DE2145018B2

DE2145018B2 - Verfahren zur herstellung bzw. gewinnung von prostansaeurederivaten

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Publication number: DE2145018B2
Application number: DE19712145018
Authority: DE
Priority date: 1970-09-11
Filing date: 1971-09-09
Publication date: 1976-02-26
Also published as: JPS4947514A; GB1324052A; NL7112402A; NL149790B; JPS4930092B1; NL7512585A; FR2106464B1; DE2145018A1; FR2106464A1

Description

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in der Ri und Ra Wasserstoffatome bedeuten oder in der Ri einen Methylrest und R2 ein Wasserstoffatom oder einen Acetylrest bedeutet, dadurch gekennzeichnet, Jaß man frisch gesammelte Kolonien oder Kolonienteile von marinen wirbellosen Plexaura homomalla (Esper) 1792, Form S, mit einem neutralen organischen Lösungsmittel, das zweckmäßig einen Siedepunkt von unter etwa 100⁰C hat, wie Kohlenwasserstoffen, halogenierten Kohlenwasserstoffen, niederen Alkanolen, Ketonen oder Estern, extrahiert, die gewünschte Verbindung in üblicher Weise, wie Einengen und Chromatographie, aus dem erhaltenen Extrakt abtrennt und gegebenenfalls reinigt, wobei man die Kolonien oder Kolonienteile vor der Extraktion gewünschtenfalls auf eine Tempe atur von mindestens +5°C abkühlt und/oder die Kolonien oder Kolonienteile vor der Extraktion gewünschtenfalls so lange mit Wasser bei einer Temperatur bis zu 50" C, zweckmäßig 20 bis 40° C, in Berührung bringt, bis im wesentlichen alle der ursprünglich in den Kolonien oder Kolonieteilen vorhandenen C-15-Acetate der Prostansäurederivate umgewandelt worden sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Methanol, Aceton, Dichlormethan, Äthylacetat oder einen Kohlenwasserstoff, wie Benzol, verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kolonien oder Kolonienteile mit einer solchen Menge Wasser in Berührung bringt, die mindestens mit dem Gewicht des Gehaltes der Kolonien oder Kolonienteile an trockenen Feststoffen entspricht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kolonien oder Kolonienteile innerhalb einer Stunde nach ihrer Entfernung von der Stätte ihres Wachstums auf eine Temperatur von unter - 20° C abkühlt und sie bis zur Weiterverarbeitung mindestens auf dieser Temperatur hält.

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bzw. Gewinnung von Prostansäurederivaten der allgemeinen Formel

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H OR₂
in der Ri und R2 Wasserstoffatome bedeuten oder in der Ri einen Methylrest und R2 ein Wasserstoffatom oder einen Acetylrest bedeutet, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man frisch gesammelte Kolonien oder Kolonienteile von marinen wirbellosen Plexaura homomaila (Esper) 1792, Form S, mit einem neutralen organischen Lösungsmittel, das zweckmäßig einen Siedepunkt von unter 100⁰C hat, wie Kohlenwasserstoffen, halogenierten Kohlenwasserstoffen, niederen Alkanolen, Ketonen oder Estern, extrahiert, die gewünschte Verbindung in üblicher Weise, wie Einengen und Chromatographie, aus dem erhaltenen Extrakt abtrennt und gegebenenfalls reinigt, wobei man die Kolonien oder Kolonienteile vor der Extraktion gewünschtenfalls auf eine Temperatur von mindestens +5⁰C abkühlt und/oder die Kolonien oder Kolonienteile vor der Extraktion gewünschtenfalls so lange mit Wasser bei einer Temperatur bis zu 50° C, zweckmäßig 20 bis 40⁰C, in Berührung bringt, bis im wesentlichen alle der ursprünglich in den Kolonien oder Kolonienteilen vorhandenen C-15-Acetate der Prostansäurederivate in C-15-Hydroxyprostansäurederivate umgewandelt worden sind.

Die Formel I umfaß*, die Prostansäurederivate, die als Prostaglandin A2 und dessen Ester bekannt sind, nämlich PGA2 (Ri und R2 bedeuten Wasserstoffatome), PGA2-Methylester (Ri ist eine Methylgruppe und R2 bedeutet ein Wasserstoffatom) und PGA2-Acetatmethylester (Ri ist eine Methylgruppe, und R2 ist eine Acetylgruppe). Diese Verbindungen sind bekannt und für pharmakologische Zwecke brauchbar (vergleiche z. B. GB-PS 10 97 533 und Pharmacol. Rev., B. 20, S. 1 [1968]). Diese Verbindungen sind auch brauchbar als Zwischenprodukte für die Herstellung anderer Prostansäurederivate mit pharmakologischen Anwendungsmöglichkeiten.

Aus Tetrahedon Letters, S. 5185 bis 5188 (1969) und H. W. Youngken, Jr. (Ed.) »Food-Drugs from the Sea«, Proc Marine Technology Society, S. 311 bis 314 (1969), ist die Gewinnung von 150-PGA2 und 15j3-PGA2-Acetatmethylester durch Extraktion aus Kolonien von Plexaura homomalla (Esper) 1792, Form R, bekannt. Dabei wurde berichtet, daß 150-PGA2 und 150-PGA2-Acetatmethylester in der luftgetrockneten Kortex von Plexaura homomalla in einer Menge von 0,2% bzw. 1,3% anwesend sind.

