DE2225148A1 - System zur bestimmung enterischer bakterien - Google Patents

Description

• System zur Bestimmung enterischer Bakterien Die Erfindung betrifft ein System zur differenzierten, spe zifischen Bestimmung enterischer Bakterien,~sowi.e hierzu geeignete Test substrate Unter den zahlreichen Bakterien des Darm- und Harnkanals befinden sich auch pathogene Arten, die wie Salmonella und Shigella Durchfall, Schwindelgefühl, Zerbrechen, erhöhte Temperatur, innere Blutung oder Vergiftung des Blutkreislaufs verursachen können. Zur Prognose der spezifischen bakteriellen Infektion sind mikrobiologische Tests unentbehrlich, weil bei falscher Therapie dauernde Organschäden oder der Tod eintreten, während im Genesungsfall der Patient als Träger der Bakterien eine Änsteckungsgefahr darstellt, oft als Epidemie aliftretend. Die bisherigen mikrobiologischen Tests sind langwierig und benötigen 72 Std. und mehr bis zur spezifischen Isolierung.
• Durch die enge Verwandtschaft der Familie Enterobacteriaceae ist die mikroskopische Unterscheidung unmöglich. Alle haben Grössen von 3 - 5 X O, »2, sind stielförmig mit abgerundeten Enden, Gramm-negativ, verschieden motil, teils verkapselt, sets ohne Sporen und fermentieren Glukose mit oder ohne Gaserzeugung. Selbst besonders geübte Bakteriologen haben bei der Identifizierung daher die grössten Schwierigkeiten. Zur Identifizierung wird die Probe in differenzierende Kultursubstrate gegeben, bei 370 über Nacht inkubiert und auf das für enterische Bakterien kennzeichnende Wachstum von Bakterienkolonnien untersucht, sodann auf differenzierende Substrate wie Tripel-Zucker-Eisen-Agar oder Kligler-Eisen-Agar gebracht und erneut bei 370 inkubiert. Sodann wird erneut untersucht, und zwar auf Anzeichen der Fermentierung verschiedener Eohlehydrate oder Schwefelwasserstoff. Meist liegen immer noch keine eindeutigen Ergebnisse vor und weitere Tests sind erforderlich. Die Gesamtunterslleklmg dauert 72 Std. oder länger, was für eine rasche Behandlung, besonders bei drohender Epidemie zu lange ist.
• Aufgabe der Erfindung ist ein rasches, zuverlässiges, spezifische Ergebnisse lieferndes System zur differentiellen Bestimmung enterischer Bakterien, sowie hierzu geeignete Rultursubstrate.
• Die Aufgabe wird durch das erfindungegemässe System mit wenigstens zwei verschiedenen Substraten dadurch gelöst, dass ein durchsichtiger Behälter beide Substrate enthält, das erste, das zweite Substrat vollstWndig abdeckende Substrat ein für die Bakterien nicht toxisches Gel enthält, in dem in jeweils ausreichender Menge dispergiert sind a) für das Wachstum der zu differenzierenden Bakterien aus reichende Nährstoffe, b) Aminosäure und freies Eisen zur Anzeige der Deaminierung durch bestimmte Bakterien, c) Kohlehydrate als Katalysator für die Dekarboxylierung und zur Anzeige der Fermentierung, d) ein den Ionen-dllrchgang durch das Gel ermöglichender Elektrolyt, e) edne die Entstehung von H2S in Gegenwart bestimmter Bakterien steigernde Schwefelquelle, f) ein pH-Indikator, und das zweite Substrat ein lysinhaltiges Gel enthält sowie einen Detektor der Dekarboxylierung des Lysins in Gegenwart v@ diese verursachenden Bakterien.
• Erfindungsgemäss kann also ein Test an die Vielzahl der bisher notwendigen Untersuchungen treten. Ausser der differentiellen Kohlehydratefermentierung werden dabei die Motilität, die tysindekarboxylierung, die Schwefelwesserstofferzeugung und die Desininierung von Phenylalanin bestimmt. Spätestens 48 Std. nach Eintreffen der Untersuchungsprobe sind z. B.
• Salmonella, Citrobacter, Shigella, Escheria coli, Arizonaorganismen, Proteus, Providence spezifisch bestimmt.
