DE2101803A1 - Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganis mus der Spezies Bacillus subtihs - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE 210 I Ö U O

dr. W. Schalk · dipl.-ing. P. Wirth · dipl.-ing. G. Dannenberg D R. V. SCHMIED-KOWARZIK - DR. P. WE 1 N HOLD · DR, D. G U DE L

6 FRANKFURT AM MAIN

CR. ESCHENHEIMER STRASSE 39

SK/SK

^Mi ff't-f Societe Rapidase S,A. lytlx .*-» B.P. 47

'•'-•-■¹' Seclin (Nord), Frankreich

Verfahren zur

Die Bezeichnung "alkalische Protease" steht für eine Klasse proteolytischer Enzyme, die im alkalischen pH-Bereich, z.B. bei einem pH-Wert zwischen B-11,5, v/irksam sind. Diese Materialien sind vielversprechend als Reinigungsmittel zur Fleckentfernung aus Bekleidung in den häufigen Fällen, wo die Flecken Proteinkomponenten enthalten. Ein v/eiterer Vorteil dieser Materialien besteht darin, daß sie im allgemeinen in Verbindung mit handelsüblichen Reinigungsmitteln verwendet werden können. Somit stehen Waschmittelformulierungen zur Verfügung, die alkalische Protease zur Verbesserung des Ver— ™ haltens der Formulierungen enthalten.

Bekanntlich kann alkalische Protease durch Züchtung des Organismus Bacillus

subtilis hergestelltt warden. Viele Organismen diaper Art ergeben jedoch nur eine Geringe Ausbeute an alkalischer Protease, wodurch die Herstellung des Materials aus diücci. Organismen unzureichend und teuer ist.

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2 1C -: O 3

En wurde nun gefunden, da" die L jchoriif'ürrni:>-.\rt dos urneniinnr-, :;. ;'-.liIu_> :.uLiilis gegenüber anderen Arten von üacillus suhtili:; wcsrnLÜGi verbesserte -.u:- L5uten an alkalischjr Protease liefert und ::-ornit einen vrespntlichon Vnrt;.:il bsi der Herstellung von alkalische Protease aufgrund erheblicher Zuri αίι:τ en in dEr Prcduktionsvarksarnkeit üurcii Verwendung des Organismus ergibt, Ι.·±υ Licheniformis-Art ivird von manchen Ctellen alü eine von subtilis unr.bfv'Irrji^s.: Art angesehen. Sie ist jedoch Bacillus suhtilis sehr ähnlich und wird crfindungsgerfiiifl als Unterart desselben angest^nen.

Die aus Licheniformis gp.bildüte Protease wird vorzugsweise clurcn Ausf.^:iliunir mit Methanol odsr einem anderen, nicht—wässrigen, polnren Lösun;j£:mittel von der Kultur abgetrennt.

Die erfindungsgemciß hergestellt= alkalische; Protease hat gewähnlich bei höheren Temperaturen eine größere Wirksamkeit als andere alkalische Pr.ot&usen, wodurch ihre Verwendung in automatischen 'Waschmaschinen erleichtert wird.

Lichenifarimis Organismen werden in einem Nahrmsdiurfi mit periodischen absatzvveisen Zugabenan löslichem Kohlehydrat während des größten Teils der Züchtungsperiode gezüchtet, um einen Gehalt an reduzierendem Zucker von etwa Q,1-2 Gew.-i/a, vorzugsweise 0,4-1 Gew.-^r;i, des Kulturmediums aufrechtzuerhalten. Die Züchtung erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 30-40 C. und einem pH-Wert von 5,0-8,0■während der gesamten Züchtungsdauer, um die vorteilhaft hohen Ausbeuten an alkalischer Protease zu erzielen.

