DE768161C

DE768161C - Verfahren zur Herstellung von antirachitisch wirksamen Praeparaten

Info

Publication number: DE768161C
Application number: DEN38285D
Authority: DE
Inventors: Albert Gerhardus Dr Boer; Johannes Van Dr Niekerk; Engbert Harmen Dr Reerink; Aart Van Dr Wijk
Original assignee: Philips Patentverwaltung GmbH
Current assignee: Philips Intellectual Property and Standards GmbH
Priority date: 1935-06-20
Filing date: 1935-06-20
Publication date: 1968-08-22

Description

Es ist bekannt, daß bei der antirachitischen Aktivierung bestimmter natürlicher Stoffe durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht die in diesen Stoffen vorhandenen unverseifbaren Lipoide eine wichtige Rolle spielen, da sie das sogenannte ■ Provitamin D enthalten. Lange Zeit hat man Ergosterin als das Provitamin D betrachtet, bis Waddell (Journ. of the Biol. Chem., Bd. 105, Juli 1934, Nr. 4, S. 7ϊ 1/739) zeigte, daß zwischen bestrahltem Ergosterin pflanzlicher Herkunft und bestrahltem Cholesterin ein Unterschied besteht, und darauf die Vermutung gründete, daß das Provitamin D pflanzlicher Herkunft mit dem Provitamin D tierischer Herkunft nicht identisch sei (a.a.O. Seite734). Der von Waddell beschriebene Unterschied der Bestrahlungsprodukte bekundet sich durch einen Unterschied in der antirachitischen Aktivität bei Küken trotz einer gleichen Anzahl von sogenannten internationalen Einheiten, die bekanntlich mit Ratten als Versuchstieren bestimmt werden.

Das Cholesterinproviant D ergibt nämlich einen antirachitisch wirksamen Stoff, der um etwa 30- bis 5omal stärker als die aus dem pflanzlichen Ergosterin erhaltenen antirachitischen Stoffe auf Küken einwirkt.

Der Verwendung von Cholesterin als Provitamin-D-Quelle haftet der Übelstand an, daß in ihm ein sehr geringer Gehalt des Pro-

vitamins vorhanden ist. Die höchste Aktivität die bei zweckmäßiger Bestrahlung eines 0,3 °/i Provitamin D enthaltenden Cholesterinpräparats erreicht werden könnte, wird etwa 30 internationale Einheiten je Milligramm betragen. Eine derartige Aktivierbarkeit hat für die technische Anwendung sehr große Nachteile.

Es wäre nun vielleicht möglich, den für Küken wirksamen Provitamin-D-Gehalt in Cholesterin z. B. durch fraktionierte Adsorption künstlich zu erhöhen oder das bestrahlte Provitamin durch Umkristallisieren von Cholesterin zu befreien, aber diese und andere bekannte künstliche Konzentrierungsverfahren besitzen gerade wegen des geringen Provitamingehalts für die Technik große Nachteile. Die Erfindung vermeidet diese Übelstände durch die Herstellung von Präparaten mit einer insbesondere bei Küken antirachitischen und daher durch Küken als Testtiere feststellbaren Wirksamkeit durch Bestrahlung von anderen Sterinen als den bisher beschriebenen.

Als Ausgangsmaterial für diese anderen Sterine dienen wirbellose Tiere, aus deren unverseifbaren Bestandteilen Sterinfraktionen mit hohem Gehalt an Provitamin (mindestens 0,3%) erhalten werden können. Die Sterinfraktionen bestehen aus einem Gemisch von Sterinen, die gegebenenfalls Cholesterin enthalten.

Es ist überraschend, daß diese Steringemische nicht nur aktivierbar sind, sondern auch Anlaß zum Entstehen von aktivierten Stoffen geben, die bei Küken wesentlich wirksamer sind als bestrahltes Ergosterin. Es ist ferner überraschend, daß diese Aktivierbarkeit zu einem besonders bei Küken wirksamen Vitamin D nicht auf Cholesterin beschränkt ist und daß man die festgestellte hohe Aktivierbarkeit in vielen Fällen besonders in Steringemischen vorfindet, die eine erhebliche Menge eines anderen Sterins als Cholesterin enthalten.

