JPH012596A - エシェリヒア・コリーの計数方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、試験検体中のエシェリヒア・コリー［Ｅｓｅ
ｈ＠ｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｔ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）］　ｆ
定性的にも定量的にも測定する方法に関する。

〔発明の背景〕

伝染病を引き起こす生物体は、ヒトや動物の排泄物そし
て下水又は糞便廃物で汚染された水に非常に高い細胞濃
蜜で存在し、ヒトの健康にとって重大な脅威を与え得る
。

現在、水の衛生的品質を試験するために利用できる糧々
の方法がある。これらの方法は、ヒト及び動物の排泄物
中に高いレベルで自然に存在するが、汚染されていない
か又は飲料用として供給される水の中では見い出せない
指標細菌を監視することを含む。

下水の、上記Ｒ―の存在？測定するための現存するほと
んどの試験の主たる欠点は、それらが糞便由来の指標細
菌を位置付けすることについて特異的でなく、温血動物
の腸内に由来するとは限らない、またそれらが必ずしも
ヒトに由来しない他の菌株をもまた検出することである
。

水の衛生的品質を測定するための細菌検出試験は、総大
腸菌測定法と糞便大腸菌測定法の２つが普通に用いられ
る。しかしながら、仁れらの試験は排泄物に由来しなか
ったであろう一群の細菌に対して陽性に反応を示す。該
総大腸菌群には糞便物には一般に見い出せないある菌株
、例えば土壌中や草木上に見い出すことができ、そして
排泄物中で分離されるのは稀で、その場合は非常に少量
であるクレプシーラ（Ｋｌｅｂｓｌｅｌｌｍ）、エンテ
ロバクタ−（Ｅｎｔ＠ｒｏｂａｃｔｓｒ）、シトＩ’　
バクター　（Ｃｉｔｒｏ−ｂａｃｔｅｒ）属が含まれる
。細菌エシェリヒア・コリーを主に含んでなり、そして
排泄物中に見い出される糞便大腸菌を主なものとする上
記糞便大腸菌群は、非常に少量のクレプシ−２やエンテ
ロバクタ−を含んでいる。そのため、糞便大腸ｍ類の存
在を示す試験結果は、糞便汚染を示したり示さなかりた
りし、そして追跡調査のみが該試験結果を確認する正確
な方法である。

〔発明が解決しようとするｖＡ題〕

税チ旧・コリー（シ皿）の特異的な測定に基づく試験サ
ンプル中の糞便排出物の存在を確認する利用しうる試験
方法がある。Ｅ、コリーハヒト及び動物の腸内に共通に
、そして自然に棲息し、そして排泄物のダラム当たり１
０７〜１０８の範囲内の粗胞濃度で存在する。これらの
試験方法は、蛍光性及び発色性化学薬品、すなわち、７
−ヒドロキシ−４−メｆルクマリンー７−β−旦−グル
クロニド及ＣＦｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−１”ルク
ロニドの使用を含む。これらの化学楽品は、Ｅ、コ１７
−に高度に選択的であるが試験検体中に存在するＥ。

コリーｔを円滑に計数又は定量するための結果を招来し
ない。特に、他方ＭＵＧとしても知られる前者の化学蛍
光剤は、それゆえに分析のために蛍光光線の使用を必要
とする。この蛍光光線は膜透過試験中に干渉を受ける場
合があり、そして正確さに乏しい計数の原因となシ得る
。ま７ｔｊ　ＰＮＧとして知られる後者の化学薬品は、
バクテリアが増殖する間に生ずる色がそのコロニー中に
悄まらないで、むしろ試験検体全部に広がるために個々
のコロニーを数え、ることが不可能であり、明確なＥ、
コリーの計数のためにはやはり適していない。

〔課題解決の次めの手段〕

本発明は、ε、コリーのβ−グルクロニダーゼ（β−Ｐ
−グルクロナイドグルクロノヒドロラーゼ、　ＩＣ３，
２，１，３１又はβ−Ｄ−グルクロノシドグルクロノソ
ヒドロラーゼ）活性にさらし友場合、試験検体中に存在
するＥ、コリー細胞に由来するすべての個々のコロニー
を代表するものとしての明瞭に特定された着色管生せし
める発色剤と該検体の相互作用を用いる該試験検体中の
Ｅ、コリーの計数を可能にし、そしてその存在を測定す
る方法を提供する。

