DE2034708A1 - Verfahren zur Herstellung eines Anacar dium occidentale L Extraktes - Google Patents

Description

Patentanwälte

DlpUng. R. BEETZ ·βα
Dlpl-Ing. K. LAMPRECHT

eMünch_en22,Stein.dorf₈tr. 10 90-15-9ObP 13.7.1970

ALBERT ROLLAND S.A., P a r i s (Prankreich)

Verfahren zur Herstellung eines Anacardium occidentale

L-Extraktes

Gegenstand der Erfindung ist ein neuer vegetabilischer Extrakt, der ausgehend von der Rinde des Anacardium oocidentale L (auch bekannt unter dem Namen Anacardium senegalensis) erhalten wird. Der Anacardium occidentale L gehört zur Familie der Anakardiazeen, zu der ebenfalls der Rhus, die Pistazie und ä die Terebinthe gehören.

Der Anacardium occidentale L oder Kaschu=Acajoubaum ist nordamerikanischen Ursprungs und wird laufend im Senegal angepflanzt. Seine Prucht, die Acajounuß, wird für verschiedene äußerliche Anwendungen, wie beispielsweise für die Behandlung von Geschwüren und Warzen benutzt. Therapeutisch wird die Prucht hauptsächlich als antilepröses Topicum verwendet. Dabei tropft man den Mesokarpsaft auf die Lepraflecke

96-(H 7591-cas 36)-D+ö-NöE (O)

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und trägt auf die mit Hilfe des Vesicatoriuras künstlich erzeugten Wunden antilepröse Pasten auf.

Die Rinde enthält einen Gummi bzw. ein Baumharz, das hervorquillt, wenn der Baum eingekerbt wird und unter Farbveränderung von rot nach gelb dick wird. Dieser Gummi wird für das erfindungsgemäße Verfahren nicht verwendet.

Insbesondere seit der Veröffentlichung der Costa de Aguiar in der brasilianischen Zeitschrift "Anais da Paculdade de Medecina da üniversidade do Recife", Vol. l8, Nr. 2, Seiten 19>7, (1958) ist bekannt, daß die Rinde des Anacardium occidentale L einen blutzuckersenkenden Wirkstoff enthält. Nach diesem Autor werden die blutzuckersenkenden Eigenschaften bei Ratten nachgewiesen, die mit einem folgendermaßen hergestellten Produkt behandelt wurden: Abkochen von 50 g Rinde in einem Liter Wasser, Einengen auf 25% und anschließendes Verdünnen auf ein Zehntel mit einer physiologischen Salzlösung von 8,5#> wobei der End-pH-Wert bei 7 liegt.

Die Anmelderin hat nun überraschenderweise gefunden, daß die Rinde des Anacardium occidentale L einen antihypertensiv wirksamen Wirkstoff enthält, der durch spezielle Methoden extrahiert werden kann, die sich von bekannten durch wässrige Mazeration der Rinde, Licht- bzw, Luftabschluß und niedrige Temperatur (0 bis 5°C) unterscheidet. Die anti-

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hypertensive Wirkung let völlig überraschend, denn ein Absud, der durch Eintauchen der Rinde in kaltes Wasser und Siedenlassen dieses Ansatzes über eine gewisse Zeit erhalten wird, zeigt keinerlei antihypertensive Wirksamkeit,

Das erfindungsgemäfle Verfahren zur Herstellung eines antihypertensiv wirksamen Extraktes von Anacardiura occidentale L-Rinde ist dadurch "gekennzeichnet, dafl man frische von Gummi bzw. Baumharz befreite Rinde fein pulverisiert und im Dunkeln bei einer Temperatur zwischen O und 5°C in einer Konzentration von 20 bis 50 g zerkleinerte Rinde pro Liter destilliertes Wasser einer wässrigen Mazeration unterwirft, anschließend filtriert und das Piltrat zur Erzielung eines Extraktes mit 20 bis JOJi Trockengewicht (bezogen auf das Gewicht der zerkleinerten Rinde) einengt;

Zur Erfindung gehört selbstverständlich der nach diesem Verfahren erhaltene Extrakt. Dieser ist für die Herstellung 'antihypertensiv wirksamer Mittel brauchbar und wird für pharmazeutische Zusammensetzungen zusammen mit physiologisch akzeptablen Trägern verwendet.

Die Herstellung einer Suspension der beispielsweisemit Hilfe eines Siebzerkleinerers fein gepulverten Rinde erfolgt unter Rühren mit destilliertem Wasser bei einer Temperatur zwischen 15 und 25°C. Danach wird unter Llehtabschlüß bei einer Temperatur zwischen 0 und 5°C mazeriert.

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Am Ende der Mazeration wird die Suspension filtriert, wobei sie immer noch unter Llchtabschluß und bei einer niedrigen Temperatur zwischen 0 und 5°C gehalten wird. Man engt im Vakuum ein und nach Ruhenlassen im Dunkeln bei niedriger Temperatur wird gefriergetrocknet.

