JPH03500166A - チトカラシンの精製方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 チトカラシンの　′および この出願は１９８７年６月１９日に出願された共係属米国出願第０６３．９４４ 号の一部継続出願である。

ｉ豆乳！見 本発明は、合成およびかび由来（天然に存在する）の膜作用化合物、すなわち、 チトカラシン（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ）類、特にチトカラシンＡ、Ｂおよび Ｄの製造及び用途に関する。他の天然に存在するナトカラシン類の精製およびこ れらもしくはチトカラシンの合成誘導体、関連するケトプロボシン（ｃｈａｅｔ ｏｇｌｏｂｏｓｉｎ）類を含めて、それらの用途も、この発明に包含される。

膜および輸送作用化合物（また環骨格作用効果をも有する）であるナトカラシン 類は、チトカラシンＡ−Ｍの同族体の他、半合成誘導体である７、２０−ジー０ −アセチルーチトカラシンＢ、　７−モツー〇−アセチルーチトカラシンＢおよ び２１．２２−ジヒドローチトカラシンＢ、および関連ケトプロボシン類を包含 するが、これらはかびによって製造される２４以上の構造的および機能的に関連 のあるアルカロイド代謝物のクラスを構成する（　Ｙａｈａｒａ等、１９８２． ジャーナルオブセルバイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

）　、　９２：　６９−７８およびＲａｍｐａｌ等、１９８０．バイオケミスト リー（Ｂｉｏｅｈｅｍ、　）、１９：　６７９−６８３）　、これらの化合物は 、培養における正常および新生細胞および組織の多くの異なった型における広い バラエティの細胞機能を変えること（Ｍｉｒａｕｄａ等、１９７４　、ジャーナ ルオブセルバイオロジー（Ｊ、Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　）　、６１：４８１−５ ００〕、また正常および新生細胞のタイプの間のある場合には異なった効果を示 すこと〔参考のためにＬｉｐａｋｉ等、１９８７　、アナリシスオブバイオケミ ストリ−（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｓｈｅｍ、　）　、１６１：３３２−３４０　） が知られている。これらの剤の種々の同族体は環骨格およびプラズマ膜相互作用 により！ｌ！節される基本的な細胞の作用の生化学を変える。

いくつかのナトカラシン類１例えば以下に図示されているチトカラシンＢ　（Ｃ Ｂ）、このものはこの同族体中で最も広く研究されているのだが、正常および新 生細胞におけるヘキソースおよびアミノ酸の輸送を妨げる〔各々、　Ｋｌｅｔｚ ｉｅｎ等、１９７３　、ジャーナ／ＬｌオブバイオロジカＪＩＪケミストリー（ Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｃ園、　）、２４８ニア１１−７１９およびＧｒｅｅｎ ｓ等、１９７６、エクスペリメントオブセルラー　リサーチ（ＥＸＰ、　Ｃｅ１ １．　Ｒｅｓ、　Ｌ　１０３：　１０９−１１７）　。

チトカラシンＢ このナトカラシン類はまた微細単繊維の形態を変えることも知られており（５ｅ ｈｌｉｖａ　、　１９８２　、ジャーナルオブセルバイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、　）　、９２：　７９−９１　）　、それによって、微細単繊維の 生化学に依存している細胞機能に影響を与える。ナトカラシン類に感受性のある いくつかの細胞作用としては食作用、細胞吸水、細胞質分裂１分泌および外部核 （ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）ばかりでなく、細胞間の有機的動きおよび細胞間輸送 、細胞運動性、組織障壁を越えての輸送および種々の免疫応答を含めた運動性お よび／または細胞間付着を要求する機能がある。

きのこの７マニタ　ファロイデス（Ａｍａｎｉｔａ　Ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ　） がら単離された他のカビアルカロイドであるファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉ ｎ　）は微細単繊維の折返しを必要とする細胞運動を封じる。このものは微細単 繊維におけるアクチン単位に結合し、その重合化（Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔ ｉｏｎ　）を阻止し、それらを効率良く封鎖する。

このようにファロイジンもしくはファロイジンの類似体はナトカラシン類の効果 と反対に作用し、本発明に含まれる膜指向剤の他のグループを構成する。

試験管内での細胞培養は、ＣＢおよび他のチトカラシン同族体が約２時間の短期 間の露出（ｅｘｐｏｓｕｒｅ　）では１１００ｕ／ｍＱ（２００ｕＭ）までの濃 度では非細胞毒性であることを示した。

（Ｔｓｕｒｕｏら、　１９８６　、パイオケミカルファーマコロジー　（Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｖａｃｏｌ、　）　、　３５：　１０８７−１０９０　） 　、　Ｌかしながら、この細胞（試験管内）をＣＢに対しより長く露出させると 可逆的なチト毒性を得ることになる。この可逆性はこの細胞環境がらＣＢを除去 すると観察される（　Ｌｉｐａｋｉら、１９８７．アナリンスオブバイオケミス トリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　１６１：　３３２−３４０）　、 このナトカラシン類の形質転換された（新生腫瘍の）細胞に対する試験管内効果 を研究したところ、ある程度の効能を示した１例えば、０’Ｎｅ１ｌｌ　（１９ ７５，キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　＋　３５：３１１１ −３１１５　）　、　Ｍｅｄｉｎａら（１９８０，キャンサーリサーチ（Ｃａｎ ｅｅｒ　Ｒｅｓ、）　、　４０：　３２９−３３３　）　、　Ｋｅｌｌｙら（１ ９７３，ネイチャーニューバイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｔｉ　Ｂｉｏｌ、 ）　、　２４２：　２１７−２１９　）、およびＤｅｆｅｎｄｉら（１９７２， ネイチャーオブニューパイオロジ−（Ｎａｔｕｒｓ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、）　、 　２４２：　２１７−２１９　）が５核分裂および新生腫瘍細胞の多核化（ｍｕ ｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ　）の結果となる細胞質分裂を含めて、正常細胞と 新生腫瘍細胞の間の異なる効果を示した。しかしながら、初期の生体内の化学療 法的研究は抗癌活性を示さなかった＊　（Ｋａｔａｇｉｒｉら、　１９７１　、 ジャーナルオブアンティパイオテックス（Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　）　 、　２４：　７２２−７２３　；およびＭｉｎａｔｏら、　１９７３　、ケミカ ルファーマシューティ力ルブレティン（Ｃｈｅｗ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、 ）　、　２１：　２２６Ｆ４−２２７７３　、事実、試験管内においてＣＢで処 理されたＢ１６Ｆ１０細胞を静脈内に投与すると、特別の肺転移（ｅｘｔｒａｐ ｕｌｍｏｎａｒｙ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ　）が増大することを示した（　Ｈａ ｒｔら、１９８０　、ジャーナルオブナショナルキャンサーインスティテユーシ ョン（Ｊ、　ＮａｔＬ　Ｃａｎｅｅｒ　Ｉｎ５ｔ、）　、　６４：　８９１−９ ００　）　。

試験管内における細胞および組織への、チトカラシンおよび関連化合物により示 される劇的効果にもかかわらず、これらの化合物で行われた生体内での研究は僅 かしかなかった。このような研究が行われていないことの１つの理由は、現在の 不適当な単離精製法の故にこの種の化合物が比較的少ないというものである。ナ トカラシン類の生体内におけるどのような有用性に関する研究も潜在的な標的組 織におけるこれらの化合物の生物活性準位の維持を要求するであろう、これらの 研究は（１）市販のものからは容易に買えないような量のナトカラシン類、およ び（２）生体におけるそれらの生物的有用性を強化するこれらの化合物の製剤を 要求するであろう。

チトカラシンの分離、精製のための現在の予備技術は沸騰クロロホルムを利用し た大がかりな多量の抽出を必要とする［　Ｔａｎｅｎｂａｕｍら、アドバンシズ インバイオテクノロジー（Ａｄｂａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　）　、　（Ｍｏｏ−Ｙｏｕｎｇｙ　ｅｄ、）　、　１９８１．　Ｐ、４２３ −４２９゜Ｐｅｒｇａ園ｏｎ、　Ｎ、　Ｙ、）　＠この手法は長期間沸騰クロロ ホルムを用い。

続いてろ過、大容量の溶媒の除去を行うという単調な工程を包含する。そのよう な方法は遅く、高価な有機溶媒の大量を伴い、潜在的に危険である。現在の方法 は水性懸濁液からナトカラシン類をバッチ式に吸着するもので、このときこの有 機化合物はＣ１８シリカゲルカラムに吸着される。この吸着工程に続いて、有機 溶媒抽出操作によりチトカラシンが単離され、このものは予備的ＴＬＣもしくは 予備的ＨＰＬＣから精製される。

ナトカラシン類の生体内研究が行われていない第二の理由は、ナトカラシン類の 製剤、生体内投与、回収および分析方法が未だ確立されていないことである。チ トカラシンＢの生体内投与に関する報告は全くなく、チトカラシンＤに関する限 られた情報が公知になっているにすぎない、また、製剤および投与経路の関数と しての生体内薬品動力学的分布（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔｒ ｉｂｕｔｉ。

ｎ）は、本発明の開示前には行われていなかった。

ナトカラシン類の広い範囲での生体内投与が熟慮されるならば。

その生物学的活性、組織および血液における分布および毒性に関する知識が、投 与計画を確立するために必要となるであろう、というのは、試験管内作用のそれ らの可逆的な形態は、生体内での持続した薬理学的活性水準の維持が癌を持って いる宿主における潜在的に有用な効果を決めるために必要であろう。