本発明の上記発色剤は次式： ％式％ （式中、Ｘ％Ｙ及び２は同一であるか又は相異なり、そ
して水素、ハロゲン、トリハロダン化アルケン、トリハ
ロ、メチル、ニトロ、１和４Ｌ＜＃：Ｃ不飽和アルキル
、及びアリールから成る群から選択される基１−！ｉ！
わす、） で示される試楽群：並びにそれらのアルカリ金属、低級
アルキルアンモニウム及び低級アリールアンモニウム塩
を包含する、それらの塩類から選択される。

本発明の好ましい態様についての詳細な説明本発明のｗ
Ｉ様によれば、上記方法はオンタリオの環境省の環境サ
ンプルの分析法ハンドブック（Ｈａｎｄ　Ｂｏｏｋ　ｏ
ｆ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　ｏｆＥｎ
ｖｌｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓａｍｐｌ＠ｓ＊　１２月、
１９８３）に記載されているような標準膜濾過分析（ｓ
ｔａｎｄａｒｄｍｅｍｂｒａｎ＠ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
　ａｎａｌｙｌｌ）を使用して実施される。このＭ濾過
法において、上記発色剤１１、Ｅ・コリーの存在に由来
するβ−グルクロニダーゼ活性にさらされるなら、試験
検体中のＥ、コリー細胞から生長し九個々のコロニーに
対応して濾過膜上に明瞭に特定された発色を生せしめる
。

これらの着色したコロニーは、該試験検体のＥ。

コリー汚染の種変を検出するために容品に計数しうるも
のである。

本発明の上記発色剤の好ましい態様は、β−グルクロニ
ダーゼと相互作用した場合、個々のＥ。

コリーのコロニーのはっきりと明瞭に縁どられ几インジ
ゴブルー発色を生じるインドキシル−β−Ｄ−グルクロ
ニド又はそれらの塩を含んでなる。

該発色剤はＥ、コリー以外の糞便細菌中に存在しないβ
−グルクロニダーゼ活性に対してのみ応答するため、本
発明はＥ、コリーに高い選択性を有する。Ｅ、コリ一種
のグループ中では、はんの稀な例外はあるが、その圧倒
的多数のものがグルクロニダーゼを産生している。

本発明の好ましい態様においては、インドキシル−β−
Ｄ−グルクロニドもしくはその化学的に均等な塩類又は
その他の類縁物を適当な栄養培地中の培養検体と、Ｅ、
コリーについて試験するための栄養培地のリットル当た
り０．３〜０．８グラムの発色剤の比率で相互作用せし
める。もしＥ、コリーが存在するならば、それによって
産生した上記酵素β−グルクロニダーゼが上記グルクロ
ニド成分からインドキシル部を開裂し、それによってア
グリコン３−ヒドロキシインドール又はその化学的均等
物が生じる。上記の試験が濾過膜上で行われた場合、青
色インジゴ色素を形成する該アグリコンが酸化して該巳
、コリー細胞に由来する個々のコロニーを容易に計数で
きるようにきわだたせる。

即ち、もっとも好適な発色剤は、前記構造式中のＸ、Ｙ
及び２が水素を表わす場合に示されるインドキシル−β
−旦旦夕クルクロニドはそのナトリウム塩であり、従っ
て構造式： ％式％ 反応スキームの詳細表説明 本発明の上記発色剤の製造方法は、サール・ウォルフ（
８ａｕｌ−Ｗｏｌｆ・）及びレイそンド・がウワー（Ｒ
ａｙｍｏｎｄ　Ｂｏｗｅｒｓ）博士（Ｑｕｅｅｎ’ｓ　
Ｕｎｉｖｅｒｓｌｔｙｉｎ　ＫｌｎｇｓｔｏｎａＯｎｔ
ａｒｌｏ、Ｃａｎａｄａ）により開発された。本発明の
該発色剤の製造のための公知の出発原料を使用する上記
方法に準する代表的反応スキームはチャートｌに示す通
りである。

以下余白 上記反応スキームに関して、アントラニル酸から既知の
方法で調製されたアントラニル酸メチル（式■）をクロ
ロ酢酸メチルエステルと反応させ弐■の化合物を得る。

