JPS58500715A - アントラサイクリングリコシド組成物、その用途及び製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アントラサイクリングリコシ ド組成物、その用途及び製造 発明の背景 アントラサイクリングリコシドは、テトラヒドロナフタセン発色団が糖、最も一 般的には塩基性糖に結合した抗生物質である。代表的なアントラサイクリングリ コシド抗生物質には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダウノルビシノール、 ドキソルビシノール、並びに薬剤的に許容できるこれらの類似体、誘導体及び塩 が包含される。

ドキソルビシンＨＣ１（アドリアマイシン、米国特許第３，５９０，０２８号の 生産物）及びダウノルビシン（米国特許第４，０１２，２８４号）のようなアン トラサイクリングリコシド並びにこれらの薬剤的に許容できる類似体、誘導体及 び塩はまた、腫瘍細胞崩壊剤として知られている。代表的な類似体は米国特許第 ３，６８６，１３６及びケイツ国特許第２，３２７，２１１号、第２，５５７， ５３７号及び第１．９２０，１９８号；イー・バッハマンら、薬剤及び作用６． １１５（１９７５）；エフーアーカモｙら同１２３；及びジー・ツビンデンら、 癌化学治療Ｒ＠ｐ、　４，７０７（１９７５’）に記載されている。これらの開 示は、参照することによってこの明細書に組み入れられたものとする。

抗生物質及び腫瘍細胞崩壊剤としてのアント２サイクリングリコシドの全体的な 有用性は、本来的な投与限界及び潜在的な致命的対心臓毒性の故に著しく制限さ れている。ドキソルビシンＨＣｔ　（アドリアマイシン）及びダウノルビシンの 対心臓毒性効果は記載されている（米国特許第４，１３８，４８０号）。蓄積的 な心筋損傷は、５００ｍ９／−を越える量のアドリアマイシンを投与した場合、 又は、これよシ少ない投与量であっても、以前にメダスチナール（ｍ＠ｄａｓｔ ｉｎａｌ　）照射を受けた患者に投与した場合に、抗療性のリフ血性心麻痺の形 態で現われる。電子顕微鏡を用いた研究によシ、驚くべき筋原繊維の退化、ミト コンドリアの歪曲、及び心臓ンオサイトの減少が示された。し７ラーク拳イー・ エイ、ピサヤジェイ、ローゼンヘイム・ニス、オプリアン・アール・エム、パー ジニス・エム・エイ、ゴツトリープ・ジェイ・エイニアドリアマイシン（ＮＳＣ −１２３１２７）心筋病、癌化学治療Ｒす、６：２０３−２０８（１９７５）。

薬物動態学的研究によル、アドリアマイシン（ドキソルビシンＨＣＡ　）　Ｂ心 筋に激しく優先的に取シ込まれることがわかりた。イエディアー・ディー・メプ リ＆、シ、バーツバ、ハ・イー、シャック・ディー、テニン・イー・ビー・、ア スベル・エム・エイ：数種の動物種におけるダウノマイシンとアドリアマイシン の比較薬物動態学（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖ＠ｐｈａｒｍａｃｏｋｌｎ＠ｔｌ＠ｓ ｏｆ　Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　Ａｄｒｌａｍｙｃｉｎ　ｉｎ　ｓｅｖ＠ ｒａｌ　ａｎｌｍａｌｓｐｅｃｉｅｓ　）癌研究（Ｃａｎｃ＠ｒ　Ｒｔｓ＠ａｒ ｅｈ　）　３２　：　１１７７−１１８３（１９７２）、アドリアマイシン（ド キソルビシンＨＣ１）を投与すると、勧められる蓄積限界未満の投与量であって も対心臓毒性が発生することが知られておシ、従って、このような場合にドキソ ルビシンＨＣ１の使用を開始することは勧められない。また、以前に完全な蓄積 投与量のアドリアマイシン及び／又はダウノルビシンを投与されている場合には 、施薬の開始は禁忌される。

この発明は、ドキソルビシンＨＣｔのようなアントラサイクリングリコシド薬剤 の抗生物質性及び抗腫瘍性を留保したまま、これら薬剤の心臓組織による取ル込 みを選択的に低減させる放出系に関する。