標的組織においてナトカラシン類を生物活性水準に維持することは、これらの化 合物の抑制された放出のためにデザインされた搬送システムを使用することによ って達成できる０種々の投与経路に順応しやすい搬送システム、例えば皮下、腹 膜内および静脈内経路が最も良く用いられるであろう、このような搬送システム はリポソームである。

リポソームは取り込まれた水性容量を有する完全に閉鎖された二分子膜層である 。リポソームはユニラメラ小胞体（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｅｌｅｓ ）　（単−膜二分子層を有す）もしくはマルチラメラ小胞体（多数の膜二分子層 によって特徴づけられる玉葱様構造をもち、各層は水性層によって次の層と分け られている）であることもできる、この二分子層は疎水性“尾部”領域と親水性 “頭部”領域を有する２つの脂質モルイヤー（一分子層）から成っている。膜二 分子層の構造は、単分子膜の疎水性（無極性）の脂質モルイヤの”尾部”が二分 子層の中心に向かっており、一方親水性（極性）の”頭部”が水性層に向かうと いったものとなっている。このリポソームの基本的構造はリポソーム学において 公知の種々の技術によってつくることができ、そのうちのいくつかは以下に検討 されている。

改良された調製および精製、生体内の研究、および調剤およびリポソームを含め た搬送のための要求に関連して、本発明は、これらの化合物を含有するかびから のナトカラシン類の精製法を開示している。特にチトカラシンＡおよびＢはかび のドレクスレラデマチオイデア（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ　ｄｅ＋５ａｔｉｏｉｄ ｅａ　）から精製することができ、チトカラシンＤはジゴスボリウムマソニイ（ 江眩匣セｘｕｍ　ｍａｓｏｎｉｉ　）から精製することができる。他のナトカラ シン類も同様に精製することができる０本発明はまたチトカラシンＢの生体内投 与のための製剤を開示しておりまた正常および新生腫瘍モデルの両者における生 体組織からナトカラシン類を測定する方法を開示している。正常および新生腫瘍 モデルの両者におけるナトカラシン類の生物的分布データが示されている１本発 明の生体内細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｅｉｔｙ）に関する研究は、化学療法剤 もしくは組合せ化学療法における化学療法増幅剤（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ　）とし てのチトカラシンの利用を示唆している。この点に関して１本発明のもう１つの 特徴は、チトカラシンと抗腫瘍剤（特にドキソルビシン）の組合せを用いた試験 管内での薬相乗作用を開示することである。

堡」Ｂ鉱賢単ｍげ 第１図は、担体（ｖｓｈｉｃｌｇ　）　（ＣＭ−セルロース（１％）／Ｔｗｅａ ｎ−２０（２％）（黒丸）〕で処理された動物におけるＳＣＭａｄｉｓｏｎ　１ ０９カルシノーマ（Ｍ２Ｏ３）腫瘍の成長（塗りつぶした丸）と、（Ａ）腫瘍接 種（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後１日に１５０＋ｕ／聴単−の巨大（ｂｏｌｕｓ）投 与、もしくは（Ｂ）腫瘍がはじめて検出できるようになったとき（ＴＡＤ）１０ ０■／ｋｇ単一の目先投与でＣＢを有するＳＣ処理動物（白丸）とを比較した図 である。

第２図は、第１図（Ｂ）からの動物における自然の肺転移の形成に関するＣＢの 効果を示すものであり、腫瘍接種後２８日目もしくは最終段階（担体対照につい ては３９３６日、ＣＢ処理については２８−５０日）における死で決定した。担 体対照と処理されたものの間の違いは重大である（ρ０．０５　）　、凡例：巾 広のスペースの斜１ｉＡ：担体、１日目もしくはＴＡＤ：点線：１００＊／瞳の ＣＢ、ＴＡＤ；巾の狭いスペースの＃ＩＩＡ：　Ｓ、Ｅ、Ｍ、分画：全マウスに 対する１もしくはそれ以上の結節を有するマウスの数。

第３図は、ＩＰ巨巨大０■／ｋｇを投与したものの投与後０．３および１２時間 のＣＢの組織分布を示した。凡例：点線：肝臓；巾の狭い左肩上り斜線：肝臓脂 肪；水平線：腸間膜：巾の狭い右肩上り斜線：すい臓；巾広の右肩上り斜線：牌 臓；巾広の左肩上り斜ｖＡ：腎臓。

第４図は、Ｂ１６Ｆ１０マウスにおける腫瘍の周辺に（ｐｅｒｉ−ｔｕｍｏｒａ ｌｌｙ　）皮下（ＳＣ）に与えたＣＢの０日における投与量一応答効果を示す、 凡例：＋ＣＢ１００■／ｋｇ：四角ＣＢＩＯ■／ｋｇ；Ｘ担体ＣＭＣ／ＴＶ。

第５図は、薬露出３時間後の禁止濃度（ＩＣ）値を用いたドキソルビシン抵抗Ｐ ３８８白血病細胞に対するドキソルビシン（ＡＤＨ）とチトカラシンＢ　（ＣＢ ）の間のイソボロ（１ｓｏｂｏｌｏ）分析による試験管内相乗作用を示す、アド リアマイシンがまず添加され１次いで５−１５分後にＣＢが添加される。凡例： 破線＝添加線（ａｄｄｉｔｉｖｉｔｙ　１ｉｎｅ　）ＩＩ四角を有している実線 ＝Ｉｃｓｏ。

第６図は、細胞への同時投与の前にＣＢとドキソルビシンが一緒に混合されたと きのＩＣ５０イソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ）を示す、ＣＢが低濃度 のときには強い相乗作用がある。凡例：破線＝添加線、四角を有している実線＝ 　Ｉ　Ｃ５０゜第７図はドキソルビシンが投与され１次いで３０分後ＣＢの投与 、更に３時間後ＣＢとドキソルビシンの両者を完全に除去した際の、全投与量に おける相乗作用を示している。全てのＣＢ濃度において強い相乗作用がある。凡 例：破線＝添加線、四角を有している実線＝　Ｉ　Ｃ５０゜ 見五玖灸１ 本発明はかび由来の膜作用化合物の精製法を開示しており、この方法は目的とす る化合物を製造しているかびマットをバッチ式の吸収技術により抽出する工程を 包含する。このかび由来の膜作用化合物はチトカラシンＢ、ＤもしくはＡのよう なチトカラシンであり、そしてこのチトカラシンは他のナトカラシン類を実質的 に含まない（１％より少ない含量である）。

特に、この精製法はかびマットを有機溶媒で抽出し、ろ過されたマット抽出物に 水溶液を添加、バッチ式吸着技術により水性混合性有機溶媒溶液を分離、得られ た分画を有機溶媒で抽出、そしてこの分画をリニアにシリカプレート上で再結晶 してチトカラシンを精製する。用いられるかびマットはディーデマチオイデア（ Ｄ、　ｄｅｍａｔｉｏｉｄｅａ　）であることができる。

本発明はまた、チトカラシンおよび製剤学的に（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｌｙ　）許容し得る担体もしくは希釈剤を含有する製剤学的単位投与形態を開示 しており、ここでチトカラシンはチトカラシンＢであり非経口もしくは経口投与 に適応したものである。

本発明はまた、抗腫瘍性病気を治療するのに有効な量の精製されたチトカラシン （例えばチトカラシンＡ、ＢもしくはＤ）の薬剤組成物を被検者に投与すること を包含する腫瘍の治療方法を開示するものである。一方、このチトカラシンはリ ポソーム中で搬送することもできる。これらのナトカラシン類およびそれらを含 有するリポソームは、またドキソルビシンのような抗腫瘍剤と共に投与すること ができる。

合成もしくはかび由来の膜作用化合物および抗腫瘍剤の相乗作用有効量を細胞に 投与する工程を包含する、試験管内での新生腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が開 示されている。この合成もしくはかび由来原作用化合物は、チトカラシンＢのよ うなチトカラシンであり、抗腫瘍剤はドキソルビシンであることができる。

−緒に投与されるとき、このチトカラシンＢとドキソルビシンは細胞に同時もし くは連続して投与することができる０例えば、このドキソルビシンはチトカラシ ンＢに先立って細胞に投与することができ、そしてこの全薬組成物の露出時間は ３時間が好ましい。

２１列ｌ頼邊」１児 次のような略号および定義が採用されている：ＡＤＲ−ドキソルビシン：アルド リッチケミカルから買うことのできるアドリアラボスの商品名である。

ＣＡ−チトカラシンＡ ＣＢ−チトカラシンＢ ＣＤ−チトカラシンＤ ＣＭＣ，ＣＭＣ−セルロース−カルボキシメチルセルロースＣＭＣ／Ｔｖ−カル ボキシメチルセルロース／トウィーンチトカラシン類−合成もしくは天然に存在 するかび由来の原作用化合物ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド ＦＡＴ−凍結融解技術により製造された小胞体ＨＰＬＣ−高速液体クロマトグラ フィーＩＣ−阻害濃度Ｈｘｃ利＝互ｑパーセントの阻害さ九た細胞ＩＰ−腹腔内 の ＩＶ−静脈内の ＬＤ一致死量 ＬＵＶ−大ユニラメラ小胞体 ＬＵＶＥＴ−ＶＥＴ技術により製造されたＬＵＶｓ類膜作用化合物−原作用、輸 送作用およびチト構造（微細単繊維）作用効果を有するチトカラシン類、ケトプ ロボシン類およびノアロイジン類からなる天然に存在および合成して得られる化 合物Ｍ１０９−マジソン１０９肺癌 ＭＬＶ−マルチラメラ小胞体 かび由来原作用化合物−天然に存在する原作用、輸送作用およびチト構造（′４ １細単繊維）作用効果を有するナトカラシン類、ケトプロボシン類およびノアロ イジン類からなるグループに属する化合物 ＭＴＤ−最大耐容投与量 ＮＭＲ−核磁気共鳴 ＰＢＳ−リン塩緩衝食塩液 ＳＣ−皮下の ５ＰＬＶ−安定ブリラメラ小胞体 ＴＡＤ−腫瘍出現臼 ＴＬＣ−薄層クロマトグラフィー Ｔｗ−トウィーン（ポリオキシエチレンソルビタンモノアルモルエーテル）：界 面活性剤 ＶＥＴ−押出し技術によってつくられる小胞体本発明は真菌類のかびマットから 例えばＣＢのようなチトカラシンの新規で改良された精製法を開示している。例 えばＣＡおよびＣＢはディーデマチオイデア（Ｄ、　ｄｅｍａｔｈｉｏｉｄｅａ 　）のかびから単離することができ、チトカラシンＤはゼットマソニイ（ス。