• Die Figur 1 zeigt als Verfahrensschema die bekannte Arbeitsweise, die Figur 2 die Arbeitsweise gemäss der Erfindung, jeweils zusammen mit einer Zeitskala; die Figur 3 zeigt im oberen Teil die Reaktion verschiedener Bakterien nach Impfung in einem bekannten Testsubstrat, und im unteren Teil die Reaktion verschiedener Bakterien nach Impfung in den erfindungegemässen Testsubstraten; die Figur 4 zeigt perspektivisch eine bevorzugte Ausgestaltung des Testbehälters.
• Zum Vergleich sei zunächst die bisher übliche Arbeitsweise als Folge einer Reihe von Stufen auf der Zeitskala entsprechend der Figur 1 erläutert.
• 1. Stufe - Zeit O.
• Eine Fäkalien- oder Urinprobe 10 wird in einem sterilen Behälter angeliefert.
• 2. Stufe.
• Ein Teil der Probe wird auf die Agarplatten 12 gewischt und in Anreicherungslösungen gegeben. Die Agarplatten bestehen z. B. aus MacConkey Agar, E. M. B., X. L. D., SB. usf., die Lösungen z. B. aus G. N. Selenit oder Tetrathionat. Ausgehend von der bestrichenen Fläche bis zu dem ungeimpften Bereich wird der Aufstrich auf der Platte verstrichen, so dass die Probe verdünnt wird und das Wachstum isolierter Kolonien von Bakterien B1, B2 usw. begünstigt wird.
• 3. Stufe.
• Die geimpften Platten und Lösungen werden bei 370 24 Std. lang inkubiert.
• 4. Stufe - Zeit 24 Std.
• Nach 24 Std. werden einige der auf der Platte entstandenen Kolonien mit einem geraden Draht von den Platten abgestrichen und in ein Reagenzglas 14 eingeimpft, das T. S. 1. Agar (dreifaches Zuckereisenagar) oder Kliglers Eisenagar enthält.
• 5. Stufe.
• Das Reagenzglas mit Inhalt wird für weitere 24 Std. inkubiert.
• 6. Stufe - Zeit 48 Std.
• Die Ergebnisse werden ausgewertet.
• 7. Stufe.
• Die Reagenzgläser mit Inhalt werden einer Reihe von biochemischen Untersuchungen unterworfen; eine Probe des T. S. 1. enthaltenden Glases 14 wird zur Untersuchung der verschiedenen biochemischen Reaktionen in den Gläsern 16a - 16f sowie des Motilitätsversuchs 18 entnommen.
• 8. Stufe.
• Der Inhalt der Reagenzgläser wird zunächst 24 Std. lang inkubiert und sodann biochemisch untersucht, z. B. mit Indol, Zitrat, Harnsäure, Phenylalanin, Lysindekarboxylase, Ornithindekarboxylase, usw., wobei als Umsetzungserscheinungen Gasentwicklung, Zuckerfermentierung, Schwefelwasserstoffentwicklung u. a. m. auftreten. Oft muss für weitere 24 Std. inkubiert werden. Jede Kolonie muss getrennt weiter untersucht werden, wobei z. B. nach 10 T. S. 1. Versuchen an 10 Kolonien äe 6 - 9 weitere Versuche vorgenommen, schliesslich also 60 -100 Reagenzgläser bearbeitet werden müssen.
• 9. Stufe.
• Frühestens nach 72 Std. kann der Bakteriologe die erforderliche Auswertung vornehmen.
• Stufen 10 - 12.
• Diese weiteren Untersuchungsstufen werden oft notwendig, weil die Auswertung kein klares Ergebnis ergibt. Das ist häufig die Folge der zahlreichen Voruntersuchungen, die zu Verwechslungen, falschen Ansätzen und dergleichen führen. Die Gesamtuntersuchung dauert daher häufig eine ganze Woche.
• Erfindungsgemäss wird diese umständliche, zu Fehlern führende und zeitraubende Arbeitsweise vermieden.
• Die Arbeitsweise mit dem System und dem Testsubstrat der Erfindung sei an Hand der Figur 2 erläutert.
• Die ersten drei Stufen entsprechen der zuvor erläuterten bekannten Arbeitsweise. Die verwendeten Kulturlösungen bzw.
• Platten bestehen beispielsweise aus MacConkey-Agar, X. L. D.
• oder G. N. Brühe.
• 4. - 6. Stufe.
• Nach 18 - 24-stündiger Inkubation werden einige der auf den Platten entstandenen Kolonien mit einem geraden Draht abgestrichen und in das erfindungsgemässe Substrat bzw. die weiter unten näher beschriebenen Substrate eingeimpft. Diese werden sodann weitere 24 Std. inkubiert.
• 7. Stufe - Zeit 48 Std.
• 48 Std. nach Versuchsbeginn zeigen die Substrate bereits die genaue Bestimmung von Bakterienspezies ermöglichende Veränderungen. Gegenüber der bekannten Arbeitsweise werden also 24 Std. eingespart.
• Ferner ermöglicht die Einfachheit der erfindungsgemässen Arbeitsweise die Untersuchung zahlreicher Kolonien, da z. B.