Während nach diesen bekannten Verfahren die Form »R« von Plexaura homomalla (Esper) 1792 extrahiert und dabei 150-PGA2 und 150-PGA2-Acetatmethylester erhalten wurden, bezieht sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die Form »S« von Plexaura homomalla (Esper) 1792, aus der andere Prostaglandin-Derivate, nämlich PGA2, PGA2-Methylester und PGA2-Acetatmethylester, gewonnen werden. Somit wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren eine neue natürliche Quelle für biologisch wirksame Prostaglandin-Derivate erschlossen.

Die beiden Formen von Plexaura homomalla gehören der Unterklasse Octocorallia, Ordnung Gorgonacea, Unterordnung Holaxonia, Familie Plexauridae, Art Plexaura an (vergleiche z. B. Bayer, »The Shallow Octocorallia of the West Indian Region«, Verlag Martinus Nijhoff, Den Haag [1961]). Kolonien dieser Plexaura homomalla-Formen finden sich sehr häufig auf den Meeresriffen in der Zone zwischen der Ebbelinie und einer Tiefe von etwa 45,7 m in den tropischen und subtropischen Regionen des westlichen Atlantiks von Bermuda bis zu den Riffen von Brasilien einschließlich der Riffe an der Ostküste von Florida, der karibischen Inseln und der Festlandriffe und der Insel- und

Festlandriffe im Golf \m Mexico. Diese Kolonien haben ein buschartiges oder bäumchenartiges Aussehen und lassen sich vom Sammler mit üblichen Kenntnissen auf diesem Gebiet leicht als Plexaura homomalla (Esper) 179.2 identifizieren. Ein Verfahren zur Unterscheidung der »S«-Form von der »R«-Form ist nachstehend beschrieben.

Die Kolonien der beiden Formen von Plexaura homomalla werden leicht in einen äußeren rindenartigen Kortex und einen inneren drahtigen proteinhaltigen ι ο Stamm oder ein Skelett getrennt Symbiotische Algen oder Zooxanthellae sind ebenfalls in den Kolonien anwesend.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Auswahl des Isolations- und Extraktionsverfahrens durch die gewünschte Verbindung vom PGA2-Typ (allgemeine Formel I) bestimmt Zur Erzielung maximaler Vorteile und einer maximalen Ausbeute an PGA2-Acetatmethylesier werden die frisch gesammelten Kolonien oder Kolonienteile der »S«-Form von Plexaura homomalla (Esper) 1792 vor der Extraktion gefroren. Wenn in erster Linie PGA2 gewünscht wird, werden die Kolonien oder Kolonienteile der »S«-Form in Berührung mit Wasser gehalten, bis sie frei von C-15-Acetat sind, wobei sie vor oder nach der Berührung mit dem Wasser gewünschtenfalls gefroren werden. Vor dem Extrahieren des Produkts der allgemeinen Formel 1 werden die frisch gesammelten Kolonien oder Kolonienteile mit Vorteil vor der Extraktion zu kleineren Stücken, vorzugsweise mit einem Gewicht von weniger als 2 g, zerbrochen oder zerhackt. Für einige Extraktionssysteme ist es vorteilhaft, die Kolonienteile so zu zerteilen, daß eine Vergrößerung der Oberfläche auf das 10Ofache bis lOOOOOfache der Oberfläche eines gleichen Gewichts der Kolonien erhalten wird.

Die Kolonien oder Kolonienteile können aber auch ais Alternative vor der Extraktion an der Luft getrocknet werden. Wenn dies geschieht, ist es vorteilhaft, den dicken rindenartigen Kortex von dem drahtartigen proteinhaltigen Skelett zu trennen und den Kortex dann vor der Extraktion zu pulverisieren. Der größte Teil der Verbindungen der allgemeinen Formel 1 befindet sich im Kortex.

Die Lösungsmittel für die Extraktion sind beliebige üblicherweise für Extraktionszwecke verwendete neutrale organische Flüssigkeiten, z. B. Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe, niedere Alkanole, Ketone und Ester. Das Lösungsmittel hat vorzugsweise einen Siedepunkt von weniger als etwa 100⁰C. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel sind Benzol, Dichlormethan, Methanol, Äthanol, Aceton und Äthylacetat.

Die Abtrennung von Produkten der allgemeinen Formel I aus dem Extrakt erfolgt nach an sich bekannten Verfahren, z. B. durch Flüssig-Flüssig-Extraktion oder Silikagelchromatographie.

Neben den Verbindungen der allgemeinen Formel I fallen kleine Mengen der 5,6-trans-Verbindungen von PG/\2 sowie ihrer Methylester und Acetatmethylester an, die mit den entsprechenden Verbindungen vom PGA2-Typ extrahiert werden und diese bei vielen ihrer Umwandlungen begleiten.

Wenn es für pharmakologische Zwecke erwünscht ist, die Hauptprodukte der Erfindung frei von 5,6-trans-Verbindungen herzustellen, werden diese 5,6-trans-Verbindungen entweder aus dem Ausgangsmaterial oder aber den Reaktionsprodukten abgetrennt. In beiden Fällen stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung.