Ein Vorteil in der Verwendung von Licheniformis besteht darin, daß man eine geringe Ausdeute cn Amylase-Nebenprodukt erhalt, während anürre, hoho Ausbeuter· an Protease liefernde Organismen dazu neigen, (iroiie Mengen un Amyla.se zu produzieren. ,

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'..ührcnil nur Zt'Jchtun r;j'".tufR wird es besonders bevorzugt, den pH~.,crt zv,^r:'.;:«":;::π (JjU-Ij₁L und die "i ί,,-η/κ.rutur zwischen ?/(~1;:ί^π0. zu halten.

Uie h'Iuri.:;:: Zurjubc lüclichcr Kohlehydrate ·,·..'.hrend der urfi Züchtuir:L.-.tui π in .;3-::ir,un Antnilcn zv.-ucks nufrochterhaltung der uLicn genannten Konzüntiv-'-ion an i'cdjzic-rcnuc:!:! Zucker vr:rbüS3crt das V/nchstum dec Grganitmus und die ProuuKtion an alkalischer Protease in unerwarteter V,eise.

Gewöhnlich wird Ltt;u:baute Stärke als Kohlehydratquelle verwendet. Dic3 GtLi leinn auf versehi rnnne .',eise-, ζ.!Γ. durci Verwundung von Enzymen, eurch V,-ärrr.3, durcli iir.urc ader durc;· irrendwslchs anderen geeigneten !.'.αΒηαηηιεη, auf ein reduziertes I.'.alekulurgEr.vicht abgeoaut sein.

Das ursprüngliche !„a^rv.yuiun, in das Bacilbu subtilis, Abart Lichenifornis, eingeführt v.irn, hat gc.vähnlicii ejnen Kohlehyciratgehalt von etwa 10-20 Gew.—,.. Nachdem nie Konzentration ecs Nührnediums an reduzierendem Zucker auf weniger als etv.a 2 Gew.—/j durc-i Stoff\vachseleinv.d.rkung ues Mikroorganismus reduziert worden ist, wird gewöhnlich in häufigen Anteilen in oben'beschriebener Weise weiteres Kohlehydrat zugefügt.

Die Konzentration en reduzierendem Zucker kann colorimetrisch mit einem Klett-Colorimcter unter Verwendung eines 54-Filters (540 m -u) bestimmt werden. Die Reduktion von üinitrosaücylsilure durch das zu testende f.'.edium wird gemessen und mit einam Glucose-^tandard in'dest. ,'.asser verglichen. Dann wird die Konzentration an reduzierendem Zucker auf Plucossbasis berechnet, d.h. man nimmt; an, daß d-'s einzige Anwesende Reduktionsmittel Glucose ist und berechnet die angenommenere G]uciisekc;nzentration als Konzentration an reduzierendem Zucker.

RAD

-*1 0 9 ö 3 1 / ί A 4 8 BAU

Nach Fortschreiten der Züchtung für eine zur UiIdung der HunhstausLuute an alkalischer Protease ausreichende Dauer wird die Ftnteaso gewöhnlich vom Rest des Mediums abgetrennt. Dies kann durch Filtrieren des Γ/ediums zur Entfernung von äußeren Feststoffen, Waschen derselben und einschließende Ausfällung der alkalischen Protease vom Filtrat erfo]uen.

Zur Ausfällung der alkalischen Protease vom Kulturfiltrat sind gewöhnlich polare Lösungsmittel mit einem niedrigen Wassergehalt geeignet. Verwendbare Lösungsmittel sind Aceton, Diethylether und Alkohole mit höchstens etwa 3 ■ Kohlenstoffatomen, wie Methanol, /.thanol und Isapropanol. Es können auch Mischungen polarer Lösungsmittel verwendet werden. Eine andere Klasse von Materialien" zur Ausfüllung der alkalischen Protease vom Kulturfiltriat sind die löslichen Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Kaliumnitrat und Natriumchlorid.