ｍａｓｏｎｉ　）のかびマットから単離することができる。この発明はまた精製 されたチトカラシンＢの生体内投与のための製剤および方法、組織中のＣＢの同 定のための新しい分析案、およびこの発明のバッチ式吸収法により精製された合 成および天然に存在するかび由来の膜作用化合物（ナトカラシン類）の生体内に おける抑制された投与のためのリポソームのような搬送系を開示している。

チトカラシンＤはまた、かびのゼット　ミュフイラム（Ｚ、　鮫力正没力４）お よびメタリジウムアニソフィラエ（Ｍｅｔａｒｒｈｉｚｉｕｍ　ａｎｉｓｏｐｈ ｉｌａｅ　）もしくはＣＤを製造することが知られている他のかび原料の培養物 から精製することもできる。チトカラシンＡもまたＣＢから標準的な手法により 同様に精製、もしくは選択的に酸化することもできる１本発明のもう１つの特徴 は１合成および天然に存在するかび由来の膜作用化合物（すなわちナトカラシン 類）と抗腫瘍剤との間の薬剤相乗である。

本発明の精製法については、ナトカラシン類を含有するかび、例えばかびのディ ーデマチオイデア（Ｄ、　ｄｅｍａｔｈｉｏｉｄｅａ　）　（ＡＴＣＣ２４３４ ６）もしくはゼットマソニイ（Ｚ、　ｍａｓｏｎｉ　）（ＡＴＣＣ２００１１） はアメリカンタイプカルチャーコレクションから脱水型で得ることができ、次い で滅菌蒸留水のような水溶液中で再水和する。この経過（ｐａｓｓａｇｉｎｇ　 ）に続き、このかびは寒天斜面上に約２０℃−３０℃、好ましくは約２５℃に保 持することができる。好ましい寒天は３．９％じゃがいもデキストロース（Ｄｉ ｆｃｏ　）を含み、Ｔａｎｅｎｂａｕｍら（前出）によって定義された媒体を用 いることができる：１％バタトーソイトーン（大豆の酸素加水分解物）、デキス トロース、２％酵母抽出物、１５％シュークロース、水道水および２０％の細か に砕いた酵母。

１２〜１４日間の成育期間（Ｚｏｍａｓｏｎｉについては２８〜３０日）に続き 、このかびマットを回収し標準的な凍結乾燥技術を用いて凍結乾燥し、そしてこ の得られた凍結乾燥物を不活性ガス。

例えばアルゴンもしくは窒素、好ましくは窒素中でメタノールのような有機溶媒 と混合する。このかびを成育させるために使用される媒体を分析したところ、Ｃ Ｂがかびマット中に含有されること、そしてこの媒体中にＣＢは全く放出されて いないことを示している。

次いで有機溶媒抽出物を、水を添加することによって水性液となし約８０％水性 溶媒を得る。続いてこの水性メタノール懸濁液をバッチ式吸収技術によって分離 、その際水性懸濁液は逆相Ｃ１８シリカゲル床（Ｗａｔｅｒｓ）上に吸着させ、 次いで吸引もしくは重力ろ過（ｇｒａｖｉｔｙ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　）によ り非有機性成分を除去し、チトカラシンをゲル床に定量的に吸着させる。約１０ 〜２０リツトル、好ましくは１５リツトルの抽出物を約４５ｇのシリカゲルに通 過させることができる。これは約１８００ｇのかび湿重量に相当する。このフィ ルターバックは真空下乾燥し、次いで約５００ｍＡの有機炭化水素、例えばヘキ サン、次いでテトラヒドロフラン：ヘキサンのような１：１（ｖ／ｖ）溶媒混合 物で洗浄する。

さもなければテトラヒドロフラン：ヘキサンの直線勾配もチトカラシンを精製す るために用いることができる。この工程で使用される溶媒を選択するに当っては 、汚染するような有機物を溶離させる最小限の孔あき性（ｐｏｌａｒｉｔｙ　） を有する有機溶媒はどれも用いることができる。

粗ＣＢの早い時期の分画は自然に結晶化し、後からの分画と一緒にして３０ない し４０℃で回転蒸発させる。得られた膜は標準的技術により約５０℃で、クロロ ホルムのような有機溶媒もしくは好ましくはクロロホルム：ヘキサンのような１ ：１（Ｖ／Ｖ）有機溶媒組合せから再結晶させることもできる。得られた結晶性 物質は標準的な技術によりシリカゲルプレート（好ましくは試料濃縮域を有する Ｌｉｎｅａｒ　Ｋプレート）上、予備ＴＬＣによって更に精製することができ、 ＣＢおよびＣＡを含有する領域はメタノールで回収され、標準的技術によりトル エン：メタノール（８５：１５）のような有機溶媒から再結晶させることができ る。８５：１５　ｖ　／　ｖ　トルエン：メタノールのような有機溶媒による溶 出により正常相シリカゲルカラムクロマトグラフィーから、母液からのＣＢの更 なる回収を行うことができる。ＣＢおよびＣＡを含有する分画は、ＴＬＣにより 同定、蒸発乾燥し、上述のように再結晶することができる。ＣＢは続いて製薬学 的製剤に調剤するするごとができる。もし望ましいとあらばこの方法によって精 製されたＣＡは生体内もくは試験管内で採用することができる。かびからＣＡを 精製するための別法としてはＣＢを精製し、そしてそれを標準的な酸化法、すな わち当業者に良く知られているゆるやかな二酸化マンガン酸化によって酸化する ものである。

さもなければ、最終的な精製技術は標準相シリカおよびヘキサン：テトラヒドロ フラン（６０：４０）もしくは逆相シリカおよびメタノール：水を用いて予備的 ＨＰＬＣ技術を用いて行うことができる。

上記の技術によりチトカラシンを精製後、単離させた精製物にたいして行われた プロトンＮＭＲ，ＨＰＬＣおよび分析ＴＬＣは少なくとも約９９％の純度を示し た。この純度は現在得られているチトカラシンの純度よりも大である。これらの 方法によって精製された結晶ＣＢは２１５℃〜２１７℃の融点を有し、標準技術 によるＴＬＣにより１１００ｕが分析されたとき、２つの溶媒の系中で蛍光抑制 、ヨウ素蒸気陽性汚染もしくはｐ−アニソールアルデヒド陽性汚染の証拠は何ら 見出されなかった。ＨＰＬＣ分析（標準的手法により行われる）は単一の非汚染 ピークをつくり呂した、標準的技術により得られたＣＢのＮＭＲスペクトルは、 ＣＢの公開されたスペクトルと全く一致し、ＣＡによる汚染はなかった。汚染チ トカラシンが実質的にない（約１％より少）精製さ九た天然のチトカラシンを提 供することが本発明の一実施態様である６例えば、チトカラシンＡのような汚染 チトカラシンを実質的に含まない、精製された天然のチトカラシンＢを提供する ことが本発明の目的の一つである。

本発明の更なる特徴はその生体内投与、および組織からチトカラシンの回収およ び分析を包含する９組織に対して外から加えられたＣＢの回収のための原案を決 定するために、切除されたＢａ１−ｂ／Ｃマウス肝臓、心臓、すい臓、牌瞳およ び肺に１もしくは５ｕｇのＣＢメタノール溶液を該器官および冷却した該器官に 添加することにより、ＣＢが添加された０組織におけるＣＢの分析は実施例１３ にしたがって行われた。この技術を用いて組織からのＣＢのほとんど全部の回収 が達成できる。この回収の結果は第１表に示されている０組織にＣＢを添加直後 にＣＢを抽出したものと。

ＣＢ添加後３０分でのＣＢ油抽出を比較したところ１回収し得るＣＢでは全く差 は見られなかった。このことは冷却された切除組織におけるＣＢ代謝がないこと を示した。

ＣＢ　（Ｌ　Ｄ　５−１ｏ　）の最大限許容し得る単−巨大薬投与量（ＭＴＤ） はＭ１０９癌保持のマウス、Ｂ１６Ｆ１０癌保持のマウスおよび正常マウスにお ける賦形薬および投与経路の関数として推定された（第２表）、ＣＤ２Ｆ、およ びＢ６Ｄ２Ｆ、両マウスが試験された。生体内ＣＢの組織分布研究において、５ ０ｍｇ／ｋｇ（１０００ｕｇ／２０ｇマウス）を腹腔内に注射し、その分布が実 施例１３で説明されているような時間間隔で測定された。単−巨大薬注射に続い て、ＣＢは腸間膜、腎臓脂肪、腎臓および血液にひろがって行き、肝臓、牌臓お よびすい臓中に最も高い水準で現われる（第３図）、牌臓およびすい臓からは１ ２時間で排出されるが、肝臓には７２時間残っている。ＣＢのいくらかは注射後 最初の数分の間に代謝されるが、残りの３５％は肝臓内に７２時間まで残ってい る。リポソームのような抑制放出製剤は組織における活性ＣＢを保持する。