Ein Verfahren wird mit Hilfe eines mit Silber gesättigten Ionenaustauschharzes (siehe z. B. j. Am. Oil Chemists' Soc, Bd. 41, S. 388 [1964]) durchgeführt, wie es nachstehend beschrieben ist Das andere Verfahren besteht darin, daß man vorzugsweise ein Mercuriacetat-Addukt der 5,6-cis-Verbindung bildet, welches in den nachstehend erläuterten Lösungsmitteln extrahierbar ist Dementsprechend erfolgt die Entfernung von S.ö-trans-PGAz-Acetatmethylester aus PGA2-Acetatmethylester mit Vorteil nach dem an letzter Stelle beschriebenen Verfahren.

Zur Erzielung maximaler Ausbeuten an PGA2-Acetatmethylester werden die Kolonien oder Kolonienteile von Plexaura homomalla (Esper) 1792, Form S, innerhalb etwa einer Stunde nach Entfernung der Kolonien von der Stelle ihres Wachstums auf eine Temperatur von +5⁰C oder darunter gekühlt und anschließend auf einer Temperatur von höchstens + 5⁰C bis zu dem Zeitpunkt gehalten, bei dem sie mit einer neutralen organischen Flüssigkeit extrahiert werden.

Wenn die Kolonien oder Kolonienteile auf diese Weise behandelt werden, stellt man einen überraschenden und unerwarteten Unterschied in der Zusammensetzung des extrahierten Gemisches von Prostansäurederivaten verglichen mit den bisher erzielten Ergebnissen fest. Beispielsweise wird in Tetrahedron Letters, loc. cit. die Isolierung eines Teils von 15/J-PGA2 und von 6,5 Teilen 15j3-PGA2-Acetatmethylester aus dem luftgetrockneten Kortex von Plexaura-homomalla-Kolonien der Form R beschrieben. Geht man nun von der Form S aus und arbeitet man in der bevorzugten Weise, so wird ein wesentlich kleineres Verhältnis von Hydroxy-Verbindung zur Acetat-Verbindung erzielt. Dieses Ergebnis ist vorteilhaft, wenn die Acetat-Verbindung als Zwischenprodukt gewünscht wird.

Eine Temperatur von weniger als etwa +5° C wird leicht mittels einer Mischung aus Eis und Wasser erhalten, und es ist zweckmäßig, die Kolonien oder Kolonienteile in diese Mischung sobald als möglich nach der Entfernung dieser Kolonien von der Stelle ihres Wachstums einzutauchen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses verbesserten Verfahrens erfolgt diese Kühlung ganz oder teilweise bei einer Temperatur von weniger als etwa -20⁰C. Die Kolonien oder Kolonienteile werden also tatsächlich gefroren und bis zum Zeitpunkt der Extraktion in gefrorenem Zustand gehalten. Vorzugsweise werden die Kolonien oder Kolonienteile innerhalb etwa einer Stunde nach ihrer Entfernung von der Stelle ihres Wachstums auf eine Temperatur von weniger als etwa -2O⁰C gefroren und bis zu dem Zeitpunkt ihrer Extraktion unterhalb von etwa 2O⁰C gehalten.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen verbesserten Verfahrens werden die Kolonien oder Kolonienteile durch Kontakt mit festem Kohlendioxid (Trockeneis) gefroren oder in einen Behälter gegeben, der festes Kohlendioxid enthält, wöbe die gefrorenen Kolonien oder Kolonienteile bis zum Zeitpunkt der Extraktion in Kontakt mit dem Kohlendioxid oder bei einer entsprechend niedrigen Temperatur gehalten werden.

Die gefrorenen Kolonien oder Kolonienteile werden vor der Extraktion mit Vorteil in kleinere Stücke zerbrochen oder zerhackt, die vorzugsweise ein Gewicht von weniger als 2 g haben. Für einige Extraktionssysteme ist es erwünscht, die Kolonienteile in einer Zerkleinerungsvorrichtung auf eine Teilchen-

größe zu zermahlen, deren größte Abmessung etwa 5 nun beträgt. Das Ausmaß der Zerteilung wird nach verschiedenen Faktoren ausgewählt, z. B. nach der Weise, in der die Feststoffe mit der Extraktionsflüssigkeit in Berührung kommen, entweder durch Druchseihen durch eine statische Schicht, oder durch Bewegung und Rühren, nach der Kontaktzeit, der Natur und Viskosität des Lösungsmittels u. dj!.

Die zur Extraktion der Kolonien oder Kolonienteile verwendete neutrale organische Flüssigkeit besteht aus irgendeinem der üblichen organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem Lösungsmittel mit einem Siedepunkt unterhalb von etwa 100° C und mit mäßiger bis hoher Polarität Besonders bevorzugte Flüssigkeiten für diese Extraktionen sind Dichlormethan, Methanol und ÄthanoL Ein unnötig langer Kontakt der Kolonien oder Kolonienteiie mit einem hydroxylhaltigen organischen Lösungsmittel, z. B. Methanol oder Äthanol, sollte jedoch vermieden werden, da ein Teil des erwünschten Acetats in dem Lösungsmittel in die entsprechende Hydroxyverbindung umgewandelt werden kann. Eine optimale Dauer der Extraktion wird vom Fachmann leicht bestimmt, beispielsweise durch wiederholte Extraktion einer kleinen Menge von Koloniestücken mit frischen Mengen des Lösungsmittels, um so festzustellen, wieviel Zeit für eine im wesentlichen vollständige Extraktion erforderlich ist. Die Extraktionstemperatur ist nicht kritisch, so lange die Extraktion nicht bei einer Temperatur erfolgt, die so hoch ist, daß die gewünschten Produkte zersetzt werden. Eine Extraktion im Temperaturbereich zwischen 5⁰C und 30°C ist gewöhnlich zufriedenstellend.

