-
B e s c h r e i b u n g VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON AMYLOLYTISCHEN
FERMENTEN WIE GLUKOAMYLASE, α-AMYLASE UND TRANSGLUKOSILASE.
-
Priorität vom 31. Mai 1971 UdSSR $Nr. $1656803 Die vorliegende Erfindung
bezicht sich auf das Gebiet der Herstellung von avlolytischen Fermenten und genauor
- auf ein Vorfahren zur Herstellung von Glukoamylase, α-Amylase und Transglukosilase.
-
Die Glukoamylase wird von einigen Gattungen der Pilze Aspergillus
und Rhizopus gebildet. Das Ferment wurde in der Leber von Tieren,im Malz, sowie
bei Hefen der Endomycopsis-Gattung gefunden. Dieses Ferment beeinflußt Stärke, Glykogen
und verwandte Poly- und Oligosacharide, indem es die α-I,4 Glukanbindungen
in Polysachariden hydrolysiert und Gludosersste von den nicht reduzierenden Kettenenden
nacheinander abspaltet, Das Endprodukt der Hydrolyse ist Glukose. Der systematischen
nomenklatur
nach ist die Benannung des erwähnten Ferments α-1,4-Glukan-glukohydrolase
(3.2.1.3).
-
Je nach der Herkunft hat das genannte Ferment ein Aktivitäts optimum
im pH-Bereich von 4 bis 5; und ein Temperaturoptimum im B@ reich von 50 bis 60°C.
Die Glukoamylase besitzt eine hohe Säurebeständigkeit und hält niedrige pH-Werte
in einer Größonordnung von 1,8 bis 2,0 aus.
-
Mit Hilfe der Glukoamylase, welche die Fähigkeit besitzt, α-14-und
α-1,6-Bindungen in Zuckeun zu hydrolysieren, wird aus Stärke und ähulichen
Polysachariden Glukose hergestellt, Die Verwendung von Glukoamylase eröffnet Perspektive
in der Behan/dlung von Zuckerkrandheiten der Leber und spielt eine wichtige Rolle
in der Assimilation der Nahrung fur die Manschen, welche an der Insuffizienz dieses
Ferments leiden.
-
Die Herstellung von hochgereinigten Glukoamylase-Präparaten die eröffnet
Perspektiven einer breiten Anwendung dieses Ferments in der Medizin.
-
Die Transglukosilase wurde in höheren Pflanzen, in Tiorgeweben und
Mikroorganismen nachgewiesen. Die Transglukosilukosilase verwirklicht dio Übertragung
des Glukoserestes am Zucker, indem sie Oligosacharide mit einer α-1,6-Bindung
bildet. Die systematische Benennung dieses Ferments ist α-1,4-Glukan: α-1,4-Oligoglukan-6-glukosiltransferase.
-
In den amylolytischen Fermentpräparaten, die aus Pilzen hergestellt
werden, ist die Anwesenheit von Transglukosilasen, welche $Isomaltose
und
höhere Oligosacharide dieser Reihe aus Glukose und Maltose bilden, nicht wünschenswert,
weil die vom genannten Ferment gebildeten Substrate, welche Oligosacharide mit α-1,6-Bindungen
darstellen, der Amylase-Wirkung viel schlechter ausgesetzt sind, als Oligosacharide
mit α-1,4-Sindungen. So, z.B. hängt bei der Industrieherstellung von Dextrose
die Ausbeute an letzterer völlig von der Anwesenheit der von Transglukosilase freien
Glukoamylasen ab.
-
Die Transglukosilierungsreaktion erreicht die größte Geschwindigkeit
am Ende des Verzuckerungsprozesses bei hohen Glukosekonzentrationen. Die Eiweißnatur
des Ferments Transglukosilase ist im Vergleich zu α-Amylase und Glukoamylase
wenig untersucht.
