DE2128625C3

DE2128625C3 - Verfahren zur Herstellung einer stabilen, direkt anwendbaren Pockenimpfstoffsalbe

Info

Publication number: DE2128625C3
Application number: DE2128625A
Authority: DE
Inventors: Mirko Dr Bern Majer (Schweiz); Bruno Thoerishaus Mettier
Original assignee: Schweiz Serum und Impfinstitut und Institut zur Erforschung der Infektionskrankheiten
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 1971-01-04
Filing date: 1971-06-09
Publication date: 1975-09-04
Also published as: ES393694A1; CA943458A; BE769356A; US3739065A; SE370549B; AU3282971A; AU452829B2; GB1284703A; FR2121491A1; DE2128625A1; SU421201A3; FR2121491B1; DE2128625B2; AT303966B; OA03800A; NL7113467A; ZA715080B; JPS5112685B1; DK127793B

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft das Verfahren zur Herstellung eines neuen wasserfreien Pockenimpfstoffes, dessen besondere Kennzeichen seine Stabilität und hohe Wirksamkeit, seine Salbenform und damit seine bequeme und sichere Anwendung sind.

Pockenimpfstoffe werden bisher stets in flüssiger Form und gewöhnlich in wäßriger Lösung angewendet. Zur Stabilisierung ist es erforderlich, diese sehr empfindlichen Lebendimpfstoffe bei sehr tiefer Temperatur oder in lyophilisierter Form zu lagern. Die Lagerung bei tiefer Temperatur ist nicht immer möglich und jedenfalls aufwendig und unbequem. Die Anwendung von lyophilisierten Pockenimpfstoffen war bis heute mit einer Reihe von Nachteilen verbunden. Vor allem müssen die Präparate unmittelbar vor dem Gebrauch durch Zugabe eines geeigneten wäßrigen Lösungsmittels rehydratisiert werden. Dies ist unbequem, zeitraubend und kann zu Fehlmanipulationen Anlaß geben. Der Impfarzt vermeidet daher nach Möglichkeit die Verwendung von lyophilisierten Pockenimpfstoffen.

Die aus dem Lyophilisat rehydratisierten Pockenimpfstoffe haben zudem die Tendenz, von der Auftragsstelle auf der Haut wegzufließen, was vor allem so bei Massenimpfungen zu einer erhöhten Zahl von Versagern führen kann. Ein weiterer Nachteil ist die Instabilität der rehydratisierten Pockenimpfstoff-Lösungen.

Zweck der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zu entwickeln fur die Herstellung eines wesentlich verbesserten Pockenimpfstoffes, der einfacher und besser applizierbar ist, bei dem mögliche Fehlerquellen, insbesondere die Anwendung von bereits unwirksam gewordenem Impfstoff oder das Wegfließen des Impfstoffes von der Auftragsstelle, ausgeschaltet sind und womit demnach eindeutige Impfresultate erzielt werden. Eine prinzipielle Voraussetzung für einen thermostabilen Pockenimpfstoff ist die Abwesenheit von Wasser. Wasserfreie Vaccinia-Virus-Präparationen konnten jedoch bisher nie direkt, d. h. nicht ohne vorgängige Rehydralisierung, angewendet werden.

Neben der grundlegenden Verbesserung der Stabilität ist es aber auch notwendig, die Konsistenz der üblichen, flüssigen Pockenimpfstoffe zu erhöhen. Das letztere ist theoretisch durch einfachen Zusatz eines Viskositätsregulierenden Stoffes, wie beispielsweise Carboxymethylcellulose oder Lanolin, möglich. Die dabei erhaltenen viskosen Pockenimpfstoffe sind jedoch in der Praxis unbrauchbar und äußerst unhandlich. Sie müßten nämlich wegen ihres Wassergehaltes bei Temperaturen weit unter OC gelagert werden. Ein Wassergehalt von bloß 2% zerstört bereits die Lagerfähigkeit bei höheren Temperaturen. Euie ratioaelle Benutzung ist dadurch ausgeschlossen. Vaseline als Salbengrundlage ist ebenfalls ungeeignet, weil diese nicht resorbiert wird, und dieser hydrophobe Träger die Vaccinia-Viren an der Entfaltung der Aktivität hindert. Bis heute gibt es keine brauchbaren Pockenimpfstoffe in Salbenform.