弐■の化合物を金属ナトリウムに接触させ式■の２−カ
ルがキシメチルインドールを得る。

グルクロン酸ま之ハグルクロノラクトンから既知の方法
で調製した式Ｖ（式中、Ｒはメチルを表わす）のメチル
（２，３，４−トリー〇−アセチルーβ−旦−グルコビ
ラノシルプロミド〕ウロネートと式■の２−カルがキシ
メチルインドールトラ、水酸化アルカリ金属、好ましく
は水酸化カリウム、そして相間移動触媒、例えばテトラ
−ｎ−ブチルアンモニウム硫酸水素塩を含有する水及び
塩化メチレン中で反応させメチル〔（２−カルボキシメ
チルインドール−３−イル）　−２，３，４−トリー〇
−アセチルーβ−旦−グルコビラノシド〕ウロネート（
式■）を得る。

水及びメタノール中で５モル当量のＮａＯＨにより弐■
の化合物を反応せしめジナトリウム〔（２−カルがキシ
インドール−３−イル−β−旦一りゞルフビラノシド〕
ウロネート（式■）を得る。

別の方法として、式Ｖｉａのメチル〔（２−カルがキシ
メチルインドール−３−イル）−β−旦−グルコピラノ
シド〕ウロネートヲ生産するために、式■の化合物をメ
トキシバリウムと反応せしめることもでき、その故、該
弐Ｍａの化合物を１当甘のＮａＯＨと反応させ、式Ｍｂ
のナトリウム〔（２−カルボキシメチルインドール−３
−イル）−β−旦−グルコピラノシド〕ウロネートを得
、そしてさらにその後代■ｂの化合物となおその上に１
当量のＮａＯＨ’ｉ反応させ式■の上記化合物を調製す
る。

次に、式■の該化合物′ｆ２００−２５０℃にて、水中
で加熱してインドール−３−イルーβ−Ｄ−グルクロン
酸ナトリウム塩（又はインドキシル−β−ｐ−グルクロ
ニド）（式［ａ）を得る。また。

別の方法としては、式■の化合物を無水酢酸と酢酸ナト
リウムによりＣ（Ｎ−アセチルインドール−３−イル）
　−２，４−ジーＯ−アセチルーβ−Ｐ−グルコピラノ
シド〕ウロネートー３．６−ラクトン（式■ａ）を生成
し、その嵌木又はメタノール中、４当量のＮａＯＨと反
応させ、次いで蒸発によ〕脱保護し、そして凍結乾燥す
ることによシ式１ｍの上記化合物を得ることもできる。

上記の詳細な反応スキームは、本発明の上記発色剤の調
製法について利用し得る１つの一般的な反応スキームの
みを表わすために示すものであることが当業者によって
理解されるであろう。上記反応スキームによりて得られ
る最終生成物はインドキシル−β−旦−グルクロン酸の
ナトリウム塩であり得るが、当業者は、困Ｊｋｌ伴うこ
となく本発明によシ描かれた試薬の範噴の構成員を調製
するために、保護基、反応条件、出発原料そして中間体
を変更することを包含する該反応スキームを適当に置き
換えることができるだろう。

また、本発明の発色剤の範喚に属する構成員は開示され
ていて、そして商業的に入手可能であり、そしてさらに
この点で該範晴それ自体についていかなる主張もなし得
ない。

例えば、５−プロモー４−クロロインドキシル−β−Ｄ
−グルクロニド（ま九５−プロそ−４−クロロ−インド
ール−３−イルーβ−ｎ−グルコビルロニシドとして知
られている）は、１９６７年にビアーソン（Ｐ・ａｒｓ
ｏｎ）等により開示され、彼れらは該化合物のジシクロ
ヘキサンアミド塩がへルマンデラウト（Ｈ＠ｒｍａｎ　
Ｐｌａｕｔ）博士やシクロケミカルコーポレーション（
Ｃｙｃｌｏ　ＣｈｅｍｌｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
）　＊　１９２２　Ｅ、　６４　ｔｈ　５ｔｒｅｅｔ。

Ｌｏｓ　Ａｎｇ＠１ｓｓｓＣａ１１ｆｏｒｎｉａ＊Ｕ、
Ｓ、Ａ、＊９０００１の職員によって公表されている〔
ピアーソン等″５−プロモー４−クロロインドール−３
−イルーβ−Ｄ−グルコピルロニシドにより測定された
喘乳動物組織内の組織化学的なβ−グルクロニダーゼ分
布１研究所研究報告（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅ
ｓｔｉ−ｇａｔｉｏｎ）Ｖｏｌ、　１７　、Ａ２　、２
１７　、１９６７　。