• die Untersuchun von 10 Kolonien in dem erfindungsgemässen Substrat 10 Befunde ergibt, während bei bekanntem Vorgehen mit 10 T. S. 1. oder Kliglers Versuchen etwa 100 biochemische Umsetzungen am folgenden Tag gemessen und ausgewertet werden müssen.
• Nach einem Merkmal der Erfindung wird ein doppelt eingegossenes Substrat verwendet. Das Substrat A bildet den oberen Teil und das Substrat B den unteren Teil der gleichfarbigen aber verschieden schraffierten Fläche der Figur 3. Zur Füllung wird zunächst der untere Teil eingegossen und stehen gelassen, bis er fest wird. Sodann wird der obere Teil eingegossen und das Reagenzglas schief gehalten, so dass eine geneigte Oberfläche entsteht, bis die obere Masse fest wird0 Es bestehen dann also zwei verschiedene, verfestigte Füllungen, wobei die Oberfläche der zweiten Füllung geneigt verläuft.
• Als Beispiel wird in'ein 150 mm langes und 16 mm weites Reagenzglas 4 ccm der Lösung B warm eingegossen, im Autoklaven sterilisiert, gekühlt, worauf 6 ccm der Lösung A eingefüllt werden. Das Glas wird nun schief gehalten, bis auch die zweite Füllung erstarrt ist.
• Substrat A (Oberer Teil) A. Nährstoff Pepton 15,0 g Hefeextrakt 3,0 g B. Aminosäure L-Phenylalanin 3,0 g L-Tryptophan 2,0 g C. Fermentiermittel Dextrose 1,0 g Lactose 19,0 g D. Elektrolyt-Natriumchlorid 5,0 g E. H2S Indikator Eisenammoniumcitrat 0,5 g Natriumthiosulfat 0,5 g F. Verfestigungsmittel Agar 15,0 g G. Indikator Bromkresol - violett 0,02 g H. Löser destilliertes Wasser, H20 1000 cc Substrat B (Unterer Teil) A. Nährstoff Pepton 5,0 g Hefeextrakt 3,0 g B. Lysin Lysin lO,O g C. Fermentiermittel Dextrose 1,0 g D. Verfestigungsmittel Agar 6,0 g E. Indikator Bromkresol - violett 0,02 g F. töser destilliertes Wasser, H20 1000 cc Aus der Lösung B wird durch Zusatz von 3 - 8 g Agar ein halbfestes Gel, das die Feststellung des Grads der Mobilität der Bakterien in dem gleichen Substrat wie der Lysindekarboxylierungstest ermöglicht.
• Mit einem zweiten Reagenzglas wird die positive Differenzierung vorgenommen. Zur Taxonomie wird die Fähigkeit bestimmter Bakterien; durch Abbau von Tryptophan Indol zu erzeugen ausgenutzt. Andere Bakterien haben die Fähigkeit, Aminosäuren wie Arnithin zu dekarboxylieren. Bisher waren hierfür gesonderte Versuche notwendig. Besondere Schwierigkeiten entstanden hierbei durch die zur Dekarboxylierung von Ornithin notwendigen, aber die Indoldarstellung verhindernden Kohlehydrate. Der folgende Ansatz vermeidet diese Schwierigkeiten.
• Formel C A. Nährstoff Pepton 20,0 g Hefe extrakt 3,0 g B. Aminosäuren L-Ornithin 5,0 g L-Tryptophan 5,° g Fermentiermittel Dextrose l,0g D. Verfestigungsmittel Agar 15,0 g E. Indikator Brom-Kresol violett 0,02 g Rest: Wasser bis ein Gesamtvobimen von 1000 ccm entsteht.
• 49,02 g dieses Ansatzes werden in 1000 ccm destilliertem H?O gelöst und 1 Min. gekocht. Die Lösung wird dann in Mengen von äe 4 cem in 13 mm weite, 10 cm lange Reagenzgläser gegeben; diese werden mit einem Pfropfen verschlossen und im Aiitoklav bei etwa 7 kg Druck 15 Min. auf 1210 erhitzt und sodann stehen gelassen, bis das Substrat fest wird, wobei das Glas etwas schief gehalten wird, dass eine tiefe Füllung mit einer kurzen1 geneigten Oberfläche entsteht.
• Das Substrat wird mit einem etwa 7,6 cm langen Stechdraht geimpft. Hierzu wird die gewünschte Kolonie abgestrichen, der Draht in den unteren Teil der Füllung gestochen und dann mit einer abstreichenden Bewegung über die geneigte Fläche zuruckgezogen. Das wird mit dem Reagenzglas II der Figur 3 wiederholt. Die Gläser mit Inhalt werden dann bei 370 während 24 Std. inkubiert. Die Dekarboxylierung des Ornithin kann durch Farbänderung des unteren Füllungsteils abgelesen werden, und zwar zeigt violett eine positive und gelb eine negative Reaktion an.