Ｍ１０９肺癌のあるＢａ１ｂ／ｃ　、　Ｂ　６　Ｂ　２　Ｆ、もしくはＣＤ２Ｆ 、マウスに投与されたＣＢの投与量限定宿主毒性を示す研究において、種々の投 与経路が種々の調剤における単−巨人（ｂｏｌｕｓ）薬に対し試験された１本発 明において用いられる賦形薬は意図された投与経路および標準的な製剤等プラク ティスにしたがって選択することができる。この製剤は非経口的に１例えば動脈 内にもしくは静脈内に注射することができる。この調剤はまた経口的に、皮下に 、腸間膜内にもしくは筋肉内経路で投与することができる。

非経口的投与に対しては１例えば他の溶質を含有するにとのできる滅菌した発熱 性物質のない水溶液の形態で用いることができる。

例えば本発明の研究において、０．８５％（ｖｔ／Ｖ　）滅菌塩化ナトリウム溶 液、滅菌した発熱性物質のないＣＭ−セルロース（１％）／トウシーン−２０（ ２％）、１０％インドラリピッド（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）　（カッターラボラ トリーズ）または４８％エタノール／塩化ナトリウム（ｖ／ｖ　）溶液が賦形薬 として用いられた。また一方、リポソームが賦形薬として使用することができる 。

このような場合、ＣＢはリポソームを形成するために当業界で知ら九でいる方法 のいずれによっても以下に述べるように取り込むことができ、上で挙げたいずれ の投与経路によっても投与することができる。

発熱物質のないカルボキシメチルセルロース（１％）／トウイーノー２０（２％ ）に溶かしたＣＢＩ＠濁液のＭＴＤは１００ｍｇ／ｋｇＳＣ，５０ｍｇ／ｋｇｒ Ｐであり、ＣＤ２Ｆ１マウスに投与されたときはＬｏｍｇ／ｋｇＩＶであった。

ＤＭＳＯ中ではＭＴＤは２５ｍｇ／ｋｇＩＰ、そして１００　ｍ　ｇ　／　ｋ　 ｇ　Ｉ　Ｖより少。

そして３３％エタノール中では１０ｍｇ／ｋｇｌＶであった０Ｍ１０９癌細胞を ＳＣで植え付け２４時間抑制したｃｈａｌｌｅｎｇｅを有するＣ　Ｄ　２　Ｆ、 、マウスにＣＭ　Ｃ／　Ｔ　ｗ中ＳＣで投与した１００−１５０ｍｇ／ｋｇＣＢ の投与量で、測定し得る癌結節の出現が６６％遅れた。

ＳＣ癌については、　Ｊｏｈｎｓｏｎらの方法（１９７５，キャンサーケモセラ ピーオブレブ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅ＠ｏ、Ｒｅｐ、）、５９（４）：６９７− ７０５）にしたがって癌重量を測定することによってその増殖を追跡することが できる。ＩＰおよびＩＶ導入された癌については宿主の生存によって増殖を測定 することができる。転移は標準的手法によるブーアン（Ｂｏｕｉｎｓ）溶液中で のその器官の固定による検死で測定され、転移病巣の数が解剖顕微鏡の下で数え られる（第１表参照）。

単独で投与されたときの抗癌効果の表示に加えて、本発明ではナトカラシン類が 試験管内で少なくとも１つの抗腫瘍剤と相乗的に作用することを示している。特 にＣＢの場合には、ドキソルビシン（Ａ　Ｄ　Ｈ）と共に同時もしくは経時的に 投与すると、試験管内での新生腫瘍細胞の増殖および成育性を阻害する効果が得 られた。特にマイクロタイタープレート（２４もしくは９６ウエルプレート）で 培養されたＰ３８８細胞が薬効果を測定するために用いられ、それは薬の露出後 ただちにソフトアガール中でのコロニー形成によって測定するのであった。成育 性は染色減少テストおよび／または再増殖細胞の数をカウンターするカウルター （Ｃｏｕｌｔｅｒ）　ｍ定によって確認された。

マイクロタイタープレート中での培養に続き、この細胞は標準的な微生物学的チ ェック技術（Ｌｏｒｉａｎ、Ｍ、＋ｇアンケバイオテックスインラボラトリーメ ディスン（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃ ｅｎｅＬ第２版、　Ｖｉｌｌａｍｓ　＆　Ｖｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ）にしたがって１種々の希釈度のＡＤＲおよびＣＢにさらされた。標準的な希釈 指数（実施例１５参照）は、算術目盛のイソボログラム（ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａ ｍ）上にプロットされたとき、それらが形成するパターンによって決められる（ 薬の組合せでの処理に続く細胞増殖および成育性の存在によって決められる）、 得られた細胞増殖および該二つの薬に対する細胞の反応により、このイソボログ ラムは（１）２つの薬の単なる相乗効果、（２）拮抗薬効果、これはどちらかの 薬単独で見られるよりも細胞増殖の阻害が低いものである、または（３）どちら かの薬単独で予測されるよりも過剰に増殖および成育性が減ぜられるという効果 を描いている。阻害が添加効果線（各薬単独、例えばＩＣ５０，ＩＣ９０もしく はＩＣ１００ｓを選択したときの阻害濃度で描かれる線）より下の濃度で生じる 場合には、薬の組合せは相乗的であると考えられる。

チトカラシンおよび抗腫瘍剤に対するＩＣｓは培養された細胞を含有するウェル に目的物質の希釈物を播種し、露出後一定の時間（すなわち２０もしくは４８時 間）で得られた露出された細胞の成育性を測定することによって測定された。培 養された初期の細胞の５０％を抑制することが見出されている化合物の濃度が。

これらの細胞に関する化合物のＩＣ５０である。ＩＣ９０およびＩＣ１００ｓも 同様に決めることができる。

薬の相乗作用を測定するために、マイクロタイターウェルに新生腫瘍細胞を播種 した後、三重の（ｔｒｉｐＨｃａｔｅ）ウェルをＣＢとＡＤＨの混合物（前述の ようにＩＣ測定実験の結果により決定された希釈度）で同時もしくは経時的に処 理する（まず最初にＡＤＲが投与され、ついで約５−１０分または３０分後のい ずれかでＣＢが投与される）、３時間インキュベートした後、プレートを遠心分 離し、媒体を除去、細胞を洗浄、９６ウエルプレート中に再供給、並べて（ｐｌ ａｔｅｄ　ｏｕｔ）４８−７２時間インキュベートした。

本発明を実行するに当って使用することのできる抗腫瘍剤はドキソルビシン、ダ ウノルビシンもしくはエビルビシンのようなアントラサイクリン、ビンブラスチ ンもしくはビンクリスチンのようなビンカアルカロイド、５−フルオロフラシル のようなプリンもしくはピリミジン誘導体、マイトキサシスロン２メクロレタミ ン塩酸塩もしくはシクロホスファミドのようなアルキル化剤、シスブラチナムの ようなプラチナム化合物、メトトレキセート（ｍｅｔｌｒｏｔｒｅｘａｔｅ）の ような葉酸類似体およびマイトマイシンもしくはプレオマイシンのような抗腫瘍 性抗生物質のようなものを含むが、これらに限定されることはない。

これまで述べてきたように、本発明のチトカラシンおよび／または抗腫瘍剤（す なわちＡＤＲ）の投与のための徐放性輸送担体としてリポソームを用いることが できる。リポソームをつくるため当業界で知られている技術はいずれも本発明で 用いることができる０例えば、パンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）等の、初期のリポソ ーム製造〔ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ）、１３．２３８−２５２．１９６５）は有機溶媒中にリン脂質を懸濁させ１次 いでこの溶媒を蒸発乾燥させ１反応容器上にリン脂質の膜を残留させるものであ る。続いて適当量の水性相を添加し、この混合物を″膨潤（ｓ＋１ｅｌｌ）”さ せ、そして得られたマルチラメラ（＋ｃｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）小胞体（肛 Ｖｓ）からなるリポソームを機械的手段で分散させる。

この技術が、ババハジコボウロス（Ｐａｐａｈａｄｊｉｏｐｏｕｌｏｓ）らによ って記載された〔バイオヒミカエトバオオフィジカウントアクタ（Ｂｉｏｃｈｉ ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）１３５，６２４−６３８．１９６７］音波処 理された小さなユニラメラおよび大きなユニラメラ小胞体の開発のための基礎を 提供している。

ユニラメラ少胞体は、ここに参照のために引用されているＣｕ１１ｉｓ等、ＰＯ Ｔ公開番号８７１００２３８．１９８６年１月１６日１名称“ユニラメラ小胞体 製造のための押し出し手法”に記載されている方法により押出機を用いて作るこ とができる。この手法によって作られた小胞体は、ＬＵＶＥＴＳと呼ばれ、加圧 下で膜フィルターを通して押し出される。小胞体は、２００ｎｍのフィルターか ら押し出されてもよい、このような小胞体は、ＶＥＴ２゜。Ｓとして知られてい る。

使用することのできる他の種類のリポソームに、実質的に均一なラメラ溶質分布 を有することを特徴とするものがある。この種のリポソーム類は、　Ｌｅｎｋ等 米国特許第４，５２２，８０３で定義されているように、安定複ラメラ小胞（Ｓ ＰＬＶ）と呼ばれ、Ｆ。

