KR101395858B1

KR101395858B1 - 다당류 리포솜, 이의 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR101395858B1
Application number: KR1020117026176A
Authority: KR
Inventors: 방인 첸; 웬준 장
Original assignee: 우한 도칸 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2014-05-15
Also published as: KR20120028868A; WO2010111807A1; JP5961551B2; JP2012522730A

Abstract

다당류 리포솜, 특히, 렌티난 리포솜, 이의 제조 방법, 상기 리포솜을 포함하는 약학 조성물, 및 항암제 또는 면역 제제를 제조하기 위한 리포솜의 용도가 개시된다. 리포솜은 다당류, 인지질, 콜레스테롤, 계면 활성제 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 물질로부터 제조되는 것이다.

Description

다당류 리포솜, 이의 제조 방법 및 용도{A POLYSACCHARIDE LIPOSOME, THE PREPARATION METHOD AND USE OF IT}

본 발명은 다당류 리포솜, 특히, 렌티난 리포솜과; 다당류 리포솜의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

다당류는 자연계에 널리 존재한다. 이는 유기체의 중요한 부분을 차지하며, 생명을 유지하는데 필요한 많은 생리학적 기능에 관련되어 있다. 다당류는 항암 효과, 항염효과, 심장혈관병증, 당대사, 항노화 등의 측면에서 특별한 역할을 가지며, 생체의 면역을 향상시킬 수도 있다.

그러나, 실제적 임상 적용에서, 다당류 약물들은 대부분이 의도하는 바람직한 약리학적 활성을 달성하지 못한다. 이는 주로 다당류 약물들이 생체 내에서 목적하는 부위에 도달하기 전에 대사되기 때문이며, 이는 특정 부위에 집중되지 못한다. 그러므로, 바람직한 임상적 효과를 얻기 위해, 다당류 약물들이 목적하는 부위에 도달하기 전에 최소한으로 대사되게 하고 특정 부위에 집중될 수 있게 하는 수단이 당업계에서 시급하게 널리 해결이 요구되고 있다.

리포솜 전달 시스템은 임상적 적용에서 보여진 우수한 효과로 인해, 많은 관심의 대상이 되고 있다. 그러나, 이의 제조, 특히 높은 캡슐화율을 갖는 다당류 리포솜의 제조의 어려움은 공통적인 문제로 남아 있다. 그리고, 높은 캡슐화율 및 작은 입자 크기를 갖는 다당류 리포솜을 얻기는 더욱 어렵다.

본 발명자들은, 계속적인 연구 결과, 리포솜으로 캡슐화된 다당류 약물과, 이의 제조 방법을 완성하였다. 게다가, 본 발명자들은, 놀랍게도, 본 발명의 다당류 리포솜이 높은 캡슐화율 및 작은 입자 크기를 가짐을 발견하였다.

본 발명은 다당류, 인지질, 콜레스테롤, 계면 활성제 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 출발 물질로부터 제조되는 리포솜을 제공한다.

본 발명은 또한, 이하의 단계를 포함하는 상기 리포솜의 제조 방법을 제공한다:

a. 유기 용매 내에 인지질, 콜레스테롤, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 출발 물질을 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하는 단계;

b. 다당류 및 계면 활성제를 포함하는 출발 물질을 물 또는 수성 용액에 용해시켜 수상 혼합물을 형성하는 단계;

c. 상기 수상 혼합물을 오일상 혼합물에 가하고, 에멀젼화하는 단계;

d. 보호 가스 내, 일정 온도 및 감압 하에서 증발에 의해 용매를 제거하는 단계; 및

e. 물 또는 수성 용액을 가하고 나서, 수조 내에서 유지시키는 단계.

본 발명은 또한, 상기 리포솜을 포함하는 조성물을 제공한다.

또, 본 발명은 상기 리포솜 또는 이를 포함하는 조성물을 항암제 또는 인간 또는 동물의 면역 기능을 조절하기 위한 약제의 제조용으로 사용하는 용도(방법)을 제공한다.

상기 본 발명의 다당류 리포솜은 1㎛ 이하의 조절 가능한 입자 크기와, 균일한 크기 분포를 갖는다. 본 발명의 리포솜은 65% 이상의 캡슐화율을 갖는다. 본 발명의 다당류 리포솜은 리포솜 내에 캡슐화되지 않은 다당류와 비교하여, 투여 후에 생체 내에서 현저히 향상된 약리적 활성을 나타낸다.

본 발명의 다당류 리포솜은 리포솜 내에 캡슐화되지 않은 다당류와 비교하여, 투여 후에 생체 내에서 현저히 향상된 약리적 활성을 나타낸다.

도 1은 실시예 1에서 얻어진 본 발명의 리포솜의 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진 본 발명의 렌티난 리포솜의 투과 전자 현미경 사진이다.

본 출원에 개시된 화합물, 조성물, 방법, 시약들은 이하에 구체적으로 나열된 것들에 한정되지 않으며, 다양하게 변형될 수 있다. 이하의 구체적 구현예들은, 특히 실시예들은 본 발명의 권리범위를 한정하지 않으며, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해 제시된 것이다.

이하, 구체적인 구현예들을 참고하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 명세서에서, "리포좀"이라는 용어는 지질 이분자층의 구조를 가지며, 그 내부에 약리학적 활성 성분이 캡슐화되어 있는 둘러쌓인 형태의 소수포를 지칭한다. 리포솜은 단일 라멜라 리포솜 또는 다중 라멜라 리포솜으로 될 수 있다. 본 발명의 리포솜은 개질된 표면을 갖는 것을 포함한다.

본 발명의 다당류는 렌티난 (lentinan), 아스트라갈란 (astragalan), 흰목이 (Tremella) 다당류, 흰목이 버섯 (Tremella fuciformis) 다당류, 파낙산 (panaxan), 가노데란 (ganoderan), 저령 (Polyporus Umbellatus) 다당류로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 다당류는 렌티난 또는 아스트라갈란이다. 가장 바람직하게는 다당류는 렌티난이다.

본 명세서에서, "인지질"은 대두 포스파티드, 레시틴, 수소화 대두 포스파티드, 수소화 레시틴, 포스파티딜 에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜콜린, PEG화 인지질 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 폴리에틸렌 글리콜은 PEG 800~5000, 인지질-개질된 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜은 PEG 1000~2400이다. 보다 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜은 PEG 2000이다.

본 발명의 계면 활성제는 데옥시콜레이트, 플록사머, 트윈-80 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 계면 활성제는 데옥시콜레이트 나트륨 또는 데옥시콜레이트 칼륨과 같은 데옥시콜레이트이다.