In der USA-Patentschrift 3 378 443 wird vorgeschlagen, die Verschiffung und Lagerung von getrocknetem biologischem Material, z. B. von Vak/inen inkl. Pockenvakzine und Toxoiden, zu rationalisieren, indem man dieses gegen Luft und Feuchtigkeit empfindliche Material statt in abgeschmolzenen, evakuierten und mit einem inerten Gas gefüllten Eintel-Verpackungen zu verschiffen, mit Silikonöl vermischt und auf diese Weise gegen Einwirkung von Feuchtigkeit oder Luft schützt. Diese Maßnahme ist vergleichbar mit dem Konservieren von Wein durch Bedecken der Oberfläche mit einer Schicht öl oder dem Versiegeln von Konfitüre mit einer Schicht Paraffin Es is» dabei gleichgültig, ob die Masse homogen ist oder sedimentiert. Wichtig ist dabei nur der Abschluß nach oben. Dabei ist sowohl das Verfahren zur Herstellung der Mischung als auch die Viskosität des verwendeten Silikonöls ganz unkritisch.

Die vorliegende Erfindung dagegen betrifft das Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffsalbe, bei der die einzelnen Virus-Partikeln, oder kleine Aggregate davon, mit einem Silikonfilm vollständig umhüllt und geschützt sein müssen.

Bei der Anwendung dieser Impfstoffsalbe aus Tuben bei Massenimpfungen muß jede herausgedrückte Partie dieselbe homogene Zusammensetzung aufweisen. Eine auch nur partielle Sedimentation würde dazu führen, daß ein bestimmter Teil des Tubeninhaltes bedeutend weniger Virus-Partikeln enthalten würde als der andere, womit ein durchgehender Impferfolg in Frage gestellt würde.

Zur Anwendung der Impfstoffsalbe in Einzeldosen ist ein stecknadelkopfgroßes Impfsalbetröpfchen zwischen den Spitzen eines Perpunktors aufgetragen und wird so zur Anwendung an den Arzt versandt. Dabei darf das Impfstofftröpfchen auch bei längerem Lagern bei erhöhter Raumtemperatur sich nicht entmischen und nicht von den Spitzen abfließen, d. h.. die Umhüllung der einzelnen Viren mit einem Film von Silikonöl darf nicht brechen.

Falls der Silikonfilm unterbrochen wird, werden die Viren ungeschützt den Einwirkungen der Atmosphäre (v. a. der Luftfeuchtigkeit) ausgesetzt und dadurch inaktiviert (s. Beispiel 3). Treten innerhalb des stecknadelkopfgroßen Impfsalbetröpfchens Ausscheidungen auf und/oder fließt die Impfstoffsalbe von den Spitzen des Perpunktors auch nur teilweise ab, so gelangen bei der Anwendung, z. B. durch Skarifikation, zu wenig aktive Viruspartikeln an die Impfstelle, und der Impferfolg ist in Frage gestellt.

Diese vergleichsweise sehr hohen Anforderungen, die an die Pocken-Impfstoffsalbe gestellt werden, erfordern ein gaaz spezifisches Verfahren zu seiner Herstellung und die Verwendung von Silikonöl ganz bestimmter Viskosität Nur dann ist die Umhüllung der Viruspartikeln gewährleistet und die unzerstörbare Einbettung dieser Partikeln in einer stabilen Salbe

Es wurde nun ein Verfahren gefunden zur Herstellung der gewünschten wirksamen, stabilen, wasserfreien, zur direkten Applikation durch Skarifikation geeigneten, handlichen Pocken-Impfstoffsalbe in Form einer Dispersion, die hochviskoses Silikonöl als dispergierende Phase enthält.

Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man feingemahlene lyophilisierte Pocken-Vakzine zunächst mit sehr niedrigviskosem, leicht flüchtigem, verdunstbarem Silikonöl versetzt, die Mischung weiter sehr fein mahlt und dispergiert, wodurch eine Korngröße der Vakzinepartikeln von kleiner als 1 um erreicht und damit eine besonders homogene, praktisch virusdisperse Verteilung erzielt wird, welche die Voraussetzung für eine gleichmäßige hohe Wirksamkeit bildet, danach ein hochviskoses Silikonöl mit einer Viskosität von etwa 30000 bis etwa 100000, Vorzugsweise von etwa 50000 bis etwa 80000 Centistokes bei 20^cC und gegebenenfalls durch Flammenhydrolyse hergestellte kolloidale Kieselsäure in einer Menge bis zu 2% bezogen auf das Silikonöl zusetzt, die Dispergierung fortsetzt und schließlich durch Einblasen eines inerten Gases oder Anwendung eines Vakuums das niedrigviskose Silikonöl entfernt.

Durch dieses Verfahren wird erstmals eine äußerst homogene Verteilung des trockenen Pockenimpfstoffes erreicht, was die Voraussetzung für seine Wirksamkeit bei der direkten Applikation bildet.

Der so erhaltene Pockenimpfstoff weist die gleiche Stabilität auf, wie der lyophilisierte Pockenimpfstoff.

Folgende Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind charakteristisch:

1. Durch die feine Mahlung und Dispergierung im niedrigviskosen Silikonöl wird eine weitaus feinere — praktisch eine virusdisperse — Suspension der Vaccine-Viren erzielt als dies bei der direkten 4s Anwendung von hochviskosem Silikonöl möglich wäre, da das Eindringlings- und Dispersionsvermögen mit steigender Viskosität stark abnimmt.

Die Viren sind jedoch in der dünnflüssigen Suspension nicht unverrückbar eingebettet, die flüssige Suspension ist nicht stabil, es treten Sedimentationen auf.

Außerdem ist die flüssige Suspension zur direkten Anwendung zur Impfung ungeeignet. Sie fließt von der Impfstelle ab, der Kontakt mit der skanl./i.rten Hautstelle ist nur flüchtig, und die Versagerquote ist dementsprechend hoch.

2. Duich den Zusatz der hoch viskosen Silikonöl-Fraktion zur bereits bestehenden, sehr feinen virusdispersen Suspension und die erst nachträgliche Entfernung der leicht flüchtigen, niedrigviskosen Siiikonöl-Fraktion wird der ursprünglich bestehende sehr hohe Dispersionsgrad aufrechterhalten und durch die beim Verdampfen bzw. Verdunsten der leicht viskosen Siiikonöl-Fraktion allmählich entstehende Salbenform, welche jede Sedimentation ausschließt, fixiert.

Durch die Salbenform wird außerdem das Abfließen aus der Impfstelle verhindert Ein großer Vorteil der erfindungsgemäßen Salbenform des Impfstoffes besteht neben seiner guten Lagerfähigkeit in seiner außerordentlich einfachen direkten Anwendbarkeit, indem nur eine kleine, stecknadelkopfgroße Menge auf die skarifizierte Haut aufgetragen werden muß. Dabei bleibt der Impfstoff infolge seiner salbenartigen Konsistenz an der Auftragsstelle haften und bringt eineausreichende Virusmengezur Wirkung, während bei flüssigem und in Suspension gebrachtem lyophilisiertem Impfstoff immer die Tendenz des Abfließens besteht.

Bei weit mehr als tausend genau registrierten Impfungen zeigte sich, daß der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Impfstoff den bisher verwendeten Impfstoffen mindestens gleichwertig ist Bei gleichzeitiger Applikation beider Impfstoffe verlaufen die Impfreaktionen bei Primo- als auch bei Re-Vakzinationen bei ein- und derselben Person gleich (vgl. dazu M. S t r a η s k y,Schweiz. med.Wschr. 103,20/21 Γ1973], s. auch Beispiel 5).

Die optimale Wirksamkeit des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten salbenförmigen Pockenimpfstoffes, die in vitro, am Versuchstier und an tausenden von Freiwilligen bewiesen wurde, war nicht ohne weiteres zu erwarten, da das Silikonöl die in ihm dispergierten Impfstoffteilchen in gleicher Weise von den Hautzellen des Impflings isolieren könnte, wie es sie von den zersetzenden Einflüssen der Atmosphäre in der Tat tut Der Kontakt de;· Impfstoffteilchen mit den Hautzellen ist die Voraussetzung seiner Wirksamkeit und die Isolierung von der Luft und Feuchtigkeit ist die Voraussetzung seiner Stabilität.