ｕｎｔａｉｎ等、米国特許第４．５８８，５７８号に記載されているような単相 性小胞体及び上記のような凍結融解した多重ラメラ小胞（ＦＡＴＭＬＶ）を含む ものである。ここでは小胞体は少なくとも１回の凍結融解サイクルにさらされる ；この方法はＢａ１ｌｙらのＰＣＴ公開８７１０００４３号、１９８７年１月１ ５日、名称“改善された取り込み効率を有するマルチラメラリポソーム″に記載 されており、これらの引例は参考のためにここに引用されている。

リポソームをつくるためにいずれの方法も、本発明方法によって精製された、合 成もしくは天然に存在するかび由来の膜作用化合物（すなわちナトカラシン類） を取り込むために用いることができる。ナトカラシン類のこれらのリポソーム形 態の製剤学的組成物は試験管内もしくは生体内に以下に記載するように投与する ことができる。

各種ステロール及びそれらの水溶性誘導体を、リポソーム形成のために用いるこ とができる。特に、Ｊａｎｏｆｆ等、米国特許第４゜７２１．６１２号、１９８ ８年１月２６日発行、名称”ステロイドのリポソーム”参照＊　Ｍａｙｈｅｖ等 （ＰＣＴ公開番号ＷＯ３５１００９６８，１９８５年３月１４日公開）には、ア ルファートコフェロールある種のその誘導体を含むリポソームで薬剤をカプセル 化することによって、薬剤の毒性を低減させる方法が記載されている。また、各 種トコフェロール及びそれらの水溶性誘導体が、リポソーム形成に用いられてい る。　Ｊａｎｏｆｆ等、ＰＣＴ公開番号８７１０２２１９．１９８７年４月２３ 日公開、名称″アルファトコフェロールをベースにした小胞体”参照。

一方、ドキソルビシンのようなイオン化し得る抗腫瘍剤が用いられるとき、ここ に参考に引用しているＢａ１ｌｙら、ＰＣＴ公開８６１０１１０２．１９８６年 ２月２７日発行の方法に従ってリポソームに薬を装薬することができる。この技 術は、リポソーム膜を貫通して膜透過濃度勾配をつくり出すことによって抗腫瘍 剤を装薬することを可能にする。この勾配は、リポソーム膜を貫いて１もしくは それ以上のイオン種（すなわちＮａ＋、Ｃ１＋、に＋、Ｌｉ＋、もしくはＨ＋） に対する濃度勾配によってつくられる。これらのイオン勾配はｐＨ（Ｈ＋）勾配 であることが好ましく、このものがリポソーム膜を貫いてのイオン化し得る抗腫 瘍剤の取り込みを促進する。この方法もしくは他の方法！二よりリポソームに抗 腫瘍剤が装填されると、以下に記載するように試験管内で搬送できる製剤学的製 剤をつくることができる。

リポソーム−薬搬送系において、薬のような生物活性剤をリポソーム中に取り込 み或いはリポソームと会合させ、次いで治療すべき患者に投与する０例えば、Ｒ ａｈｍａｎ等、米国特許第３，９９３，７５４号；　５ｅａｒｓ、米国特許第４ ，１４５，４１０号：　Ｐａｐｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等、米国特許第４，２３ ５，８７１号；　５ｅｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，１１４，１７９号；　Ｌ ａｎｋ等。

米国特許、第４，５２２，８０３号；及びＦｏｕｎｔａｉｎ等、米国特許第４， ５８８，５７８号参照。本発明においては、上述したように本発明方法により精 製された、合成および天然に存在するかび由来の膜作用化合物（すなわちチトカ ラシン、それらの誘導体またはカエトプロボシン）はリポソーム中に取り込まれ るかまたは会合させることができる。択一的にまたは付加的に、上で述べたよう な抗腫瘍剤をリポソーム中に共取り込みすることができ、またリポソーム中に取 り込んでチトカラシンを含有するリポソームを共投与することもできる。このよ うなリポソーム製剤は同時もしくは経時的に投与することができる。

リポソームの製造の間、脂質を懸濁するために有機溶媒を使用することができる 。好ましい有機溶媒は広範囲の極性および誘電特性を持ち、脂質を溶解するもの で、クロロホルム、メタノール。

エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）’、メチレンクロライドおよび ベンゼン：メタノール（７０：３０）のような溶媒混合物を包含するが、これら に限定されることはない、その結果。

脂質を含有する（脂質および他の成分が均質に分散されている）が形成される。

溶媒はその生物学的許容性、低毒性および溶解化能力を基にして一般的に選択さ れる。

チトカラシンおよび／または抗腫瘍剤を含有する本発明のリポソーム、およびそ の製剤学的製剤は、その化合物の活性形態での繰り返しの投与または抑制された 搬送を必要とする病気もしくは状態の治療に、動物（人間を含めて）に治療的に 用いることができる。このような状態としては本発明の方法により精製された合 成もしくは天然に存在するチトカラシン、あるいは抗腫瘍剤とチトカラシンで治 療し得るような新生腫瘍を包含するが、これに限定されることはない。

他の薬剤搬送もまた、本発明により精製された合成もしくは天然に存在するかび 由来の原作用化合物を投与するために用いることができる。このような搬送シス テムとしては浸透ポンプ、転移皮膚貼剤（ｔｒａｎｄｅｒｍａｌ　ｐａｔｃｈｅ ｓ）　、注入ポンプ（ｉｎｆａｓｉｏｎ　ｐｕ＋＊ｐｓ）、生物学的に分解し得 る高分子、モノクローナル抗体結合体、座薬、鼻腔薬（ｒｈｉｎｉｌｅ）、糖衣 錠、トローチ等がある。

（１）本発明の方法によって精製された合成もしくは天然のナトカラシン類、も しくは（２）（１）で述べたようなチトカラシンと抗腫瘍剤、もしくは（３）リ ポソーム中で搬送されるナトカラシン類と抗腫瘍剤、の投与形態およびその製剤 学的剤型は、この化合物が搬送される器官における部位及びその細胞を決定する ことができる０本発明のリポソームを含めてこれらの製剤は単独で投与できるが 、通常は投与の意図された経路および標準的な製剤学的慣行に関連して選択され た薬剤的担体と混合して投与される。これらの組成物は製剤学的単位投与形態で 与えることができる。このような製剤学的単位投与形態は経口および非経口投与 に対して適用することができる。この調剤は非経口的に、例えば静脈内に注射す ることができる。非経口投与については、これらは滅菌した１発熱物質のない溶 液で、そのものが他の媒質、例えば該溶液を等張にするに十分な量の塩もしくは グルコースを包含し得るような形で使用できる。これら製剤は、また皮下例えば 腸間膜部位に投与することができる。調剤の特別の物性に依り、他の使用法が当 業者により考えることができる。

経口型の投与については、本発明の製剤は錠剤、カプセル、甘味入り錠剤（ｌｏ ｓｅｎｇｅｓ）　、　トローチ、粉末、シロップ、チンキ薬。

水溶液および懸濁液等の形態で用いることができる６錠剤の場合には、使用でき る担体としてはラクトース、クエン酸ナトリウムおよびリン准塩がある。でん粉 のような種々の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムお よびタルクのような滑剤が通常は錠剤で用いられる。カプセル型での経口投与に ついては、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量のポリエチレングリコール である。経口使用のため水性懸濁液が必要とされるとき、この活性成分は乳化お よび懸濁化剤と結合して用いられる。

もし望まれるならば、ある種の甘味剤および香味剤を添加することができる。

本発明の薬剤組成物を使用する薬の治療（すなわち生体内における転移病を治療 する）はまた、このような組成物を用いる治療処理、軽減処理、遅延処理もしく は予防処理を包含する。新生腫瘍病の治療、軽減、遅鑓もしくは予防処理におけ る人間への投与については、投与される人間に対して適当な投与量の抗腫瘍性病 気治療の腫瘍剤を、処方医者が最終的に決めるであろう、そしてこれは年齢、体 重、病人の病気の性質および重さと同様１個人の反応により、変わることが予測 される。

ナトカラシン類の投与量はマウスにおけるＬＤ、。（ＭＴＤの１７１０）を作り 出す投与量の約１／１０．もしくはそれ以上であることが予測されるが、用いら れる特定のチトカラシンおよび治療の環境によって、また投与する医者によって 投与量は決められるであろう、リポソーム形態１こおける薬の投与量は一般的に 、大体遊離の薬に対して採用されるものであろう、しかしながら、ある場合には これらの限度の範囲外の投与量を投与することが必要となるかもしれない。

次の実施例は説明のためにのみ与えられるものであり１本発明の範囲を限定する ためのものではない。

失庭粁よ かび、デイデマチオイデア（Ｄ、ｄｅａ＋ａｔｉｏｉｄｅａ）　（Ａ　Ｔ　ＣＣ ２４３４６）、（約２５ｍ　ｇ）をアメリカンタイプ力ルチュアコレクシｓ　（ ｔｈｅ　Ａｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｅｔｊ、ｏｎ ）から脱水された形態で得、殺菌蒸留水中で再水和し、懸濁液を形成した。この かびを次いで一回通過し、２５℃で３．９％じゃがいもデキストロースかんでん 斜面上に保持した。チトカラシンＢ精製のための培養の調製のために、タネンバ ウム（Ｔａｎｅｎｎｂａｕｍ）等（上述）により定義された媒体を用いた；手短 に言えば、１％バクトーソイトン（Ｂａｃｔｏ−ｓｏｙｔｏｎｓ）、４％デキス トロース、２％瀞母抽出物、１５％シュークロース、水道水および２０％押しつ ぶされ細かく切られた酵母を用いて、２リツターの媒体を作った。この媒体を４ つのバイレックスプレート中に注ぎ、２７０℃で９０分間加圧した。冷却したプ レートにかびの蒸留懸濁液１５ｍＡを種まきし。