Die Prostansäurederivate werden aus dem Extrakt isoliert und voneinander nach bekannten Verfahren getrennt. Diese Verfahren werden in den nachstehenden Beispielen erläutert.

Bei einer anderen Verfahrensvariante werden Kolonien oder Kolonienteile von Plexaura homomalla (Esper) 179?, Form S, vor der Extraktion in Kontakt mit Wasser innerhalb eines Temperaturbereichs bis zu 50° C gehalten, bis im wesentlichen alle ursprünglich in den Kolonien oder Kolonienteilen anwesenden C-15-Acetate der Prostansäurederivate in C-15-Hydroxyprostansäurederivate umgewandelt worden sind.

Bei dem vorstehend genannten Wasser kann es sich um Zellwasser, d. h. um Wasser innerhalb der inneren Struktur des wirbellosen Meerestieres, um Wasser innerhalb der endodermen Struktur und der Nadeln, um an den gesammelten Kolonien anhaftendes Wasser oder um zugesetztes Wasser handeln. Was das natürliche innere Wasser dieser Formen von Plexaura homomalla (Esper) 1792 anbetrifft, so besteht etwa die Hälfte des Koloniegewichts aus innerem Wasser, wie durch getrenntes Erhitzen sowohl des Kortex oder der äußeren Rinde als auch des strangartigen proteinhaltigen Skeletts bei 50¹³C und einem Druck von 0,2 mm/Hg für die Dauer von 24 Stunden und anschließend bei 5O⁰C und Atmosphärendurck für die Dauer weiterer 48 Stunden gezeigt wird. Während der Zeitspanne, in der alle C-15-Acetate in c-15-Hydroxyderivate umgewandelt werden, ist die Menge des anwesenden Wassers gewichtsmäßig mindestens gleich der Menge des trockenen Feststoffgehaltes der Kolonien oder Kolonienteile. Um einen Verlust an Wasser durch Verdampfen zu verhindern, werden die Kolonien oder Kolonienteile entweder in Behälter eingeschlossen oder untergetaucht.

Bei einer Ausführungsform des verbesserten Verfahrens werden zur Erleichterung des Zerbrechens der Kolonien in kleinere Stücke die Kolonien oder Kolonienteile vor dem Zerhacken oder Mahlen gefroren. Dies geschieht nach üblichen Verfahren.

Aus einem nicht völlig geklärten Grund werden überlegene Ergebnisse hinsichtlich der Ausbeuten an PC1A2 erzielt, wenn die Kolonien oder Kolonienteile nach ihrer Aufbewahrung in Wasser bis zur erfolgten Umwandlung der C-15-Acetate in C-15-Hydroxyderivate vor der Extraktion gefroren und aufgetaut werden. In gefrorenem Zustand können die Kolonien oder Kolonienteile zweckmäßig ohne wesentlichen Zerfall oder unerwünschte chemische Umwandlungen und Nebenreaktionen gelagert werden.

Während der Zeitspanne der Umwandlung der C-15-Acetate in die C-15-Hydroxyderivate, wird die Mischung der in Berührung mit Wasser stehenden Kolonien oder Kolonienteile, bei dem es sich teilweise um zugesetztes Wasser handeln kann, bei Temperaturen im Bereich zwischen 2O⁰C und 40⁰C gehalten, bis die erwünschte chemische Umwandlung stattgefunden hat. Bei höheren Temperaturen, z.B. oberhalb von etwa 50° C, erfolgt die chemische Umwandlung rascher, es besteht jedoch die Möglichkeit, daß ein gewisser Abbau des gewünschten Produktes stattfindet Bei niedrigeren Temperaturen, z. B. bis herab zu etwa 5° C, erfolgt die chemische Veränderung langsamer. Bei etwa 25° C ist die gewünschte Reaktion innerhalb von etwa 15 bis 20 Stunden abgeschlossen.

Das Ende der gewünschten Reaktion, d. h. die Umwandlung im wesentlichen der gesamten ursprünglich in der Kolonien oder Kolonienteilen anwesenden C-15-Acetate der Prostansäurederivate in C-15-Hydroxyprostansäurederivate, wird leicht bestimmt, indem man ein Stück einer Kolonie oder einige kleine Koionienteile entnimmt und mit Methanol extrahiert Dieser Methanolextrakt wird der Dünnschichtchromatographie unter Anwendung eines Lösungsmittelsystems aus Äthylacetat, Essigsäure, 2,2,4-Trimethylpentan und Wasser im Verhältnis 90 :20:50 :100 (vgl. J. Biol. Chem., Bd. 241 [1966], S. 257) unterworfen. Auf diese Weise wird leicht festgestellt, ob bereits wesentliche Mengen der C-15-Acetate nicht mehr vorhanden sind, d. h. umgewandelt wurden.

