DE2255089B2

DE2255089B2 - Verfahren zur Feststellung der antibakteriellen Wirksamkeit von in Wasser unlöslichen Verbindungen

Info

Publication number: DE2255089B2
Application number: DE2255089A
Authority: DE
Inventors: Florian Prof. Dr. 2000 Hamburg Heiss
Original assignee: Co-Pha-Test Cosmetics-Pharmaceuticstest & Co Kg 2000 Hamburg GmbH
Current assignee: Co-Pha-Test Cosmetics-Pharmaceuticstest & Co Kg 2000 Hamburg GmbH
Priority date: 1972-08-22
Filing date: 1972-11-10
Publication date: 1975-10-09
Also published as: DE2324587A1; DE2264527A1; CH532397A; GB1433029A; BE803855A; FR2196816B1; DD108035A5; IT1003129B; AU5958873A; DE2255089A1; FR2196816A1; GB1433030A; JPS4962647A; PL90232B1; NL7311478A; US4082852A

Description

Wasserunlösliche Verbindungen, deren antibakterielle Wirkung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelt werden kann, sind die auf Kunststoffen aufziehenden und dort eine langanhaltende bakteriostatische Wirksamkeit entfaltenden halogenierten Phenole, insbesondere die mehrfach chlorierten Phenole, wie 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenyläther und Kombinationen dieser Verbindungen mit Di-, Tri- und Tetrahalogensalicylaniliden, beispielsweise dem 3,3', 4,5',-Tetrachlorsalicylanilid, 3',4',5-Trichlor- und 3,4',5-Tribromsalicylanilid und deren Gemischen oder mit ätherischen ölen. Diese Kombinationen besitzen eine synergistisch gesteigerte antibakterielle Wirkung.

Weitere wasserunlösliche Verbindungen, deren bakteriostatische Wirkung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren festgestellt werden kann, sind unter anderem 1,6-Bis-(p-chlorphenylbiguan:do)-hexan, S^^'-Trichlorcarbanilid, 3-Trifluormethyl-4,4'-dichlor-N,N'-diphenylharns⁽.off und ähnliche bekannte Verbindungen, die allein oder im Gemisch mit den zuvor genannten Verbindungen als antibakterielle Mittel angewandt werden können und zu einer langanhaltenden antibaktericllen Wirkung mit Depotcha-

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rakter führen, die auch bei häufiger Berührung mit menschlicher Haut erhallten bleibt. Der sowohl unmittelbar nach der Behandlung als auch nach mehrfachem Waschen mit Wasser oder nach häufigem Berühren erfindungsgemaß ermittelte Kontakt-Wachsturn-Index (KWI) liegt bei Anwendung der weiter unten detailliert beschriebenen Methode bei Werten zwischen 0 und 1.

Mit quarternären antibakteriellen Ammoniumverbindungen wurde eine länger anhaltende Wirkung offensichtlich deshalb nicht beobachtet, weil diese Wirkstoffe wasserlöslich sind, so daß sie bei Kontakt mit schweißfeuchter Haut von der Oberfläche der behandelten Gegenstände entfernt werden.

Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren:

Beispiel

Für die anschließenden Versuche wurden zunächst die folgenden bakteriostatisch wirksamen Mittel hergestellt. Als Lösungsmittel diente jeweils wäßriger 70volumprozentiger Äthylalkohol.

Mittel A:

0,02 Gewichtsprozent 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenyläther

Mittel B:

0,01 Gewichtsprozent 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenyläther (5% 3,5-Dibromsalicylanilid als Verunreinigung)
0,01 Gewichtsprozent 3,4',5-Tribromsalicylanilid

Mittel C:

0,02 Gewichtsprozent 2,4,4'-Trichlor-2'-hydro-

xydiphenyläther und

1,0 Gewichtsprozent Isopropylmyristat

Mittel D:

0,01 Gewichtsprozent 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenyläther

0,01 Gewichtsprozent 3,4',5-Tribromsalicylanilid (5°/o 3,5-Dibromsalicylanilid als Verunreinigung) und

1,0 Gewichtsprozent Isopropylmyristat

Mittel E:

0,1 Gewichtsprozent hochmolekulares Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid, wasserlöslich, als Vergleich.

Die antibakterielle Wirkung der vorstehenden Mittel auf die Oberfläche von Telefonapparaten aus Acrylnitril/Butadien/Styrol-Polymerem wurde mit der erfindungsgemäßen Testmethode ermittelt. Hierzu wurden aus den Telefonapparaten viereckige Plättchen mit einer Kantenlänge von 2 · 2 cm ausgesägt und dann mit den Mitteln behandelt, indem man die Oberfläche kräftig mit einem Wattetupfer abrief, der mit der zu untersuchenden Lösung getränkt war. Der Kontakt-Wachstums-Index (KWl) wurde in der oben angegebenen Weise bestimmt, wobei 10 Staphylococcus aureus-, 10 Staphylococcus epidermis-, 10 Escherichia coli-, 10 Proteus spec-, 10 Pseudomonas aeruginosa- und 10 Acrobacter klebsiella-Stämme verwendet wurden.