発明の説明 この発明は、治療効果を有するが、また宿主によって心臓組織に優先的に取シ込 まれ対心臓毒性及び心筋病を伴うことを特徴とするアント２サイクリングリコシ ド組成物を基礎とする、哺乳動物宿主に対する放出系に関する。この放出系自身 は、アントラサイクリングリコシドの治療活性を留保する一方、宿主の心臓組織 による組成物の取ル込みを選択的に低減させ、それによって対心臓毒性及び心筋 病の副作用を実質的に低減させる。この放出系は、アントラサイクリングリコシ ド、カルシオリビン及びリポソームを含有する組成物に基づく。この発明の方法 は、この組成物の製造方法及び投与方法を包含する。

この発明の組成物のアント２サイクリングリコシドは、抗生物質活性及び／又は 腫瘍細胞崩壊活性を示し、哺乳動物宿主の心臓組織に取り込まれ、対心臓毒性及 び／又は心筋病を伴うことによりて特徴ずけられるいずれのものでありてもよく 、またこれらの無毒で薬剤的に許容できる類似体、誘導体及び塩であってもよい 。塩酸ドキソルビシン（アドリアマイシン）及びダウノルビシンがこのようなア ント２サイクリングリコシドであることがよく記載されている。この発明の特定 の具体例では、アントラサイクリングリコシドはアドリアマイシンである。

この発明によると、アントラサイクリンはカルシオリビンに複合される。アント ２サイクリングリコシｙ−カルシオリビン複合体においては、カルシオリピンは 少なくとも物理的にアントラサイクリングリ；シトに結合されている。アントラ サイクリングリコシド−カルシオリビン複合体中のカルシオリビンの量は、アン ト２サイクリングリコシドの重量に対し約３０１ないし約７０％の範囲で変化す る。アンドラサイクリングリコシドーカルノオリピン複合体は、アントラサイク リングリコシドを、複合体形成に十分な時間溶媒中でカルシオリピンと混合し、 その後溶媒を蒸発させて分離することによってつくられる。溶媒線、両成分が溶 ける液体であれは何でもよい。この発明の特定の具体例においては、このような 溶媒はメタノールである。溶媒の蒸発は、複合体及びその成分に対して不活性な 、例えば窒素のようなガスを複合体を含有する溶液に吹きつけることによって行 なうことが好ましい。

アントラサイクリングリコシド−カルシオリピン複合体が形成された後、この複 合体はリポソーム中に閉じ込められる。閉じ込めは、リポソームを生成する脂質 を含有する溶液中に複合体を導入することによって行なわれる。リポソームは好 ましくは陽性リポソームである。陽性リポソームは、フォスファチジルコリン、 コレステロール及びステアリルアミンを含む溶液からつくられる。陽性リポソー ムは、フォスファチジルコリン、コレステロール及びフォス７アチジルセリンを 含む溶液からつくられる。′ リポソームの形成及び閉じ込め紘、アントラサイクリングリコシドとカルシオリ ピンとの複合体を、前記脂質含有溶液に分散させることを包含する。分散は、一 般的に、マダネティックスタラーを約２０分間用いて分散液を形成すること及び ／又は５リポンームを超音波処理することによって行なわれる。閉じ込められた 生成物は、それからアントラサイクリングリコシドを除去することによって分離 される。遊離のアントラサイクリングリコシドは、徹底的な透析、例えば、０． ８５％ノＮａＣ２ｆ含ｔｒｐＨ７，４＋７）　０．００１Ｍリン酸緩衝液に対し 、４℃で３０時間、少なくとも３回緩衝液を替えて行なう透析によって閉じ込め られた生成物から分離することができる。