Vor der Ausfällung der alkalischen Protease vom Filtrat aus der Züchtung es ist es zv/eckmäßig,' das Kulturfiltriat und die zugefügte Vvaschlösung auf etwa 30-40 ^c/₃ des ursprünglichen Gewichtes einzudampfen. Dann wird die alkalische Protease vom EvacDrat, vorzugsweise mit einem Alkohol mit höchstens 3 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, ausgefällt.

Die so hergestellte Protease hat gewöhnlich ihre maximale proteolytische Wirksamkeit in einem Temperaturbereich von etwa 57—G7 C. bei einem pH—Wert von etwa 8,5.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.

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B e i s ρ j. π 1 2

(A) eine Kultur von Uacillus subtilis, Abart Licheniformis, wurde unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium mit einem pH-'.7ert von 6,0-6,7 bei einer Temperatur von 35-37^DC. gezüchtet. Das Kulturmedium enthielt die folgenden Bestandteile:

mit Amyipse abgebaute Maisstärke 30 Gew.-^o

gepreßte Hefe 0,1-0,8 Gew.~f;i

f.'aisweichflüssigkeit 0,9-2,5 Gew.-$

Lactose ' Li; 1-0,5 Gew.-^

P ho sp.horsäure 0,5-1,8 G ew. -f Ό - &

Calciumcarbonat 1 Gew.-^

Magnesiumsulfat Spur

Mangansulfat . Spur ^!

Zinksulfat " ' Spur

Kupfersulfat Spur

Eisencarbonat Spur

Wasser ' Rest

Als das Wachstum des Organismus den Gehalt an reduzierendem Zucker unter 1 % absinken ließ, wurde in häufigen Anteilen weitere mit Amylase abgebaute Stärke zugefügt, um die Konzentration an reduzierendem Zucker zwischen etwa 0,1—2

Gew.-f/o zu halten. Mj

Nach 50-üO-stündiger Fermentation wurden in der Kulturmaische etwa 29

Wirkcamkeits- Ä

Protease-yeinheiten pro ecm gefunden. Die Protease wurde mit Methanol ausgefüllt und abfiltriert. .■' *"

(lj) Üiü Wiederholung dus obigen Versuches ohne Zugabe der abgebauten Stärke in häufirjc;n Antfjilen ortjab eiruj Hüchstausbeute von etwa 2ü OÜÜ Protease-WirksamknitBoiriheitcn pro ecm nach etwa 4ü-ntündirjer Fermenttition.

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2\ -^! : 5 O 3

— U —

. Die Protease.—Wirksamkeitseinheiten wurden wie falijt berechnet: Eine Pufferlösung aus 3,0 g Tris-(hydroxymethyl}-::ninomcthan (als "Tris" bekannt) in Mischung mit 400 ecm dost. '.\asser wurde hergestellt und unter Rühren mit 1M-Salzsüure auf einen pH-.'.ert von 0,5 titriert, bann wurde riest. Wasser bis zu einem Volumen von 500 ecm zugefügt.

Es wurde eine Substratlösung hergestellt durch Zugabe von 1,3 g Casein zu CO ecm eines 0,05?,! "Tris"—Puffers bei einem pH-'.vert von 7,6, dann wurde zum Lösen das Caseins unter Rühren erhitzt. Mach dem Abkühlen.wurde weitere Pufferlösung bis zu einam Volumen von 100 ecm zugefügt.

Eine Mischung, zu der die in der obigen Fermentation hergestellten, enzymhaltigen Produkte zugefügt wurden, wurde in einer Reihe von Testrohren hergestellt, indem man in jedem Rohr 3 ecm der obigen Substratlösung, 3 ecm einer 0,02i\i-Natriumhydraxydlösung und 3 ecm einer 0,014 M Natriumtripolyphosphatlösung, die mit HCl auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht war, mischte. Die Rohre wurden mit Stöpseln verschlossen und auf eine Temperatur von 37°C. gebrächt. Der pH-Wert sollte bei 8,5 oder darüber liegen.