Wie vorstehend angegeben, ist der PGA2-Acetatmethylester das Hauptprodukt in Plexaura homomalla (Esper) 1792, Form S. Durch das vorstehend beschriebene Verfahren wird die Acetatgruppe fast vollständig in die Hydroxylgruppe umgewandelt- Gleichzeitig wird der größte Teil der -COOCHa-Gruppen in -COOH-Gruppen umgewandelt. Wenn praktisch alle Acetatgp.'ppen in Hydroxylgruppen umgewandelt worden sind, ist jedoch gewöhnlich noch eine kleine Menge der 15-Hydroxymethylester anwesend. Gegebenenfalls kann die Mischung aus Wasser und aufgetauten Kolonien oder Kolonieteilen bei Temperaturen bis zu 5O⁰C gehalten werden, bis diese 15-Hydroxymethylester in 15-Hydroxysäuren übergeführt worden sind. Die verbleibenden Mengen an 15-Hydroxymethylestern sind jedoch üblicherweise klein, und die Ester können von den 15-Hydroxysäuren leicht abgetrennt werden. Bei diesem verbesserten Verfahren ist es daher gleichgültig, ob man die aufgetauten Kolonien oder Kolonienteile über den Zeitpunkt hinaus im Wasser hält, von dem an die 15-Acetat-Verbindungen im wesentlichen abgebaut sind.

Wenn die gewünschte Umwandlung praktisch abgeschlossen ist, werden die Hydroxysäuren und Hydroxy-

methylester aus den Kolonien und Kolonienteilen und dem ebenfalls anwesenden Wasser unter Anwendung geeigneter Extraktionsmethoden isoliert. Zu diesem Zweck verwendet man vorzugsweise eine mit Wasser mischbare organische Flüssigkeit, z. B. ein niederes Alkanol, wie Methanol oder Äthanol, oder ein Keton, wie Aceton, und zwar vorzugsweise mit einem Siedepunkt unterhalb von etwa 100⁰C.

Die Lösung aus dem Extrakt und der organischen Flüssigkeit wird vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb von etwa 50°C und verminderten Drucken konzentriert. Falls die Schaumbildung stört, wird ein Antischaummittel zugesetzt, beispielsweise ein Polypropylenglykol, Schmalzöl, Sojabohnenöl, ein Silikon oder ein anderes für diesen Zweck als nützlich bekanntes Material.

Wie bei den anderen Verbindungen der allgemeinen Formel I erfolgt die Abtrennung von PGA2 aus dem Extrakt nach bekannten Verfahren, z. B. durch Silikagel-Chromatographie. In gleicher Weise werden die entsprechenden 5,6-trans-Verbindungen nach dem oben angeführten Verfahren, z. B. unter Verwendung einer Silber-Harz-Kolonne, abgetrennt.

Ein anderer Weg zu PGA2 geht von den entsprechenden Methylestern und 15-Acetatmethylestern aus, die auf die vorstehend beschriebene Weise aus den Kolonien oder Kolonienteilen von Plexaura homomalla extrahiert werden. Ein geeignetes Verfahren zur Entfernung der Acetylgruppe der 15-Acetatmethylester der allgemeinen Formel I besteht darin, daß man den Acetatmethylester, gelöst in einem niederen Alkanol, vorzugsweise in Methanol, mit einer starken Säure, z. B. Perchlorsäure, etwa 15 Stunden bei 25° C mischt. Ein geeignetes Verfahren zur Entfernung der Methylgruppe des Methylesters der allgemeinen Formel I ist die enzymatische Hydrolyse, die in der DT-OS 19 37 912 beschrieben und in »Farmdoc Complete Specifications«, Buch Nr. 14, Nr. 6869R, Woche Rs, 18. März 1970, abgedruckt ist.

Die vorliegende Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele besser verständlich:

Alle Temperaturen sind in ⁰C angegeben.

Die Ultraviolettspektren sind mit einem Cary-Spektrophotometer, Modell 15 aufgezeichnet

Die Gewinnung der Eluatfraktionen bei der Chromatographie beginnt, wenn die Lösungsmittelfront den Boden der Säule erreicht.

Der im vorliegenden verwendete Ausdruck »Salzlösung« bezieht sich auf eine wäßrige gesättigte Natriumchloridlösung.

Unterscheidung von Plexaura homomalla (Esper) 1792, Form R, und Plexaura homomalla (Esper) 1792, Form S.

Es wurde ein Dünnschichtchromatographie-Verfahren (DC-Verfahren) verwendet Eine Probe mit einer Länge von etwa 2 cm wurde geerntet und gegebenenfalls mit einer geringen Menge Wasser behandelt, um zu gewährleisten, daß die Probe feucht war, dann in einen kleinen Kolben gegeben und 6 bis 24 Stunden unter Verschluß gehalten. Dann wurde 1 ml Methanol zugesetzt, die Probe entweder 2 Stunden bei 25° C geschüttelt oder 16 bis 24 Stunden bei etwa 10° gelagert Eine Probe der Flüssigkeit (10 bis 21 A) wurde auf eine DC-Platte getropft Vorzugsweise wurde dabei eine fluoreszierend gemachte Silikagel-Platte verwendet Als Bezugssübstanzen wurden PGA2- und 150-PGA2-Flekksn ebenfalls aufgebracht Die Platte wurde in dem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat, Essigsäure, 2,2,4-Trimethylpentan und Wasser (90 : 20 : 50 :100) entwikkelt. Die Flecken wurden schließlich mit einem Vanillin-Phosphorsäure-Spray (McAleer, Arch. Biocheni. E. Biophys. Bd. 66,2.120 [1957]) sichtbar gemacht s Dann wurde der unbekannte Fleck mit den beiden Bezugsflecken verglichen. Es wurde festgestellt, daß Form S dem PGA² und Form R dem 15j3-PGA2 entspricht.