본 발명의 리포솜을 제조하기 위한 출발 물질은 리포솜을 제조하는데 적절한 것들을 더 포함할 수 있다. 발명의 일 구현예에서, 예를 들어, 출발 물질은 리포솜의 저장 안정성을 향상시키기 위한 항산화제를 더 포함할 수 있다. 발명의 리포홈의 다른 구현예에서, 상기 출발 물질은 리포솜이 주사용 동결-건조 분말로 제제화될 수 있도록 동결-건조 보호제를 더 포함한다.

본 발명의 항산화제는 비타민 E, 비타민, C, 시스테인, 메티오닌, 소디움 바이설파이트 및 이들의 혼합물과 같은 약학적으로 허용 가능한 임의의 항산화제로 될 수 있다.

본 발명의 동결 건조 보호제는 만니톨, 트레할로스, 수크로스, 글리신 및 이들의 혼합물과 같은 약학적으로 허용 가능한 임의의 동결-건조 보호제로 될 수 있다.

발명의 리포솜의 일 구현예에서, 상기 출발 물질은 각 성분을 다음의 함량비로 포함한다: 1부의 다당류, 30~100부의 인지질, 2~20부의 콜레스테롤; 바람직하게는, 1부의 렌티난, 40~90부의 인지질, 및 5~15부의 콜레스테롤; 더욱 바람직하게는, 1부의 렌티난, 50~70부의 인지질, 및 5~15부의 콜레스테롤.

특별히 기재되지 않는 한, 본 명세서의 "부"는 중량부를 나타낸다.

발명의 리포솜의 일 구현예에서, 출발 물질은 3~12부의 계면 활성제를 포함한다. 발명의 리포솜의 다른 구현예에서, 출발 물질은 1~8부의 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

발명의 리포솜의 또 다른 구현예에서, 출발 물질은 항산화제를 당업자의 기존 상식에 따라 잠명하게 결정할 수 있는 적절한 함량으로 더 포함한다. 예를 들어, 1~8부의 항산화제가 사용될 수 있다.

본 발명의 리포솜은 대상에게 투여하기 적합한 임의의 제형으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 리포솜은 주사액 또는 주사 분말과 같은 주사제, 또는 정제, 캡슐 또는 과립과 같은 경구 제제로 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 리포솜은 주사액 또는 주사 분말의 형태로 될 수 있다.

본 발명의 리포솜은 상술한 a~e 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 리포솜이 주사 분말로 제형화되는 경우, 본 발명의 리포솜의 제조 방법은 f 단계: e 단계에서 얻은 용액을 여과하고 나서, 동결 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 a 단계에서, 상기 용매는 클로로포름, 클로로포름-메탄올 또는 디에틸에테르와 같이 출발 물질을 용해시키기에 적합한 임의의 유기 용매로 될 수 있다. 상기 유기 용매는 출발 물질을 용해시킬 수 있는 함량으로 사용된다. 출발 물질에 따른 사용량은 당업자가 자명하게 결정할 수 있다.

상기 b 단계에서, 사용된 수성 용액은 인산 완충 용액, 시트레이트 완충 용액, 아세테이트 완충 용액, 소디움 바이카보네이트 완충 용액 또는 타르트레이트 완충 용액 등의 완충 용액; 또는 식염수와 같은 소금 용액일 수 있다. b 단계에서 사용된 물 또는 수성 용액은 출발 물질을 용해시킬 수 있는 양으로 사용된다. 출발 물질에 따른 사용량은 일반적으로 당업자가 자명하게 결정할 수 있다.

상기 c 단계에서, 본 발명의 제조 방법의 에멀젼화는 초음파 처리에 의해 달성되거나, 고압에서 수행될 수 있다. 에멀젼화는 전형적으로 10℃ 이하와 같은 저온에서 수행된다. 에멀젼화는 상기 혼합물이 적절한 크기를 갖는 입자로 형성되는 시간 동안 수행된다. 에멀젼화의 시간은 입자 크기에 따라, 임의의 알려진 방법에 의해 당업자가 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어, 에멀젼화의 시간은 3~10분으로 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 초음파 처리는 배치 초음파 처리이고, 고압 하의 에멀젼화는 바람직하게는 고압 하의 순환식 에멀젼화(circular emulsification)이다.

본 발명의 제조 방법의 d 단계에서, 보호 가스는 질소를 포함하는 불활성 가스로 될 수 있다.

본 발명의 제조 방법의 d 단계에서, 로터리 증발이 적절한 온도, 바람직하게는 35~45℃의 일정한 온도에서 진행될 수 있다.

본 발명의 제조 방법의 e 단계에서, 수조 내의 유지는 바람직하게는 35~50℃의 온도에서 진행되며, 보다 바람직하게는 40℃에서 진행된다.

본 발명의 제조 방법의 e 단계에서, 수조 내의 유지는 바람직하게는 1~2 시간 동안 진행된다.

본 발명의 제조 방법의 e 단계에서, 수성 용액은 인산 완충 용액, 시트레이트 완충 용액, 아세테이트 완충 용액, 소디움 바이카보네이트 완충 용액 또는 타르트레이트 완충 용액 등의 완충 용액 또는 소금 용액으로 될 수 있다.

바람직하게는, 상기 b 단계에서 반응계의 pH 값은 e 단계와 다르게 된다. 보다 바람직하게는, 상기 b 단계에서 반응계의 산도 또는 염기도는 e 단계와 반대로 된다. 반대의 산도 또는 염기도라 함은, 단계 b 또는 e 중의 어느 하나의 반응계가 산성을 띠고, 나머지가 염기성을 띠는 경우를 지칭한다. 특히 바람직하게는, b 단계의 반응계가 염기성이고, e 단계의 반응계가 산성이다.

본 발명의 리포솜의 일 구현예에서, a 단계의 출발 물질은 항산화제를 더 포함한다.

본 발명의 리포솜의 다른 구현예에서, e 단계에서 수성 용액은 동결-건조 보호제를 더 포함한다. 동결 건조 보호제는 당업자의 상식에 따라 자명하게 결정될 수 있는 함량으로 사용된다.

본 발명의 다당류 리포솜은 간, 골수, 암 및 염증 조직과 간은 특정한 조직 또는 세포에 현저히 집중될 수 있고, 연장된 순환을 갖는다.