• Zum Nachweis von Indol wird ein Teil des Wachstums auf der geneigten Fläche abgestrichen und auf einen Papierstreifen IV (z. B. Filterpapier) gewischt, der zuvor mit einer Lösung von 5% PariSmethylbenzoldehyd in 10% wässeriger Salz säurelösung getränkt wurde. Rote Färbung zeigt die positive Reaktion, während bei negativem Befund die Farbe unverändert bleibt oder eine andere als die rote Farbänderung eintritt.
• Das Substrat kann anstelle von 20 g Pepton auch 5 g Pepton enthalten. Ferner kann ein doppeltes Substrat wie die Substrate im Glas I eingegossen werden; das Substrat für den Nachweis der Ornithindekarboxylierung (Formel C ohne Ornithin) bildet dann den unteren Teil, das Substrat fur den Indolnachweis (Formel O'ohne Tryptophan) den unteren Teil.
• Das Reagenzglas I der Figur 3 enthält die Substrate A und B, das Glas II das Substrat C. Vor der Impfung ist die Färbung violett. Zum Vergleich ist auch das Glas für den bekannten T. S. I.Test gezeigt. Nach der Impfung mit der gewählten Bakterienkultur und 24-stündiger Inkubation treten die gezeigten Reaktionen auf. Beim T. S. I. Test können wenigstens vier verschiedene Reaktionen auftreten, von denen keine für bestimmte Bakterien spezifisch ist, sondern nur irgend eine von 2 - 7 verschiedenen Spezies anzeigt. Demgegenüber ergibt das erfindungsgemässe Substrat fast durchweg eine klare Differenzierung. Ähnliche Reaktionen sind nur für E. Coli und Serratia sowie Hafnia und Aerobacter zu beobachten. Ein einfacher Papiertest IV differenziert ohne weiteres E. Coli.
• Eine weitere ähnliche Reaktion von P. Rettgeri und Providence kann durch einen gewöhnlichen Harnstofftest leicht differenziert werden. Dagegen zeigen beim T. S. I. Test allein 7 Spezies, darunter die pathogene Spezies Shigella, identische Reaktionen. Erfindungsgemäss erhält man eine spezifische Anzeige von Salmonella durch violetteh, geneigten Oberteil mit einem schwarzen Band und violettem Unterteil des Substrats.
• Bei Shigella erscheint eine violette, geneigte Fläche, gelber Oberteil und gelber Unterteil ohne Gasentwicklung.
• Citrobacter waren bisher schwer zu identifizieren, weil die Anzeige meist mit der für Salmonella verwechselt wurde. Erfindungsgemäss ist die Anzeige spezifisch mit einer violetten geneigten Fläche, schwarzem Band im gelben Oberteil und gelbem Unterteil (keinerlei Ausnahmen).
• Bei Proteus vulgaris und Proteus mirabilis erscheint eine rotbraune geneigte Fläche, schwarzes Band im gelben Oberteil und gelber Unterteil.
• E. Coli und Aerobacter erzeugen verschiedene Formen mit gelber geneigter Fläche und gelbem Oberteil und gelbem Unterteil, sowie trennender Gasentwicklung. Alle Farbkominationeh sind für die biochemischen Reaktionen und Sermentierungen kennzeichnend und ergeben eine spezifische Anzeige, Im Reagenzglas 1 entsteht das schwarze Band und/oder der schwarze Oberteil durch Bildung von H2S.
• Die Lysindekarboxylierung kann von der Farbänderung unter der geneigten Fläche zu violett bei positivem und zu gelb bei negativem Befund abgelesen werden.
• Die Motilität ergibt sich aus dem Grad der Diffusion der betreffenden Organismen durch das Substrat. Die Deatinierung von Phenylalanin wird durch die Farbänderung zu deutlichem Rotbraun in der geneigten Fläche des Oberteils des Substrats angezeigt.
• Nach günstiger Ausgestaltung der Vorrichtung wird ein Doppelbehälter entsprechend der Figur 4 anstelle von zwei getrennten Reagenzgläsern I und II verwendet. Er besteht z. B. aus einer durchsichtigen Flasche aus Glas oder sterilisierbarem Eunststoff 50 mit einem Schraubverschluss 52. Eine Trennwand 51 unterteilt ihn in zwei Kammern für die Substrate A, B. bzw. C.
• Der Schraubverschluss lässt sich einfach mit einer Hand öffnen, so dass die andere Hand zur Einführung des Impfdrahts frei ist.