Beispiele für die Herstellung und Prüfung von Pockenimpfstoffsal ben

Beispiel 1

a) Als Ausgangsmaterial für die Impfstoffherstellung können die üblichen Vaccinia-Virusstämme, wie z. B. Elstree, Bern, New York. EM 63, verwendet werden, die gewöhnlich auf der Haut von Tieren vermehrt werden.

Die z. B. mit dem Vaccinia-Stamm Elstree erzeugte Pulpa wird geemtet und bei - 25 C eingefroren und gelagert.

1 Gewichtsteil Pulpamaterial wird mit 9 Gewichtsteilen Mc Ilvainpuffer (M 0,004), 0,4% Phenol und 10% eines niedrigen aliphatischen Chlor-fluor-kohlenwasserstoffes, z. B. CHCl₂ — CClF₂ suspendiert und homogenisiert. Nach Abtötung der Begleitbakterien, vor allem durch das Phenol, wird die Virussuspension während 15 Minuten bei 1000 g zentrifugiert.

Der überstand, der pro 1 ml 1 · IO⁹ pfu (plaque forming units) Vaccine-Viren enthält, wii ' abdekanliert mit einem gleichen Volumen einer 10%igen Pepton-Lösung, gemischt und lyophilisiert.

b) Die Lyophilisierung erfolgt beispielsweise in Plasma-Stechflaschen von 500 ml Inhalt, in welchen sich rostfreie Stahlkugeln von 4—16 mm Durchmesser befinden.

Die offenen Flaschen werden bei -70°C vorge- Das leicht flüchtige Silikonöl kann dem Abgas

kühlt, danach mit je 100 ml Virussuspension/Pepton- durch Kondensation in einer Kühlfalle entzogen und

Mischung beschickt und bei -70⁰C eingefroren. erneut eingesetzt werden. Die Entfernung der leicht

flüchtigen Silikonöl-Fraktion ist aber auch du-ch

TrocknungsbedingungeB 5 Anwendung von Vakuum oder kombinierte An- Kammertemperatur -5ObIsO¹C, wendung von Schutzgas und Vakuum möglich.

ansteigend Durch dieses Verfahren wird eine äußerst homogene

Drucfc 5 - ίο ~² Torr "^nd stabile Verteilung der Vacciniaviren erreicht, was Dauer 24 Stunden die Voraussetzung fur die Wirksamkeit des Impf-

lo stoffes bei der direkten Applikation durch Skarifi-

Narhtrocknung bei 0 bis + 30^uC, kation bildet.

ansteigend Bj_e erhaltene Pockenimpfstoßsalbe ist, wie aus der

Druck 2 · 10 ~^s Torr Bestimmung des Titerabfalles hervorgeht, ebenso Dauer 20 Stunden stabil wie der reine lyophilisierte PockenimpfstoiT

15 (s. Beispiel 5).

Bis zur Einbettung der Viren in das Silikonöl muß

nun das Lyophilisat vor der Einwirkung von Sauer- B e i s d i e 1 2 stoff oder Feuchtigkeit geschützt werden, z. B. durch

ein Schutzgas. Zu diesem Zweck werten die Flaschen Konsisten? der Impfstoffsalbe unter Stickstoff (99,99%ig) verschlossen. Der Ver- 20

Schluß besteht z. B. aus absolut trockener Durchstech- Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren er- Scheibwidichtung und Schraubdeckel. haltene Produkt ist eine Impfsalbe. Als Salbe stellt

sie keine Newtonsche Flüssigkeit dar und unterliegt

O Mahlung und Dispergierung ^ηί<*¹ den Viskositätsregeln (Newtonsche Gleichung) Z5 Ihre Konsistenz, d. h. ihr Fheßwiderstand, hangt Die Flaschen werden auf einem horizontalen Wal- vielmehr von der Schubspannung ab und wird in

zensystem einige Stunden rotieren gelassen, wobei das Dyn/cm² ausgedrückt. Um die Moleküle der Salbe

Lyophilisat fein zermahlen wird. zum Fließen zu bringen (Fließgrenze), ist eine be- Pro Flasche werden nun 25 ml leicht flüchtiges stimmte Kraft in Dyn/cm² erforderlich (vergleiche Silikonöl von 0,65 cSt (Centistokes) und einem Siede- 30 z.B. Eprecht, Schweiz. Archiv für angewandte

punkt von etwa 97 bis 100^cC mit einer Spritze durch Wissenschaft und Technik, Heft Nr. 3. 25. Jahrgang.

den Gummistopfen zugesetzt. 1959).