본 발명의 다당류 리포솜은 간, 난소, 장, 폐, 가슴, 전립선, 이자, 신장, 위, 자궁 내막, 식도, 머리 또는 목의 종양, 악성 늑막암, 또는 복수암 등과 같은 암의 치료 또는 부속 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 다당류 리포솜은 또한, 면역 조절 효과를 갖는다. 예를 들어, 간염, 류마티스 관절염 또는 에이즈로 고통받는 환자의 면역을 향상시키는데 사용될 수 있다. 다당류는 단독으로 투여된 경우에 비하여 리포솜 내에 캡슐화된 형태로 투여되었을 때, 현저히 향상된 효과를 나타낸다.

본 발명의 다당류 리포솜은 높은 캡슐화율을 갖는다. 본 발명의 다당류 리포솜의 캡슐화율은 65% 이상이다. 바람직하게는, 상기 캡슐화율은 70% 이상이다. 보다 바람직하게는, 상기 캡슐화율은 80% 이상이다. 높은 캡슐화율에 더하여, 본 발명의 다당류 리포솜은 작은 입자 크기를 갖는다. 일반적으로, 리포솜의 입자 크기는 1㎛ 이하, 바람직하게는 100~500 nm, 보다 바람직하게는 140~300 nm이다.

본 명세서에서, 상기 리포솜의 캡슐화율은 리포솜을 제조하기 위한 출발 물질 내의 다당류의 총량에 대하여, 리포솜 내에 캡슐화된 다당류의 중량비를 중량%로 나타낸 것이다.

약학적 조성물은 하기의 1종 이상의 다른 약리학적 활성 성분과 조합하여, 본 발명의 리포솜으로부터 제조될 수 있다.

예를 들어, 블레오마이신, 독소루비신, 미토마이신, 카무스틴, 카보플라틴, 시스플라틴, 이프로플라틴, 시클로포스파미드, 겜시타빈, 도세탁셀, 에톱사이드, 플루오로우라실, 멜팔란, 메토트렉세이트, 비노렐빈, 빈크리스틴, 파크리탁셀 등의 세포 독성제, 및 아미노글루테틴마이드, 아나스트로졸, 비칼루타미드, 이리노테칸, 리툭시맙, 타목시펜, 트라스트주맙 등의 호르몬 또는 항 호르몬;

예를 들어, 간시클로비어, 리바비린, 비다라빈, 팜시클로버, 라미부딘, 아바카비르, 네비라핀, 인디나비르 등의 항바이러스제, 및 아스피린, 이부프로펜, 인도메타신, 피록시칸, 니메술리드, 글루코사민 등의 항염증제와 같은 항 염증성 약제; 그리고,

예를 들어, 인터페론 제제 또는 인터류킨 제제의 면역 조절 약제.

본 발명의 리포솜 및 조성물은 또한, 충전제, 흡착제, 습윤제, 접착제, 윤활제, 색소, 감미제, 안정화제, 보존제, 완충제, 붕해제, 코팅제, 분산제, 서스펜션화제와 같은 1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 보조제와 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 다당류 리포솜 또는 조성물은 대상의 목표 지점에 다양한 경로로 전달될 수 있다. 예를 들어, 리포솜 또는 조성물은 정맥 주사, 근육 주사, 복막 주사, 및 피하 주사와 같은 주사 또는 경구 투여를 통하여 적절한 형태로 치료될 부위에 집중되어 향상된 면역 조절 또는 항암 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 리포솜은 일 종 이상의 다른 약학적 활성제, 예를 들어, 상술한 바와 같은 다른 활성제와 병용하여 투여됨으로서, 치료 효과를 나타낼 수 있다.

[실시예]

이하 실시예를 참고하여 발명의 구현예를 더욱 구체적으로 설명한다. 실시예에서 사용되는 화합물 또는 약제는 상업적으로 입수 가능하거나, 당업계에서 널리 알려진 방법에 따라 당업자가 제조할 수 있으며, 실험에서 사용된 기구 또는 장치들 역시 상업적으로 입수 가능하다.

실시예 1

리포솜 1의 출발 물질의 조성:

리포솜 1의 제조:

8.0 g의 대두 포스파티드, 1.0g의 콜레스테롤, 0.2g의 PEG 2000 및 0.2g의 비타민 E를 교반 하에 900 ml의 클로로포름에 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하였다. 0.1g의 주사 가능한 등급의 렌티난 및 0.9g의 데옥시콜레이트 나트륨을 300ml 의 주사용 물에 가하고, 0.1 mol/L NaOH 용액의 적량을 렌티난이 용해될 때까지 가하였다. 이 용액은 0.1 mol/L HCl 용액으로 pH 7.0~8.0으로 조절되었다. 이러한 수상 혼합물은 냉수조 내의 오일상 혼합물에 서서히 가해졌다. 이어서, 배치 초음파 에멀젼화가 약 5분 동안 진행되어, 균질한 우유 같은 흰색의 W/O 에멀젼이 형성되었다. 질소 가스의 보호 하, 40℃의 감압 하에서, 용매는 로터리 증발에 의해 제거되어, 밝은 황색의 진한 라텍스 유사한 결과물이 형성되었다. 0.9% NaCl 용액의 200 ml가 가해진 후, 생성된 혼합물은 40℃에서 1 시간 동안 유지되어, 리포솜 1의 용액이 형성되었다. 이러한 리포솜 용액은 렌티난 리포솜의 주사액의 100 부분 표본으로 나뉘기 전에 밀리포어 필터를 통과하여 멸균되었다.

리포솜 1의 평가:

(1) 캡슐화율

0.2ml의 리포솜 1은 10ml 테이퍼 원심관에 가해졌고, 0.2ml의 프로타민 (10mg/ml)이 첨가되었다. 이들은 균일하게 진동이 가해졌고, 3분 동안 방치된 후, 0.05ml/L NaOH 용액이 총 부피 5ml로 되게 첨가되었다. 생성된 혼합물은 실온에서 30분 동안 3000 r/min으로 원심 분리되었다. 2ml의 상청액은 제거되고, 이의 내에 4ml의 0.2% 황산-안트론 용액 (0.2g의 안트론 및 100ml의 농축 황산으로부터 제조)이 첨가되었다 생성된 혼합물은 균일하게 진동이 가해졌고, 끓는 수조에서 6분 동안 가열되고, 냉수조에서 2분 동안 냉각되고, 실온에서 10분 동안 방치된 후, 흡광도가 측정되었다. 또, 대조군으로서, 일정 중량을 갖도록 P₂O₅에 의해 건조된 렌티난의 적량은 정확하게 질량이 측정되고, 그라인딩에 의해 0.5mol/L NaOH 용액의 소량에 용해되고, 희석되어 20μg/ml의 농도의 용액으로 형성되었다. 이러한 대조건에 대한 흡광도는 마찬가지 방법으로 측정되었다. 리포솜 내에 캡슐화되지 않은 렌티난의 함량은 계산되었다. 캡슐화율은 하기 식에 의해 계산되었다:

캡슐화율(%) = (1 - 캡슐화되지 않은 렌티난의 양/렌티난의 총량) X 100

상기 샘플의 렌티난의 캡슐화율은 82.8%로 결정되었다.