Da es sich hier um Grundstoffe aus der lebenden organischen Natur handelt, ist es naheliegend, daß der Provitamingehalt bei bestimmten Vertretern nicht konstant ist, sondem von den Lebensverhältnissen, vom Entwicklungsstadium usw. abhängt. Wie jedoch aus den nachstehend gegebenen Beispielen hervorgeht, ist bei einer großen Anzahl von erfindungsgemäß aus Gliedertieren (Anne-Iida), Gliederfüßern (Arthropoda) und Muscheln (Lamellibranchiata) beliebig gewählten Vertretern der Provitamingehalt des Sterins größer als derjenige des Cholesterins aus Wirbeltieren.' Der Provitamingehalt erreicht manchmal einen überraschend hohen Wert. Unter Anwendung von an sich bekannten präparativen Verfahren gelingt es nun, aus Gliedertieren, Gliederfüßlern oder Muscheln insbeosndere auf Küken wirksame Provitamin-D-Präparate herzustellen.

Mouriquand und Leulier (Comptes rendus de L'Academie des Sciences, 1929, S. 1701 bis 1702) haben einen Versuch beschrieben, bei dem sie aus Helix pomatia erhaltenes reines Cholesterin (»cholesterine pure«) und eine Mischung von Cholesterin und »Lipoiden« (»cholesterine 4- lipids cholesteriques« byw. »voisins«) zwecks antirachitischer Aktivierung bestrahlt haben. Das gereinigte Cholesterin soll sich dabei als vollkommen unwirksam erwiesen haben, während die Mischung für Ratten stark antirachitisch gewesen sein soll.

Diese im übrigen mit Hinsicht auf die angewendete Arbeitsweise zur Herstellung der zu bestrahlenden Produkte unklaren und unvollständigen Angaben zielen auf die Herstellung eines ungiftigen Vitamin-D-Produkts aus einem Tier mit hohem Blut-Calcium-Gehalt hin und offenbaren dem Fachmann nichts über die allgemeine Lehre der vorliegenden Erfindung.

Es handelt sich somit dabei um einen einzelstehenden Versuch, der weder in wissenschaftlicher noch in technischer Hinsicht zu irgendeiner weiteren Entwicklung der Vitamin-D-Technik beigetragen hat.

Bei der Herstellung von Provitamin D enthaltenden Sterinen aus wirbellosen Tieren werden bei der bekannten Empfindlichkeit des Provitamins gegen verschiedene Einflüsse zweckmäßig Vorkehrungen getroffen, um dieses zu schützen. Diese präparativen Vorsichtsmaßnahmen bestehen grundsätzlich darin, daß bestimmte Handlungen unterlassen werden und die Einwirkung von bestimmten Stoffen vermieden wird. Es sind insbesondere bereits bei der Vorbehandlung der zu extrahierenden Stoffe vor der Fettextraktion z. B. längeres Kochen mit Wasser und Trocknen mit Dampf zu vermeiden.

Ein geeignetes präparatives Verfahren, bei dem keine derartigen schädlichen Handlungen erfolgen, ist beispielsweise das folgende:

Die zu behandelnde gemahlene Masse wird no entweder im Vakuum bei nur mäßig erhöhter Temperatur (z.B. etwa 50⁰C) getrocknet oder nach Zermahlen und Zerreiben mit Sand mit Natriumsulfat, Alkohol oder Aceton getrocknet. Aus dem auf diese Weise vorbehandelten Grundstoff wird dann das Fett extrahiert, wobei zweckmäßig niedrigsiedende Fettlösungsmittel, wie Äther oder Petroläther, verwendet und zweckmäßig halogenhaltige Extraktionsmittel, wie Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, vermieden werden, da diese zur Bildung von Salzsäure An-