Die Flaschen werden wiederum auf das Walzen- Die Fließgrenze der erfindungsgemäß erhaltenen system gebracht und während 3 bis 8 Stunden rotieren Pockenimpfstoffsalbe variiert etwa zwischen 20 und gelassen, wobei das Lyophilisat weiter zerkleinert und 35 500 Dyn/cm². Sie läßt sich durch die Viskosität des die Viren im niedrigviskosen hocheindringungsfähigen Silikonöls und durch konsistenzerhöhende Zusätze. Silikonöl sehr fein dispergiert werden. Nun setzt man etwa von durch Flammenhydrolyse hergestellte kol-200 ml eines Gemisches aus gleichen Teilen hoch- loidale Kieselsäure in Mengen bis zu 2%, bezogen viskosem Silikonöl von 60000 cSt und niedrigviskosem auf das Silikonöl, beeinflussen. Die Kieselsäurezusätze Silikonöl von 0,65 cSt zu und wälzt die Flaschen 40 haben vor allem den Zweck, das Abfließen der steckwährend weiteren 6 Stunden. nadelkopfgroßen Impfstoffsalbenpartikeln, die zwi-Nun werden die Flaschen entleert, die Dispersion sehen den Spitzen eines Perpunktors aufgetragen wird von den Stahlkugeln getrennt und mit Stickstoff sind, beim Lagern und beim Transport zu verhindern, durchflutet, um das leicht flüchtige Silikonöl von Der Zusatz der Kieselsäure erfolgt !gegebenenfalls 0,65 cSt zu entfernen, wonach die Pockenimpfstoff- 45 zusammen mit der Zugabe des hochviskosen Silikonöls Dispersion eine salbenförmige Konristenz aufweist, (s. Beispiel 1 c): Dispergierungen von lyophilisierten die sich innerhalb eines weiten Temperaturbereiches Pocken-Vakzine in leicht flüchtigem Silikonöl werden nur wenig verändert. nach Beispiel 1 c) hergestellt, mit einer Mischung aus Wie exakte Gewichtskontrollen ergaben, wird bei 0,5 bis 2 g kolloidaler Kieselsäure 100 g Silikonöl von der Durchflutung mit dem Schutzgas (z.B. mit 50 0,65cSt und 100ml Silikonöl von 6000OcSt versetzt 99,99%igem Stickstoff) die niedrigviskose Silikonöl- und anschließend während weiteren 6 Stunden im Fraktion, die sehr leicht verdunstet, praktisch voll- Kugelmahlsystem nach Beispiel 1 c) rotieren gelassen ständig entfernt. und danach wie im Beispiel 1 c) aufgearbeitet.

	Zusammensetzung	konsisten/erhöhender Zusatz	f'heßgrenze
Vaccima-Lyophilisal	Silikonöl (hochviskos) [Viskosität]		in D>n,cm²
5g	20 g		20
	[60000 cSt]	0,3 g
5g	40g	Kieselsäure	200
	[60000 cSt]	0,3 g
5g	20 g	Kieselsäure	330
	[60000 cSt]	0,5 g
5g	20 g	Kieselsäure	500
	[60000 cSt]

Fortsetzung

Vaccinia-Lyophilisat	Zusammensetzung Silikonö! (hochviskos) [Viskosität]	koiisislenzerhöhender Zusatz	Fließgrenze in Dyn/cm²
Zum Vergleich: 5g 5g	20 g [10000 cSt] 20 g [20000 cSt]	~0,l g	0 (keine Fließgrenze; es liegt eine Flüssigkeit, keine Salbe vor) 0 bis 10 (halbflüssige instabile Masse mit unzureichen der Trägerfähigkeit für das Lyophilisat, sedimen- tiert beim Lagern)

Der wesentliche Fortschritt der nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Impfstoffsalben gegenüber Virus-Suspensionen in niedriger viskosen Silikonölen ist offensichtlich.