(2) 입자 크기 및 미세 형태

리포솜 1은 레이저 입자 크기 분석기 (DELSA 440S laser particle size analyzer, Beckman, USA) 200~400 nm의 입자 크기 및 316nm의 평균 크기를 갖는 것으로 결정되었다 (도 1 참조). 리포솜 1은 투과 전자 현미경 하에서 구형 외관 및 명확한 배열 형태를 갖는 것으로 관찰되었다 Tecnai G²12 transmission electron microscope, FEI, Holland) (도 2 참조).

실시예 2

리포솜 2의 출발 물질의 조성:

제조:

8.0g의 대두 포스파티드, 1.0g의 콜레스테롤, 0.2g의 PEG 2000 및 0.2g의 비타민 E를 교반 하에 900 ml의 클로로포름에 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하였다. 0.1g의 주사 가능한 등급의 렌티난 및 0.9g의 데옥시콜레이트 나트륨을 300ml 의 주사용 물에 가하고, 0.1 mol/L NaOH 용액의 적량을 렌티난이 용해될 때까지 가하였다. 이 용액은 0.1 mol/L HCl 용액으로 pH 7.0~8.0으로 조절되었다. 이러한 수상 혼합물은 냉수조 내의 오일상 혼합물에 서서히 가해졌다. 이어서, 배치 초음파 에멀젼화가 약 5분 동안 진행되어, 균질한 우유 같은 흰색의 W/O 에멀젼이 형성되었다. 질소 가스의 보호 하, 40℃의 감압 하에서, 용매는 로터리 증발에 의해 제거되어, 밝은 황색의 진한 라텍스 유사한 결과물이 형성되었다. pH 6.0~6.5의 200ml의 인산 완충 용액 내의 2% 만니톨이 첨가된 후, 생성된 혼합물은 40℃에서 1 시간 동안 유지되어, 리포솜 2의 용액이 형성되었다.

이러한 리포솜 용액은 100 부분 표본으로 나뉘기 전에 밀리포어 필터를 통과하여 멸균되었고, -50℃에서 2 시간 동안 사전 동결되었다. 이러한 온도는 점차 증가하여 8 시간 내에 -6℃로 되었고, 이후 12 시간 내에 30℃로 되었다. 그 결과, 밝은 황색물, 즉, 리포솜 2의 주사 분말이 형성되었다.

실시예 1의 방법에 따라, 생성된 주사 분말을 재편성한 후에, 리포솜 2는 84.3%의 캡슐화율, 318nm의 평균 입자 크기를 갖는 것으로 결정되었다. 리포솜 2는 투과 전자 현미경을 통해 구형 외관 및 명확한 배열 형태를 갖는 것으로 관찰되었다.

실시예 3

리포솜 3의 출발 물질의 조성:

제조:

6.1g의 대두 포스파티드, 0.8g의 콜레스테롤, 0.2g의 PEG 1000 및 0.2g의 비타민 E를 교반 하에 900 ml의 클로로포름에 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하였다. 0.1g의 주사 가능한 등급의 렌티난 및 0.5g의 데옥시콜레이트 나트륨을 300ml 의 주사용 물에 가하고, 0.1 mol/L NaOH 용액의 적량을 렌티난이 용해될 때까지 가하였다. 이 용액은 0.1 mol/L HCl 용액으로 pH 7.0~8.0으로 조절되었다. 이러한 수상 혼합물은 냉수조 내의 오일상 혼합물에 서서히 가해졌다. 이어서, 배치 초음파 에멀젼화가 약 6분 동안 진행되어, 균질한 우유 같은 흰색의 W/O 에멀젼이 형성되었다. 질소 가스의 보호 하, 40℃의 감압 하에서, 용매는 로터리 증발에 의해 제거되어, 밝은 황색의 진한 라텍스 유사한 결과물이 형성되었다. pH 6.0~6.5의 200ml의 인산 완충 용액이 첨가된 후, 생성된 혼합물은 40℃에서 1.5 시간 동안 유지되어, 리포솜 3의 용액이 형성되었다. 실시예 1의 방법에 따라, 렌티난의 캡슐화율은 82.2%로 결정되었고, 302nm의 평균 입자 크기를 갖는 것으로 결정되었다. 리포솜 3은 투과 전자 현미경을 통해 구형 외관 및 명확한 배열 형태를 갖는 것으로 관찰되었다.

실시예 4

리포솜 4의 출발 물질의 조성:

제조:

5.2g의 대두 포스파티드, 0.7g의 콜레스테롤, 0.2g의 PEG 2000 및 0.2g의 비타민 E를 교반 하에 900 ml의 클로로포름에 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하였다. 0.1g의 주사 가능한 등급의 렌티난 및 0.7g의 데옥시콜레이트 나트륨을 300ml 의 주사용 물에 가하고, 0.1 mol/L NaOH 용액의 적량을 렌티난이 용해될 때까지 가하였다. 이 용액은 0.1 mol/L HCl 용액으로 pH 7.0~8.0으로 조절되었다. 이러한 수상 혼합물은 냉수조 내의 오일상 혼합물에 서서히 가해졌다. 이어서, 배치 초음파 에멀젼화가 약 6분 동안 진행되어, 균질한 우유 같은 흰색의 W/O 에멀젼이 형성되었다. 질소 가스의 보호 하, 40℃의 감압 하에서, 용매는 로터리 증발에 의해 제거되어, 밝은 황색의 진한 라텍스 유사한 결과물이 형성되었다. 200ml의 2% 만니톨 수용액을 첨가한 후, 생성된 혼합물은 40℃에서 1.5 시간 동안 유지되고, 밀리포어 필터를 통해 여과하여 리포솜 4의 용액을 형성하였다. 리포솜 4의 주사 분말은 실시예 2의 방법에 따라 형성되었다. 재편성한 후에, 실시예 1의 방법에 따라, 렌티난의 캡슐화율은 75.1%로 결정되었고, 평균 입자 크기는 297nm로 결정되었다. 리포솜 4는 투과 전자 현미경을 통해 구형 외관 및 명확한 배열 형태를 갖는 것으로 관찰되었다.