laß geben können. Eine länger andauernde Berührung mit Äther ist zweckmäßig zu vermeiden, da dieser häufig Peroxyde enthält oder wenigstens bei seiner Verwendung die Bildung von Peroxyden schwer zu verhindern ist. Ist der Grundstoff mit Hilfe von Alkohol oder Aceton getrocknet worden, so ist darin ein Teil des Fettes gelöst, das durch Eindampfen des Lösungsmittels im Vakuum gewonnen werden kann. Die Fettlösung wird durch Filtrieren von gegebenenfalls suspendierten Einweißbestandteilen befreit und das Lösungsmittel durch Destillation entfernt. Das Fett wird dann auf übliche Weise verseift, wobei zweckmäßig wieder sehr hohe Temperaturen vermieden werden und z. B. eine Lösung von NaOH oder KOH in wenigstens 8o°/oigem Alkohol verwendet wird. Die Seifenlösung kann gewünschtenfalls durch ao Destillation von einem Teil des Alkohols befreit werden, worauf der unverseifbare Teil entweder dadurch erhalten werden kann, daß die Seifenlösung mit Wasser verdünnt und dann der unverseifbare Teil mit Hilfe von Äther oder Petroläther extrahiert wird oder daß in der wäßrigen Seifenlösung durch Behandlung mit einem Kalksalz die Kalkseifen niedergeschlagen und die zusammen mit den Kalkseifen niedergeschlagenen unverseifbaren Bestandteile, z. B. mit Aceton, aus ihnen extrahiert werden. Aus dem 'auf diese Weise erhaltenen unverseifbaren Teil wird die Sterinfraktion durch Umkristallisieren, z. B. aus Alkohol, abgeschieden. Zur weiteren Reinigung kann nochmals aus Methylalkohol umkristallisiert werden, in dem bestimmte verunreinigende, z.B. ölartige Stoffe oder farbige Lipoidbestandteile sehr wenig löslich sind. Insbesondere in denjenigen Fällen, in denen die unverseifbaren Bestandteile erhebliche Mengen von Farbstoffen, wie Carotinoide, enthalten, kann unter dem Einfluß von Licht und Luft ein Teil des Provitamins verlorengehen; es ist also erwünscht, auch diesem Umstand Rechnung zu tragen.

Es ist vorteilhaft, bei der Bestimmung des Provitamingehalts das bekannte Absorptionsspektrumverfahrenanzuwenden. Es ist auf diese Weise möglich, auf optischem Weg in einem genügend reinen Präparat die Menge des Kükenprovitamins zu bestimmen, und zwar durch Vergleich mit der Menge von pflanzlichem Ergosterin, welche die gleiche Absorption herbeiführt. Da nun diese in gleichem Maß absorbierenden Mengen des insbesondere bei wirksamen Kükenprovitamins und des- Ergosterins bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht unter vollkommen gleichen Verhältnissen eine gleiche antirachitische Aktivität für Ratten, d. h. eine gleiche Anzahl von internationalen Einheiten, erhalten, ist die Menge des Kükenprovitamins bestimmt.

Wenn man ein Präparat mit einer höchstmöglichen Anzahl von Einheiten je MiUigramm des umgesetzten Provitamins herzustellen wünscht, empfiehlt es sich, die aktivierende Strahlung auf das Wellenlängengebiet zwischen 270 und 300 πιμ zu beschränken und höchstens 60% des Provit- 7» amins umzuwandeln.

Es werden nachstehend einige Ausführungsbeispiele gegeben.

Beispiel 1

4,1kg Salzwassermuscheln (mytilus edulis) wurden nach Entfernung der Schalen in einer Hackfleischmaschine zermahlen und im Vakuum bei etwa 50⁰C getrocknet. Die getrocknete Masse wurde dreimal mit insgesamt 3,51 Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60⁰C) extrahiert, der Petrolätherauszug mit Wasser gewaschen, getrocknet, filtriert und der Petroläther abdestilliert. Die Fettmasse (45 S) wurde 2 Stunden mit 200 ecm o.6⁰/oigem Alkohol und 20 g KOH in 20 ecm Wasser am Rückflußkühler gekocht, die Seifenlösung nach Abkühlung in 11 destilliertes Wasser gegossen und die Mischung fünfmal mit insgesamt 11 Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wurde fünfmal mit je 100 ecm destilliertem Wasser gewaschen, mit Na₂SO₄ getrocknet und filtriert. Es blieben nach Abdestillieren des Äthers 7,5 g einer festen rotgelben Masse zurück. Diese wurde nacheinander aus 50 und 25 ecm 96%igem Alkohol und schließlich aus 110 ecm Methylalkohol umkristallisiert. Auf diese Weise wurden 2,5 g einer lichtgelben kristallinen Sterinfraktion erhalten. Die Messung des Absortionsspektrums entsprach einem Ergosteringehalt von i6°/o.