-
Die α-Amylasen wurden bei Tieren (im Speichel- im Pankreas),
in Pflanzen (kalz), Cn Schimmelpilzen und Bakterien nachgewiesen. Alle Amylasen
sind α-1,4-Glukan-4-glukohydrola0£n und hydrolysieren Starke, Glukogen und
verwandte α-1,4-Glukane. Jedoch unterscheiden sich die genannten Fermente
im Molekulargewicht, der Erwärmungsbeständigksit, dem pH-Optimum und einer Beihe
anderer Merkmale nach. Die außerordentlich breite Verwendung finden verschiedene
Präparate der Pilz-α-Amylase, u. z. in der Alkohol-, Back-, Brauerei-Industrio
zur Hydrolyse von natürlichen Oligo- und Polysachariden bis zu den vergärbaren Zuckern.
Auf Grund der hochgereinigten α-Amylase aus der Plisgattung Aspergillus werden
Präparate zur medizinischen
Verordnung hergestellt.
-
Von den bekannten Verfahren zur Herstellung von glukoamylase werden
zur industriellen Verwirklichung folgende Methoden am häufigsten bevorzugt (T.Fukui,
L.Nikuni, Arg.biol.Chem. v. 33, N 6, 884-891, 1965. H. U@yama, T. Fuk imbara, G.
Terui, J. Ferm.
-
Technol. v. 43, N 4, 228- 232, 1965. K. Watanabe. T. Fukimbara, J.
Form0 Technol. v. 43, N 11, 864-872, 1965).
-
Das von X. Watanabe und T. Fukimbara entwickelte Verfahren zieht
folgende Vorgänge in Betracht.
-
Die Kultur des Pilzes Aspergillus awamori vas fumens aus 1-13-42
wird während 96 Stunden bei 30°C in den Fermentern an einem Nährmediam gezüchtet,
welches 3% Weizenkleie, 1,5% Stärke, 0,5% Reiskleie und 0,2% NaNO3 enthält. Die
Kulturflüssigkeit wird filtriert. Das Filtrat der Submerskultur wird mit saurem
Ton behandelt, dann mit der I M NaOH-Lösung bis pH von 4,5 gebracht und filtrtort.
Das Filtrat wird um das 10- bis 15-fache eingedampft und während 48 Stunden gegen
Leitungswasser dialysiert.
-
Nachher wird ins Dialysat Azeton bis 35% vom Gesamtvolumen des Dialysats
zugegeben und der Niederschlag durch Filtration entfernt. Zum Filtrat wird wiederholt
Aet;on zugegeben und dessen Konzentration auf 55% gebracht. Der ausgefallene Nieder-Schlag
wird abgetrennt und in Wasser galöst, und Azeton wird durch Vakuumverdampfen entfernt.
Nachher wird zur Lösung Ammoniumsulfat bis 45% von Gesamtsättigung zugegeben und
der Niederschlag wird entfernt. Man gibt dem Filtrat Ammoniumsulfat bis
75%
von Gesamtsättigung zu und hält 24 Stunden bei +5°C. Der ausgefallene Niederschlag
wird abgetrennt und im Wasser gelöst und läßt zur Dialyse gegen Leitungswasser für
48 Stunden und noch für 48 Stunden gegen destilliertes Wasser stehen. Nachher wird
zum Dialysat die gesättigte Rivanollösung zugegeben, Der ausgefallene Niederschlag
wird abgetrennt und im Azetatpuffer mit pH von 5,0 gelost, die Lösung wird auf die
Säule mit Diäthylaminoäthylzellulose aufgetragen und die Eiwei@stoffe werden stufenweise
mit einem Phosphat-Zitratpuffer eluiert. Dann wird die Glukoamylasenfraktion auf
dem genannten Sorbens rechromatographiert, nachher mit dem genannten Puffer eluiert
und die Glukoamylase wird mit Azeton gefällt. Die Ausbeute an Glukoamylase betragt
nach solcher Behandlung 8-97o.
-
Die wichtigsten Nachteile dos beschriebenen Verfahrens und anderer
bekannter Verfahren bestehen t einer sehr niedrigen Ausbeute anh Glukoamylase, die
höchstens 8-10% beträgt, sowie in einer großen Anzahl an Vorgängen und deren Arbeitsaufwendigkeit.