실시예 5

리포솜 5의 출발 물질의 조성:

제조:

10.0g의 대두 포스파티드, 1.5g의 콜레스테롤, 및 0.3g의 PEG 2000을 교반 하에 900 ml의 클로로포름에 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하였다. 0.2g의 아스트라갈란 및 1.0g의 데옥시콜레이트 나트륨을 교반 하에 300ml의 주사용 물에 가하여 수상 혼합물을 형성하였다. 이러한 수상 혼합물은 냉수조 내의 오일상 혼합물에 서서히 가해졌다. 이어서, 배치 초음파 에멀젼화가 약 6분 동안 진행되어, 균질한 우유 같은 흰색의 W/O 에멀젼이 형성되었다. 질소 가스의 보호 하, 40℃의 감압 하에서, 용매는 로터리 증발에 의해 제거되어, 밝은 황색의 진한 라텍스 유사한 결과물이 형성되었다. 200ml의 주사용 물이 첨가된 후, 생성된 혼합물은 40℃에서 1.5 시간 동안 유지되고, 밀리포어 필터를 통해 멸균되고, 아스트라갈란의 주사액의 100 부분 표본으로 나뉘었다. 실시예 1의 방법에 따라, 아스트라갈란의 캡슐화율은 75.2%로 결정되었고, 293nm의 평균 입자 크기를 갖는 것으로 결정되었다. 리포솜 5는 투과 전자 현미경을 통해 구형 외관 및 명확한 배열 형태를 갖는 것으로 관찰되었다.

실시예 6

리포솜 6의 출발 물질의 조성:

제조:

10.0g의 대두 포스파티드, 1.5g의 콜레스테롤, 및 0.7g의 PEG 2000을 교반 하에 900 ml의 클로로포름에 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하였다. 0.2g의 아스트라갈란 및 0.9g의 데옥시콜레이트 나트륨을 교반 하에 300ml의 주사용 물에 가하여 수상 혼합물을 형성하였다. 이러한 수상 혼합물은 냉수조 내의 오일상 혼합물에 서서히 가해졌다. 이어서, 배치 초음파 에멀젼화가 약 6분 동안 진행되어, 균질한 우유 같은 흰색의 W/O 에멀젼이 형성되었다. 질소 가스의 보호 하, 40℃의 감압 하에서, 용매는 로터리 증발에 의해 제거되어, 밝은 황색의 진한 라텍스 유사한 결과물이 형성되었다. pH 6.5, 200ml의 인산 완충 용액 내의 2% 만니톨을 첨가한 후, 생성된 혼합물은 40℃에서 1.5 시간 동안 유지되어 리포솜 6의 용액이 형성되었다.

리포솜 6의 주사 분말은 실시예 2의 방법에 따라 형성되었다. 재편성한 후에, 실시예 1의 방법에 따라, 아스트라갈란의 캡슐화율은 84.5%로 결정되었고, 평균 입자 크기는 308nm로 결정되었다. 리포솜 6은 투과 전자 현미경을 통해 구형 외관 및 명확한 배열 형태를 갖는 것으로 관찰되었다.

실시예 7

리포솜 7의 출발 물질의 조성:

제조:

5.0g의 대두 포스파티드, 0.6g의 콜레스테롤, 0.2g의 PEG 2000, 및 0.2g의 비타민 E를 교반 하에 900 ml의 클로로포름에 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하였다. 0.1g의 주사 가능한 등급의 렌티난 및 0.4g의 트윈-80을 교반 하에 300ml의 주사용 물에 가하고, 0.1 mol/L NaOH 용액의 적량을 렌티난이 용해될 때까지 가하였다. 이 용액은 0.1 mol/L HCl 용액으로 pH 7.0~8.0으로 조절되었다. 이러한 수상 혼합물은 냉수조 내의 오일상 혼합물에 서서히 가해졌다. 이어서, 배치 초음파 에멀젼화가 약 6분 동안 진행되어, 균질한 우유 같은 흰색의 W/O 에멀젼이 형성되었다. 질소 가스의 보호 하, 40℃의 감압 하에서, 용매는 로터리 증발에 의해 제거되어, 밝은 황색의 진한 라텍스 유사한 결과물이 형성되었다. pH 6.0~6.5의 200ml의 인산 완충 용액이 첨가된 후, 생성된 혼합물은 40℃에서 1.5 시간 동안 유지되어 리포솜 7의 용액이 형성되었다. 실시예 1의 방법에 따라, 렌티난의 캡슐화율은 80.2%로 결정되었고, 293nm의 평균 입자 크기를 갖는 것으로 결정되었다. 리포솜 7은 투과 전자 현미경을 통해 구형 외관 및 명확한 배열 형태를 갖는 것으로 관찰되었다.

실시예 8

리포솜 8의 출발 물질의 조성:

제조:

6.1g의 대두 포스파티드, 1.5g의 콜레스테롤, 0.2g의 PEG 2000, 및 0.2g의 비타민 E를 교반 하에 900 ml의 클로로포름에 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하였다. 0.1g의 주사 가능한 등급의 렌티난 및 0.4g의 트윈-80을 300ml 의 주사용 물에 가하고, 0.1 mol/L NaOH 용액의 적량을 렌티난이 용해될 때까지 가하였다. 이 용액은 0.1 mol/L HCl 용액으로 pH 7.0~8.0으로 조절되었다. 이러한 수상 혼합물은 냉수조 내의 오일상 혼합물에 서서히 가해졌다. 이어서, 배치 초음파 에멀젼화가 약 6분 동안 진행되어, 균질한 우유 같은 흰색의 W/O 에멀젼이 형성되었다. 질소 가스의 보호 하, 40℃의 감압 하에서, 용매는 로터리 증발에 의해 제거되어, 밝은 황색의 진한 라텍스 유사한 결과물이 형성되었다. pH 6.0~6.5의 200ml의 인산 완충 용액 내의 2% 만니톨이 첨가된 후, 생성된 혼합물은 40℃에서 1.5 시간 동안 유지되어 리포솜 8의 용액이 형성되었다. 리포솜 8의 주사 분말은 실시예 2의 방법에 따라 제조되었다. 재편성한 후에, 실시예 1의 방법에 따라, 렌티난의 캡슐화율은 82.1%로 결정되었고, 305nm의 평균 입자 크기를 갖는 것으로 결정되었다. 리포솜 8은 투과 전자 현미경을 통해 구형 외관 및 명확한 배열 형태를 갖는 것으로 관찰되었다.

