente solubilizante conhecido e depois submete-se a um processo de electroforese em gel. Os geles utilizáveis podem ser à base de poliacrilamida ou de quaisquer outros meios que sirvam de base aos geles, conhecidos pelos especialistas na matéria como sendo eficazes para separar proteínas. A seguir à electroforese em gel recorre-se então à aplicação da técnica de Western e a actina libertada do coágulo, se houver alguma, é detectada com um anticorpo anti-actina. Para se avaliar a quantidade de gelsolina necessária para libertar a actina existente no coágulo junta-se quantidades variáveis de gelsolina a diversos coágulos por forma a permitir determinar a quantidade necessária para libertar a maior parte ou a totalidade da actina existente no coágulo. No momento em que a concentração a que a libertação de actina fica completa ou atinge um patamar constante, considera-se que é essa a concentração eficaz da gelsolina. A seguir é possível utilizar então um meio de incubação resultante do procedimento em que se acrescentou a quantidade que maximiza a eficácia da proteína que se liga à actina para quantificar a quantidade de actina libertada do coágulo por imunoprecipitação dos complexos de actina-proteína que se ligam à actina no meio de incubação. A seguir à libertação máxima de actina a partir dos coágulos é possível titular completamente a quantidade de actina por adição de uma proteína exógena que se ligue à actina, por exemplo, a gel solina ou a PLD. É possível utilizar anticorpos anti-ligação à actina, tais como anti--gelsolina ou anti-PLD, para desencadear a imunoprecipitação e subsequentemente quantificar os complexos. Em alternativa, é possível utilizar anticorpos anti-actina para detectar a actina libertada no meio de incubação por imunoprecipitação do complexo constituído por actina-anticorpo anti-actina.

De acordo com uma variante alternativa preferencial, deixa-se formar um coágulo num pequeno tubo de cromatografia. Através do tubo aplica-se uma solução de proteína que se liga à actina, de preferência a gelsolina ou a PLD ou os seus fragmentos. Depois analisa-se o produto de eluição em conformidade com o protocolo convencional de EISLE ou desencadeia-se a imunoprecipitação da proteínas que se ligam à actina e avalia-se a presença dos complexos formados com a actina por electroforese em gel, de preferência por electroforese em gel de poliacrilamida. Os parâmetros relevantes estão indicados e descritos a seguir.

Prepara-se o fibrinogénio com uma concentração entre 0,1 e 10,0 mg/mL, estando de preferência entre 2 e 3 mg/mL. Regula-se o pH para um valor entre 6 e 8,5, de preferência 7,4. A potência iónica está compreendida entre 50 mM e 500 mM, sendo de preferência 100 mM. O tampão utilizado é um imidazol ou o tampão Tris. A concentração do cálcio está compreendida entre 0,1 mM e 10 mM, sendo de preferência cerca de 0,3 mM. A concentração do ATP está compreendida entre 10 μΜ e 10 mM. Junta-se cerca de 0,5 mL de fibrinogénio a uma coluna de cromatografia com o diâmetro de 1 cm e deixa-se formar um coágulo de aproximadamente 1 imn adicionando entre 0.01 e 10 unidades dc NHL dc preferência 0.1 unidade de NIH t>or cada mL de trombina. O coágulo assim formado é suiicientemente forte, sob o ponto de vista mecânico, para aguentar a impregnação com fluidos sem ser destruído e é snfici entemente poroso para permitir que a impregnação tenha lugar à razão de cerca de 0,2 mL/minuto. A formação do coágulo requer um período de cerca de 1 a 10 minutos. Ao fim de um período de coagulação de 10 minutos aplica-se ao tubo de cromatografia uma pressão correspondente a um valor entre 1 e 10 cm. Depois ajusta-se o nível de tampão de incubação até se atingir um caudal de cerca de 0,2 mL/minuto. Ajusta-se a pressão observando o menisco do coágulo. No momento em que o menisco do coágulo começa a ser destruído, alivia-se a pressão ligeiramente. Assim, faz-se com que o fluido consiga penetrar através do coágulo no tampão descrito supra. Inicialmente o tampão não contém gelsolina. Utiliza-se o tampão para remover do coágulo a proteína não fixada de forma específica. Depois acrescenta-se gelsolina ao tampão e com este tampão, contendo já a gelsolina, lava-se o coágulo muito bem durante 1 a 5 minutos. Efectua-se uma análise das fracções eluídas para pesquisar a existência de actina mediante a aplicação de diversas fracções a um gel, em particular gel de poliacrilamida com DSS, e realiza-se então a imunotransferência autorradiográfica com o anticorpo anti-actma. À concentração da gelsolina está compreendida entre 50 nM e 5 μΜ e de preferência estará entre 1 μΜ e 5 μΜ.