Claims (10)

Patentansprüche

1. System zur Differenzierung enterischer Bakterien mit wenigstens zwei verschiedenen Substraten, dadurch gekennzeichnet, dass ein durchsichtiger Behälter beide Substrate enthält, das erste, das zweite Substrat vollständig abdeckende Substrat ein für die Bakterien nicht toxisches Gel enthält, in dem in jeweils ausreichender Menge dispergiert sind a) für das Wachstum der zu differenzierenden Bakterien ausreichende Nährstoffe, b) Aminosäure und freies Eisen zur Anzeige der Deaminierung durch bestimmte Bakterien, c) Kohlehydrate als Katalysator für die Dekarboxylierung und zur Anzeige der Fermentierung, d) ein dem Ionendurchgang durch das Gel ermöglichender Elektrolyt, e) eine die Entstehung von H2S in Gegenwart bestimmter Bakterien steigernde Schwefelquelle, f) ein pR-lndikator, und das zweite Substrat ein lysinhaltiges Gel enthält sowie einen Detektor der Dekarboxylierung des Lysins in Gegenwart von diese verursachenden Bakterien.

2. System gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite durchsichtige Behälter ein drittes Substrat mit einem Detektor für von bestimmten Bakterien erzeugtes Indol enthält.

3. System gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des ersten Substrate geneigt verläuft.

4. System gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Behälter in einem gemeinsamen Mantel angeordnet sind.

5. System gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der gemeinsame Mantel durch eine Trennwand in zwei Behälter unterteilt ist.

6. System gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Substrat festphasig und mit geneigter Oberfläche in spitzem Winkel zur Hauptachse des langgestreckten Behälters angeordnet ist.

7. System gemäss irgend einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Indikator aus Bromkresol violett besteht.

8. System gemäss irgend einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Substrat ein halbfestes Gel ist.

9. estsllbstrat zur Verwendung in dem System nach irgend einem der vorhergehenden Ansprüche, das aus einem normalerweise basischen Gel mit einem geneigten Oberflächenteil besteht, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Geliermittel, Nährstoffe für enterische Bakterien, Bromkresol violett, in Gegenwart von Proteus oder Providence Gruppen durch Deaminierung eine Farbänderung hervorrufende Aminosäuren, H2S erzeugende Bakterien anzeigende Stoffe, ein fermentierfähiges, in Gegenwart enterischer Bakterien eine Säure erzeugendes Material und einen EleRtrolyten für den lonendurchgang durch das Gel enthält.

10. System gemäss irgend einem der Ansprüche 2 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Substrat (a) Pepton 15,0 Teile + 1,0 Prozent Hefeextrakt 3,0 Teile + 2,0 Phenylalanin 3,0 Teile + 0,5 ei Tryptophan 2,0 Teile + 0,5 Dextrose 1,0 Teile + 0,5 Lactose 10,0 Teile + 1,0 Natriumchlorid 5,0 Teile + 1,0 Eisenammoniumcitrat O,5 Teile + O,5 II Natriumthiosulfat 0,5 Teile f 0,5 fl Agar 15,0 Teile + 1,0 Bromkresol violett 0,2 Teile + 0,001 Wasser 1000 Teile + 0 das zweite Substrat (b) Pepton 5,0 Teile + 1,0 Prozent Hefeextrakt 3,0 Teile + 2,0 Lysin 10,0 Teile + 0,8 Dextrose 1,0 Teile + 0,5 Agar 6,0 Teile + 0,3 Bromkresol violett 0,2 Teile + 0,001 Wasser 1000 Teile + 0 und das dritte Substrat (c) Pepton 20,0 Teile + 1,0 Prozent Hefeextrakt 3,0 Teile + 2,0 L-Ornithin 5,0 Teile + 1,0 Tryptophan 5,0 Teile + 1,0 Dextrose 1,0 Teile + 0,5 Agar 15,0 Teile + 0,5 Bromkresol violett 0,02 Teile + 0,001 Wasser 1000 Teile + 0 enthält.

L e e r s e i t e