실시예 9

리포솜 9의 출발 물질의 조성:

제조:

7.0g의 대두 포스파티드, 0.8g의 콜레스테롤, 0.6g의 PEG 1000, 및 0.2g의 비타민 E를 교반 하에 900 ml의 클로로포름에 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하였다. 0.1g의 주사 가능한 등급의 렌티난 및 0.5g의 데옥시콜레이트 나트륨을 300ml 의 주사용 물에 가하고, 0.1 mol/L NaOH 용액의 적량을 렌티난이 용해될 때까지 가하였다. 이 용액은 0.1 mol/L HCl 용액으로 pH 7.0~8.0으로 조절되었다. 이러한 수상 혼합물은 냉수조 내의 오일상 혼합물에 서서히 가해졌다. 이어서, 배치 초음파 에멀젼화가 약 6분 동안 진행되어, 균질한 우유 같은 흰색의 W/O 에멀젼이 형성되었다. 질소 가스의 보호 하, 35℃의 감압 하에서, 용매는 로터리 증발에 의해 제거되어, 밝은 황색의 진한 라텍스 유사한 결과물이 형성되었다. pH 6.0~6.5의 200ml의 인산 완충 용액이 첨가된 후, 생성된 혼합물은 40℃에서 1.5 시간 동안 유지되어 리포솜 9의 용액이 형성되었다. 실시예 1의 방법에 따라, 렌티난의 캡슐화율은 75.0%로 결정되었고, 312nm의 평균 입자 크기를 갖는 것으로 결정되었다. 리포솜 9는 투과 전자 현미경을 통해 구형 외관 및 명확한 배열 형태를 갖는 것으로 관찰되었다.

실시예 10

본 발명의 다당류 리포솜의 생체 내 항암 및 면역 조절 효과는 일 예로서 상술한 방법으로 제조된 렌티난 리포솜(리포솜 9)를 사용하여 평가되었다. 치료 효과는 대식세포, 자연살생세포(NK 세포) 및 림프구의 활성과, 종양-억제율을 평가함으로서 결정되었다.

쥐 종양 모델의 준비

20~24g의 몸무게를 갖는 건강한 성체 수컷 Kunming 쥐 (Laboratory Animal Center of Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology에서 제공)가 사용되었다. 쥐들은 H₂₂ 헤파토마 세포(the Teaching and Researching Department of Medical College of Wuhan Univesity에 의해 제공됨)로 접종되었고, 라이브러토리 내에서 적어도 3세대 이상 사육되었다. 사육된 쥐들의 복강으로부터 복수액이 취해졌으며, RPMI1640 배양 배지(Gibco)로 2x10⁷/ml의 최종 세포 농도로 희석되었다. 희석된 용액은 종양의 접종을 위해 0.2ml/쥐의 투여량으로 쥐들에게 우측 다리 아래에 피하 주사되었다. 모델 뒤에서, 종양은 1.13 내지 3.1g의 범위에 있는, 0.4g을 초과하는 평균 중량을 가진다.

그룹화 및 투여

테스트될 약제 및 이들의 투여량에 따라, 쥐들은 종양-모델 그룹, 시클로포스파미드 그룹, 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹, 및 렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 그룹으로 그룹화되었다. 그룹에 관한 정보는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.

테스트될 약제의 그룹화

그룹 및 투여량	테스트될 약제의 농도 및 투여 방법
종양 모델	5% 글루코오스 주사액; 0.1 ml/10 g의 투여량으로 복강내 주사됨
시클로포스파미드 (30 mg/kg)	3 mg/ml 시클로포스파미드; 0.1 ml/10 g의 투여량으로 복강내 주사됨
렌티난 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	6 mg/ml 시클로포스파미드 및 200 μg/ml 렌티난; 각각 0.05 ml/10 g의 투여량으로 복강내 주사됨
렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	6 mg/ml 시클로포스파미드 및 200 μg/ml 렌티난 리포솜; 각각 0.05 ml/10 g의 투여량으로 복강내 주사됨

간 대식세포의 식균 작용, 비장 림프구의 형질 전환 활성 및 NK 세포의 활성의 평가에서, H₂₂ 헤파토마 세포로 접종된 후 2일째 동물들은 상술한 4개 그룹으로 무작위로 그룹화되었고, 각 약물은 이들에게 복강 내로 15일 동안 투여되었다. 종양-억제율 평가에서, H₂₂ 헤파토마 세포로 접종된 후 4일째 동물들은 상술한 4개 그룹으로 무작위로 그룹화되었고, 각 약물은 이들에게 복강 내로 15일 동안 투여되었다.

(1) 대식세포 활성 평가

쥐들은 최종 투여 후 24 시간째 희생되었다. 간 세포의 현탁액은 다음과 같이 준비되었다: 쥐들은 75% 에탄올 내에 잠시 동안 담궈지고, 간이 멸균적으로 제거되고, D-Hank 용액으로 3회 세척되고, 중량이 측정되었다. 동일 그룹의 동물들의 간은 수집되어 RPMI 1640 배양 배지(Gibco)에 가해져 균질화되었다. 세포들의 최종 농도는 2x10⁵/ml로 조절되었다.

얻어진 간 세포의 현탁액은 100μl/웰의 양으로 96-웰 마이크로플레이트에 가해졌다. 플레이트는 이산화탄소 배양기 내에서 24 시간 동안 배양되었고, 이후 RPMI 1640 배양 배지(Gibco)로 3회 세척되어, 밀착된 대식세포 단일층이 얻어졌다. 이후에, 식염수 내의 0.072%의 neutral red (Solarbio Inc.)가 10μl/웰의 양으로 첨가되었다. 세포들은 4 시간 동안 배양되고, 상청액은 폐기되었다. 아세트산-에탄올 용액(1:1)이 150μl/웰의 양으로 첨가되었다. 96-웰 마이크로플레이트를 셰이커 내에서 10분 동안 흔들어서 결정이 완전히 녹게 하였다. 그리고 나서, 흡광도가 플레이트 리더 (ZS-3, Xinfeng Mechanical-Electronic Technology Inc., Beijing, China) 내에서 각 웰에 대해 492nm에서 측정 되었다. 그리고, 대식세포의 식균 작용 (OD 값)은 계산되었다. 그 결과는 SPSS 통계 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 모든 데이터는 x±s로 표시되었다. 그룹 간 비교는 t-테스트로 수행되었다. 결과는 하기 표 2에 나타난 바와 같았다.