参照〕。もつとも最近、５−プロモー４−クロロインド
ール−３−イル−β−ｐ−グルクロニドがゾェファーソ
ン（Ｊｅｆｆｓｒｓｏｎ）等によって公表され（’遺伝
子融合マーカーとしてのエシェヒリア・コリー由来のβ
−ダルクロニダーゼＰｒｏ、ＮａｔｌＡｃａｄ−８ｃｌ
−Ｕ−８−Ａ−−８３ｓ　８４４７−８４５１頁。

１１月１９８６年）、そして今やリサーチオルガニツク
ス社（Ｒｅｓ＠ａｒｃｈ　Ｏｒｇａｎ％Ｃｓ　Ｉｎｃ−
ｓ）、４３５３　Ｅａｓｔ　４９ｔｈ　５ｔｒｅｅｔ＊
Ｃ１ａｖｅｌａｎｄｅＯｈｉｏｓＵ、Ｓ、Ａ、、４４１
２５−１０８３からそれらのシクロヘキシルアンそニウ
ム塩の形（カタログ１６１１７７Ｂ　）で商業的に入手
可能である。

本発明の発色剤の範晴に帰属する種々の化学名は完全に
交換しうるものであることが指摘されることである。す
なわち、インドキシル−β−旦−グルクロニドはインド
キシル−β−旦−グルクロン酸ソしてインドール−３−
イルーβ−旦−グルクロン酸と交換可能であり、同様に
そのいくぶん旧式の学名β−旦−グルコピルロニシドａ
一般ｔｔｃβ−ルーグルクロニド又はβ−ｐ−グルクロ
ン酸のほうを選んで記載した。

実験例　１ このミクロタイター試験はＥ、コリーに対するインドキ
シルβ−Ｄ−グルクロニド（Ｉ　ＢＧＵ　）の特異性を
示すために行われた。

２５０ｄの基礎（ＢＡＳＡＬ）寒天生育培地を次の１／
ｌ成分で調裏したニ ブロチオース鴫ぺ１トンφ３５□Ｏｇ。

イースト・エキストラクト　　３．０．９゜グリセロー
ル　　　　　　　１０．ＯＩＩ。

Ｎａｃｌ　　　　　　　　　　　　７．５　ｇ−に２Ｈ
ＰＯ４３，３ｇ。

Ｋ）Ｉ２ＰＯ４１，０，９゜ ラウリルスルホン酸ナトリウム　　　０．２，９゜脱オ
キシコラン酸ナトリウム　　　　０．１１゜寒　　　天
　　　　　　　　　　　　　１５．０．９’−蒸　　溜
　Ｉ２０　　　　　　１０００−の容量に対して、 次いで、該ＢＡＳＡＬ寒天生育培地を１２１℃、１５　
ｐ、ｓ、ｉ”ｔ’１５分間蒸気ｆｉｌｌし友。

その後、上記の合計２５０ｄから各々２５ｍ１の４パツ
チを得ｔ、第１のパッチに０．０１５０．９のインドキ
シル−β−Ｐ−グルクロニド（Ｉ　ＢＧＵ　）のナトリ
ウム塩を添加した。第２のパッチに０．００９７１のｐ
−ニトロフェニル−β−Ｄ　−／　ｋ　ｐ　ｅｌニド（
ＰＮＧ　）を添加した。第３のパッチに０．００７９．
９のインドキシル−β−旦ルールコシド（ＥＮＤＩＣＡ
Ｍ）を添加した。第４のパッチは処理しないで残こした
。

上記の各２５ｍ／のパッチを各々２ｄの５つのサンプル
に分は取り合計２０個のサンプルに割り当てた。次に、
各パッチ由来の４個のサンプルに以下に示すような４種
の細菌菌株ｔ−接極した。ネガティブ（対照）サンプル
は植菌しなかった。本試験についての培養時間は４５℃
にて１６±１時間であった。

このミクロタネター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）特異性試
験の結果を次の表１に示す。