Beispiel 1

Kolonien von Plexaura homomalla (Esper) 1792, Form S, die auf Felsenriffen vor der Nordküste Jamaikas gesammelt wurden, wurden in Stücke mit einer Länge von mehreren cm gehackt und gefroren. Die Stücke (500 g) wurden dann mit Methanol bedeckt, und das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 25° gehalten. Das Gemisch wurde anschließend in einem Waring-Mischer gemahlen und filtriert, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen, und die Lösung wurde der Reihe nach mit 1 η-Salzsäure, Wasser und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand wurde über 2 kg mit Säure gewaschenem Silikagel, das mit einem Gemisch aus isomeren Hexanen feucht eingefüllt wurde, Chromatographien, wobei mit 241 eines Gemisches von 25 bis 100% Äthylacetat in einem Hexangemisch eluiert wurde. Die Fraktionen, die wie aus dem Dünnschichtchromatogramm mit dem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat, Essigsäure, 2,2,4-Trimethylpentan und Wasser (90 :20 :50 :100) ersichtlich wurde, PGA2-Acetatmethylester, PGA2-Methylester und PGA2 enthielten, wurden einzeln vereinigt und eingedampft, wobei jene drei Verbindungen im Verhältnis von 60 :20 :20 erhalten wurden.

Beispiel 2

Kolonien von Plexaura homomalla (Esper) 1792, Form S, die auf Felsenriffen vor der Nordküste von

' Jamaika gesammelt wurden, wurden in Stücke mit einer Länge von mehreren cm gehackt. Die Stücke wurden innerhalb einer Stunde nach Entfernung aus den Riffgewässern durch Berührung mit festem Kohlendioxid gefroren. Die gefrorenen Kolonienstücke wurden bis zur Extraktion in isolierten, festes Kohlendioxid enthaltenden Behältern (bei einer Temperatur von unter etwa -20°) aufbewahrt. Dann wurden die gefrorenen Stücke der Kolonien zu einer kleinen Teilchengröße gemahlen, wobei die mittlere größte Abmessung etwa 5 mm betrug. Die Teilchen (1500 g) wurden anschließend 20 Minuten lang bei einer äußeren Temperatur von etwa 25° mit 18,91 Dichlormethan verrührt Das Gemisch aus Dichlormethan und Teilchen wurde dann durch eine Füllung von Diatomeenerde filtriert, und das Filtrat wurde bei 30° unter vermindertem Druck zu einem Volumen von etwa 21 eingedampft Die verbleibende Flüssigkeit wurde mit Wasser gewaschen,

über Natriumsulfat getrocknet und bei 30° unter vermindertem Druck eingedampft

Der ölige Rückstand (60 g) wurde über 3 kg Silikagel, das mit einem Gemisch aus isomeren Hexanan feucht eingefüllt wurde, Chromatographien, wobei die Elution nacheinander mit einem Gemisch aus 41 Hexangemisch und 4120%igem Äthylacetat in Hexangemisch, 27 1 von 20%, 18 1 von 50% und 8 1 von 75% Äthylacetat in Hexangemisch durchgeführt wurde und Fraktionen von

609 509/488

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je 600 ml aufgefangen wurden. Die Fraktionen 39 bis t>0 wurden vereinigt und eingedampft, wobei 24,3 g PGA2-Acetatmethylester erhalten wurden. Von den Fraktionen 60 bis 74 wurden diejenigen Fraktionen vereinigt und eingedampft, bei denen das Dünnschichtchromatogramm ergab, daß sie PGA2-Acetat enthielten; dabei wurde dann das PGA2-Acetat erhalten Die Fraktionen 74 bis 76 wurden vereinigt und eingedampft, wobei 1,03 g des PGA2-Metnylesicrs erhalten wurden. Die Fraktionen 83 bis 91 wurden m vereinigt und eingedampft, wobei 1,08 g PGE2-I5-Acetatmethyiester erhalten wurden. Noch spätere Fraktionen, bei denen das Diinnschichtchromatogramm ergab, daß sie den PGE2-Methylester enthielten, wurden unier Erhalt dieser Verbindung vereinigt und eingedampft. ι s

Die Bestimmung der jeweiligen Verbindungen mittels Dünnschichtchromatographie (DC) wurde nach bekannten Methoden durchgeführt, beispielsweise inaem man Flecken der Fraktionsextrakte neben den Fleckerder authenischen Verbindungen auf einer DC-Siiikagei-Platte auftrug, die Platte mit dem Lösungsmitteisysten; aus Äthylacetat, Essigsäure, 2,2,4-Dimethyipentan uik Vv asser (90 : 20 : 50 : 100) entwickelte und beobachtete welche Flecken der Fraktionsextrakie den Flecken dei authenischen Verbindungen genau entsprachen.

An Stelle von Dichlormethan kann aucn benzo verwendet werden.

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Kolonien von Hexaura homomalla (Esper) 1/92. Form S, die auf Felsenriffen vor der Nordküste von Jamaika gesammelt wurden, wurden in Mücke mit einem Gewicht von weniger als etwa 2 g gehackt. Das 3j /erhackte, mit Wasser befeuchtete Material wurde etwa 24 Stunden lang bei 25° aufbewahrt, oder so lange, Dis gemäß der DC-Analyse keine PGA2-13-Acetat-Verbindungen mehr vorhanden waren. Die DC-Probe wurae der flüssigen Phase eines Gemisches aus einer typischen Probe der Koralle und anhaftender Flüssigkeit entnommen, wobei das Gemisch mit mindestens dem gleichen Volumen an Aceton verrührt worden war.