リポソームを形成する脂質の重量は、これを形成するのに用いた条件に依存して 変化し、アントラサイクリングリコシド成分の重量に対して約２倍ないし約６倍 の範囲で変化する。後述するように、リポソーム中に閉じ込められたカルシオリ ピン複合体は、心臓組織への骸複合体薬剤の取〕込みを選択的に低減させ、急性 対心臓毒性を低下させる。ｔｌとんどのアントラサイクリングリコシド又はその 類似体の投与限界毒性は、心臓組織の蓄積的な損傷であって、これが投与可能な 薬物の総量に限界を与えている。リポソーム内に閉じ込められたカルシオリピン 複合体中のこれらの薬剤の放出は、この問題を解決するとｈう点において、大き な臨床医学的意義を有するように思われる。

この発明を、図面及び実施例に示された、以下に説明する特定の具体例によって 例示し、説明する。

図面の簡単な説明 第１図線、遊離のアドリアマイシンを投与した後の心臓組織中の該薬物の濃度の 時間変化を、この発明のアドリアマイシン含有組成物を投与した後の心臓組織中 の濃度の時間変化及びカルシオリピン複合体を形成することなくリポソーム中に 閉じ込められたアドリアマイシンの心臓組織中の濃度と比較したグラフ（時間（ 時間）に対して心臓組織中の薬物濃度をとったもの）である。

第２図は、遊離のアドリアマイシン’ｋ１５η／ｋｌ？靜脈内投与した後のＤＢ Ａ／２マウスの心臓組織の電子顕微鏡写真である。細胞器官の一掃及び筋形質領 域の膨張を伴なったミオフィラメシトの消失及び分断が見られる。

第３図は、この発明に従ってカルシオリピンと複合体を形成し、リポソーム内に 閉じ込められたアドリアマイシンを１５９／ｋｐ投与した後のＤＢＡ／　２マウ スの心臓組織の電子顕微鏡写真である。隣接するミオサイト間の、脈管構造を伴 なった組織中の空胞として表わされるように、限定された毒的損傷を受けた実質 的に正常な外観を呈する。

実施例１ この発明のアントラサイクリングリ；シト−カルシオリピン−リポソーム組成物 の製造 リポソーム内に閉じ込められたアドリアマイシン−カルシオリピン複合体をつく るために、１１．６μｍｏｌのアドリアマイシンを含むメタノール溶液をフラス コ中で５．９μｍ１）ｌのカルシオリピンを含ムエタノール溶液と混合した。次 にこの２つの溶液を窒素流下でゅっくシと蒸発させ、乾燥させた。乾燥したアド リアマイシンとカルシオリピンの膜を含むこのフラスコに、次の脂質溶液を順々 加えた。１）ンオスフアテジルコリン２８．５　μｍｏｌ　、　２）コレステ四 −ル１９．４μｍｏｌ、及び３）ステアリルアミン１１．５μｍｏｆ。７２スコ 内容物をゆりくシとかきまぜ、窒素下で蒸発させて、７２スコの側部に薄膜を形 成した。カルシオリピン複合体と脂質の乾燥した膜を次に６罰の０．９％ＮａＣ ｔと混合し、３０分間水和させた。フラスコの内容物を次にマグネチ。

クスタラーで１０分間かきまぜて多層のリポソームを生成し、浴槽型の装置（ヒ ートシステム１００Ｗ）で、温度を連続的に制御（３７′Ｃ）しながら９０分間 超音波処理した。゛超音波処理中に１ｏ分間の間隔で、フラスコ内容物に窒素流 を浴びせた。超音波処理が完了した後、閉じ込められなかったアドリアマイシン を、上述のように４℃の下で０．９％ＮａＣｔに対して３０時間透析することに よって、リポソーム内に閉じ込められたカルシオリピン複合体から分離した。

この条件下で捕捉されたアドリアマイシンの量を、透析完了後螢光によって測定 した。リポソーム内に閉、　じ込められたアドリアマイシン−カルシオリピン複 合体の量は、仕込み総量の５５％（６，３８μｍｏｌ）でありた。

用いた種々の脂質は次のようにして得られた。フォスファチジルコリン（子ウシ ）、フォスファチジルコリン（卵）、フォスンアチジルセリン（子ウシ）及びコ レステロールはシグマヶにカルコ−ポレーション（セントルイス、ミズーリー） から得、ステアリルアミンはクイアンドケイラボラトリーズにニューヨーク、ニ ューヨーク）から得た。すべての脂質は得られたままで用い、−２０℃で貯えた 。アドリアマイシン（Ｍ８Ｃ’　１２３１２７　）は、国立癌研究所癌治療部治 療開発支部から供給された。他の全ての化学物質は試薬級であった。