Test 1

Zunächst wurde nach Lufttrocknung bei den mit den Mitteln A bis E behandelten Kunststoffplättchen der Kontakt-Wachstum-Index bestimmt. Anschließend wurde eine zweite, in gleicher Weise behandelte Serie von Plättchen in einen Schütte!apparat gestellt und 10 Minuten lang in destilliertem Wasser geschüttelt, worauf die Plättchen in ein weiteres Gefäß mit destilliertem Wasser übergeführt wurden. Diese Behandlung wurde unter Auswechseln des Wassers 6mal wiederholt, worauf der Kontakt-Wachstum-Index bestimmt wurde. Bei der ersten Serie wurde für alle 5 untersuchten Mittel ein KWI von 0 gefunden. Dagegen wurde bei der zweiten Serie für die mit dem Mittel E (Vergleich) behandelten Kunststoffplättchen ein KWI von 4, für die mit den Mitteln A bis D behandelten aber ein KWI von 0 festgestellt. Dies zeigt an, daß die wasserunlöslichen Wirkstoffe der Mittel A bis D auf der Oberfläche der Kunststoffplättchen aufziehen und dort eine antibakterielle Depotwirkung ausüben, während der wasserlösliche Wirkstoff des Mittels E vom destillierten Wasser weggewaschen wurde.

Test 2

Nach Behandlung der Oberfläche der Kunststoffplättchen mit dem Wattetupfer der mit den zu untersuchenden Mitteln getränkt war, wurden die Plättchen 6mal nacheinander in Nähragar inkorporiert und wieder herausgenommen. Nach der letzten Inkorpierung wurde erneut in Nähragar eingebettet und dann mit den verschiedenen Bakterienstämmen beimpft. Trotz der nach jedem Inkorporieren notwendigen Entfernung der die Plättchen bedeckenden Agarschicht zeigte das mit dem Mittel A behandelte Plättchen noch einen Kon takt-Wachstum-Index von 1. Für die mit den Mitteln B, C und D behandelten Plättchen wurde ein KWI von 0 gefunden. Der KWI für das mit dem Mittel E behandelte Plättchen betrug 4, was wiederum anzeigt, daß der wasserlösliche Wirkstoff des Mittels E beim wiederholten Inkorporieren in den Nähragar entfernt wurde.

Test 3

In einer weiteren Untersuchungsreihe wurden die Verhältnisse beim praktischen Gebrauch möglichst naturgetreu nachgeahmt. Dazu wurden die Oberflächen der Plättchen wie zuvor mit Wattetupfern abgerieben, die mit den zu untersuchenden Lösungen getränkt waren. Anschließend wurden insgesamt 100 Finger auf die behandelte Oberfläche gedrückt, bevor die Plättchen in Paare von Nähragarplatten inkorporiert wurden. Dabei wurde jeweils nur eine der Nährbodenplatten mit Bakterien beimpft und der KWI bestimmt, während die andere zum Vergleich diente. Die Plattenpaare wurden jeweils 20 Stunden bei 37^c C bebrütet. Bei der nicht-beimpften Nährbodenplatte wurde das Angehen der durch die Berührung mit den Fingern aufgebrachten Kontaminationskeime beobachtet. Die beste Wirksamkeit zeigte das Mittel D, doch erwiesen sich auch die Mittel A, B und C als voll wirksam. Die durch das Berühren auf die Plättchen aufgebrachten Kontaminationskeime konnten sich auf den mit den Mitteln A, B, C und D behandelte Plättchen nicht vermehren. Im einzelnen wurden ermittelt: Für das Mittel A ein KWI von 1 bis 2, für B, C und D ein KWI von 0 bis 1 und für das Mittel E ein KWI von 4, woraus hervorgeht, daß durch die Berührung mit der (schweißfeuchten) Haut der wasserlösliche Wirkstoff des Mittels E entfernt und somit nicht mehr wirksam wurde.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Feststellung der antibakteriellen Wirksamkeit von in Wasser unlöslichen Verbindüngen, bei dem man einen mit den zu untersuchenden Verbindungen imprägnierten Träger auf einen Nährboden bringt, den Nährboden beimpft, bebrütet und mögliches Bakterienwachstum beobachtet, dadurch gekennzeichnet, daß man den Träger, auf den die zu untersuchenden Verbindungen aufgebracht sind, in solcher Weise in einen festen Nährboden einbettet, daß dieser in einer Schichtdicke von einem Bruchteil eines Millimeters überschichtet wird, den Nährboden beimpft und bebrütet und sodann den Grad des Bakterienwachstums auf der den Träger bedeckenden Schicht im Vergleich zum Bakterienwachstum auf der angrenzenden Schicht feststellt, die nicht mit dem Träger in Kontakt " steht.