Etwa 1 kg der mit Wasser befeuchteten, zerhackten Plexaura homomalla wurde dann etwa 1 Stunde lang mn einem Liter Aceton verrührt und filtriert. Die Feststoffe wurden auf diese Weise weitere vier Mal mit Aceton und schließlich einmal mit Dichlormethan extrahiert. Die wäßrigen Acetonmutterlaugen wurden im Vakuum zu einem Zehntel ihres ursprünglichen Volumens konzentriert. Zur Regulierung der Schaumbildung wurde ein Antischaummittel in einer Menge von etwa 1 g/kg der befeuchteten Kolonienstücke zugesetzt. Das Konzentrat wurde dann dreimal mit Dichlormethan extrahiert, und die vereinigten Dichlormethanextrakte wurden zu etwa einem Fünftel ihres ursprünglichen Volumens konzentriert

Das Dichlormethankonzentrat wurde siebenmal mit einer wäßrigen Lösung von 0,5 Mol Dinatriumorthophosphat extrahiert, wobei das eineinhalbfache VoIu- men der organischen Phase verwendet wurde. Zur Regulierung der Emulsionen wurde eine l°/oige !lösung eines Antischaummittel in Methanol bis zu einem Zehntel des Volumens der wäßrigen Phase zugesetzt Die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden mit 4 n-Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 2 bis 3 angesäuert und mit Dichlormethan extrahiert Die Dichlormethanextrakte wurden mit Aktivkohle entfärbt über wasserfrei em Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert.

Der Rückstand wurde über 2 kg mit Säure gewaschenem Silikagel, das mit einem Hexangemisch feucht gepackt wurde, Chromatographien, wobei mit einem Gemisch aus 25 bis 100% Äthylacetat in einem Hexangemisch eluiert wurde. Die Fraktionen, bei denen die DC mit dem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat. Essigsäure, 2,2,4-Trimethylpentan und Wasser (90 : 20 : 50 : 100) ergab, daß sie den PGA2-Methylester und PGA2 enthielten, wurden einzeln vereinigt und eingedampft, wobei 14 g PGA2 und 4 g PGA2-Methylester erhalten wurden, was einer Ausbeute an PG A2 von 1,4% und an PGA2-Methylester von 0,4% entsprach.

Unterwirft man die mit Wasser befeuchtete, zerhackte Plexaura homomalla. Form S, nach 24stündiger Lagerung bei 25" einer Gelrierstute mit festem Kohlendioxid, lagert die gefrorenen Feststoffe eine Woche lang bei unter etwa -20", taut sie auf, verrührt sie mit Aceton und arbeitet sie dann in aer vorstehend näher beschneoenen Weise auf, so erhält man PGA2 ebenfalls in l,4°/oiger Ausbeute.

Beispiel 4

Kolonien von Hiexaura homomalla (Lsper) 1792, Form S, die aui Felsenriffen vor der Nordküste von Jamaika gesammelt wurden, wurden innerhalb einer Stunde nach Enuernung aus den Riffgewässern durch Berührung mit iestem Kohlendioxid gefroren. Die gefrorenen Kolonien wurden so lange in isolierten, festes Kohlendioxid enthaltenden Behältern (bei einer Temperatur von unter etwa —20") aufbewahrt, bis sie fertig zum Auftauen waren. Dann wurden die gefrorenen Kolonien (700 g) mit einem Waring-Mischer zu einer kleinen Teilchengröße vermählen und mit 1500 ml Wasser vermischt. Das Gemisch wurde etwa 20 Stunden lang unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 25° gehalten. Dann wuroe das Gemisch durch eine Füllung von Diatomeeneroe filtriert, und das Fiitra? wurde mit konzentrierter Salzsäure bis zu einem pH-Wert von etwa 2 bis 3 angesäuert. Das angesäuerte Fütrat wurde viermal mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, filtriert, mn Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 11 g eines öligen Rückstands erhallen wurden.

Der auf der Filterfüllung aus Diatomeenerde befindliche feste Rückstand wurde 2 Stunden lang bei 25° mit Methanol, das zum Bedecken des Rückstands ausreichte) verrührt. Das Gemisch wurde dann filtriert und das Filtrat wurde eingedampft, wobei 14 g eines öligen Rückstands erhalten wurden.

Die Rückstände wurden vereinigt und über 1500 g mil Säure gewaschenem Silikagel chromatographiert wobei der Reihe nach mit 81 eines Gemisches von 25 bis 65% Äthylacetat in einem Hexangemisch, 81 eines Gemisches von 65 bis 100% Äthylacetat in einerr Hexangemisch und 51 2% Methanol in Ätyhlacetai eluiert wurde und Fraktionen von 500 ml aufgefanger wurden. Die Fraktionen 8 bis 12 wurden vereinigt unc eingedampft, wobei eine kleine Menge PGA2, da! Spuren von PGA2-Methylester enthielt, erhalten wurde Die Fraktionen 15 bis 18 wurden vereinigt unc eingedampft wobei 9,54 g PGA2 erhalten wurden. Di< Fraktionen 35 bis 40 wurden vereinigt wobei 0,414 j PGE2 erhalten wurden.