Em alternativa é possível efectuar uma experiência de lise com plasmina para se determinar a quantidade de actina libertada e o ritmo a que se liberta dos coágulos por acção de uma proteína que se ligue à actina, de preferência a gelsolina ou a PLD. Tendo em conta que a actina inibe a lise à base de plasmina, é possível então utilizar o ritmo a que ocorre a lise de um coágulo como medida da libertação da actina O ritmo a que ocorre a lise aumenta à medida aue a actina vai sendo removida de um coáuulo uue contenha actina. Nos casi?* que se recorre a este tipo de ensaio, os coágulos são formados em tubos de cromatografia, conforme descrito supra, ou então são retirados dos tubos e colocados a incubar em meio tampão na presença ou na ausência da proteína que se liga à actina, de preferência a gelsolina ou a PLD. Há métodos alternativos de detecção da actina libertada de um coágulo em que se explora o parâmetro endurecimento esforçado. O parâmetro endurecimento esforçado pode ser medido por métodos descritos minuciosamente nos exemplos ilustrativos subsequentes. O parâmetro endurecimento esforçado diminui nos coágulos que contêm actina e pode retomar os valores primitivos quando a actina é libertada dos coágulos. Assim sendo, a libertação de actina dos coágulos pode ser quantificada por meio de medições reológicas descritas nos exemplos ilustrativos.

As proteínas que se ligam à actina e que estejam praticamente isentas de contaminantes naturais podem ser isoladas e purificadas a partir das suas fontes naturais ou recombinantes em conformidade com condições convencionais e de acordo com técnicas conhecidas na especialidade já utilizadas para isolar tais proteínas, por exemplo, as técnicas de extracção, precipitação, cromatografia, cromatografia por afinidade, electroforese e outras que tais.

Qualquer especialista na matéria pode identificar o(s) domínio(s) de ligação à actina existente(s) num composto que se liga à actina, utilizando técnicas conhecidas na especialidade, sem necessidade de efectuar experiências desnecessárias, sendo tais domínios preferíveis nos métodos da presente invenção. Por exemplo, é possível produzir derivados de proteínas naturais que se ligam à actina, ou derivados de proteínas produzidos por via recombinante e que se ligam à actina, recorrendo a um processo de clivagem proteolítica da proteína de comprimento completo que se liga à actina, utilizando para tal proteases vulgares tais como, por exemplo, a tripsina, a quimotripsina e a subtilisina. Para a análise de tais fragmentos para pesquisar a sua capacidade dc sc ligarem à actina é possível recorrer à cromatografia por afinidade com resinas transformadas com actina.

No caso de se pretender identificar compostos ou os seus fragmentos que possuam actividade fragmentadora da actina, então tais compostos ou fragmentos também podem ser identificados utilizando técnicas conhecidas na especialidade, por exemplo, acompanhando a par e passo o ritmo de despolimerização da actina F marcada com pireno.

Por outro lado, tais fragmentos podem ser identificados pela sua homologia com outros domínios conhecidos que se liguem à actina ou que fragmentem a actina, em que se possa prever que a actividade está de acordo com a homologia. Por exemplo, sabe-se que a severina, a gelsolina e a vilina e em especial os resíduos aminoácidos 40 a 351 na severina e os resíduos aminoácidos 63 a 383 na gelsolina revelam uma vasta homologia no domínio responsável pela sua actividade fragmentadora da actina F.

Por exemplo, a metade do terminal N da gelsolina, que é um fragmento tripsinado no terminal N, designado por CT45, é capaz de fragmentar a actina F e contém dois locais de ligação da actina. Um destes locais está situado num fragmento quimotripsínico, designado por CT15N (os resíduos 24 a 150 da gelsolina humana), que liga as extremidades dos monómeros e filamentos de actina com elevada afinidade; o outro local está contido no fragmento adjacente, designado por CT28N (resíduos 151 a 406), que se liga ao lado da actina F de uma forma regulada por um polifosfoinositido. Nenhum dos fragmentos, por si só, cinde os filamentos de actina. O mais pequeno polipeptido de gelsolina que é capaz de fragmentar a actina F compreende os resíduos 25 a 165 da gelsolina do plasma

Além do mais, os compostos da família das proteínas que se ligam à actina são fortemente conservados entre espécies e podem ser isolados facilmente em grandes quantidades a partir 36 do plasma dou dos tecidos musculares de animais (bovinos, porcinos) e os tecidos e os fragmentos de tais proteínas podem ser preparados por via química ou enzimática recorrendo a técnicas bem conhecidas na especialidade. Assim, esses compostos que se ligam à actina podem ser administrados a um paciente que necessite da prática dos métodos terapêuticos da presente invenção, sem que lhe seja induzida uma resposta imunitária grave.

Tendo sido assim descrita a invenção na sua generalidade, apresenta-se seguidamente a descrição de materiais e métodos para a prática da presente invenção. Os exemplos apresentados não têm por finalidade limitar a invenção de forma nenhuma.