以下全白 ＋１Ｊ　ｇリー ■　　ｃＱ　　ｚｚ 埋　　国　　−−− Ｅ、コリーの存在を測定する忙ついて、上記ＰＮＧ及び
ＩＮＤＩＣＡＮはそれぞれ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）対
照及び陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）対照を提供した。なと
、上記表中陰性←）印を表わす場合はいつも、これがい
かなる色の変化もないことを示し、陽性（＋）印はＩ　
ＮＤ　Ｉ　ＣＡＮとＩ　ＢＧＵの場合には青色を、そし
てＰＮＧにあっては黄色を示す。ＡＴＣＣ細菌菌株はア
メリカンタイプカルチ＊　−（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ
ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ１１＠ｃｔ１ｏｎ、Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、８．Ａ）由来のも
のであシ；Ｅ、コリー８３−１７３５０はオンタリオ環
境省、キングストン地域研究所（ＫｉｎｇｓｔｏｎＲｅ
ｇｉｏｎａｌ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｓＫｌｎｇｓｔｏ
ｎｓＯｎｔａｒｉｏｓＣａｎａｄａ）からの分離菌株で
あり；クレプシーラ・二、ウモニｘ　（Ｋｌｅｂａｌ＠
ｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）　ＰＨＬはオンタリオ保
健省、キングストン地域研究所（ＫｉｎｇａｔｏｎｅＯ
ｎｔａｒｌｏ）から分譲された。

上記の表１は、Ｉ　ＢＧＵが陽性の対照（ｐｏｓｔ　ｔ
ｌｖｅａｏｎｔｒｏｌ）　ＰＮＧについて観察されたも
のＶｃ類似する態様で反応すること、及び前記Ｉ　ＢＧ
ｔＪは上記ｗ＃累β−グルクロ辱ダーゼ産生能を具備し
ない上記クレプシーラ菌株のいずれにもいかなる活性を
も持たないことを示す。この結果は、ＩＢＧＵを寒天生
育培地に共存させた場合に、試験検体中のＥ、コリーの
定性的な分析に使用し得ることを示している。

実験例　２ 本実験は、適当な一過膜の表面上で上記細菌を培養した
場合のＥ、コリーに対するインドキシル−β−Ｄ−グル
クロニドの特異性を示すために実施された。

この実施の九めに、本実験はオンタリオ環境省の１環境
のサンプル分析方法のハンドブック”１２月１９８３年
に記載されているところの飲料水の微生物分析のために
使Ｊ＋３ｔｌ−推奨されている格子模様を有する濾過膜
を用いて実施した。

実験例１と同様に調製したＩＢＧＵ（ナトリウム塩）、
ＰＮＧ、　ＩＮＤＩＣＡＮ及びＢＡＳＡＬ寒天生育培地
の４棟のパッチの各々から各２１！Ｌｔの２つのサンプ
ルを得、そして８伽のベトリ皿に注入して合計８個のサ
ンプルを用意した。次に、細菌を接種する前に各ペトリ
皿中の上記寒天培地の表面に単一濾過ｋ（ｆルマン、格
子状ＧＮ−６、Ｏ，４５ｔクロン）を乗せた。

その後、実験例１で用いたのと同じ菌株を双方とも存在
させるため各々の一過膜の上半分にε。

コリーＡＴＣＣ３５２１８を、そしてこれらの同じ濾過
膜の各々の下半分にタレプシーラ・二、つそ二工ＡＴＣ
Ｃ１３８８３をヨウジで移植することによシ４つの濾過
膜の第１グループに接種した。矢に、すぐ前に記載した
方法によシ、実験例１で用いた同じＥ、コリー８３−１
７３５０を各々の一過膜の上半分忙、そしてタレプシー
ラ・ニュウモニ！　ＰＨＬをこれらの同じ４つの濾過膜
の半分に接種して第２グループの４つの一過膜を調製し
た。すなわち、８個のベトリ皿中の処理された生育培地
上で培養するために合計８個の一過膜に細菌を接種した
。

その後、上記ペトリ皿の各々を４５℃で約１４時間培養
した。

培養後、Ｉ　ＢＧＵ生育培地上忙置装た上記濾過膜の上
半分（即ち、Ｅ、コリーを接種した半分）上に一連の個
別のそして容易に識別できるインジゴブルーのコロニー
が現われた。これらの同じ２つの濾過膜の各々の下半分
上に一連の澄明なコロニーが現われた。対照の上記ＩＮ
ＤＩＣＡＮ培地上に置いた２つのｐ過ＪＩＱにおいては
、その下半分（即ち、タレプシー２・二、−モニエを接
種した半分）上に一連のブルードツト（コロニー）が机
われタカ、−方、それらの各一過膜の上半分には一連の
澄明なコロニーが出祝するという逆の状態を示した。上
記濾過族の上半分と下半分に接種されたＥ、コリー及び
り、レプシーラ菌株は、上記ＢＡＳＡＬ培地上における
培養後、無色のコロニーを生じさせ次。上記ＰＮＧ培地
においては、ＰＮＧの加水分解の結果としてＵ濾過膜の
表面の下方に少量の黄色のＥ、コリーコロニーが生じた
。しかし、黄色の個々のＥ、コリーコロニーは黄色のパ
ックグランドから容易Ｋｆｉ別できなかった。