-
Es ist auch ein Vorfahren zur gleichzeitigen Herstellung von Fermenten
amylolytischer Komplexe, von α-Amylase, Glukoamylase und Transglukosilase,
durch die Kultivierung unter den Submersbedingungen des Produzenten dieses Ferments
Aspergillus awamori auf dem wäßrigen Nährmedium folgender Zusammensetzung in g/l:
Stärke - 60; NaN03 - 9; MgSO4 - 0,5; KH2PO4 - 1,0; EC1 -0,5; FeSO4 - 0,001 und 10
Vol.% 10%igen Malzsprossenextraktes während 120 Stunden bei 30°C bekannt (Angewandte
Biochemie und
Mikrobiologie 1968, Bd. IY, H. 2, S. 167).
-
Die Kultivierung des Schimmelpilzes Aspergillus awamori auf dom genannten
Medium untor den Bedingungen der optimalen Belüftung gibt die Möglichkoit, die Kulturflü.sigkeit
mit einem hohen Biosyntheseniveau von Glukoamylase, Transglukosilase und, α-
Amylase zu erhalten.
-
Das Verfahren sieht jedoch die Isolierung der Fermente und dessen
Trennung nicht vor.
-
Die Notwendigkeit, die genannten Fermente in der Industrie und in
der Medizin auszunutzen, stellt die Aufgabe der Abtrennung der Transglukosilase
von der Glukoamylase und der α-Amylase abzutrennen und die letzteren im hochgereinigten
Zustand herzu @@@ stellen.Das Ziel der Erfindung besteht in der Beseitigung der
genannten Nachteile.
-
In Übereinstimmung mit dem Liel wurde die Aufgabe gestellt, ein Verfahren
zu entwickeln, welches ermöglicht, die Abtrennung der genannten Fermente voneinander
durchzuführen somit die hornogene Glukoamylase zu erhalten.
-
Die genannte Aufgabe wurde erreicht durch das Verfahren zur Herstellung
von amylolytischen Fermenten durch die Kultivierung des Schimmelpilzes Aspergillus
awamori unter einen Submersbedingungen auf wäßrigen Nährmedium, welches aus Stärke;
NaNO3; MgSO4; KH2PO4; KCl; FoSO4 und Malzsprossenextrakt besteht, in dem dio Kultivierung
des genannten Pilzes erfin dungsgemäß auf dem Nährmedium durchgeführt wird, welches
folgende
Komponenten in g/l enthält: Stärke von 40 bis 80; NaNO3
von 7 bis 15; MgSO4 von 0,4 bis 1,5; KH2PO4 von 0,2 bis 1,2; Kol von 0,5; FeSO4
von 0,001 bis 0,08; Mg(NO3)2 von 0,2 bis 0,8; Mg(HwPO4)2 von 0,1 bis 0,7 und 10
Vol% 10%igen Malzsprossenextraktes.
-
Die Kultivierung wird unter Blüftung bei einer Temperatur von 28-32°C
während 110-130 Stunden durchgeführt. Die erhaltene Kulturflüssigkeit wird zwecks
der Abtrennung der Biomasse abZ filtriert.' Das Filtrat stellt die gsq von Gluko'wnylase,
-Amylase und Traansglukosilase dar. Im weiteren wird das Filtrat nach zwei Var;ranten
behandelt, Je nach dem, welche . Bermente man erhalten will.
-
Die erste Variante des Verfahrens schließt den Prozeß der aufeinanderfolgenden
Herstellung von Transglukosilase, Glukoamylase und der Fraktion ein, welche aus
oL -Amylase~und Glukoamylase besteht.
-
Nach dieser Variante wird das Filtrat zur Dialyse gegen destilliertes
Wasser während 10-12 Stunden xur Entfernung aus dem Filtrat der Beimischungen von
zurückgebliebenen Mineralsalzen und anderen niedermolekularen Metaboliten gestellt.