Exemplos

Materiais. O fibrinogénio (Mosher e Blout, J. Biol. Chem. 248:6896 (1973)) e a gelsolina (Chaponnier et al., J. Cell. Biol. 103:1473 (1986)) foram purificados a partir do plasma sanguíneo humano e a actina foi purificada a partir dos músculos do esqueleto do coelho, em conformidade com métodos já anteriormente descritos (Janmey et al., J. Biol. Chem. 261:8357 (1986)). Marcou-se a actina com pireno-iodoacetamida ou tetrametil-rodamina-5-(e 6-)-iodoacetamida (T-488, Molecular Probes, Eugene, OR), conforme descrito em obras já publicadas (Symons e Mitchison, J. Cell. Biol. 114:503 (1991)). A proteína de ligação à vitamina D foi preparada a partir de sangue humano, por cromatografia por afinidade, utilizando para tal actina-Sepharose (Haddad et al., Anal. Biochem. 146:96 (1985)), ou então foi adquirida a Calbiochem (San Diego, CA). Qualquer destes dois materiais revelou possuir uma afinidade semelhante para a actina, com base na sua capacidade para inibir a polimerização da actina, conforme medido pelas variações da fluorescência da actina marcada com pireno. Diluiu-se a trombina do plasma humano (T-6759, Sigma, St. Louis, MO) e a plasmina (810655 Kabi Vitrum, Franklin, OH) respectivamente para 100 unidades/mL e 10 unidades/raL, utilizando água como diluente, e congelou-se imediatainente. Efectuou-sc o descongelamento de aliquotas que foram mantidas a 4°C e utilizadas antes de decorridas 10 horas. A faloídina marcada com rodamina foi obtida em ‘Molecular Probes’, a avidina marcada com fluoresceína foi obtida em ‘Enzo Diagnostics NY* e a DNase I foi obtida em ‘Boehringer Mannheim’ (Indianapolis, IN).

Exemplo I - Medições viscoelásticas

Efectuou-se a determinação das propriedades viscoelásticas dos geles de fibrina através de medições reológicas utilizando para o efeito quer um instrumento de modelo ‘Rheometrics’ quer um pêndulo de torção. O princípio subjacente a estas medições assenta no facto de se saber que uma força aplicada numa direcção paralela à face de uma amostra (uma tensão de corte ou esforço cortante = força/superfície, que é uma grandeza cuja unidade é o pascal (1 Pa = 10 dine/cm2)), deforma essa amostra, se for viscoelástica, com uma intensidade (a deformação é uma quantidade adimensional) que vai depender da amplitude do esforço e do período de duração desse esforço aplicado. Uma parte da energia de deformação é armazenada elasticamente no material e outra parte é dissipada pelo movimento lento viscoso da amostra, dando origem a uma deformação irreversível depois de ter cessado a força que a provocou. Estas propriedades viscoelásticas podem ser descritas de forma quantitativa pelo módulo de elasticidade ao corte que é a razão entre o esforço e a deformação, grandeza que é uma função do tempo e que para determinados materiais e intensidades de deformação é também uma função do esforço aplicado. Por vezes, efectua-se a medição do módulo de elasticidade ao corte em carga e do módulo de elasticidade ao corte sem carga (viscoso) aplicando deformações oscilatórias e depois calcula-se os módulos de elasticidade ao corte, sendo designado por G’ o módulo em carga e por G” o módulo em repouso (sem caiga) a partir dos desvios de amplitude e fase entre esforços oscilatórios e correspondentes deformações. O aparelho ‘Rheometrics’ aplica uma deformação angular oscilante a uma amostra confinada entre um cone e um prato e permite efectuar medições do módulo de elasticidade ao corte em caiga G7 em função do tempo, da frequência ou da amplitude de deformação. O pêndulo de torção pode medir quer o módulo dinâmico de elasticidade ao corte, a partir das oscilações livres, quer a elasticidade ao corte (razão entre deformação e esforço) a partir de medições da deformação quando se aplica uma tensão de corte constante a uma amostra em forma de disco imobilizada entre os pratos do pêndulo. Os princípios de funcionamento destes dois instrumentos estão descritos em obras já publicadas (Janmey et cd., Biochemistry 27:8218 (1988); Janmey, P., J. Biochem. Biophys. Meth 22:41 (1991)).

Com qualquer dos instrumentos deixa-se formar o gel de fibrina ou de fibrina/actina entre os pratos do reómetro, aplicando entre 400 jjL e 800 pL de uma solução proteínica sobre o fundo do prato imediatamente após a adição de trombina para dar início à polimerização da fibrina. Escolheu-se uma concentração de trombina que correspondesse a um período de coagulação de alguns minutos, o que deu tempo para colocar a amostra no reómetro antes de ter ocorrido a coagulação. As medições começaram tipicamente 1 minuto depois de a amostra ter sido colocada entre os pratos e o período de coagulação foi aproximadamente de 3 minutos. As medições de dependência do esforço foram efectuadas já com uma maturação de 90 minutos, ou pelo menos 30 vezes o período de coagulação, para se garantir que a formação dos coágulos estava praticamente completa e que não haveria modificações no decurso das medições. Ao juntar actina ou os complexos de actina/gelsolina à solução de fibrinogénio, ocorreu em primeiro lugar a polimerização da actina G para dar actina F na presença ou na ausência de gelsolina por incubação durante 1 hora em soluções tampão que continham MgCk 2 mM e KC1150 mM.