とれらの実績結果は、ＩＢＧＵの存在下においてＥ。

コリーのポジティブな検出を示すばかシでなく、またＥ
、コリー細胞から生じ、濾過膜上に付着され、そしてＩ
　ＢＧＵの存在下での培養されたコロニーは、同一条件
で及び同一の濾過股上で増殖し次タレプシーツ・二、ウ
モニエの細菌コロニーから容易に識別することができる
ことを示している。

実験例　３ １　ＢＧＵのナトリウム塩を含有する実験例１と同様に
調製されたＢＡＳＡＬ寒天生育培地に予めのせられた濾
過膜に、木裏の塗布ステックを用いて、１２種の純粋な
分離株又はコロニー培養物（Ｏｎｔａｒｌ。

Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｖｌｒｏｎｍｅｎｔ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＳ＠ｒｖｉｃｅｓ　Ｂｒａｎｃｈ　
ｌｎ　Ｒｅｘｄａｌ＠会０ｎｔａｒｉｏ＊Ｃａｎａｄａ
から得た）を移植した。次いで、この培養培地を約１８
時間３５℃の温度で培養した後。

次の我２に示したように核分離株又は培養物の各各の色
が評価された。

以下全白 表　　　　２ 分離株　　　　　　色 １、エシェリヒア中コリー　　　　　　　　力−コエト
Ｑζ旦加υ１剣■ξニリ１）（ストック　す３）２、ク
レプシーラ・ニュウモニエ　　　　　　　　　クリーム
コロニー（Ｋｌａｂｓｉ＠ｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎＩａ
ｅ）（ストック　φ７）３、サルモネラ・チビムリーム
　　　　　　　クリームコロニー（セ」ユ、ユリ、１ａ
ｙｌｖリユ＝乙ハ＝す（ストックナ４）４、ストレプト
コッカス・ファカリス　　　　　　増殖せず（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｅｅａｌｉｓ）（ストック
φ１０）５、スタフィロコッカス・アウレウス　　　　
　　　クリームコロニー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ａｕｒａｕａ）（ストック　す５）６、シ、つｖモ
ナス・エルギノーザ　　　　クリームコロニー（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ＠ｒｕｇｉｎｏｓａ）（ストック
　φ２１） ７、バチルス　　　　　　　　　　　　　　増殖せず（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）２．（ストック　φ２２）８、アク
チノ／ｖＰ−―力喫ス　　　　　　　　クリームコロニ
ー（Ａｃｉｎａｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔ
ｉｃｕｓ）（ストック　φ６４） ９、バチルス　　　　　　　　　　　　　　増殖せず（
Ｂａｅｉｌｌｕｓ）上り、（ストック　φ１２５）１０
、アエロモナス・ヒドロフィーラ　　　　クリームコロ
ニー（八〇よ、ユユユユユよχ旦しジｌす」μ］（スト
ックφ３９）１１、エンテロバクタ−・クロアカニ　　
　　クリームコロニー（Ｅｎｔ＠ｒｏｂａｃｔａｒ　ｃ
ｌｏａｅａｅ）（０６４０−Ｃ）１２、エシェヒリア・
コリー　　　　　　　ブルーハローで（Ｅａｅｈ＠ｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｉｌ）（ＭＵＧ上で弱ハ蛍光　囲まれた
クリ−を示す）　　　　ムコロニー この結果は、　ＩＢＧＵ存在下でＥ、コリーのみがブル
ーコロニーを生ずる微生物であることを示している。す
なわち、これらの結果は、Ｉ　ＢＧＵの存在下で３５℃
にて寒天生育培地の濾過膜上で上記微生物を培養した場
合は、Ｅ、コリーに対するＩＢＧＵの高度の特異性及び
選択性の両方を示す。

実験例　４ 強いグルクロニダーゼ活性、弱いグルクロニダーゼ活性
そしてクレプシーラ・二、ウモニエの分離株と同様にグ
ルクロニダーゼ活性を示さない菌株を含んでなる３種の
分離Ｅ・コリーを試験した。

上記の細菌分離株の適当な希釈液ｆ濾過膜を通して濾過
することにより、そＯＦｉ膜に全ての分離株を殖菌し、
次にＩＢＧＵナトリウム塩で処理したＢＡＳＡＬ寒天生
育寒天生育状地上膜を移し友。その後。