Beispiel 5

Trennung von PGA2und 5,6-trans-PGA2(Reinigung)

a) Die Trennung von PGA2 und 5,6-trans-PGA2 kann über einer chromatographischen Säule unter Verwendung eines mit Silber gesättigten Ionenaustauscherharzes durchgeführt werden. Vorzugsweise wurde ein Makronetz bildendes lonenaustauscherharz verwendet, z. B. ein sulfoniertes Styrol-Divinylbenzolcopolymeres mit einer Oberfläche tu von 40 bis 50 m²/g, einer Porosität von 30 bis 40% und einer gesamten Austauscherkapazität von 4,5 bis 5,0 mÄ/g trockenes Harz. Das Harz in seiner sauren Form wurde in eine Säule gefüllt, mit warmem Wasser gewaschen und in die Silberform i> umgewandelt, indem eine 10%ige Silbernitratlösung so lange durch die Säule geleitet wurde, bis die abfließende Hüssigkeit einen pH-Wert von 3,5 bis 4,0 aufwies. Die Säule wurde dann zur Entfernung des ionischen Silbers mit Wasser und schließlich mit 2t Äthanol (vergällt mit 5% Methanol) gewaschen. Eine Lösung eines Gemisches aus PGA2 und 5,6-trans-PGA2, z. B. die Fraktionen 15 bis 18 des Beispiels 4, in Äthanol, wurde in die Säule gegeben. Das Eiuieren mit Äthanol (vergällt mit 5% 2 s Methanol) ergab dann Fraktionen, die je nach ihrem Gehalt an 5,6-trans-PGA2 (weniger polar) oder PGA2 vereinigt wurden. Die Prüfung auf das Vorhandensein von 5,6-trans-PGA2 oder PGA2 in-, Eluat wurde zweckmäßigerweise mittels Dünn-Schichtchromatographie durchgeführt, wobei man mit Silbernitrat behandelte Silikagelplatteii verwendete und mit dem Lösungsmittelsystem aui Äthylacetat, Essigsaure, 2,2,4-Trimethylpentan und Wasser (90 :20 :50 :100) entwickelte. Der Rf-Wen 3s für PGA2 betrug 0,45, der Rf-Wert für 5,6-trans-PGA2 0,50. Die vereinigten Fraktionen wurden konzentriert, zwischen Dichlormethan und etwas Wasser durch Verteilung getrennt, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck 4c konzentriert, wobei die gewünschten Verbindungen erhalten wurden.

Zur quantitativen Untersuchung des Gehaltes an 5,6-trans-PGA2 in Gemischen aus PGA2 und 5,6-trans-PGA2 wurde eine Kombination von Dünnschichtchromatographie und Spektrophotometrie verwendet. Mit Silikagel imprägnierte, aus Glasmikrofasern bestehende Platten wurden mit Silbernitrat imprägniert, wobei man 5%iges äthanolisches Silbernitrat verwendete und die Platten trocknete. Flecken von 100 bis 200 μg des PGA2-Gemisches wurden aufgebracht und in dem Lösungsmittelsystem aus 2,2,4-Trimethylpentan-Äthylacetat/Essigsäure/Wasser (100 :35 : 8 :10, obere Phase) entwickelt. Die Platte wurde getrocknet, mit Diäthylrhodamin-äthylester besprüht und unter ultraviolettem Licht geprüft. Die das eis- und trans-Material enthaltenden Flächen (Rr-Wert für PGA2 = 0,6; Rf-Wert für 5,6-trans-PGA2 = 0,7) wurden markiert, dann herausgeschnitten und mit Methanol (1,9 ml) und einer 45%igen Kaliumhydroxidlösung (0,1 ml) eluiert. Nach 30niinütigem Behandeln bei 40° wurden die jeweiligen Lösungen zentrifugiert und spektrophotometrisch bei 278 nm analysiert.

b) Man kann auch ein Gemisch aus PGA2-15-acetatmethylester und 5,6-trans-PGA2-15-acetatmethylester (11,0 g, 85 : 15) in 415 ml einer Lösung von Methanol-Wasser-Essigsäure (95-5-0,4) und 6,1 g QuecksiIber(II)-acetat lösen und 30 Minuten lang bei etwa 25° stehen lassen und dann auf folgende Weise trennen:

Das Gemisch wurde mit 250 ml Wasser versetzt und zweimal mit 700 ml eines Gemisches isomerer Hexane gewaschen. Die Hexangemisch-Phase wurde mit 100 ml 60%igen Methanol gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem öl (4,35 g) konzentriert, das einen hohen Gehalt an 5,6-trans-PGA2-15-acetatmethylester besaß. Die wäßrige Methanolphase wurde mit 32 ml 6 n-Salzsäure angesäuert, und das Gemisch wurde mit zwei Portionen von 700 ml Hexangemisch extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und zu einem öl (5,53 g) konzentriert. Dieses öl wurde nochmals dem gleichen Verfahren unterworfen, wobei 350 ml der Lösung aus Methanol-Wasser-Essigsäuri; und 4,6 g Quecksilber(II)-acetat verwendet wurden. Aus der aufgearbeiteten wäßrigen Methanolphase wurde eine Fraktion von 3,92 g PGA2-15-acetatmethylester gewonnen, die nur einen kleinen Prozentsatz der 5,6-trans-PGA2-Verbindung enthielt

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Claims

2 i 45 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung bzw. Gewinnung von Prostansäurederivaten der allgemeinen Formel S

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