Propriedades viscoelásticas dos geles de fibrina/actina. A presença de filamentos de actina durante a polimeiização do fibrinogénio afecta fortemente as propriedades mecânicas da malha de gel de fibrina. A figura 1 mostra o efeito sobre o módulo de elasticidade ao corte, que é uma medida da resistência elástica do coágulo aos esforços deformantes, quando se incorpora no coágulo quantidades cada vez maiores de actina F. A actina F faz aumentar o módulo de elasticidade ao corte com uma amplitude que depende da concentração da actina. A viscoelasticidade dos próprios filamentos de actina pode ser responsável por uma parte do aumento do módulo de elasticidade ao corte, mas há também uma componente significativa que resulta da alteração da estrutura do gel de fibrina provocada pela inibição do agrupamento dos protofilamentos em feixes, já previamente descrita (Janmey et ai, Biochim. Biophys. Acta 841:151 (1985)). O efeito da actina F consiste em fazer o coágulo mais fino e é de admitir que os coágulos mais finos possam eventualmente possuir módulos elásticos ao corte menores do que os coágulos de maiores dimensões, uma vez que contêm filamentos mais finos. No entanto, os coágulos finos também revelam possuir módulos de elasticidade ao corte mais elevados se a inibição da formação dos feixes de fibrina estiver associada a um aumento do número de pontos de ramificação (Roberts et ai, Biorheology 10:29 (1973); Rosser et ai, Biophys. Chem. 7:153 (1977)), tendo já sido assinalados módulos elásticos ao corte mais elevados para coágulos mais finos no caso da fibrina polimerizada na presença de IgG (Gabriel et ai, J. Lab. Clin Med 101:545 (1983)).

Uma das propriedades viscoelásticas surpreendentes dos geles de fibrina é o facto de endurecerem em carga: os seus módulos dc elasticidade aumentam para amplitudes cada vez maiores de deformação. A figura 2 mostra que esta particularidade da reologia da fibrina, que pode ser crucial para a sua função fisiológica como tampão hemostático flexível mas resistente à ruptura, é quase completamente eliminada pelos filamentos compridos de actina F. A actina não só inibe o endurecimento da fibrina sujeita a um esforço (em carga) como também reduz a recuperação elástica dos coágulos. A figura 3 A ilustra a reversibilidade quase total do módulo de elasticidade ao corte observado quando um gel de fibrina é deformado em primeiro lugar por aumentos sucessivos até ao valor máximo da deformação e é depois forçado a experimentar deformações sucessivamente mais pequenas. A reprodutibilidade de G’ a seguir a estas deformações grandes reflecte o grau elevado de elasticidade destes geles e a sua resistência ao colapso mecânico mesmo quando fortemente deformados. A presença de uma quantidade bastante pequena (0,2 mg/mL) de actina reduz o grau de endurecimento em carga (esforçado) e conduz a diminuições irreversíveis de aproximadamente 40% no módulo de elasticidade ao corte após a deformação, significando isso que os geles de fibrina/actina são danificados por deformações definidas entre os limites de variabilidade que possam ocorrer in vivo (figura 3B). Este fenómeno exige filamentos compridos de actina, uma vez que a partir do momento em que os filamentos de actina são encurtados pela gelsolina, se observa mais uma vez o endurecimento em carga e a recuperação elástica aumenta para valores próximos dos observados apenas com fibrina (figura 3C).

Exemplo II - Experiências de ligação

Mediu-se a quantidade de actina ligada à fibrina pela penda de fluorescência da solução após a incorporação de actina marcada com rodamina em coágulos de fibrina de 2 mg/mL. Os coágulos foram formados em tubos de vidro de borossilicato para culturas de tecidos por adição de 1,7 unidades de NIH/mL de trombina a uma quantidade de fibrinogénio na concentração de 2 mgtiiL em meio T7 (NaCl 100 mM, Tris 50 mM-ΟΙ a pH 7,4) com actina F, tendo polimerizado em tampão B (Tris 20 mM, ATP 0,5 mM, DTT 0,2 mM, CaCl2 0,2 mM, KC1150 mM e MgCl2 2 mM a pH 7,4). A solidificação da fibrina ocorreu em menos de 10 minutos e deixou-se os coágulos a incubar durante 1 a 2 horas a 24°C. Os coágulos insolúveis, contendo mais de 97% da fibrina total, foram removidos por um processo de enrolamento numa pipeta de vidro e determinou-se a fluorescência da solução restante. Antes e após a formação dos coágulos determinou-se a fluorescência utilizando para tal um espectrómetro de fluorescência de modelo Peridn Elmer LS-5B com excitação a 547 nm e emissão a 573 nm. Experiências de sedimentação prévias efectuadas com actina marcada com rodamina indicaram que 15% da fluorescência total estava desligada ou estava ligada à actina não funcional, tendo este valor sido subtraído a todas as leituras. Calculou-se a percentagem da actina total ligada à fibrina pela relação seguinte: percentagem ligada = 100(FLo-FLi)/FLo em que é FLo é igual à fluorescência inicial antes da polimerização da fibrina e FLj é igual à fluorescência da solução menos a do coágulo de fibrina.