Nachher wird das Dialysat durch die Såule mit (tem Sorbens- Diäthylaminoäthylzellulose
in einer Menge durchelassen, die dem Verhaltnis von höchstens 80 mg ] Eiweiß zu
1 g Sorbens entspricht; dabei werden α-Amylase, Glukeamylase und Transglukosilase
auf dem Sorbens völlig sorbiert. Nachher wird durch die Säule
mit
dem Sorbens die Phesphatpufferlösung bei einer Konzontratjon von 0,03 bis 0,05 M
mit pE von 6,5 bis 7,5 durchgelassene dabei werden vom Sorbens nur Transglukesilase
und andere der α-Amylase und Glukoamylase nach unaktive Eiweißstoffe eluiert.
-
Unter der Phosphatpufferlösung ist das Gemisch von wäßrigen Salzlösungen
KH2PO4 und Na2HPO4 zu verstehen. Nachher wird durch das Sorbens die Phosphatpufferlösung
bei einer Konzentration von 0,06 bis 0,09 M mit pH von 6,5 bis 7t5 durchgelassen;
dabei geht nur die Elution der Glukoamylasenisoform I vor sich. Und die dritte Fraktion
enthält nur zwei Eiweißstoffe - die Glukoamylasenisoform II und die α-Amylase.
Diese Fraktion wird auf dem Wege des Durchlassens durch das Sorbens mit dem Phosphatpuffer
bei einer Konzentration von 0,1 bis 0,12 M mit pH von 6,5 bis 7,5 eluiert.
-
Die Gesamtausbeute an Glukoamylase nach der vorgeschlagenen Methodik
beträgt über 60°, und die Ausbeute an α-Amylase -95%.
-
Das Verfahren zur Behandlung des Filtrats nach der zweiten Variante
wird verwirklicht, wenu das Ziel verfolgt wird, eine homogene Glukoamylase zu erhalten.
-
Dus Filtrat dor submerskultur wird mit I n-HCl bis pE von 1,5 bis
2,2 angesaucrt und bei +80C während 36 Stunden zur Fällung der Transglukosilasse
und α-Amylase stehengelassen.
-
Der Niederschlag der denaturierten α-Amjylase, Transglukosilase
und anderer Eiweißstoffe wird durch Filtration entfernt. Dann
wird
das Filtrat mit NaHCO3 bis pH von 6,5 - 7,5 alkalislert und zur Dialyse gegen destilliertes
Wasser fur 18-24 Stunden gestellt. Nachher wird das Destillat auf eine Saule mit
dem Sorbens Diäthylaminoäthylzellulose aufgetragen; dabei wird die Glukoamylase
auf dem Sorbens völlig sorbiert.
-
Zur Extraktion der Glukeamylase und deren Abtrennung von Begleiteiweißstoffen
vom Sorbens werden Phosphatpufferlösungen an derselben Reihenfolge verwendet, wie
in der 1. Variante angegeben wird. Zuerst wird das Sorbens mit der bei einer Konzentration
von 0,03-0,05 M bei pH von 6,5 bis 7,5 aufgearbeitet, dabei werden vom Sorbens die
der Glukoamylase nach unaktiven Eiweißstoffe eluiert. Dann wird das Sorbens mit
dem Phosphatpuffer bei einer Konzentration von 0,06-0,09 M bei pH von 6,5 bis 7,5
bearbeitet; infolgedessen erhält man eine Fraktion, welche eine Glukoamylassenaktivität
besitzt (Isofrom I).
-
Nachher wird durch das Sorbens die Phosphatpufferlösung bei einer
Konzentration von 0,1-0,12 Al bei pH von G,5 bis 7 7,5 durchgelassen und man erhält
die zweite Fraktion der homogenen Glukoamylase (Isoform Il).
-
Dio Beachtung der angegebenen Elutionsreihenfolge ist eine wichtige
Voraussetzung, weil deiese erlaubt, erstens, unaktive Begleiteiweißstoffe von Glukoamylasenfraktion
abzutrennon und, zweitens, die Glukoamylasenfraktion in zwei Fraktionen zu teilen,
wovon jede eine besondere Isoform darstellt.