150 mg der gewonnenen Kristalle wurden in peroxydfreiem Äther gelöst, und diese Lösung wurde unter stetigem Rühren im Vakuum mit dem von einer Xylollösung filtrierten Licht einer Quarzquecksilberlampe bestrahlt, bis etwa 40 bis 50% des vorhandenen Provitamins umgewandelt worden sind. Die bestrahlte Lösung wurde, immer noch im Vakuum, in 200 ecm Arachisöl eingeführt und der Äther im Vakuum abgedampft.

Die antirachitische Wirkung der öllösung wurde an Ratten im Vergleich zu der internationalen Normallösung von Vitamin D und an Küken im Vergleich zu einem Lebertran untersucht, der je Kubikzentimeter 100 internationale Einheiten (Ratten) Vitamin D enthielt. Es ergab sich aus dem Rattenversuch, daß die öllösung je Kubikzentimeter

iooo internationale Einheiten Vitamin D enthielt. Aus dem Kükenversuch ergab sich, daß die Öllösung zehnmal stärker als der benutzte Lebertran war.

Sowohl beim Ratten- als auch beim Kükenversuch wurde somit festgestellt, daß die Öllösung die zehnfache Aktivität im Vergleich mit dem Lebertran hatte, woraus folgt, daß pro internationale Einheit (Ratten) die ÖI-lösung dieselbe Wirkung auf Küken ausübt wie Lebertran (was bei bestrahltem Ergosterin keineswegs der Fall ist). 150 mg Muschelsterin ergaben insgesamt etwa 200 000 internationale Einheiten Vitamin D,

d. h. etwa 1330 internationale Einheiten je Milligramm.

Beispiel 2

900 g Austern (ostrea edulis) wurden nach Entfernung der Schalen in einer Hackfleischmaschine zermahlen und die Masse zweimal mit je 900 ecm a.6°/oigem Alkohol behandelt. Der Alkohol wurde jedesmal mittels eines Büchnerfilters gut abgesaugt. Die vereinigten Auszüge wurden auf einen Wassergehalt von etwa 50% gebracht und mit insgesamt 2 1 Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60⁰C) die Fettbestandteile extrahiert. Der Petroläther wurde dann der zermahlenen Austermasse zugesetzt und abfiltriert und die Masse noch zweimal mit etwa 500 ecm Petroläther extrahiert. Der gesammelte Petrolätherauszug wurde mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und der Petroläther abdestilliert. Der Rückstand (14,7 g) wurde 2 Stunden am Rückflußkühler mit 50 ecm 96°/oigem Alkohol und 7,5 g KOH in 7,5 ecm Wasser gekocht. Nach dem Abkühlen wurde die Seifenlösung mit 250 ecm destilliertem Wasser versetzt und wie im Beispiel 1 der unverseifbare Teil der wäßrigen Seifenlösung mit Äther entzogen. Nach Abdampfen des Äthers verblieben 1,85 g Rohmasse.

Durch Umkristallisieren aus 96°/oigem Alkohol mit folgendem zweimaligem Umkristallisieren aus Methylalkohol wurden 0,6 g einer weißen kristallinen Sterinfraktion erhalten, die 3°/o Provitamin enthielt. Nach Bestrahlung und Bestimmung der antirachitischen Wirkung bei Ratten und Küken ergab sich, daß die antirachitische Aktivität etwa 300 internationale Einheiten je Milligramm betrug.
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Beispiel 3

9 kg Teichmuscheln (anodonte cygnea) wurden mit den Schalen in einem Mörser zerstampft und mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60⁰C) gemäß Beispiel 2 behandelt. Als Ausbeute wurden 10.3 g Fettsubstanz erhalten, die beim Verseifen mit 5 g KOH in 5 ecm Wasser und 50 ecm Alkohol und nach Extraktion mit Äther 2,65 g unverseifbaren Rückstand lieferten. Hieraus wurde durch Umkristallisieren aus Alkohol und Methylalkohol r,og hellgelbes Sterin erhalten. Der Provitamin-D-Gehalt betrug 8°/o und die antirachitische Aktivität nach der Bestrahlung etwa 750 internationale Einheiten je Milligramm.