Ligação de fibrina-actina. Experiências de ligação revelaram que a quantidade de actina ligada aos coágulos de fibrina depende do comprimento dos filamentos de actina acrescentados (figura 4). Na ausência de proteínas que encurtem os filamentos de actina parece que a ligação é insaturável e a proporção molar entre actina e fibrina no coágulo é superior a 1:1 para as mais altas concentrações de actina evidenciadas. Este resultado deve-se provavelmente ao facto de os filamentos de actina polimerizados, na ausência de proteínas específicas de ligação à actina, formarem geralmente filamentos com comprimentos de vários micra (pm) (Pollard e Cooper, Arnti. Rev. Biochem. 55:987 (1986)) e poderem não só ligai-se ao coágulo de fibrina como ficarem também emaranhados nele (Janmey et al., Biochim. Biocphys. Acta 841:151 (1985)). No caso de o comprimento do filamento ser limitado por uma razão molar de gelsolina a 1:12 (que dá origem a filamentos rematados com gelsolina cujo comprimento médio é de 32 nm (Janmey et ai, J. Biol. Chem 2(57:8357 (1986)), parece que a ligação atinge um limite de uma razão molar de aproximadamente 2:3 entre subunidades de actina e de fibrina (figura 4). No pressuposto de se evitar que a actina polimerize por incubação de monómeros de actina G com a proteína PLD de ligação aos monómeros de actina (figura 4), então a quantidade de actina ligada ao coágulo passa a ser muito menor, mas não é totalmente eliminada. Foram observados resultados idênticos quando se impediu a actina de polimerizar por acção de DNase I que forma complexos compactos com os monómeros de actina mas que liga a actina num local diferente daquele que se observa para a PLD (dados não apresentados). Estes resultados sugerem que também pode ocorrer, apesar de os filamentos compridos de actina poderem ser aprisionados de forma não específica na formação do coágulo de fibrina, a ligação específica de filamentos curtos e de monómeros organizados sob a forma de complexos. Presume-se que esta ligação seja específica, uma vez que tanto os filamentos curtos de actina (32 nm) como os complexos de monómeros de actina e de PLD se ligam a coágulos cujos poros têm um tamanho médio de vários micra (pm) (Rosser et ai, Biophys. Chem. 7:153 (1977)). É difícil avaliar a afinidade dos monómeros de actina ou dos fragmentos de filamentos com o gel de fibrina exactamente porque a presença de actina perturba a estrutura da matriz a que se liga (Janmey etal., Biochim. Biocphys. Acta 847:151 (1985)), mas os dados indicados na figura 4 sugerem que a afinidade é suficientemente grande (Kd < 1 μΜ) para que seja considerada significativa aos valores das concentrações a que a fibrina e a actina provavelmente ocorrem 0 efeito do comprimento dos filamentos sobre a quantidade de actina F incorporada no coágulo está ilustrado mais minuciosamente na figura 5. Nesta experiência efectuou-se a polimerização de uma quantidade constante de actina (12 μΜ; 0,5 mg/mL) na presença de quantidades variáveis de gelsolina e juntou-se a fibrinogénio 6 μΜ (2,0 mgfaiL) antes da adição de trombina. Uma vez que cada molécula de gelsolina vai nuclear e rematar um filamento, e tendo em conta que nestas condições de solução não há filamentos não rematados, o número médio de subunidades de actina por cada filamento é igual à razão entre actínaigelsolina (Janmey et cd., J. Biol. Chem. 207:8357 (1986)) e calcula-se o comprimento médio a partir da conclusão de que há 370 subunidades numa extensão de 1 μτη de filamento (Hanson e Lowy, J. Mol. Biol. 6:46 (1963)). Este cálculo permitiu concluir que o comprimento médio dos filamentos de actina existentes na solução do fibrinogénio em polimerização estava compreendido entre 34 nm e 2,7 μτη. Mais de 80% da actina total ligou-se ao coágulo quando o comprimento médio dos filamentos era bastante comprido, mas mesmo os filamentos de actina muito curtos, formados a razões elevadas entre gelsolinaiactina, também se ligaram de forma significativa. Por outro lado, a ligação dos filamentos com um tamanho inferior a 300 nm não dependeu do seu comprimento, sugerindo tal facto que a interacção não é totalmente devida ao aprisionamento dos filamentos dentro dos poros do gel de fibrina, mas sim a uma interacção específica entre a actina e a fibrina. Estes resultados confirmam que a actina se liga à fibrina, em parte independentemente de interacções espaciais. Λ figura 5 também mostra que a ligação da actina F à fibrina uão depende de alterações na estrutura da fibrina provocadas por concentrações milimolares do ião cálcio.