その培地上の濾過膜’ｊ−４４，５℃にて１８〜２０時
間インキ、ベートした。強い活性と物いグルクロ二／−
４を活性（Ｄ　Ｅ、コＩＪ−菌株はブルーのコロニーを
生じるが、一方、非グルクロニダーゼ活性のＥ。

コリー菌株（対照番号０１５７：　Ｈ７＊　０ｎｔａｒ
ｉ。

Ｍｉｎｌｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）は少しも増殖
を示さなかり友。

タレプシーラ・二、−モニエは上記し次項地上で微黄色
のコロニーを生じ友。そのため青色のＥ・コリーのコロ
ニーカラクレプシーラ・ニューギニエのコロニーは容易
に視覚的に識別することができた。

実験例　５ ８つの異る海水浴用の浜辺のサンプルから分離した１０
種の環境汚染Ｅ、コリーを試験した。その純粋培養物を
ＩＢＧＵナトリウム塩を備えるＢＡＳＡＬ、寒天生育培
地上に予め置かれた濾過膜上にスポット接種し、次いで
４４．５℃で１８時間培養した。全てのサンプルから分
離され７ｔＥ、コリーが格子模様′ｔ−有する濾過膜上
で容易に数え得る別々の青色コロニーの形状で簡単に識
別でき友。

実験例　６ 環境汚染サンプルから回収され、そしてＩ　ＢＧＵを含
有する寒天生育培地上で青色又は無色のコロニーとして
増殖した細菌の属及び８Ｉを同定することにより、ＩＢ
ＧＵｆ：使用するＥ、コリーについての試験の有効性を
確認するために、次の膜濾過試験を実施した。

下記の表３及び４に示すように、Ｉ　ＢＧＵのナトリウ
ム塩で処理したＢＡＳＡＬ寒天生育寒天生育製地上た濾
過膜を使用して、多数の異る“盲検（ｂｌｉｎｄ）”サ
ンプルを分析した。培養に伴い、該多数の異なるサンプ
ルの分析のために使用した上記側々の濾過膜上に青色、
で同時に明瞭なコロニーが決われた。

表３はＡ欄中に、６１個の青色コロニーが出現したこと
を示す。次に、どれ程多くのものが実際にＥ、コリーで
あるか、又は少なくともＥ、コリーを含有するものであ
るかを確認するために、これらの個々のコロニーを、テ
ストストリップ法（ｔｅｓｔｓｔｒｉｐ　ｍｅｔｈｏｄ
）でＡＰＩ　２０　Ｔ２　（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＰｒ
ｏｆｉｌｅ　ＩｎｄｅｘｓＡｎａｌｙｔａｂ　Ｐｒｏｄ
ｕｃｔａ、Ｄｌｖｉｓｉｏｎｏｆ　Ａｙ＠ｒａｔ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｓｓｅ２００　ＥｘｐｒｅｓｓＳｔｒ
ｅｅｔｓＰｌａｌｎｖｉｅｖｒ、Ｎ＠ｖ　Ｙｏｒｋ−１
１８０３ｓＵ−８−Ａ−）を用いて再試験した。その再
試験の結果を表３０Ｂ欄に示した。

表４のＡ＠ＩＫは、上記多数の試験サンプル中に見い出
されたパックグランド又はクリームコロニーの数を示し
念。その故、これらのクリームコロニーは、それらのコ
ロニーの任意のものが巳、コリーを含んでいるかを確認
するために上記の標準ＡＰＩ裸試験法を用いて再試験し
た。再試験の結果を表４のＢ欄に示し几。

以下余白 上記表３において理解されるように、試験され次全６１
個の青色コロニーから６０個がＥ、コリーとして確認さ
れ、精度は９８．４％を示す。表４は、クリームコロニ
ーとして発現する２８Ｎのコロニーの内３個が実際にＥ
、コリーを含んでいたことが確かめられ友。該コロニー
に含まれるこれらの３つのＥ、コリーを、次にＩＢＧＵ
のナトリウム塩を用いて再試験した。そのとき、該クリ
ームコロニーのサンプル１６９４から１個の青色コロ−
を生じ友。