実施例２ 組成物の投与後の組織内分布の測定 体重２０ないし２５グラムのＤＢＡ／　２マウスにおける遊離のアドリアマイシ ンとリポソー入内に閉じ込められたアドリアマイシンカルシオリピン複合体の生 理的分配を測定した。遊離のアドリアマイシン又はリポソーム内に閉じ込められ たアドリアマイシン−カルシオリピン複合体を、尾の静脈に４ダ／ゆの投与量で 体重の２％注射した。薬物投与後５分ないし２４時間の時点で、ヘパリン処理し たチューブ内の軌道腔を介してマウスから採血した。血漿を直ちに分離し、−２ ０℃で保存した。名処置群のうち４匹のマウスを頚椎脱臼によりて殺し、心臓、 肝臓、腎臓、肺臓、肺及び小腸を速やかに切ｂｉｂ％０．９　％　ＮＩＬＣＬで そそぎ、分析の時まで一２０℃で貯蔵した。

血漿及び組織を癌化学治療Ｒａｐ、　５４　、８９−９４（１９７０）にベイチ ャーらによって記載された螢光光度法によって分析した。短かく言うと、血漿は ５倍体積の０．３　ＮＨＣｌ　−５０％エタノールで抽出し、組織は２０倍体積 のこの酸アルコールでホモジェナイズした。

血漿及び組織ホモジネートを１５．００　Ｏｒｐｍで１ｏ分間遠心し、上清をパ ーキンエルマー螢光光度計を用い、４７０ｎｍで励起し、５８５ｎｍで発光させ て分析した。

薬物を含まなりリポソームを投与したマウスから得た対照組織について同様にし て螢光を測定し、あらゆる内発的な螢光を補正した。新鮮なアドリアマイシン標 準を０．３　ＮＨＣｌ　−５０％エタノール中に毎日っくシ、組織サンプル中の アドリアマイシンの濃度を計算した。

第１図は％　４１１１９／ｋｃＩの投与量で１回静脈内投与したマウスの心臓中 の遊離のアドリアマイシン及びリポソーム内に閉じ込められたアドリアマイシン −カルシオリピン複合体の配置を表わ、す。遊離の薬物では濃度のピークが投与 ３０分後に現われ、その値は心臓組織１ｔあたシ８．３μ？であった。しかしな がら、リポソーム内に閉じ込められたアドリアマイシンカルシオリピン複合体の 心臓による取多込みのピークは５分後にあル、系物肖量は心臓組織Ｉｆあたル３ ，４μ？であって、これは遊離のアドリアマイシンの場合のわずかに約４０％で ある。リポソーム内に閉じ込められたアドリアマイシンカルシオリピン複合体の 心臓組織内濃度は、当量の遊離薬剤分配に比較して、１時間以内に無視できる程 度になった。リポソーム内に閉じ込められたカルシオリピン複合体におけるアド リアマイシンの放出は、全ての時点で心臓組織による薬物の取シ込みを選択的に 阻害しているように思われる。さらに、リポソーム内に閉じ込められ、カルシオ リピンと複合したアドリアマイシンを投与した場合には、２４時間中に心臓組織 がさらされる薬物の総濃度は実質的に低減される。

２４時間中の心臓組織における組織内鎖度Ｘ時間（ＣＸＴ）値は、リポソーム内 に閉じ込められたカルシオリピン複合体として放出されるアドリアマイシンの場 合には５５．２　ｐｇ＠ｂｒ＊ｆ−でありた。

第１図よシ、リポソーム内に賄じ込められたアドリアマイシンのカルシオリピン 複合体は、カルシオリピンなしで形成された陽性リポソームの場合よルも効率的 に心臓組織による薬物の取シ込みを阻害することが明らかである。２４時間中の 陽性リポソームのＣＸＴ値は４０μ）＊１１ｙ−？−であるのに対し、リポソー ム内に閉じ込められたカルシオリピン複合体のそれは、わずかに４．２μ？・ｈ ｙ　＠　ｆ−である。