Exemplo III - Microscopia confocal

Misturou-se fibrinogénio, na concentração de 2 mg/mL, com actina marcada com rodamina 6 μΜ na presença ou na ausência de gelsolina e de PLD para proporções molares em relação à actina respectivamente de 1:4 ou 2:1. A polimerização da fibrina teve início por adição de trombina à razão de 0,1 unidade/mL e colocou-se 10 pL de cada uma das soluções sobre uma lamela de microscópio numa câmara humidificada constituída por papel de filtro hidratado num prato de Petri tapado. Decorridos aproximadamente 5 minutos após a adição de trombina, num instante próximo do momento de coagulação, aplicou-se sobre a amostra uma lamela de cobertura e fez-se uma vedação perfeita dos rebordos com verniz de unhas. Numa experiência de contraprova misturou-se com fibrinogénio uma quantidade de avidina marcada com fluoresceína 10 μΜ e deu-se início à polimerização por adição de trombina. O procedimento de análise começou 1 minuto após a preparação das lamelas, tendo as amostras sido examinadas por meio de um microscópio confocal de varrimento por raios laser ‘Bio--Rad MRC 600’ acoplado a um microscópio de modelo ‘Zeiss Axâovert’. Para a obtenção das imagens utilizou-se uma objectiva ‘Plan-neofluar’ com uma ampliação de 100X (NA 1.3) e regulou-se o orifício confocal para uma abertura mínima. Isto ajudou a eliminar a fluorescência acima e abaixo do plano do foco, o que permite aumentar a resolução e facilita a visualização de cadeias individuais de fibrina. Para todas as amostras foram utilizados os mesmos parâmetros de regulação dos raios laser, ganho e quadros de imagens acumulados. Isto permitiu uma comparação mais rigorosa dos intensidades da fluorescência.

Microscopia de fluorescência. Executou-se um processo de microscopia confocal sobre os coágulos de fibrina que continham actina para se examinar directamente a interacção da actina com a fibrina. A figura 6 mostra uma imagem de fluorescência típica obtida quando se juntou actina F marcada com rodamina a uma solução de fibrinogénio antes da formação do coágulo e a figura 6B mostra a correspondente imagem de contraste de fase das cadeias de fibrina. A fluorescência da actina F marcada coincide com a estrutura da malha de fibrina, demonstrando isso a associação directa entre a actina marcada com rodamina e a fibrina. Forma obtidas imagens semelhantes utilizando actina F marcada com fluoresceína (dados não representados). A coincidência entre as cadeias de actina F e de fibrina sugere que estes polímeros se associam lateralmente e não interactuam na totalidade simplesmente por uma sobreposição espacial não especifica. Ao reduzir-se o comprimento de um filamento de actina a 32 nm por acção da gelsolina, a marcação fluorescente da malha de fibrina é muito mais fraca (figura 6C) e são observáveis algumas manchas de fluorescência brilhante correspondentes a sinais de alta densidade no contraste de fase (figura 6d). Estas manchas podem representar locais em que os filamentos curtos de actina se ligam ou são aprisionados no coágulo. A malha de actina F na ausência de fibrina não pode ser visualizada por microscopia confocal, uma vez que os finos filamentos de actina (9 nm) formados nestas condições não formam febres (Janmey et al., J Biol. Chem. 261:8357 (1986)) e por isso produzem uma malha muito fina cuja resolução é difícil por microscopia confocal (figuras 6e e 6f). A incubação de rodamina-actina com a PLD antes da formação dos coágulos reduziu de forma significativa a intensidade da marcação fluorescente da fibrina, mas era ainda visível um padrão distinto de fluorescência coincidente com as cadeias da fibrina (figura 6g). Estes resultados são consistentes com os dados das figuras 4 e 5 que revelaram uma ligação reduzida, se bem que mensurável, dos monómeros de actina, sob a forma de complexos, aos coágulos de fibrina. A especificidade de ligação da actina F à fibrina é fundamentada pela conclusão a que se chegou de que ao acrescentar fluorcsccína:avidina a uma solução de fibrinogénio, em vez de actina F marcada com rodamina, antes da formação dos coágulos, não tem lugar a marcação fluorescente das cadeias de fibrina (figura 6h).