간 대식 세포에 대해 테스트된 약제의 효과 (x±s)

그룹	OD 값
종양 모델	0.501 ± 0.119
시클로포스파미드 (30 mg/kg)	0.558 ± 0.128
렌티난 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	0.559 ± 0.176
렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	1.234 ± 1.05^**##

주: 종양 모델 그룹과 비교, **p < 0.01; 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹과 비교, ##p < 0.01

상기 결과는 시클로포스파미드 그룹과 종양 모델 그룹의 대식 세포 활성의 차이는 작아서, 시클로포스파미드가 종양을 가진 쥐에서 간 대식 세포의 식균 작용에 작은 효과를 나타냄을 드러내고;

또, 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹 및 시클로포스파미드 그룹의 대식 세포 활성의 차이는 작아서, 렌티난 역시 종양을 가진 쥐에서 간 대식 세포의 식균 작용에 작은 효과를 나타냄을 드러내며;

그리고, 종양 모델 그룹 또는 시클로포스파미드 그룹과 비교하여 렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 그룹에서 대식 세포의 식균 작용이 현저치 향상되어 (p < 0.01), 렌티난 리포솜이 종양을 가진 쥐에서 간 대식 세포의 식균 작용을 현저히 향상시킬 수 있었음을 드러내고;

또, 동일 투여량에서 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹과 비교하여도, 렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 그룹에 속한 종양을 가진 쥐에서, 대식 세포의 식균 작용이 크게 향상되었음을 드러낸다 (p < 0.01).

그러므로, 리포솜 형태의 렌티난은 간의 대식 세포의 작용을 현저히 증가시키는 것으로 확인되었다.

(2) 자연살생세포(Natural killer cell, NK 세포) 평가

쥐들은 최종 투여 후 24 시간째 희생되었다. 비장 세포의 현탁액은 다음과 같이 준비되었다: 쥐들은 75% 에탄올 내에 잠시 동안 담궈지고, 비장이 멸균적으로 제거되고, D-Hank 용액으로 3회 세척되고, 중량이 측정되었다. 동일 그룹의 동물들의 비장은 수집되어 RPMI 1640 배양 배지(Gibco)에 가해져 부피에 대한 중량의 1:1의 비율로 균질화되었다. 세포들의 최종 농도는 2x10⁶/ml로 조절되었다.

100μl의 반응 세포 (상술한 방법으로 얻어진 비장 세포) 및 RPMI 1640 배양 배지(Gibco)가 96-웰 마이크로플레이트의 E웰에 가해지고, 100μl의 타겟 세포 (K562 세포, Laboratory Center of School of Basic Medical Science, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology 제공) 및 RPMI 1640 배양 배지(Gibco)가 T 웰에 가해지고, 100μl의 반응 세포의 반응 세포 및 100μl의 타겟 세포가 E + T 웰에 각각 3배로 가해졌다. 플레이트는 이산화탄소 배양기 내에서 37℃에서 24 시간 동안 배양되었다. 배양 종료 전 4시간 때, 5mg/ml MTT(Sigma)가 20μl/웰의 양으로 첨가되었고, 세포는 4 시간 동안 더 배양되었다. 상청액은 폐기되었고, DMSO는 150μl/웰의 양으로 첨가되었다. 96-웰 마이크로플레이트를 셰이커 내에서 10분 동안 흔들어서 결정이 완전히 녹게 하였다. 그리고 나서, 공용매로 DMSO를 사용하여 흡광도가 각 웰에 대해 492nm에서 측정 되었다. 그 결과는 다음과 같이 계산되었다: NK 세포의 살생율 = [1-(D_E+T-D_T)]×100%. 이러한 결과는 SPSS 통계 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 모든 데이터는 x±s로 표시되었다. 그룹 간 비교는 t-테스트로 수행되었다. 결과는 하기 표 3에 나타난 바와 같았다.

NK 세포의 살생율에 대한 테스트된 약제의 효과 (x±s)

그룹	살생율(%)
종양 모델	65.95 ± 17.05
시클로포스파미드 (30 mg/kg)	48.97 ± 12.87
렌티난 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	56.19 ± 23.25
렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	91.02 ± 9.156^*#

주: 시클로포스파미드 그룹과 비교, *p < 0.05; 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹과 비교, #p < 0.05

상기 결과는 종양 모델 그룹과 비교하여, 시클로포스파미드 그룹의 NK 세포의 살생율은 현저히 감소하여 (p < 0.05), 시클로포스파미드가 종양을 가진 쥐에서 NK 세포의 살생율에 억제 효과를 나타냄을 드러내고;

또, 종양 모델 그룹과 비교하여, 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹의 NK 세포의 살생율이 현저히 감소하고, 시클로포스파미드 그룹과 비교하여 통계학적으로 비현저하게 증가하여, 시클로포스파미드와 조합된 렌티난이 종양을 가진 쥐에서 NK 세포에 대한 시클로포스파미드의 독성 효과 및 부작용을 부분적으로 감소시킴을 드러내고;

그리고, 종양 모델 그룹 또는 시클로포스파미드 그룹과 비교하여, 렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 그룹의 NK 세포의 살생율이 현저히 증가하여 (p < 0.05), 시클로포스파미드와 조합된 렌티난 리포솜이 종양을 가진 쥐에서 NK 세포에 대한 시클로포스파미드의 독성 효과 및 부작용을 제거할 뿐 아니라, 종양을 가진 쥐에서 NK 세포의 살생율을 현저하게 증가시킴을 드러내고;

또, 동일 투여량에서 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹과 비교하여도, 렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 그룹의 NK 세포의 살생율이 현저히 증가하여 (p < 0.05), 렌티난과 비교하여, 렌티난 리포솜은 종양을 가진 쥐에서 NK 세포의 살생율을 현저하게 증가시킴을 드러낸다.

(3) 림프구 증식 평가

비장 세포의 현탁액은 상술한 방법으로 준비되었다. 현탁액은 100μl/웰의 양으로 96-웰 마이크로플레이트에 가해졌다. 대조군 웰 및 테스트 웰은 테스트될 각 약물에 대해 세팅되었다. 100μl (12.5μg/ml)의 PHA-P (Sigma)가 각각의 테스트 웰에 첨가되고, 100μl의 RPMI 1640 (Gibco)가 각 대조군 웰에 첨가되었다. 이러한 플레이트는 이산화탄소 배양기 내에서 37℃에서 24 시간 동안 배양되었다. 상기 (2)에서 기술된 다음의 단계가 진행되었다. 그 결과는 다음과 같이 계산되었다: 형질 전환율 = (OD_테스트웰 - OD_대조군웰)/ OD_대조군웰 × 100%. 이러한 결과는 SPSS 통계 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 모든 데이터는 x±s로 표시되었다. 그룹 간 비교는 t-테스트로 수행되었다. 결과는 하기 표 4에 나타난 바와 같았다.