リポソーム内に閉じ込められたカルシオリピン複合体中のアドリアマイシンの心 臓組織による取シ込みが低減されることによって、対心臓毒性が減少するか否か を調べるために電子顕微鏡を用いた研究を行なった。遊離の薬物又はリポソーム 内に閉じ込められたカルシオリピン複合体中に捕捉された薬物を１５ダ／ｋｇの 投与量でＤＢＡ／２マウスに静脈内投与した。各群から３匹のマウスを頚椎脱臼 によって第３日、第５日、第７日に殺し、心臓を直ちに切除して生理食塩水中に 置いた。左心室の頂端部を隔壁の一部とともに切ル取シ、１−のプ四ツクに切少 刻み、ｐＨ７，２の０．１Ｍカコジレート緩衝液中の２．５チグルタルアルデヒ ド中で、室温下で２時間固定した。標本を緩衝液でそそぎ、ベネ。

トとル７トのコリジン緩衝四酸化オスミウムでオスミウム処理し、濃度を徐々に 高めたエタノール及びアセトンで脱水し、エポン（Ｅｐｏｎ　）に埋め込んだ。

電子顕微鏡観察をするために、予備的な１μｍのエポン切片をアルカリ性トルイ ジンブルーで染色し、適当な領域を超薄切片作成のために選び、２ンダム切片を ２００メッシ、の銅グリッド上に載せ、酢酸つ２ニル及びクエン酸鉛で染色した 。切片を観察するためにＪＥＯＬ１００Ｓ電子顕微鏡を加速電圧８０　ｋｅＶで 用いた。

第２図は遊離のアドリアマイシンで処理したマウスの心臓組織の心筋の前約損傷 の範囲及び程度を示す。

この前約損傷において、個々のミオザイトは、滑面小胞体の空胞化及び筋原繊維 の消失を伴なった退化的変化を示す。損傷の進行は、遊離のアドリアマイシンを マウスに投与した後第７日によ如強く見られた。しかしながら、リポソーム内に 閉じ込められたアドリアマイシンカルシオリピン複合体で処理したマウスでは、 対照組織と全体的に匹敵する外観を呈した（第３図）。

一般的に、リポソーム内に閉じ込められたカルシオリピン複合体で処理された群 の調べた領域線、薬物から保護された外観を一貫して呈した。すなわち、組織の 大部分は正常な外観を呈し、わずかばかりの平行な縁領域で見られただけであっ た。第３図に示されるように、リポソーム内に閉じ込められたカルシオリビン複 合体で処理したものは、建オサイドの正常な脈管構造及び中間層が明瞭である。

（注：脈管構造の隣の物の一掃Ｘ４０００） 実施例３ アドリアマイシンカルシオリピン複合体をリポソーム内に閉じ込めることによっ て、薬物の抗腫瘍活性が低下するか否かを調べるために、ＤＢＡ／２マウスのネ ズミＰ３８８腹水白血病に対するリポソーム内に閉じ込められたアドリアマイシ ンカルシオリピン複合体の効果を調べた。マウスにＰ３８８白血病細胞をＩ　Ｘ 　１０’個腹腔内注射した。腫瘍移殖２４時間仮に遊離のアドリアマイシン又は リポソーム内に閉じ込められたカルシオリビン複合体を４９／ゆの投与量で腹腔 内投与した。

対照マウスには０．９％ＮａＣ１又はアドリアマイシンカルシオリビン複合体を 閉じ込めるのに用いた脂質と同濃度の、中に薬物を含まないリポソームを与えた 。全ての注射は、体重の２％の量で行なった。マウスの体重は注射当日に測定し 、体重に基づいて薬物の投与量を計算し、マウスの生存時間を日数で記録した。