-
Die bei der Bearbeitung des Sorbens mit der Phosphatpufferlösung
bei
einer Konzentration von 0,1-0,12 M erhaltene Fraktion erwies sich bei der Untersuchung
nach den methoden der Scheibenelektrophorese und des analytischen Ultrazentrifugierens
dem Eiweißstoff nach als homogen. Gleichzeitig beträgt der Gehalt an der glukoamylasenisoform
I, welche bei der Behandlung des Sorbens mit der Phosphatpuffe'rlosung bei einer
Konzentration von 0,06-0,09 M erhalten wurde, gegen 70% zum Gesamtgehalt an Eiweißstoffen.
-
Auf solche Weise wird nach der ersten Variante, wo die Trennung der
Eiweiß stoffe auf Diäthylaminoäthylzellulese ohne Filtratansäuerung durchgeführt
wird, in der ersten Fraktion die von α-amylase und Clukoamylase freie Transglukosilase
erhalten.
-
In der zweiten Fraktion ist die Glukoamylasenisoform I enthalten,
die ebenso von Transglukosilase und α-amylase frei ist, und in der dritten
Fraktion sind endlich qualitativ nur zwei Eiweßstoffe α-amylase und Glukoamylasenisoform
II entbalten.
-
Die zweite Variante dieses Verfahrens erlaubt, zwei. Glukoamylasenisofermente
zu erhalten; Glukoamylasenisoform I, die von Transglukosilase und -Amylase frei
istt und Glukoamylasentioforn II, die dem Eiweißstoff nach vollig homogen ist.
-
Auf solche Weise erraubt- das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
von amylohytischen Fermenten die Glukoamylase in homogener Form bei verhältnismäßig
geringer Menge von technologischen Vorgängen mit einr Ausbeute an Produkt bis 70%
zu isolieren.
-
Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung durch die auf diesem
Gebiet sachknndigen Personen seien konkrete Beispiele der Verwirklichung des Verfahrens
angeführt.
-
Beisiel 1.
-
Konidien der 50 Tage alten Kultur des Produzenten Aspergillus awamori,
die im Röhrchen auf der 7%igen wäßrigen Bierwürzenlösung gezüchtet wurde, welche
2% Agar enthält, werden mit sterilem Leitungswasser abgespült und in Schüttelkolben
zu je 5 ml auf das Nährmedium folgender Zusammensetzung in g/l übertragen: Stärke
- 40; NaNO3 - 8; KH2PO4 - 1,0; KCL - 0,5; MgSO4 - 0,5; FeSO4 - 0,001 und 10 Vol%
10%igen Malzsprossenextraktes. Die Impfkultur wird während 30 Stunden bei einer
Temperatur von 30°C auf dem Schütteltisch gezüchtet, der 180 Umdrehungen pro Minute
ergibt. Nachher wird das Inoculum in einer menge von 0,5% in den Fermenter von 1000
1 Inhalt steril übertragen, in welchem 500 1 sterilen Nährmediums folgender Zusammensetzung
in g/l enthalten sind: Stärke - 60; NaNO3 - 9; KH2PO4 - 1,0; KCL - 0,5; MgSO4 -
0,5; FeSO4 - 0,001; Mg(H2PO4)2 -0,3; Mg(NO3)2 - 0,4 und 10 Vol% 10%igen Malzsprossenextraktes.
-
Die Fermentation wird während 120 Stunden bei einer Temperatur von
30°C durchgeführt. Die Fermenter sind mit dem Barboteur für die Luftzufuhr und dem
Rührwerk versehen. Die Menge der zugeführten Luft beträgt während der ersten 20
Stunden 280 1 pro Minute und in der nächsten Zeit - 500 1 pro Minute. Für die Dämpfung
des sich bildenden Schaums wird der Pottwaltran ausgenut
St ( os
ist möglich, die Oleinsäure und andere Antischaummittel zu verwende). Nach der Beendigung
der Fermentation wird dic Pilzbiomasse durch Filtration (odor durch Separieren)
abgetrennt.