１４日間室温で成長するまで放置した。

１庭且Ｉ チゴスボリュームマソニイ（Ｚｙｇｏｓｐｏｒｉｕｍ　Ｍａｓｏｎｉｉ）　（Ａ 　Ｔ　ＣＣ番号２００１１）を用い、実施例１の方法に従って２８日間培養した 。

去】０」支 実施例１の方法に従って成育したデイデマチオイデアかびマットを採取し、サー モバック（Ｔｈｅｒｍｏｖａｃ）凍結乾燥器を用いて凍結乾燥し、乾燥かび４１ １ｇを得た。この乾燥かびを次いでワーリング（Ｗａｒｉｎｇ）混合機を用い、 窒素雰囲気中で１６００ｍＡのメタノールと数分間混合し１次いで１００１００ Ｏのメタノールを用いて第２の抽出を行った。得られた抽出物を次いで吸引ろ過 によりこの溶媒から分離し、この残渣を８００ｍｆｆ１のメタノールで再び抽出 した１次いで蒸留水を加えて８０％メタノール水溶液をつくった。続いてこのメ タノール水溶液を吸引下、逆相Ｃ１８シリカゲルカラム（Ｗａｔｅｒｓ　）を用 いバッチ式の吸着法により分離した。

１５リツトルの抽出物を、１８００ｇ湿重量のかびに相当する４５ｇのシリカゲ ルに通過させた。この床はデシケータ−中で真空中−晩乾燥させた０次いでこの フィルターパックを５００ｍ４のヘキサン、次いで直線勾配（最終的に）の１： １（ｖ／ｖ）混合物のテトラヒドロフラン：ヘキサンで洗浄した。はじめの方の 粗ＣＢの分画は自然に結晶化し、そして後の方の分画と混合し。

２５℃で蒸発させた。得られた膜を標準的技術によりクロロホルム：ヘキサンか ら再結晶した。得られた結晶物質は次いで標準的技術によるシリカゲル（Ｌｉｎ ｅａｒ　Ｋプレート）上で予備的ＴＬＣにより再精製を行い、回収されたＣＢお よびＣＡを包含する領域をエタノールで溶出し、そしてクロロホルム：ヘキサン から再結晶した。母液からの添加ＣＢを、トルエン：メタノール（８５：１５） による溶出により正常相シリカゲルカラムクロマトグラフィーから回収した。Ｃ ＢおよびＣＡを包含する分画をＴＬＣで同定、蒸留乾固し、次いで上述のように して再結晶を行った。

夫隨莢土 Ｒｏｓｅの技術（Ｘ９８１．キャンサー　トリートメント　レプ（Ｃａｎｃｅｒ 　Ｔｒｅａｔ、　Ｒｅｐ、　）　、　６５：　２９９−３１２　）により１２日 毎にマウス中に２０％癌ブライ（ｂｒｅｉ）　（おおよそＩ　Ｘ　１０ｔ″総細 胞数）を連続通過させＢａ１ｂ／ｃおよ’ｔｙｃＤ２Ｆ、にマジソン（Ｍａｄｉ ｓｏｎ）１０９　（Ｍ２Ｏ３）癌を保持させた。このＣＤ２Ｆ１マウＸ　ニ０　 。

２ｍｇＭ１０９皮下的に腹側に腹部上に植えつけた。この通過したマウスから癌 を取り出し、壊死した部分は全て取り除き、癌の重さを測り、これを細かくきざ み、０．１ｍｇの２ｏ％（Ｖ／Ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｖｃ ｏ　）および０．８５％（ｗ／ｖ）滅菌塩化ナトリウム溶液（総量１．０ｒｎＱ ／ｇ癌）中にこの断片を懸濁し、繰り返し吸い出すことによって分散させ、注射 器から排出することにより、癌ブライが調製された。この懸濁液をついで０．８ ５％の滅菌塩化ナトリウムで２０％にまで希釈し、０．２ｍｇを皮下的に注射し た。この痛烈濁液の成育性は標準的なトリパン青排出試験により測定したところ 約２０％であった・ Ｍ１０９癌ブライ■（０，１ｍｇ）を尾部静脈からもしくは工Ｐ　（０，２ｍｇ ）で投与して上記の方法を繰り返した。

夫芝涯旦 実施例４で単離したＩ　Ｘ　１０’癌細胞をＯ日目にマウス（６）に皮下的に植 え付け、１８目に薬剤処理を行った。ＣＢ（１００ｍｇ／ｋｇマウス、もしくは ２０ｇのマウスにつきＱ、２ｍｇの１０．０ｍｇ／ｒｒ＋ｆｉｃＢ）をＣＭ　Ｃ ／　Ｔ　ｗに懸濁したものをマウスに投与した。投与の結果については第２表を 参照されたい。

０．８５％塩化ナトリウム溶液中に懸濁したＣＢを用いて薬剤投与に対する反応 をみる研究をインドラリピッド（Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｓ）中、および滅菌し発 熱物質のないＣＭ−セルロース（１％）／トウィーン２０（２％）、もしくはＤ ＭＳＯ中に溶解して繰り返した。このＣＭ−セルロース／トウイーン２０はＣＢ の懸濁および投与に対して最も信頼できる担体であった。というのは、注射器中 に残ったＣＢｔ−ＴＬＣ分析により測定したところ、名目上の投与量の８０−９ ０％を運んでいたからであった。

前にＩＶ癌の植付け（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を受けたマウスにＩＰ経路で５０ｍ ｇ／ｋｇＣＢを投与したとき、殺毒効果は眠られなかった（延命効果なし）。し かしながら癌植付後２４時間後、あるいは癌が出現（約６日）したときに１回の 目先（ｂｏｌｕｓ）投与量としてＳＣ投与したときにはＣＢは測定できる癌結節 の出現を遅らせることができ、結節の増加割合を遅くしてその侵略を阻止し。

寿命を延ばすことができた（第１図）。

第１図に示されているように、動物が１日（第１図Ａ）もしくは測定し得る癌結 節が見られたとき（すなわち約６日）（第１図Ｂ）、癌の周辺にＳＣでＣＢ植え 付は処理されたとき、ＣＢ処理は癌増殖率の十分な減少をつくり出した。１８目 もしくは結節が見つけられたときＣＢ処理した動物では、平均生存時間の増加が 見られ、３３％の動物が５０日までに癌がなくなっていた。対照に比べて全ての 処理グループで低い癌重量が見られたが、この違いは癌の成長の段階が進んでい くにつれて小さくなっていった。

第２図に示されるように、癌の検出時に１００ｍｇ／ｋｇＣＢで皮下処理した動 物は担体だけで処理した対照群に比べて肺癌結節（転移）がより少なかった。Ｃ ＢのＳＣ投与では、肝臓もしくは牌臓にお゛ける癌転移の減少に対する効果は見 られなかった。

夫庭杯旦 実施例３で単離されたＩ　Ｘ　１０’癌細胞をマウスに腸管内に０８目に投与し 、１８目に薬処理を行った−　ＣＢ　（０，２ｍｇの５ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑ溶液 ）が０．８５％塩化ナトリウム溶液として投与された（２０ｍｇマウスにつき１ ．０ｍｇＣＢ；すなわち５０ｍｇ／ｋｇ）、投与結果については第２表を参照さ れたい。

夫庭五工 実施Ｉ７１？で単離されたＩ　Ｘ　１０’癌細胞をマウスに腸管内に０８目に投 与し、１８目に薬処理を行った。ＣＢ　（０，２ｍｇ、０゜８５％塩化ナトリウ ム溶液中０．１ｍｇの３３％ＥｔＯＨ中で）を投与した。投与結果については第 ２表を参照されたい。

マウスにおけるＢ１６Ｆ１０癌に対する薬剤反応性の研究によれば、皮下投与さ れたＣＢは癌結節増殖率に測定し得る効果を有していることが示されている（第 ４図）、癌周辺に投与されたＣＢ　（１００ｍｇ／ｋｇ）は、１８目に処理がな されたときは７日から１８日間癌の出現を遅らせる。

失庭涯ｌ 腸管投与によるＣＢ　（５０ｍｇ／ｋｇＣＢ）の最大許容投与量（ＭＴＤ）は次 の方法によって決められた。実施例２によって単離されたＣＢ溶液は、超音波浴 中、８０−９０　Ｈｚ出力で２分間、ＤＭＳＯ中ＣＢを音波処理をすることによ って得られた（２５ｍｇ　／　ｋ　ｇ　ＣＢ溶液をつくるために）。この懸濁液 （０，１ｍｇ）を単−巨丸注射でＩＰに投与し、その毒性に対する結果は第２表 に示されている。

ＣＭ−セルロース／トウィーン２０　（ＣＭ　Ｃ／　Ｔ　ｗ　）担体中のＣＢ　 （０，１ｍ１２が投与された）に上記方法が繰り返された。

ＤＭＳＯ中の２５および１００ｍｇ／ｋｇＣＢ、およびＣＭＣ／　Ｔ　ｗ中の１ ００ｍｇ／ｋｇＣＢに対して上記方法が繰り返された。

ＤＭＳＯ中で投与されたＣＢはＣＭ−セルロース／トウイーン２ｏ中で搬送され たときの約２倍の毒性があった（第２表）。

夫λ銖主 皮下投与に腸間壁へのＣＢの最大許容投与量（ＭＴＤ）（１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｃ ＭＣ／Ｔｗ中）は、実施例８の方法により決定された。