Beispiel 3

Einfluß der Viskosität des Silikonöls auf Brauchbarkeit der damit hergestellten Pockenimpfstoffsalbe

Zur Demonstration des Einflusses der Viskosität des verwendeten Silikonöls auf die Brauchbarkeit des damit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Impfstoffes wurden die folgenden Versuche durchgeführt:

Auf Objektträgern von 76 · 26 mm wurden Filme aus je 30 mg nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Impfstoffsalbe bzw. eine feinst homogenisierte 4°

Impfstoffsuspension aufgetragen, zu deren Herstellung Silikonöl verschiedener Viskosität verwendet wurde. Die Objektträger wurden 2 Wochen bei 37° C unter Zutritt von Luft und Luftfeuchtigkeit stehengelassen. Versuch

Vor und nach dieser Exposition wurde die Aktivität der angewandten Impfstoffzubereitung bestimmt (Tabelle).

Bereitung der Impfstoffsalbe bzw. -suspension:

A. Nach den im vorstehenden Beispiel 1 beschriebenen Verfahren 1 a),b) wurde in einer Plasma-Flasche 5< > Virus-Lyophilisat bereitet.

In diese Flasche wurden zunächst 25 ml Silikonöl mit einer Viskosität von 0,65 cSt (Centistokes) eingespritzt und rotieren gelassen. Nach 8 Stunden wurden weitere 75 ml Siiikonöi derselben Viskosität zugesetzt und weitere 6 Stunden rotieren gelassen.

B. Wie A mit folgenden Abänderungen: In die mit 25 ml dünnflüssigem Siiikonöi (0.65 cSt) bereitete Suspension wurden 100 ml Süikonöl von 1250OcSt zugesetzt und wie im Beispiel Ic) weiterbehandelt. wobei am Schluß das leicht flüchtige Süikonöl verdunstet wird. , ..

C. Wie A mit folgenden Abänderungen: In die mit 25 ml dünnflüssigem Silikonöl bereitete Suspension wurden 200 ml eines Gemisches aus gleichen Teilen Silikonöl von 3000OcSt und 0,65 cSt zugesetzt und nach dem im Beispiel IcJ beschriebenen Verfahren weiterbehandelt.

D. Wie C mit folgenden Abänderungen: Es wurden 200 ml eines Gemisches aus gleichen Teilen Silikonöl von 60000 cSt und 0.65 cSt zugesetzt.

E. Zur Suspension der lyophilisierten Pocken-Vakzine in niedrigviskosem, leicht flüchtigem Silikonöl wurde ein Gemisch (200 ml) von Silikonöl mit einer Viskosität von 80000 cSt und 0,65 cSt zugesetzt und nach dem Beispiel der Erfindung weiterverarbeitel.

Je 30 mg der vorstehend beschriebenen Impfstoffzubereitungen A, B, C, D und E wurden jeweils auf der Oberfläche eines Objektträgers von 76 · 26 mm gleichmäßig verteilt und bei 37°C normal feuchter Luft ausgesetzt.

Nach 2 Wochen wurde die Impfstoffzubereitung mit dünnflüssigem Silikonöl (0,65 cSt) vom Objektträger abgespült und deren Aktivität bestimmt.

Tabelle

0.65 cSt B !250OcSt

3000OcSt

D 6000OcSt

E A)OOOcSt Aktivität der Impfsloffzubereitung in pfu

(plaque forming units) pro 30 mc

bestimmt auf der Chonoallantois-

mcmbran (CAM)

Ausgangswert

9· 10*
7,0 · 10*
1.0 ■ 10"⁷
&£ 10"
7.6 10"

Endwert

(nach 2 Wochen

37 C)

10²

110* 5.4 · 10^s 5,9 · 10" 5,8 · 10"

Tilerabfall in log 10

1,27 0,14 0,12

Ergebnisse

Aus den Daten der vorstehenden Tabelle get hervor:

A. ImpfetoffenberertungenindünnilüssigetnSihico« öl sind als Film aufgetragen an der Luft nicht haltba:

Die Aktivität sinkt auf einen nicht mehr exakt bestimmbaren, sehr tiefen Wert ab.