-
Das Filtrat der Submerskultur wird gegen destilliertes 8 Wasser während
24 Stunden dialysiert und das erhaltene Dialysat wird durch dio Säule von 50 mm
breite und 300 mm Höhe durchgelassen, welche mit 20 g Sorbens - Diäthylaminoäthylzeliulose
gefülit ist. Das Dialysat wird durch das Sorbens in der Menge durchgelassen, daß
es 1300 mg Eiweißstoff enthält, was 110000 Einheiten Glukoamylasenaktivität und
5000 Einheiten Amylasenaktivität entspricht. Die genannto Eiweißstoffmenge wird
nach der Fähigkeit dos Sorbens, den Eiweiß stoff zu sorbieren, u. z. höchstens 80
mg Eiweißstoff fur 1 g Sorbons berechnet.
-
Wahrend des Durchlassens durch das Sorbens werden darauf Glukoamylase,
α-Amylase und Transglukosilase und deren Begleiteiweißstoffe sorbiert. Nachher
wird die Elution der Eiweißstoffe vom Sorbens durchgeftilirt. Die Eiweißfraktion
welche Transglukosilase und andere der Amylase und Glukoamylase nach unaktive Eiweißstoffe
enthält, wird mit der Phosphatpufferlösung bei einer Konzentration von 0,05 M bei
pH von 7,1 eluiert. Die Eiweißmenge in dieser Fraktion beträgt 510 mg, d.h. gegen
40% von der Gesamtmenge dos auf das Sorbens aufgetragener Eiweißstoffes.
-
Die Fraktion der Glukoamylasenisoform I wird mit der Phosphatpufferlösung
bei
einer Konzentration von 0,08 M bei pII von 7,1 oluiert. Diese Fraktion enthalt 16200
Einheiten der Glukoamylasenaktivität. Diese Fraktion enthält 170 mg Eiweißstoffe.
-
Die Fraktion, welche die Glukoamylasenisoform II und dio α-Amylase
enthält, wird vom Sorbens mit der Phosphatpufferlösung bei einer Konzentration von
0,12 M bei, pH von 7,1 eluiert. Die Gesemtaktivität der Glukoamylase in dieser Fraktion
beträgt 71000 Einheiten und die Gesamtaktivität von α-Amylase - 4800 Einheiten.
-
Auf solche Weise beträgt die Ausbeute an Glukoamylase gegen 80% von
der Gesamtmenge der Glukoamylase, wekche im Dialysat enthalten ist, und die Ausbeute
an α-Amylase beträgt 96% von der Menge der α-Amylase im Dialysat.
-
Beispiel 2o Das im Beispiel 1 erhaltene Filtrat der submerskultur
wird mit I n-HCl-Lösung bis pH von 1,9 angesäuert und bei einer,Temporatur von 44°C
während 48 Stunden stehengelassen. Der. Nieder-Schlag der denaturierton α-Amylase,Transglukosilase
und anderer Begleiteiweißstoffe wird durch Filtration entfernt. Nachher wird das
Biltrat mit NaHCO3 bis pH von 7,0 alkalisiert und gegen destilliertes Wasser während
24 Stunden dialysiert, dann werden elle die im Beispiel 1 angegebenen Vorgänge durchgeführt.
-
Die bei der Elution dos Sorbens mit der Phosphatpufferlösung bei
einer Konzentration von 0,08 M mit pH von 7,1 erhaltene Fraktion enthält die Glukoamylasenisoform
I in einer Menge von 70-80%
von der Gesamteiweißstoffmenge, die
in dieser Fraktion enthalten ist.
-
Die bei der Elution vom Sorbens mit dar Phosphatpufferlösung bei
einer Konzentration von 0,12 M M mit plI von 7,1 erhaltene Fraktion stellt die Glukoamylasenisoform
II, dar und ist dem Eiweißstoff nach homogen. Die Ausbeuten an genannten Ferm@nten
sind den im Beispiel j analog.
-
Diese Angaben wurden nach den Methoden der Rechromatographie auf
dem Sorbens Diäthylaminoäthylzellulose, nach den Methoden der Scheibenelektrophorese
und des analytischen Ultrazentrifugierens erhalten.