Ｉ　ＢＧＵ試験試験上地上試験し比場合、２個のＨＲク
リームサンプルを除いたものがクリーム色を生産するこ
とを継続し友。

上記全体にわたる試験の結果は、実際に存在する合計６
３個のε、コリーコロニーの内正解率が９５．２％に当
たるこれらの６０個が所期の目的とする反応を生じるこ
とを示している。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試験検体中のエシェリヒア・コリー（￥Ｅｓｃｈｅ
   ｒｉｃｈｉａ￥　￥ｃｏｌｉ￥）の存在及び数を測定す
   る方法であって、該検体と、エシェリヒア・コリー（￥
   Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）のグルクロニダーゼ酵素活性にさ
   らした場合に該試験検体中に存在するＥ．コリー細胞に
   由来する個々のコロニーを代表するものとしての明瞭な
   着色をもたらす発色剤とも相互作用せしめることを特徴
   とする方法。 ２、上記発色剤がインドキシル部分とβ−￥Ｄ￥−グル
   クロニド部分を有することを特徴とする請求項１記載の
   方法。 ３、試験検体中のＥ．コリーの存在を決定しそして数を
   測定する方法であって、検体と、インドキシル−β−￥
   Ｄ￥−グルクロニド又はその塩を含んで成り、これによ
   って、該発色剤がグルクロニダーゼ酵素活性にさらされ
   た場合に、前記試験検体に由来するＥ．コリー細胞の個
   々のコロニーを代表するものとしての明瞭なインジゴブ
   ルーの着色を生じることを特徴とする方法。 ４、液体サンプル中のＥ．コリーの存在を決定し、そし
   て数を測定する膜ろ過去であって、Ｅ．コリー栄養培地
   に発色剤インドキシル−β−Ｄ−グルクロニド又はそれ
   らの塩を添加し、ろ過膜を通して予め決定した量の該液
   体サンプルを通過せしめ、上記発色剤を含有する該培地
   にそのろ過膜を導入し、そしてこれをインキュベートす
   ることにより該発色剤をグルクロニダーゼ酵素活性にさ
   らし、該ろ過膜上に存在するすべてのＥ．コリー細胞の
   個個のコロニーを代表するものとしての明瞭な着色を生
   ぜしめることを含んでなる方法。 ５、上記ろ過膜を約３５℃〜４５℃にて約１４〜２４時
   間にわたりインキュベートすることを特徴とする請求項
   ４記載の方法。 ６、上記ろ過膜が該個々のＥ．コリーコロニーの計数を
   容易にするための格子パターンを備えることを特徴とす
   る請求項５記載の方法。 ７、栄養培地のリットル当たり約０．３〜０．８グラム
   の発色剤を添加することを特徴とする請求項４記載の方
   法。 ８、試験検体中のＥ．コリーの存在を決定しそして数の
   測定方法に使用するための発色剤であって、該発色剤が
   式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｘ、Ｙ及びＺは同一又は相異り、そして水素、
   ハロゲン、トリハロゲン化アルケン、トリハロメチル、
   ニトロ、飽和又は不飽和アルキル及びアリールから成る
   群から選択されるいずれか１のものを表わす。） で示される化合物群並びにそれらの塩から選択される発
   色剤。 ９、上記塩がアルカリ金属、低級アルキルアンモニウム
   又は低級アリールアンモニウム塩である請求項８記載の
   発色剤。 １０、上記式（ I ）中のＸ、Ｙ及びＺがそれぞれ水素
   を表わす、即ちインドキシル−β−￥Ｄ￥−グルクロニ
   ド及びそれらの塩であることを特徴とする請求項８記載
   の発色剤。 １１、インドキシル−β−￥Ｄ￥−グルクロニドのナト
   リウム塩である請求項１０記載の発色剤。 １２、インドキシル−β−￥Ｄ￥−グルクロニドのシク
   ロヘキシルアンモニウム塩である請求項１０記載の発色
   剤。 １３、上記式（ I ）中のＸがクロルであり、Ｙがブロ
   ムであり、そしてＺが水素を表わす、５−ブロモ−４−
   クロロ−インドキシル−β−￥Ｄ￥−グルクロニド並び
   にそれらの塩であることを特徴とする請求項８記載の発
   色剤。 １４、５−ブロモ−４−クロロ−インドキシル−β−￥
   Ｄ￥−グルクロニドのナトリウム塩である請求項１３記
   載の発色剤。 １５、５−ブロモ−４−クロロ−インドキシル−β−￥
   Ｄ￥−グルクロニドのシクロヘキシルアンモニウム塩で
   ある請求項１３記載の発色剤。