ＤＭＳＯ中で投与したＣＢは、ＣＭ−セルロース／トウイーン２０中で搬送した ときの約２倍の毒性があった（第２表）。

第２表はこの方法の結果を示す。

１庭銖上立 静脈内投与によるＣＢの最大許容投与量（ＭＴＤ）（５ｍｇ／ｋｇ）は、実施例 ７の方法により決定された。このＣＢを０．１ｍｇの９５％エタノール１０．８ ５％ＮａＣＱ　（１：　２ｖ／ｖ）中に懸濁し、３７℃に加熱し、混合５分間以 内に尾部静脈から投与した。

０．１ｍＭのＣＭ−セルロース／トウイーン２０を用いて上記の方法を繰り返し た。

ＣＭ−セルロース／トウイーン２０担体と１０．２０．４０および５０　ｍ　ｇ 　／　ｋ　ｇ投与量のＣＢ、およびＥｔＯＨ／ＮａｅＱと１０．２０および４０ 　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ　ＣＢを用いて上記の方法を繰り返した。

上記の結果を第２表に示す。

大五舅上よ 実施例１で精製したＣＢ　（２，０ｍｇ）を２００ｍｇの卵ホスファチジルコリ ンを含有する２、０ｎ（ｌのクロロホルム中に＠濁した。この溶液を丸底フラス コ中にピペットで入れ薄膜となるまで乾燥させた。この膜をついで５．０ｍＭの ＰＢＳ中に再懸濁する。この懸濁液を乱さないように１時間放置し、その後Ｌｔ ＪＶＥＴ法により５．０ｕｍポリカーボネート（直線経路）フィルターから５回 押出し、大きなユニラメラ小胞体を形成した。

２００ｍｇ総量の卵ホスファチジルコリンニジミリストイルホスファチジルグリ セロール（ＥＰＣ：　ＤＭＰＧ）７０　：　３０混合物を用いて上記の方法を繰 り返す。

叉胤貫上１ ２００ｍｇの卵ホスファチジルコリンをクロロホルムから乾燥させて丸底フラス コの側面上に薄膜とし、この膜を５．０ｍｇのエチルエーテル中に再懸濁し実施 例１で精製された５、０ｍｇのＣＢを添加することによって、ＣＢを含有する５ ＰＬＶｓがつくられる０次いで水浴中、３７℃で回転蒸発することによって有機 溶媒を除去し、残ったペーストを１０．０ｍＭのＰＢＳを用いて更に水和する。

失庭匠上ｌ 実施例４，５、および６により処理されたマウスの肝臓を、５゜０　ｍ　Ｑのメ タノール／ｇ組織を用いてブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）ポリトロンで均質 にした。この均質化物を５０００ｍｇで５分間遠心分離した。この上清をＨＰＬ Ｃ等級の水を用いて８０％の水となし、まず５．０ｍＭのメタノールで、１０． ０ｍＭ蒸留水で調整した５ｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ−１８カートリツジに通した。この カートリッジを真空下で乾燥し、次いで３．０ｍＭのヘキサン（ＨＰＬＣ等級） で洗浄、そして２．０ｍ１２のＥｔＯＡｃ　（ＨＰＬＣ等級）でＣＢを回収した 。この溶出物を窒素気流中で蒸発し、２５０ｕＲテトロヒドロフラン（ＨＰＬＣ 等級）中に溶解した。

試料を０．４５ｕｍナイロン筒フィルターを通して５０ｕＲ試料ループ中にろ過 した。この試料をＨＰＬＣで、正常相シリカカラム、ヘキサン：テトラヒドロフ ラン（６０：４０）の溶媒系を用いて分析し、２３０ｎｍで分析した。感受性の 低い方の限界は。

２０％が０．２ｕｇの定量的限界で分析されたので、総抽出量に対しｌｕｇであ ると測定された。

実施例６および７からの肝臓を用いて上記の方法を繰り返した。

失庭態上土 Ｐ３８８ネズミ白血病細胞に対するＡＤＲ，ＣＡおよびＣＢの阻害濃度□ｊ　Ｉ Ｃ５７１）　（薬−抵抗線）を次のようにして決定した。

細胞（５Ｘ　Ｉ　Ｑ’）を、１０％子牛血清を含有する２００ｕＬのＲＰＭ１１ ６４０媒体中に並べた。ＣＢ、ＣＡ、およびＡＤＲを次のようにしてウェルに添 加し１次のようにして阻害濃度を決定した：８ウェルにいくつかの希釈度のＣＢ を播種した＝０．０ＯｕＭＣＢ、１．ＯＯｕＭ　ＣＢ、２．ＯＯｕＭ　ＣＢ、４ ．ＯＯｕＭ　ＣＢ、１０．ＯＯｕＭ　ＣＢ、２０．ＯＯｕＭ　ＣＢ、４０．００ ｕＭＣＢ、および８０．ＯＯｕＭＣＢ。

７つの別々のウェルに次のようにＣＡを播種した。１．ＯＯｕＭ、２．ＯＯｕＭ 、４．ＯＯｕＭ、１０．００ｕＭ、２０．ＯＯｕＭ、４０、ＯＯｕＭ、および８ ０．ＯＯｕＭ。

８つの別々のウェルに次のようにＡＤＨを播種した：１．ＯＯｎＭ、２．ＯＯｎ Ｍ、４．ＯＯｎＭ、１０．ＯＯｎＭ、２０．ＯＯｎＭ、４０．００ｎＭ、１００ ．ＯＯｎＭおよび２００．ＯＯｎＭ。

全てのウェ″ルを３７℃、５％ＣＯ□、３時間インキュベートし。

その後このプレートを６ＱＱＸｇで５分間遠心分離し、この薬媒体を除去し１次 いで１０％子牛血清を含有する新鮮なＲＰＭＩＩ６４０媒体２００ｕＬで置き換 え、６ＱＱＸｇで再び遠心分離し。

細胞を再供給し、３７℃で５％ＣＯ□中で４５時間インキュベートした。この４ ５時間インキュベート後、この細胞をＡ１１ｅｙらに記載されているＭＴＴ減少 分析を用いて成育性を分析した。

このＩＣ分析の結果は、ＣＢのＩＣ５０は３３５−４０ｕで、一方ＡＤＲのＩＣ ５０は３．５ｎＭであることを示している。

失蓬豊↓旦 ドキソルビンおよび他の天然物抗腫瘍剤に対する多種薬抵抗に対して選択された Ｐ３８８ネズミ白血病細胞（Ｐ３８８／ＡＤＨ）、このものはナショナルインス ティチューツオブヘルスから得られたものであるが、このものを１０％牛脂児血 清および１゜ｕＭメルカプトエタノールを有するＲＰＭ１１６４０媒体中に溶か して２４−ウェルのマイクロタイタープレート中に５Ｘ１０’細胞／ｍΩで、こ れはウェルにつき２．０ｍＭであるが、播種した。この細胞は５％ｃｏ２中、３ ７℃で一夜平衡化１分割（ｄｉｖｉｄｅ）され、続いて複製ウェル中で２．５， ５．１０および２０ｕＭでＡＤＲで処理された。他の複製ウェルは２．５，５． ７．５゜１０および２０ｕＭでＣＢで処理された。複製ウェルはまた上記の量の ＡＤＨおよびＣＢを含有し、このものは細胞に同時に加えられた。（ＡＤＨに関 するＩＣ５０ｓはＡＤＨのロットに依り３゜５ｕＭおよび１２ｕＭであり、ＣＢ のＩＣ５０ｓは３３５−４０ｕであった。）３７℃で３時間インキュベートした 後、各ウェルからの細胞は滅菌した遠心管に移し、２．０ｍＭの滅菌媒体でウェ ルを洗い、細胞の完全な移し変えを行った。この管は６００ｘｇで５分間遠心分 難し、薬媒体は傾斜して捨てた。この細胞は続いて２．０ｒｎＱの新鮮な媒質中 に再懸濁し２４ウエルのプレート中に置き、３７℃で９６時間インキュベートし 、クルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）８１！ｌ定法によって処理後の細胞生育性および 増殖が測定された。

失り莢上且 ９６−ウェルのマイクロタイタープレートを用い、実施例１４の材料および手法 を用いて、ウェルにっき２００ｕ　Ｑの媒体および１×１０４細胞の播種を行っ た。細胞の播種および一晩で２倍トシタ後、ＡＤＲを次の希釈度：０，５０，１ ００，２００および４００ｎＭ　ＡＤＲでウェルの内３０個に添加し、これを５ 回繰り返した。３０分後ＣＢを次の希釈度でウェルに添加した：ウェル１−５に はＯｕＭのＣＢを播種、ウェル６−１０には１０゜００ｕＭＣＢを播種、ウェル １１−１５には２０．ＯＱｕＭＣＢを、ウェル１６−２０には４０．ＯＯｕＭ　 ＣＢを、ウェル２１−２５には８０．ＯＯｕＭＣＢを、そしてウェル２６−３０ には１６０．ＯＯｕＭ　ＣＢを播種した。このプレートを実施例１４のようにし てインキュベートし、ＡＤＨの添加後、３時間したら、この媒体を新鮮媒体に置 き換えた。４８時間後、３７℃。

５％ｃｏ、でインキュベートした後、この細胞の生育性が、Ａ１１ｅｙに、らの 技術［１９８６，キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、４８：５ ８９−６０１）によりＭＴＴ染色減少測定に記載されたように、５００ｎｍにお ける染色減少を読むことによってｉｎされた。