B. Die Impfstoffzubereitung in Silikonöl von 12 50OcSt — entsprechend etwa der höchsten nach der USA.-Patentschrift 3378443 verwendeten Viskositat — erleidet in 2 Wochen eine Aktivitätseinbuße um mehr als 99,9%.

Eine solche Impfstoffsalbe ist nicht verwendbar.

C. Die Impfstoffsalbe, welche mit einem Silikonöl zubereitet wurde, das an der unteren Grenze der erfindungsgemäßen Viskositätsspanne (30000 cSt) steht, erfährt eine Aktivitätseinbuße um etwa 90%.

D./E. Die mit dem Silikonöl bevorzugter Viskosität (60000 und 80000 cSt) hergestellten Impfstoffsalben zeigen optimale Stabilität, selbst wenn sie in dünner Schicht exponiert werden, was in etwa der Verwendung als Einzeldosis mit dem Perpunktor entspricht.

Impfstoffsalben aus Silikonölen mit Viskositäten von über 100000 cSt weisen unerwünschte Eigenschaften auf, z. B. Fadenziehen beim Portionieren, wodurch eine genaue Dosierung unmöglich wird.

Beispiel 4

Messung des Einflusses von Zusätzen

kolloidaler Kieselsäure auf die Aktivität

der Pockenimpfstoffsalbe

Die Herstellung der Pockenimpfstoffsalben erfolgte in 6 Plasma-Stechflaschen nach Beispiel 1 mit den im Beispiel 3 C. D und E beschriebenen Abänderungen und wobei je 1 von 2 Flaschen mit Inhalt C, D und E in der Phase 1 c) zusätzlich mit 2 g kolloidaler Kieselsäure versetzt wurden (s. auch Beispiel 2).

Es wurden folgende Aktivitäten gemessen.

Tabelle

io

15

20

	C	Aktivität der ImpfslolTzubereitung in pfu	nut Zusatz	Tilcr-
	30000 cSt	(plaque forming units) pro Gramm	von 2% kolloider Kieselsäure	veränderung in log 10
	D	bestimmt auf der Chorioallantois-	2,0 · 10"	-0,13
Versuch	6000OcSl	membran (CAM)')
	E		2,5 · 10⁸	+ 0,04
(s. auch Beispiel 3\|	8000OcSt	ohne Kieselsäure
2.7 ■ 10"	1,9 · 10⁸	+ 0,07

2,3 · 10⁸

1,6· 10"

') Um den Salbenimpfstoff auf der CAM titrieren zu können muß das Virus quantitativ in wäßrige Suspension gebracht werden. Die Salbe wird zunächst mit niedrig-viskosem Silikonöl verdünnt und diese Verdünnung mit Mc Ilvainpuffer(0,04 M kräftig geschüttelt. Nach Abtrennung der beiden Phasen wire die virushaltige wäßrige Phase weiter verdünnt und geprüft

Ergebnis

Zusätze von 2% kolloidaler Kieselsäure habet keinen signifikanten Einfluß auf die Aktivität de Pockenimpfstoffsalbe.

Bi e i s ρ i e I 5

Prüfung der nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Pockenimpfstoffsalbe

a) Stabilitätsprüfung

Titerabfall bei der Lagerung bei 37°C wahrem Wochen.