Exemplo IV- Experiências de fibrinólise

Efectuou-se a lise dos coágulos de fibrina que continham actina por dois métodos diferentes. De acordo com o primeiro método, polimerizou-se a fibrina, na presença ou na ausência de actina, por adição de uma concentração relativamente elevada de trombina e de uma concentração relativamente baixa de plasmina, escolhidas de modo a que a solidificação ficasse quase completa antes que pudesse ter lugar uma degradação significativa quer da fibrina quer do fíbrinogénio, em conformidade com o método de Shen et al. (Shen et al., J. Biol. Chem. 252:6184 (1977)). Os geles de fibrina foram polimerizados num pêndulo de torção e foi efectuada a medição das propriedades reológicas dos coágulos, tanto durante a sua formação como durante a sua dissolução. As amostras continham fibrina à razão de 3 g/L, 0,42 unidades de NIH/mL de trombina e 0,3 UC/mL de plasmina em soluções que continham NaCl 140 mM, Tris 10 mM-Cl, MgCl2 2 mM, CaCl2 2,5 mM a pH 7,4.

Na prática do segundo método os coágulos de fibrina (6 μΜ), contendo 6 μΜ de rodamina-actina filamentosa, foram formados em tubos de vidro de borossilicato para culturas, mediante a adição de trombina. O início da formação dos coágulos teve lugar por adição de trombina (concentração final de 0,8 unidades NIH/mL). Os coágulos foram mantidos à temperatura ambiente durante 2 horas e depois foram retirados cuidadosamente dos tubos e embebidos num volume igual de tampão B (Tris 2 mM, ATP 0,5 mM, CaCl2 2 mM, DTT 0,2 mM, KC1150 mM e MgCl2 2 mM a pH 7,4) na presença ou na ausência de quantidades fisiológicas de gelsolina (2 μΜ). Removeu-se, a intervalos variáveis, a solução envolvente do 47 coágulo e mediu-se a fluorescência para se determinar a quantidade de marcador rodamina libei lado pelo coágulo.

Efeito dos filamentos de actina sobre a lise dos coágulos de fibrina. Λ incorporação de actina num coágulo de fibrina origina a inibição da sua velocidade de lise por acção da plasmina, conforme medido pela libertação de fragmentos radioactivos de fibrina (Lind e Smith, J. Biol. Chem. 266:5273 (1991)), o que é muito mais evidente ao fim de algumas horas. Uma vez que a perda da coesão estrutural de um coágulo (conforme traduzido pelo seu módulo elástico) é uma das primeiras consequências da lise (Shen et al., J. Biol Chem. 252:6184 (1977)), procedemos à realização das experiências ilustradas na figura 7 para determinar se o efeito da actina sobre a lise do coágulo poderia ser detectada antecipadamente. A incorporação de filamentos de actina compridos (figura 7A) e curtos (figura TB) no gel de fibrina atrasou quer o aumento do módulo elástico ao corte, durante a formação do coágulo, quer a diminuição, induzida pela plasmina, do módulo de elasticidade ao corte durante a lise. O efeito dos filamentos de actina incorporados (tanto os ligados à fibrina como os aprisionados espacialmente) foi evidente 20 minutos após o início da lise. Assim sendo, os efeitos da incorporação de actina num coágulo traduzem-se por uma modificação das propriedades fisicas do coágulo em condições líticas mais rápidas do que as devidas à velocidade de libertação dos fragmentos de fibrina no banho de Use. As medições viscoelásticas de controlo permitiram concluir que a actina F não era degradada pela plasmina no decurso de tais experiências (dados não apresentados).

Exemplo V - Eluição da actina a partir de coágulos de fibrina Tendo em conta que é de importância terapêutica potencial saber se os filamentos de actina aprisionados nos coágulos de fibrina podem ser eluídos para fora do coágulo, efectuou- 48 -se a incubação de coágulos que continham actina, na presença ou na ausência de gelsolina do plasma. Preparou-se fibrinogénio purificado com uma concentração compreendida entre 2 mg/mL e 3 mg/mL num tampão de imidazol ou Tris. O pH foi de 7,4. A força iónica não foi além de 150 mM e em termos óptimos foi de 100 mM. O cálcio encontrava-se presente na concentração de 0,3 mM. A actina estava presente numa concentração entre 6 μΜ e 20 μΜ. O ATP estava presente numa concentração entre 10 μΜ e 10 mM. Foi possível portanto formar um coágulo de 1 mm numa coluna de cromaíografia com o diâmetro de 1 cm obturando a coluna, enchendo-a com 0,5 mL de uma solução de fibrinogénio e coagulando o fibrinogénio com cerca de 1 décimo de 1 unidade de N1H por cada mililitro (mL) de trombina. Deste modo, uma vez formado o coágulo, este era suficientemente forte, sob o ponto de vista mecânico, para aguentar a impregnação com fluídos sem ser destruído e era suficientemente poroso para permitir que tivesse lugar a impregnação com fluídos à razão aproximada de 0,2 mL por minuto. O coágulo de fibrinogénio formou-se num período compreendido aproximadamente entre 1 e 10 minutos. Ao fim de um período igual a 10 vezes o período de coagulação, aplicou-se uma pressão compreendida entre 1 e 10 cm ao tubo de cromatografia. Dito de outro modo, o fluído utilizado para impregnar o coágulo foi mantido a uma altura compreendida aproximadamente entre 1 e 10 cm sobre a parte de cima do coágulo. Depois ajustou-se o nível do tampão de incubação até se obter um caudal de cerca de 0,2 mL por minuto. Observou-se o menisco do coágulo para verificar a sua destruição. Verificou-se a pressão observando o menisco do coágulo. Esperou-se que a solução tampão impregnasse bem o coágulo. A solução tampão era idêntica àquela em que o fibrinogénio foi dissolvido (a solução tampão em que se formou o coágulo). Esta solução tampão não continha gelsolina Essa solução tampão eliminou do coágulo a proteína contida de forma não específica Depois juntou-se gelsolina a essa solução tampão c com este produto lavou-se bem o coágulo durante cerca de 1 a 5 minutos. A actina contida no coágulo foi separada pela gelsolina e eluída. Efectuou-se uma análise das fracções eluídas para se pesquisar a existência de actina, por electroforese em gel de poliacrilamida com DSS (o mesmo que SDS) e foram obtidas imagens por iimuiotiaiisfcrcncia com um anticorpo anti-acdna. Em experiências prévias, a actina marcada fluorescentemente foi verificada por via espectrofotométrica. Graças a este método foi possível remover cerca de 80% da actina total contida no coágulo, impregnando-o com soluções que continham gelsolina numa concentração entre 1 e 5 μΜ.