Mittels einer Uhr.mit zusätzlichem Zeiger wurdennach einer gegebenen Zeit 3 ecm einer Enzymlösung, die die zu bestimmende alkalische Protease enthielt, in jedes Tsstrohr mit Ausnahme der Kontrolle "ohne Substrat" gegeben, die statt dessen 3 ecm der oben hergestellten Pufferlösung erhielt. Der Rohrinhalt wurde mindestens 30 Sekunden durch Klopfen der Rohrende'gemischt und dann bei 37 C. bebrütet. Genau 15 Minuten nach Zugabe der Enzymlösung wurden jedem Rohr 10 g Trichloressigssurelösung (hergestellt durch Zugabe von 16 g Trichloressigsäure, 10 g Natriumacetat und Ίϋ,9 ecm Eisessig in einen Behälter und Verdünnen mit dest. Wasser auf 1 l) zugefügt. Pieso Mischung

109831/U48 ORIGINAL !MSFECTEO

9 in 13 03

zerstört ±ια I n::yai und verhindert ein:; «eitere Hydrolyse das urweBC.-r.Gn tinnnins durch du, V.nrym. Dann wurde ücr Inhalt jedes Rohres durcn ein V< z~ ,Vhatinan Mr. 42 i'cpicr filtriert, wobei der erste Anteil des Filtrates er.- = -durch das Papier filtriert wurde.

Gleichzeitig v.urdü eine "Enzym-Kontrollprabe" hergestellt, inaern rr.an 5 zzn der Fnzymlüsunn Ib Minuten bui 37°C. bebrütete. üic Lösung wurds dann zu einer Miscnung auc 3 ecm nuhatratlck.ung, 3 ecm 0,2N Natriumhydroxyc un; 2 zzn 0,Lj-I-Ii.¹! !Jatriuntripolvpha^phr.t zurcnr.hcn, nachdem die Mischung 15 !.'inurän rsi 37°w. bebrütet worden war und 1ü ccn v.m- obigen TrichlorcsüigiülursläE^-;: zugegeben vvuren. Mach Zugabe der Enzymlüsung wurde die Mischung err.svz rric gelegentlichem schütteln eine halbe Stunde bei 27°C. bebrütet und dann filtriert .

Dann wurden die optischen Dichten jedes der obigen Filtrate bsi 275 n,u ur.tsr Verwendung einer 10 ram Zelle und eines üpektrophotonieters bestimmt, ύετ sz eingestellt war, daß der Punkt einer lüD-vicjen Durchlässigkeit der abgsis£=-is Vfert der obsn hergestellten Kontrollprobe "ohne Substrat" war. Dann würger. ε^3 abgelesenen Werte korrigiert, indem man die optische Dichte der oben hergestellten "Enzymkontrollprobe" von den optischen Dichten der anderen Testlösungen subtrahierte.

Dann wurde die [.".enge an anwesender alkalischer Protease in Y.'irksarioiteinhoiten ausrjedri"ir.kt, die durch die folgende Formol berechnet wurden:

korrigierte opt.Dichte bei 27üm,u der- i!ydrijlycatmiüchuruj Süwirk.v-ink.- im Tristrohr Volumen (d.h. 22 zz~

iiinhBitun ⁼ opt.üid-tc bei 27Ü m,u von 1,ü mg ^{Zeit [aAu} '^{l= Π}*^Γ^ Tyrosin pro ecm (d.h. O,Ü11A)

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2101 303

-B-

D.h. eine Wirksatn'iitseinheit ist diejenige Enzymmenge, die in einer Minute unter den Bedingungen des obigen Testes ausreichend Tyrosin und andere Materialien durch Hydrolyse des Casein bildet, um bei 275 m,u eine solche Dichte zu ergeben, die gleich der Dichte einer Tyrosinlösung mit 1,5 mg Tyrosin pro ecm ist.