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Es ist bekannt, daß sich die bakteriostatische Wirksamkeit von in Wasser löslichen Verbindungen mittels üblicher bakteriologischer Untersuchungsmethoden, z. B. dem Diffusionstest feststellen läßt. Bei diesem Test wird ein mit der zu untersuchenden Verbindung imprägnierter Träger auf einen Nährboden gebracht, der Nährboden beimpft, bebrütet und auf Hemmzonen des Bakterienwachstums um die Auftragungsstelle untersucht. Die bakteriostatische Wirksamkeit von in Wasser unlöslichen Verbindungen läßt sich jedoch nicht auf diese Weise ermitteln, da diese Verbindungen auf Grund ihrer Wasserunlöslichkeit nicht in den Nährboden diffundieren und so auch nicht zu einem Hemmhof führen.

Bei der Suche nach einer Methode zur Ermittlung der bakteriostatischen Wirksamkeit von in Wasser unlöslichen Verbindungen wurde nun überraschend gefunden, daß auf einem Nährboden minimaler Schichtdicke, auf dem sich normalerweise keine Bakterienkulturen entwickeln würde;i, ein normales Bakterienwachstum eintritt, wenn der Nährboden minimaler Schichtdicke mit Nährboden größerer Schichtdicke in Verbindung steht, dieses Bakterienwachstum jedoch gehemmt wird, wenn sich unter dem Nährboden minimaler Schichtdicke eine bakteriostatisch wirksame Verbindung befindet, und zwar auch dann, wenn diese Verbindung wasserunlöslich ist, also nicht in den Nährboden diffundieren kann. Offensichtlich ermöglicht die geringe Schichtdicke des Nährbodens einen direkten Kontakt mit den bakteriostatisch wirksamen wasserunlöslichen Substanzen, so daß auf diese Weise ihre bakteriostatische Wirksamkeit quantitativ erfaßt werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Feststellung der antibakteriellen Wirksamkeit von in Wasser unlöslichen Verbindungen ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man den Träger, auf den die zu untersuchenden Verbindungen aufgebracht sind, in solcher Weise in einen festen Nährboden einbettet, daß dieser in einer Schichtdicke von einem Bruchteil eines Millimeters überschichtet wird, den Nährboden beimoft und bebrütet und sodann den Grad des Bakterienwachstums auf der den Träger bedeckenden Schicht im Vergleich zum Bakterienwachstum auf der angrenzenden Schicht feststellt, die nicht mit dem Träger in Kontakt steht.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bringt man die zu untersuchenden wasserunlöslichen Verbindungen zweckmäßig als Lösung in einem hochprozentigen Alkohol auf einen Träger. Besonders geeignet sind aliphatische Alkohole mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, insbesondere mindestens 7O°/oiges Äthanol und mindestens 50", ₀-iges Isopropanol. Den so behandelten Träger bettet man dann auf solche Weise in einen festen Nährboden ein, daß der Träger in sehr geringer Dicke von Bruchteilen eines Millimeters mit Nährboden überschichtet ist. Die Kontrolle eines normalen Bakterienwachstums ist dadurch gegeben, daß sich auf demjenigen Teil des Nähragars, der nicht in Kontakt mit dem Träger steht, also der Randzone, optimales Bakterienwachstum entwickelt. Das neuartige Verfahren ermöglicht gleichzeitig einen Rückschluß auf den Grad der Wasserlöslichkeit der untersuchten Verbindungen, weil Wachtstumshemmungen über den Bereich des Trägers hinaus — also in der Kontrollzone — darauf hindeuten, daß die zu untersuchende Verbindung in bestimmtem Maße wasserlöslich ist und somit während der Bebrütung in den umgebenden Nährboden hineindiffundiert ist. Dabei wird die nach der Bebrütung festgestellte Hemmung des Bakterienwachstums, die vorliegend als Kontakl-Wachstums-Index (KWI) bezeichnet wird, nach der folgenden Skaia bewertet:

0 = totale Hemmung auf der gesamten Kontaktfläche.

1 = minimales Wachstum am Rande der Kontaktfläche.

2 = ganz vereinzelte Mikrokolonien auf der

Kontaktftäche.

3 — eine geringe Zahl von Mikrokolonien auf

der Kontaktfläche.

4 = optimales Wachstum auf der Kontaktfläche

entsprechend demjenigen in der Kontrollzone.