Conforme se observa na figura 8, a incubação de coágulos que continham actina marcada com rodamina em concentrações fisiológicas (2 μΜ) da gelsolina do plasma deu origem a uma perda da maior parte da actina existente nos coágulos. Uma vez que a fluorescência da actina F marcada com rodamina é maior do que a dos monómeros de actina sem rodamina ou marcados com rodamina, a quantidade de marcador que é libertada no meio pode ser de algum modo subestimada pela fluorescência do meio, comparativamente com a da solução inicial de actina F marcada. A quantidade de actina marcada que permanece associada ao coágulo é consistente com os resultados ilustrados na figura 2. Além disso, a eluição da actina para fora dos coágulos restituiu a sua susceptibilidade à lise mediada pela plasmina, conforme avaliado visualmente. Uma inspecção feita ao fim de 18 horas revelou restos macroscópicos dos coágulos que não haviam sido expostos à gelsolina do plasma, ao passo que os coágulos incubados em soluções que continham gelsolina do plasma foram totalmente dissolvidos. A perda de rodamina associada aos coágulos não reflecte a lise total 50 dos coágulos, mas sim a clivagem conhecida do dipeptido de actina terminal, marcado com rodamina, por acção da plasmina (Momet e Ue, Proc. Natl Âcad Sei. USA 57:3680 (1984)).

Lisboa, 9 de Janeiro de 2001 1) O Agente Oficial da Propriedade Industrial

JOSE DE SAMPAIO A.o.p.r. Rua do Sulifre, 195. r/c-Drt. 1750 USDOA

Claims (9)

1 Reivindicações 1. • Método para fazer a eluição e a quantificação de actina num coágulo que a contenha, o qual compreende os passos seguintes: (1) retirar plasma dc um paciente com uma lesão tecidual, (2) permitir que esse plasma forme um coágulo in vitro, (3) isolar o referido coágulo formado em (2), (4) realizar a incubação desse coágulo num meio liquido com um composto que se ligue à actina, (5) quantificar a quantidade de actina no referido meio.

2. Utilização de um composto, pelo menos, que se ligue à actina, para a preparação de uma composição farmacêutica para reduzir a quantidade de actina num coágulo que contenha actina num paciente onde esteja o coágulo que contém a actina.

• 3. Utilização de um composto, pelo menos, que se ligue à actina, para a preparação de uma composição farmacêutica para restituir as propriedades viscoelásticas normais e a suscepti-bilidade à lise mediada pela plasmina aos coágulos formados num paciente após uma lesão tecidual.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 ou 3, em que o referido composto que se liga à actina é a gelsolina ou um seu fragmento activo. 2

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o referido fragmento activo é o fragmento quimotripsínico CT45.

6. Método ou utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o referido fragmento activo contém os resíduos aminoácidos desde 25 até 165 da gelsoliua.

7. Método ou utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o referido fragmento activo contém os resíduos aminoácidos desde 1 até 260 da gelsolina.

8. Método de acordo com a reivindicação 1 ou utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 ou 3, em que o referido composto que se liga à actina é a proteína de ligação à vitamina D ou um seu fragmento activo.

9. Método de acordo com a reivindicação 1 ou utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 ou 3, em que um composto que se liga à actina é a gelsolina ou um seu fragmento activo e um outro composto que se liga à actina é proteína de ligação à vitamina D ou um seu fragmento activo. Lisboa, 9 de Janeiro de 2001 j ,/ O Agente Oficial da Propriedade Industrial

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