Beispiel 4

Zwei eßbare Taschenkrebse (cancer pagurus) im Gewicht von 690 g wurden in einem Mörser möglichst zerstampft, das Fleisch wurde in einer Hackfleischmaschine zermahlen und nach Trocknung mit Alkohol das Fett mit Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60⁰C) wie im Beispiel 2 extrahiert. Das Rohfett (19g) wurde mit 9,5gKOH in9,5 ecm Wasser und 65 ecm 96%igem Alkohol verseift und der unverseifbare Teil wie im Beispiel 2 mit Äther extrahiert. Aus dem rohen unverseifbaren Teil (1,5 g) wurde durch Umkristallisieren aus Alkohol und durch zweimaliges Umkristallisieren aus Methylalkohol die Sterinfraktion (0,25 g) als vollkommen weiße Kristalle erhalten. Der Provitamingehalt betrug 2,7% und die antirachitische Aktivität nach Bestrahlung etwa 250 internationale Einheiten je Milligramm.

95 Beispiel 5

2 Hummer (homarus vulgaris), Gewicht mit Schalen 1,2 kg, wurden möglichst weitgehend von den Schalen befreit (Gewicht 800 g) und in einer Hackfleischmaschine zermahlen. Nach Behandlung mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis 90⁰C), wie im Beispiel 2, wurden 25 g Fett und daraus nach Verseifung mit 12,5 g KOH in 12,5 ecm Wasser und 125 ecm Alkohol 1,6 g unverseifbare Anteile erhalten. Die Kristallisation, zweimal aus Alkohol und einmal aus Methylalkohol, lieferte 0,60 g rosafarbiges Sterin mit 0,25% Provitamin D. Durch Bestrahlung w^rurde eine Aktivität von etwa 25 internationalen Einheiten je Milligramm erhalten.

Beispiel 6

524 g Mehlwürmer (tenebrio molitor) wurden in einer Hackfleischmaschine zermahlen und wie im Beispiel 2 mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis 6o° C) behandelt. Das Fett (44,5 g) wurde mit 22 g KOH in 22 ecm Wasser und 150 ecm 96%igetn Alkohol verseift und der unverseifbare Teil

mit Äther extrahiert, wobei 1,08 g Rohprodukt erhalten wurde. Nach Umkristallisieren· aus Alkohol und viermaligem Umkristallisieren aus Methylalkohol blieb eine schwerlösliche butterartige Substanz zurück; die Sterinfraktion (0,14 g) wurde in Form eines nahezu weißen Kristallpulvers erhalten. Der Provitamingehalt betrug 11 °/o und die antirachitische Aktivität nach Bestrahlung etwa 1000 internationale Einheiten je Milligramm.

Beispiel 7

174 g Schwimmkäfer (dytiscus marginalis) wurden nach Beispiel 2 und 4 behandelt und lieferten 4,7 g Fett bzw. nach dem Verseifen mit 2,5 g KOH in 2,5 ecm Wasser und . 25 ecm Alkohol 0,45 g unverseifbare Anteile (durch Extraktion mit Äther gewonnen). Es stellte sich heraus, daß die" unverseifbaren Anteile sehr viel einer wachs- oder ölartigen Substanz enthielten, die sich nur schwer durch Umkristallisieren aus Alkohol (zweimal) und Methylalkohol (viermal) entfernen ließ. Die Ausbeute betrug 12 mg weißes, kristallinisches Sterin, das 4% Provitamin D enthielt. Durch Bestrahlung wurde eine Aktivität von etwa 400 internationalen Einheiten erhalten.

Beispiel 8

123 g getrocknete Puppen von Seidenspinnern (bombyx mori) wurden in einer Kugelmühle zermahlen und mit Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60⁰C) extrahiert. Der Extrakt (34,3 g) wurde mit 17 g KOH in 17 ecm Wasser und 120 ecm Alkohol verseift und der unverseifbare Teil auf die im Beispiel ι angegebene Weise mit Äther extrahiert, wobei i,3 g erhalten wurden. Durch Umkristallisieren aus Alkohol und Methylalkohol wurde 0,27 g ziemlich unreines Sterin erhalten. Der Provitamingehalt betrug o, S 5%, die antirachitische Aktivität nach Bestrahlung 50 internationale Einheiten je Milligramm.