第１表は、Ｐ３８８腫瘍を有するマウスの生存時間に対する遊離のアドリアマイ シン及びリポソーム内に閉じ込められたカルシオリビン複合体の効果を示す。

遊離のアドリアマイシンを４り／穆の投与量で腹腔内注射したマウスは１３２− のＴ／Ｃ（処置対対照）を示した。同量のアドリアマイシンを、この発明の組成 物であるリポソーム内に閉じ込められたカルシオリビン複合体として注射した場 合にｄ、１２５チＴ／Ｃの生存率を示した。これらの研究によル、アドリアマイ シンをカルシオリピンと複合させ、リポソーム内に閉じ込めても抗腫瘍活性が損 失しないことが明らかに示されている。

第１表 Ｐ３８８腫瘍を有するＤＢＡ／２マウスの生存に対する遊離の及びカルシオリピ ンと複合し、リポソーム内に閉じ込められたアドリアマイシンの効果 腹腔内　４　１３２　１２５ 体重２０ないし２５１のマウスに１０’個の細胞を腹腔内注射し、２４時間後に 遊離の又はカルシオリピンと複合し、リポソーム内に閉じ込められたアドリアマ イシンを投与した。

この発明の既述の記載は、説明及び例示のためにこの発明の特定の詳細を述べた ものである。しかしながら、この発明の範囲及び精神から離れることのない多く の修飾及び変形が可能であること並びに添附の請求の範囲には、この発明の真の 範囲及び精神に含まれる全てのこのような等価な修飾及び変形が含まれることＬ 尚業者にとりて明らかであろう。

浄書（内容に変更なし） 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １．事件の表示 ＰＣＴ／Ｕ３８２１００４６４ ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ノオージタウン・ユニバーンティ５、補正命令の日付 ５８年２月１日 国際調査報告 し Ｃ；

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、治療剤としてのアントラサイクリングリコシド又は薬剤的に許容できるその 類似体、誘導体若しく紘塩であって、哺乳動物宿主に投与すると該哺乳動物宿主 の心臓組織によって取シ込まれるもの、前記アントラサイクリングリコシドと複 合されたカルシオリピン、及び カルシオリピンと複合したアントラサイクリングリコシドをその内部に閉じ込ぬ るのに十分な量のリポソームから成る治療組成物であって、骸組成物中の治療剤 の宿主心臓組織による取シ込みが、前記カルシオリピン及びリポソームがない場 合のその取９込みと比較して選択的に低減されるもの。 λ　前記アントラサイクリングリコシド紘アドリアマイシンである請求の範囲第 １項記載の治療組成物。 ３、リポソームは７オスフアチジルコリン、コレステロール及びステアリルアミ ンから形成される請求の範囲第１項記載の治療組成物。 ４、哺乳動物宿主の心臓組織によって取ル込まれるアント２サイクリングリコシ ドを、該アント２サイクリングリコシドと複合するのに十分な量のカルシオリピ ンと混合し、それによってアントラサイクリングリコシドカルシオリピン複合体 を形成する工程と、該混合中に、該複合体を組成物生成リポソームと込める工程 と、次に当該閉じ込められた複合体を分離する工程とから成夛、それによって当 該閉じ込められた複合体中の前記アントラサイクリングリコシドの宿主心臓組織 による取シ込みが選択的に低減される、哺乳動物宿主に投与するためのアントラ サイクリングリコシドの組成物の製造方法。 ５、前記アントラサイクリングリコシドはアドリアマイシンである請求の範囲第 ４項記載の方法。 ６、前記リポソームは７オスフアチジルコリン、コレステロール及びステアリル アミンの混合物から生成される請求の範囲第４項又は第５項に記載の方法。 ７、請求の範囲第１項記載の治療組成物を提供し、これを哺乳動物宿主に効果量 投与して抗生物質性又は腫瘍細胞崩壊活性を表わすことから成る、該宿主の心臓 組織によって選択的に取り込まれるアント２サイクリングリコシド又は薬剤的に 許容できるその類似体、誘導体若しくは塩を哺乳動物宿主に投与する方法。 ８、前記アントラサイクリングリコシドはアドリアマイシンである請求の範囲第 ７項記載の方法。 ９、前記リポソームはフォス７アチゾルプリン、コレステロール及びステアリル アミンから形成される請求の範囲第７項又は第８項記載の方法。 浄書（内容に変更なし）