Titration auf der Chorioallantoismembran (CAM)

Impfstoff
(Vaccinia Stamm E 1st reel

Pockenimpfstoffsalbe
mit einer Fließgrenze von 20 Dyn.rm²
gemäß Beispiel 1

Lyophihsierter Pocketjimpfetoff
(trocken), vor Gebrauch zu rehydratisieren

Pockenimpfstoff

(flüssig), amtlich geprüftes Handelspräparat

1. 2,4· iCpfu/gr

2. 1,8 · 10⁸ pfu/gr

4.5 · IO⁸ pfij/ml

1.0 4,9 · 10"⁷ pfu/gr
6,0 · IO⁷ pfu/gr

9,0 · 10" pfu/ml
1.0 · 10² pfti/ml

0,68 0,45

0.70

6.0

Die Tabelle zeigt, daß der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff ebenso haltbar ist. wie der lyophilisierte Impfstoff, während der flüssige Impfstoff unter gleichen Bedingungen einen Titerabfali von log 6.0 erleidet, was nach den Nonnen der WHO (World Health Organisation) einem völligen Wirkungsverlust gleichkommt.

b| Nachweis der Wirksamkeit

der Pockenschutzimpfung bei Versuchstieren

und Menschen

1. Prüfung am Kaninchen

Die nach Beispiel 1 hergestellte Pockenimpfctoff salbe wurde unverdünnt und in Verdünnungen vor

ΙΟ"¹, ΙΟ"², ΙΟ"³ und ΙΟ"⁴ geprüft. Die Verdünnungen wurden mit niedrigviskosem Silikonöl hergestellt.

Methode

Enthaarte Kaninchen-Haut-Felder von 5 cm² wurden mit je 100 mg der oben angegebenen Verdünnungen durch Skarifikation mittels multipler Durchstechung der Haut beimpft.

Ergebnisse

Unverdünnt und Verdünnungen bis 10 ³

= konfluierende Pustelbildung.
Verdünnung 10"⁴

= Bildung vereinzelter nicht konfiuierender
Pusteln.

II. Prüfung am Menschen
Impftechnik

Auf die mit Alkohol—Äther desinfizierte Haut wurde die nach Beispiel 1 hergestellte Impfstoffsalbe in stecknadelkopfgroßer Portion aufgetragen. Mit einer Lanzette wurde die Skarifikation durch Abschaben der Epidermis (Fläche von Durchmesser etwa 0,5 cm) durchgeführt. Der Impfstoff wurde danach mit der Impflanzette in die skarifizierte Epidermis leicht eingerieben.

Beurteilung des Impferfolges

Nach 8 Tagen wurden die Impfreaktionen kontrolliert. Als positive Reaktionen wurden Bläschen- und Pustelbildung betrachtet.

Ergebnisse der Revakzinationen

Impfstoff-Salbe 5	Anzahl der Impflinge	Positive Reaktion
Frisch hergestellt 12 bis 16 Monate bei + 4⁰C gelagert ίο 4 Wochen bei 37°C ge lagert	950 360 432	923 (97%) 347 (96%) 388 (90%)

III. Bestimmung der Reaktogenität am Menschen

Bei gleichzeitiger Impfung mit der erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffsalbe und mit dem konventionellen lyophilisierten Impfstoff, zeigten die Impflinge folgende Lokalreaktionen:

Gleiche Reaktion
auf beide impfstoffe

272

Stärkere Reaktion

mit konventionellem

Impfstoff

396

Stärkere Reaktion mit Impfstoffsalbe

56

Diese Befunde zeigen, daß der Salbenimpfstoff eher eine geringere Reaktogenität als der konventionelle Impfstoff aufweist.

Bis heute wurden mehr als 18000 Personen mit der erfindungsgemäß hergestellten Pockenimpfstoffsalbe erfolgreich geimpft.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung einer stabilen Pocken-Impfstoffsalbe zur Applikation durch Skarifikation, dadurch gekennzeichnet, daß man feingemahlene lyophilisieite Pocken-Vakzine zunächst mit sehr niedrig viskosem, leicht flüchtigem, verdunstbarem Silikonöl versetzt, die Mischung sehr fein mahlt und dispergiert, danach to ein hochviskoses Silikonöl mit einer Viskosität von etwa 30000 bis etwa 100000, vorzugsweise von etwa 50000 bis etwa 80000 Centistokes bei 20⁰C und gegebenenfalls durch Flammenhydrolyse hergestellte kolloidale Kieselsäure in einer <s Menge bis zu 2%, bezogen auf das Silikonöl, zusetzt, die Dispergierung fortsetzt und schließlich durch Einblasen eines inerten Gases oder Anwendung eines Vakuums das niedrigviskose Silikonöl entfernt.