Beispiel 2

Wurde Beispiel 1 (A) und (θ) unter Verwendung eines Kulturmediums wiederholt, das nur 2,5 Gew.—yj der mit Amyläse abgebauten Maisstärke enthielt, wobei die restliche Maisstärke durch Wasser ersetzt war, und die Fermentation bei einer Temperatur von 37-42°C. für 70-80 Stunden durchgeführt, so erhielt man praktisch äquivalente Ergebnisse.
Beispiel 3

.(A) Eine Kultur Eacillus subtilis, Abart Licheniformis, wurde 20 Minuten auf

erhitzt, 60 C. in einer 0,ÖEM/aigen Natriumchloridlösung/auf eine Kartoffelschaibe be-

impft und 24 Stunden bei 37 C. gezüchtet. Danach wurden Stücke der Kartoffelscheibe zu 1000 ecm einer Mischung aus 4 g Dextrose, 5 g Natriumchlorid, 10 g Tripton, 3 g Rindfleischextrakt, 1 g Κ^ΗΡΟ», 3 g Hefeextrakt und dem Rest aus Wasser zugefügt. Diese Mischung wurde 16 Stunden bei 37°C. in einem RotationschüttelEutomaten zur Bildung eines bakteriellen · Inoculums bebrütet.

Aue den folgenden Bestandteilen wurde ein Maischenpräparat hergestellt/

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Gew.-Teile

mit Amylase abgebaute Stärkelösung -24 ^

(45 Gew.-i/i Stärke) ' ·

Lactose ' 4,3

K₂HPO₄ 4,3

Maisweichflüssigkeit 26,0

Phosphorsäure (75-^/oig) 12,9

Brewer's Hefe 7,2

Sojaprotein (Kaysoy) 3,65

Calciumcarbonat · 2,88

hydratisiertes Magnesiumsulfat .1,25

Natriumchlorid 0,72 * mk

Mischung aus 5 Gew.-Teilen Kleie und „ „

4 Gew.-Teilen Fettöl . '

hydratisiertes Ferrosulfat Spur

hydratisiertes Mangansulfat Spur

hydratisiertes Zinksulfat Spur

Wasser ■ ausreichend für sir,

Gesamtgewicht vor, 1000 Gew.-Teilen

Die obige Maische, wurde absatzweise 45 Minuten bei 125-130 C. sterilisiere und auf 35-37°C. abgekühlt. Zur Schaffung eines pH-Wertes von 6,3-6,5 v.lt=3 steriler Ammoniak zugefügt. Zur Maische wurden etwa 0,3 Gew.-iji des oben hergestellten bakteriellen Inoculums zugefügt, dann wurde etwa 20 Stunden ur.z=r Λ Belüftung und mit Rühren fermentiert. Während dieser Zeit wurde die Temperatur auf 35—37 C. und der pH-Wert durch periodische Ammoniakzugabe zwiscen 6,1—6,5 gehalten.

Danach wurde ein anderes, dem obigen ähnliches Maischenprüparat hergestellt, wobei 372 Gew.-Teile des 45-'/iigGn, mit Amylase abgebauten StürkOlüsung ur.z entsprechend wenicjor Wasser zugefügt wurden. Dia Maische wurde absatzweise untar dun obun beschrieborion Hßdinrjun[.ien sterilisiert, auf 35-37^DC. abgekühlt, und dünn wurde Ammoniak hi::> zu oincmi pii-.V^rL vi;iw (),4-(j,fi zuqt.fügt.

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.-,ο- 2li..:jO3

Etwa BO Gew.-Teile der bereits fermentierten f.'uiscnu wurden zum neuen !.tai^chbpräparat zugefügt, dann wurde 50 Stunden unten der obicrun Fermentations— bedingungen fermentiert. Der Kohlehydratgehalt der Forrnentationsrnischung wurde von Zeit zu Zeit untersucht, und gelegentlich wurden jev.ails et.'.u 17 Ge'.v.-Teile der obigen, mit Amylase abgebauten Stürkelusuno' zugegeben, um eine Konzentration an reduzierendem Zucker zwischen 0,4-1 Gew.-^j aufrechtzuerhalten. Gewöhnlich erfolgten die Kohlehydratzugaben alle 3 Stunden.