Beispiel 9

5)4 g Heuschrecken-Eier (carausius morosus) wurden in einem Mörser mit Sand verrieben und mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis 6o° C) nach Beispiel 2 behandelt. Die Ausbeute betrug 0,40 g Fettstoffe, die nach Verseifung mit 0,4 g KOH in ι ecm Wasser und 9 ecm Alkohol und Extraktion mit Äther 36 mg unverseifbare Teile ergaben. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Methylalkohol wurden 3 mg einer noch sehr unreinen Sterinfraktion erhalten, deren Provitamingehalt 2,5% betrug.

Beispiel 10

404 g Regenwürmer (lumbricus) wurden in einer Hackfleischmaschine zermahlen und 6g mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis 6o° C) auf die im Beispiel 2 angegebene Weise behandelt. Der Extrakt (4,3 g) wurde mit 2,2 g KOH in 2,2 cm Wasser und ιό ecm Alkohol verseift und aus der Seife durch Extraktion mit Äther 0,9 g Unverseifbares erhalten, das nach Umkristallisieren aus Alkohol und Methylalkohol eine Sterinfraktion (0,3 g) in Form weißer Kristalle ergab. Der Provitamingehalt betrug 11% und die antirachitische Aktivität nach Bestrahlung etwa 1100 internationale Einheiten je Milligramm.

Beispiel 11

500 g Blutegel (hirudines) wurden in einer Hackfleischmaschine zermahlen und nach Beispiel 2 mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60⁰C) behandelt. Der Extrakt (7,4 g) wurde mit 3,7 g KOH in 3,7 ecm Wasser und 25 ecm Alkohol verseift und ergab 1,5 g unverseifbare Teile. Nach Umkristallisieren aus Alkohol und Methylalkohol wurden 0,68 g einer aus weißen Kristallen bestehenden Sterinfraktion mit einem Provitamingehalt von 4,2% und einer antirachitischen Wirksamkeit nach Bestrahlung von 400 internationalen Einheiten je Milligramm erhalten.

Bezüglich der Beispiele sei nochmals darauf hingewiesen, daß der Provitamingehalt eines Sterins einer bestimmten Tierart von den Lebensverhältnissen, ob sie z. B. frei mit der Luft in Berührung bzw. im Freien leben — solche Tiere können vorzugsweise verwendet werden —, vom Entwicklungsstadium usw. beeinflußt wird. So sind z. B. auch Versuche mit Muscheln ausgeführt worden, welche 11% statt 16%, Provitamin enthielten.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung von antirachitisch wirksamen Präparaten durch Bestrahlen einer tierischen Sterinfraktion mit ultraviolettem Licht, dadurch gekennzeichnet, daß man' die aus Gliedertieren, Gliederfüßlern oder Muscheln in bekannter Weise abgeschiedenen unverseifbaren Bestandteile unter Anreicherung des Provitamins umkristallisiert und die erhaltene Sterinfraktion mit ultraviolettem Licht bestrahlt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Bestrahlung

kürzere Wellenlängen als 270 mu, verwendet werden und vorzugsweise nur so lange bestrahlt wird, bis höchstens 6o°/o des Provitaniin-D-Gehalts umgewandelt worden sind.

Zur Abgrenzung des Ernndungsgegenstands vom Stand der Technik sind im Erteilungsverfahren folgendeDruckschriften in Betracht gezogen worden:

Schweizerische Patentschrift Nr. 156889; französische Patentschrift Nr. 606984; Biochemical Journal, Bd. 4, 1909, S. 22 ff; Comtes Rendus de l'Academie

de Sciences, 1929, S. 1701 bis 1702; Hoppe-Seyler, Zeitschrift f. physiol.

Chemie, Bd. 55, 1908, S. 427; Journal of Biological Chemistry, Bd. 104,

1934, S. 3i7> 553;
Paris medical, 1929, Bd. 73, S. 409 bis 415.

Θ 809 60402 8.