비장 림프구의 증식율에 대한 테스트될 약제의 효과 (x±s)

그룹	증식율(%)
종양 모델	29.58 ± 18.63
시클로포스파미드 (30 mg/kg)	14.95 ± 10.90
렌티난 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	28.58 ± 12.35
렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	45.00 ± 22.76^*#

상기 결과는 종양 모델 그룹과 비교하여, 시클로포스파미드 그룹의 비장 림프구의 증식율이 크게 감소하여 (p < 0.05), 시클로포스파미드가 종양을 가진 쥐에서 비장 림프구의 증식율에 대해 억제 효과를 나타냄을 드러내고;

또, 종양 모델 그룹과 비교하여, 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹의 림프구 증식율이 거의 유사하고, 시클로포스파미드 그룹과 비교하여 증가하여, 시클로포스파미드와 조합된 렌티난이 종양을 가진 쥐에서 림프구에 대한 시클로포스파미드의 독성 효과 및 부작용을 감소시킴을 드러내고;

그리고, 종양 모델 그룹 또는 시클로포스파미드 그룹과 비교하여, 렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 그룹의 림프구의 증식율이 현저히 증가하여 (p < 0.05), 시클로포스파미드와 조합된 렌티난 리포솜이 종양을 가진 쥐에서 림프구에 대한 시클로포스파미드의 독성 효과 및 부작용을 제거할 뿐 아니라, 종양을 가진 쥐에서 림프구의 증식율을 현저하게 증가시킴을 드러내고;

또, 동일 투여량에서 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹과 비교하여도, 렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 그룹의 림프구 증식율이 현저히 증가하여 (p < 0.05), 렌티난과 비교하여, 렌티난 리포솜은 종양을 가진 쥐에서 비장 림프구의 증식율을 현저하게 증가시킴을 드러낸다.

(4) 종양-억제율 평가

쥐들은 최종 투여 후 24 시간째 희생되었다. 종양은 쥐로부터 분리되어 중량이 측정되었다. 그리고, 종양 억제율이 계산되었다. 이러한 결과는 SPSS 통계 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 모든 데이터는 x±s로 표시되었다. 그룹 간 비교는 t-테스트로 수행되었다. 결과는 하기 표 5에 나타난 바와 같았다.

테스트될 약제의 종양 억제율 비교 (x±s)

그룹	종양 중량(g)	종양 억제율(%)
종양 모델	1.88 ± 1.40	--
시클로포스파미드 (30 mg/kg)	0.69 ± 0.29	61.40 ± 16.48
렌티난 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	0.54 ± 0.28	69.89 ± 15.90
렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 (1.0 mg/kg + 30 mg/kg)	0.46 ± 0.20	75.22 ± 10.75^*

주: 시클로포스파미드 그룹과 비교, *p < 0.05

항암제 약물의 약동학 가이드라인에서 치료 효과의 평가에 대한 기준에 따르면, 통계학적으로 (종양 모델 그룹과 비교하여), 효과 없음의 기준은 종양-억제율 <= 40%, 그리고 효과 있음의 기준은 종양-억제율 >= 40% 및 p<0.05 이다.

상기 결과는 시클로포스파미드 그룹과 비교하여, 렌티난 + 시클로포스파미드 그룹의 종양 억제율이 증가하여, 렌티난이 시클로포스파미드의 종양-억제 효과를 향상시키기는 하지만, 통계학적으로 현저하지 않음을 드러내고;

또, 시클로포스파미드 그룹과 비교하여, 렌티난 리포솜 + 시클로포스파미드 그룹의 종양 증식율이 현저히 증가하여 (p < 0.05), 렌티난 리포솜이 시클로포스파미드의 종양-억제 효과를 현저히 향상시킴을 드러낸다.

그러므로, 렌티난 리포솜은 렌티난에 비해 현저한 항암 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

Claims

이하의 단계를 포함하는 리포솜의 제조 방법:
a. 유기 용매 내에 인지질, 콜레스테롤, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 출발 물질을 용해시켜 오일상 혼합물을 형성하는 단계;
b. 다당류 및 계면 활성제를 포함하는 출발 물질을 물 또는 수성 용액에 용해시켜 수상 혼합물을 형성하는 단계;
c. 상기 수상 혼합물을 오일상 혼합물에 가하고, 에멀젼화하는 단계;
d. 보호 가스 내, 일정 온도 및 감압 하에서 증발에 의해 용매를 제거하는 단계; 및
e. 물 또는 수성 용액을 가하고 나서, 수조 내에서 유지시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 다당류는 렌티난 (lentinan), 아스트라갈란 (astragalan), 흰목이 (Tremella) 다당류, 흰목이 버섯 (Tremella fuciformis) 다당류, 파낙산 (panaxan), 가노데란 (ganoderan), 저령 (Polyporus Umbellatus) 다당류 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 인지질은 대두 포스파티드, 레시틴, 수소화 대두 포스파티드, 수소화 레시틴, 포스파티딜 에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜콜린, PEG화 인지질 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 계면 활성제는 데옥시콜레이트, 폴록사머, 트윈-80 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 PEG 800~5000, 인지질-개질된 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 PEG 1000~2400인 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 출발 물질은 1중량부의 다당류, 30~100중량부의 인지질, 2~20중량부의 콜레스테롤, 3~12중량부의 계면 활성제, 및 1~8중량부의 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 출발 물질은 1중량부의 렌티난, 40~90중량부의 인지질, 및 5~15중량부의 콜레스테롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, f. 상기 e 단계에서 얻은 용액을 여과하고 동결 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 a 단계에서 유기 용매는 클로로포름 또는 클로로포름-메탄올인 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c 단계에서 에멀젼화는 배치 초음파 처리 또는 고압하에서의 순환식 에멀젼화(circular emulsification)로 진행하는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 e 단계에서 수조 내의 유지는 35~50℃의 온도에서 진행하는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 수조 내의 유지는 40℃의 온도에서 진행하는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b 단계에서 반응계의 pH 값은 e 단계와 다르게 되는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b 단계에서 반응계의 산도 또는 염기도는 e 단계와 반대로 되는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 e 단계에서 수조 내의 유지는 1~2 시간 동안 진행되는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 a 단계에서 출발 물질은 항산화제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 e 단계에서 수성 용액은 동결-건조 보호제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜의 제조 방법.
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