Die anwesende alkalische Protease wurde nach dem unten beschriebenen Verfahrein bestimmt und ergab die folgenden Werte:

Fermentation; std Protease-.Virksamkeitseinheiten

pro ecm

34 2 784

42 23 -655

46 24 166

50 ; 24 662

58 ■ 23 693

Dann wurde die erhaltene Maische filtriert und der Filterrückstand mit Leitungswasser gewaschen. "

Das FiItrat wurde auf eine Konzentration von etwa 18° Be. eingedampft, auf 3 C. abgekühlt und auf einen leicht sauren pH-Wert eingestellt. Zur Ausfällung der Protease wurde (.'.ethanol bis zu einer Konzentration von etwa BO ^4 zugefügt, der dann von der flüssigen Phase abfiltriert wurde.

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[JiD na cn ϋί.-ΓΓι obinnn Verfahren hergestellte alkalische Protease zei-v^ irre maximale prateolytiscnn V.irksainkeit bei etwa CD-OS C, gemessen durc: i"rs Hydrolyse van Casein für 10 Minuten bei einem pH-Wert von b,5. Die al-;?.li=--is Prütnaso zeigt hei einem pii-V.ert von etwa 10 ihre maximale proteolyciscr= Wii'ksnmkcit bei einer Temperatur von 37 C. und bei einem pH-v'/ert von οτ.νπ 9,(3 bei einer Temperatur von 61 C.

(Β) Der obige Versuch wurde wiederholt, wobei während der Fermentr-icr.ezsikeine absatzweise Zugabe der mit Enzym abgebauten Stürkel-ooung erfcli:--2. ία wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

Fermentation; std Protease-.VirksE-rnkoitseinr.si-^n

pro ecm -

30 13 11Ö

34 '15 930

42 10 395

Die Protease-Wirksamkeitseinheiten in diesem Beispiel werden wie 'in'EciszisI 1 definiert.

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Claims (6)

Potentansprüche

1.- Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganismus der Spezies· Bacillus subtili^s, Unterart Licheniformis, in aerober Weise in'einem Nährmedium bei einen pH-Wert von 5,0-8,0, dadurch gekennzeichnet, daß während des grüßten Teils der Züchtungsdauer des Mikroorganismus absatzweise häufig sin wasserlösliches Kohlehydrat zugefügt wird, um den Gehalt an reduzierendem Zucker im Medium zwischen etwa ü_s1-2 Gsw.-,₃ zu halten.

2,— Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kohlehydrat als abgebaute Stärke zugefügt wird,

3.- Verfahren nachAnsprush 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, deß die Temperatur 3U-4G C. beträgt.

4,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, -daß die Temperatur 34-38°ü. beträgt und der pH-Wert 6,0-6,6 ist. · .

5,- Verfahren ndch Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an reduzierendem Zucker zwischen 0,4-1 Gew.-ya gehalten wird.

6.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, .üaB der Mikroorganismus gezüchtet wird, indem man ihn in ein [Jährmedium mit etwa 10—20 Gev.'.-j. Kohlehydrat in Form von abgebauter Stärke, bezogen auf das Gewicht dec Mediums gibt, und, nachdem der Kohlehydratgehalt Durch die Etoffwechseleinwirkung des Mikroorganismus auf weniger als etwa 2 Gew. — .' verringert worden ist, in häufigen Anteilen Kohlehydrat zugefügt, um den Gehalt an reduzierenden Zucker zwischen utv.a 0,4-1 Gew.-^o zu halten. ₍

Der Patentanwalt:

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