相乗効果が第６図にグラフとして表された。ＣＢの高投与量（１０ａＭ以上のＣ Ｂ）では、ＣＢおよびＡＤＲが同時に添加されたとき拮抗作用が観察されたが、 １０ａＭＣＢより下の場合には強い相乗効果が生じた。しかしながら、ＡＤＲが 最初に投与された時には全ての場合、全ての投与量において相乗効果が観られた 。

細胞の増殖が、標準としてＩＣ５ｏ、ＩＣ８ｏおよにＩＣ９０値を用いて、イソ ボログラム（第５，６および７図参照）上にプロットされた。ＩＣ５０プロツト については（第６図）、　７．　ＯｕＭおよびそれ以下のＡＤＨ投与量が、９０ ａＭおよびそれ以下のＣＢ投与量を結合されたとき、相乗効果が現われた。ＩＣ ８０プロツトについては（第５図）、３０ａＭおよびそれ以下のＡＤＲ投与量が 、６０ａＭおよびそれ以下のＣＢ投与量を結合されたとき、相乗効果が現われた 。最も力のある投与の組合せは、最小量のＡＤＲと最も多いＣＢを採用する効果 を有する結合投与量である。

去Ｊｕ１１１− ＣＢの代わりにＣＡを用いて、実施例１６の手法および材料が繰り返される。ウ ェルは実施例１６に記載されたＡＤＨの希釈液を有し、ＣＡの希釈度は次のよう であった；ウェル１−５　：　０゜００ａＭ　ＣＡ；つｘ）Ｌｉ６−１０　：　 ２．ＯｏｕＭ　ＣＡ　；ウェル１１−１５：４．ＯＯｕＭ　ＣＡ：ウェル１６− ２０：１０．００ａＭＣＡ；ウェル２１−２５　：　２０．００ａＭ　ＣＡ；お よびウェル２６−３０：４０．ＯＯｕＭ　ＣＡ。

細胞の生育性を決定するための方法は実施例１６に記載されているようなもので あった。

寒胤鮭上１ ＩＣ８０のＡＤＲにおけるＡＤＲ−ＣＢ相乗効果を測定するために、実施例１６ の物質および手法が採用された。ＡＤＨおよびＣＢの連続的希釈液が実施例１６ によりつくられ、９６−ウェルプレート中に置かれた。ＣＢおよびＡＤＨの結合 した量を播種した場合、ＡＤＨをマイクロタイターウェルに植え付け、次いで５ −１５分後これらのウェルにＣＢを添加した。ＡＤＲの希釈液をＣＢの希釈液と 混合し、インボログラム上にプロットした。３０ａＭおよびそ九より少のＡＤＲ および６０ａＭおよ、びそれより少のＣＢの間の全ての希釈度において、薬剤相 乗効果をＩｌ！察した（第５図）。

失庭牲上ｌ 実施例１１の物質および手法を採用して、ｃＡをリポソーム中に取り込んだ。

第１表 マウス組織へ外部から添加後のＣＢの回収ａ　測定せず ｂ　グループにつき４−６匹の動物 ｃ　１グループにつき２匹の動物 第２表 生体内のチトカラシンＢ 最大耐容投与量Ｉ　ＩＰ、ＳＣ，ＩＶ ＩＰ　ＣＭＣ／トウィーン　懸濁液　１　５０　７　２／３４ＣＭＣ／）−ウィ ーン　懸濁液　１，４，７　５０／Ｂ　６　０／１６ＤＭＳＯ溶液　１　２５　 ５　１１５ ＳＣＣＭＣ／トウィーン　懸濁液　１　１００　３　０／３１ＣＭＣ／トウィー ン　懸濁液　１　１５０　７　４／２８ＤＭＳＯ溶液　１　１００　７　５／３ ２Ｉｖ　ＣＭＣ／トウィーン　懸濁液　１　２０　１　０１５（ＢＤＦ）ＥＴＯ Ｈ／生理食塩水　溶液　１　２０　１　０／７（ＢＤＦ）ＥＴＯ）ｌ／生理食塩 水　溶液　１　１０　２　１１５（ＣＤＦ）ＥＴＯＨ／生理食塩水　溶液　１　 ５　０　０／２９（ＣＤＦ）＃　Ｂ６Ｄ２Ｆ１．ＣＤ２Ｆ１．もしくはＣ５７Ｂ １／６　マウスにおいて第１図 日数 ２８日　最終段階 第３図 時間 日数 ＢｕＭ ＣＢ（υに） ＣＢｕ間 国際調査報告

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．パッチ吸収技術によって所望する化合物を製造するかびマットを抽出する工 程を含むかび一由来の膜作用化合物の製造方法。
2. ２．かび一由来の膜作用化合物がチトカラシンである請求の範囲１に記載の方法 。
3. ３．チトカラシンがチトカラシンＢ，ＤまたはＡである請求の範囲２記載の方法 。
4. ４．チトカラシンが実質的に他のチトカラシンを含まないものである請求の範囲 ２記載の方法。
5. ５．精製されたチトカラシンが約１％以下の他のチトカラシンを含有するもので ある請求の範囲４記載の方法。
6. ６．チトカラシンが次の工程によって精製されたものである請求の範囲３記載の 方法： （ａ）有機溶媒でかびマットを抽出する工程；（ｂ）（ａ）工程のろ過されたマ ット抽出物に水性溶液を添加する工程； （ｃ）パッチ吸収技術により（ａ）工程の水混和性有機溶媒を分離する工程； （ｄ）得られた分画を有機溶媒で抽出する工程；および（ｅ）その分画をリニア Ｋシリカプレート上で再結晶化し、チトカラシンを精製する工程。
7. ７．かびマットがディーデマチオイデア（Ｄ，ｄｅｍａｔｉｏｉｄｅａ）である 請求の範囲６記載の方法。
8. ８．請求の範囲７の方法により精製されたチトカラシンＢ。
9. ９．実質的に他のチトカラシン類を含まない精製されたかび一由来チトカラシン 。
10. １０．チトカラシンがチトカラシンＢ，ＤまたはＡである請求の範囲６記載の精 製された天然に存在するチトカラシン。
11. １１．チトカラシンおよび製薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する製 薬学的単位投与量形態。
12. １２．チトカラシンがチトカラシンＢである請求の範囲１１記載の製薬学的単位 投与量形態。
13. １３．非経口的投与のために適合する請求の範囲１２記載の製薬学的単位投与量 形態。
14. １４．経口的投与のために適合する請求の範囲１２記載の製薬学的単位投与量形 態。
15. １５．被検者に対して、請求の範囲４記載のチトカラシンの製薬学的組成物の抗 腫瘍性病気の治療に有効量を投与する工程を含む腫瘍を治療する方法。
16. １６．チトカラシンがチトカラシンＢである請求の範囲１５記載の腫瘍を治療す る方法。
17. １７．請求の範囲９記載のチトカラシンおよびリポソームを含有する組成物。
18. １８．請求の範囲１７記載の組成物および製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤 を含有する製薬学的組成物。
19. １９．被検者に対して、請求の範囲１８の製薬学的組成物の抗腫瘍性病気の治療 に有効量を投与する工程を含む転移性病気の治療方法。
20. ２０．付加的に抗腫瘍剤を含有する請求の範囲１７記載の組成物。
21. ２１．抗腫瘍剤がドキソルビシンである請求の範囲２０記載の組成物。
22. ２２．請求の範囲９のチトカラシンおよび抗腫瘍剤を含有する組成物。
23. ２３．請求の範囲２２記載の組成物および製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤 を含有する製薬学的組成物。
24. ２４．被検者に対して、請求の範囲２３の製薬学的組成物の抗腫瘍性病気の治療 に有効量を投与する工程を含有する生体内での転移性病気を治療する方法。
25. ２５．抗腫瘍剤がドキソルビシンである請求の範囲２３記載の製薬学的組成物。
26. ２６．チトカラシンがチトカラシンＢである請求の範囲２５記載の製薬学的組成 物。
27. ２７．細胞に対して、合成もしくはかび一由来の膜作用化合物及び抗腫瘍剤の相 乗作用有効量を投与する工程を含有する試験管内での腫瘍細胞生長を抑制するた めの方法。
28. ２８．合成もしくはかび一由来の膜作用化合物がチトカラシンである請求の範囲 ２７記載の方法。
29. ２９．チトカラシンがチトカラシンＢである請求の範囲２８記載の方法。
30. ３０．抗腫瘍剤ドキソルビシンである請求の範囲２９記載の方法。
31. ３１．チトカラシン及びドキソルビシンが同時に細胞に対して投与される請求の 範囲３０記載の方法。
32. ３２．ドキソルビシンがチトカラシンＢの前に細胞に対して投与される請求の範 囲３０記載の方法。
33. ３３．全薬の組合せ露出量が３時間である請求の範囲３０記載の方法。
34. ３４．合成もしくはかび一由来の膜作用化合物及び抗腫瘍剤の相乗作用の組合せ 。
35. ３５．膜作用化合物がチトカラシンであり、抗腫瘍剤ドキソルビシンである請求 の範囲３４記載の相乗作用の組合せ。
36. ３６．請求の範囲３５記載の相乗作用の組合せ及び製薬学的に許容し得る担体又 は希釈剤を含有する製薬学的組成物。
37. ３７．被検者に対して、請求の範囲３６の製薬学的組成物の抗腫瘍一生産物の有 効量を投与することを含有する、腫瘍を治療する方法。
38. ３８．他のかび一由来の膜作用化合物の１％以下で含有するかび一由来膜作用化 合物を含む組成物。