Es folgen Beispiele zur Erläuterung der Erfindung. Beispiel 1

100 g Rinde wurde unter Verwendung eines Siebgitters bzw. -rostes unter Gewinnung von 88 g eines feiner als Sägespäne pulverisierten Produktes zerkleinert. Dieses Pulver wurde in 4,4 1 destilliertem Wasser bei 20⁰C in einer Konzentration von 20 g/l suspendiert. Es wurde etwa 5 Minuten lang gerührt. Die Mazeration in einer Kühlkammer von +2⁰C unter Lichtabschluß dauerte 48 Stunden, wobei am Tag alle 2 bis 4 Stunden gerührt wurde. Filtriert wurde ebenfalls in der Kühlkammer bei +2⁰C unter Lichtabschluß, und zwar durch eine erste Filterscheibe (trüber Saft) und dann durch eineweniger poröse zweite Filterscheibe (blaßroter durchsichtiger Saft).

Das Filtrat (5,8 1) hatte einen pH-Wert von 5,8 und eine Trockenextraktkonzentration von 0,68 Gew.-^ entsprechend einer Gesamtmenge gelösten Produktes von 25,64 g. Es wurde

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im Vakuum auf einem Wasserbad von 25°C bis auf ein Volumen von 380 ml entsprechend 6,8 Gew.-% Trockenextrakt eingeengt. Nach Ruhenlassen bei +2⁰C bildete sich in der Lösung eine Ausfällung. Eine homogene Probe wurde durch ein Faltenfilter filtriert. Der auf dem Filter verbliebene Niederschlag wandelte sich beim Aufheizen in ein braunes gummöses Harz um» Der Rest der Lösung, d.h. 320 ml, wurde zur Lyophilisierung über Platten geschickt. Man erhielt 20 g eines chamois-farbenen Produktes von sehr geringer Dichte.

Beispiel 2

Als Ausgangsmaterial wurden 90 g Rinde verwendet. Während der Zerkleinerung bzw. des Mahlvorganges zeigten sich Schwierigkeiten, die von dem noch zu feuchten Zustand des Ausgangsmaterials herrühren konnten (leichte Neigung zum Anbräunen bzw. zur Karamelbildung an der Mahlvorrichtung). In diesem Falle wurde mit zwei-Durchgängen ohne Siebrost gearbeitet. Das gesammelte, zerstückelte und gemahlene Produkt wog 90 g. Es wurde unter etwa 5 Minuten langem manuellen Rühren in 4,5 1 destilliertem Wasser von 20⁰C mit einer Konzentration von 20 g/l in Suspension gebracht. Anschließend wurde die Suspension in einer Kühlkammer von +2⁰C unter· Lichtabschluß 9 Tage lang ruhengelassen, wobei zweimal am Tage einige Minuten lang durchgerührt wurde. Filtriert wurde in der Kühlkammer bei +2⁰C

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unter Lichtabschluß, und zwar durch eine erste Filterscheibe (trüber Saft) und dann durch eine zweite weniger poröse Filterscheibe (blaßroter durchsichtiger Saft).

Das Filtrat hatte ein Volumen von 4,2 1, der pH-Wert lag bei 5*25 und die Konzentration an Trockenextrakt bei 0,62 Gew.-%. Es wurde im Vakuum auf einem Wasserbad von 25°C bis auf 400 ml eingeengt, d.h. auf einen Trockenextraktgehalt von etwa 6,5 Gew.-Jß und anschließend bei +2°C ruhengelassen, wobei sich in der Lösung Ausscheidungen bildeten. Eine homogene Probe wurde durch ein Faltenfilter filtriert; der auf dem Filter zurückgehaltene Niederschlag wandelte sich beim Aufheizen in einen braunen gummösen Lack um« Der Rest der Lösung (320 ml) wurde zur Lyophilisierung Über Platten geschickt. Man erhielt 25 g eines chamois-farbenen Produktes von sehr geringer Dichte»

Dieser Extrakt wurde an Cellulosepulver mit einer Wanderungszeit von 5 Stunden zweidimensional chromätographiert unter Verwendung unterschiedlicher Lösungsmittel und Farbreagenzien je nach nachzuweisenden Wirkstoffen.

Die erhaltene Fraktion hat keinen Eiweißcharakter und enthält sehr wenig Aminosäuren.

Indolkerne wurden mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in η Salzsäurelösung nachgewiesen. Es wurden rosaviolette Flecke beobachtet.

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Der Extrakt scheint keine Purinderivate zu enthalten (rosaviolette Färbung mit Eosin) und keine reduzierenden Zucker oder deren Phosphorsäureester (Abwesenheit von orange-farbenen Flecken mit Pikrinsäure). Es 1st allerdings su bemerken, dafl die Erkennung gewisser Einfärbungen, wie insbesondere diejenigen reduzierender Zucker, die Eigenfärbung des erfindungsgemäfien Extraktes schwierig gemacht | wird.

Dagegen wurde das Vorhandensein von Desoxyribosiden (nachgewiesen mit einer Lösung von Cystein-hydrochlorid in 3 η Schwefelsäure), von ThIölen in sehr groBer Menge, von Dlsulfiden, phosphorhaltlgen Verbindungen und schließlich von Spuren von Aminosäuren festgestellt.

Mit dem Draggendorf-Reagenz wurde das Fehlen von Alkaloid-Reaktionen festgestellt.

Die Chromatogranane des Anacardlum Occident ale L-Extraktes wurden mit Chroaatogrammen von Nierenextrakten gemäB der britischen Pattntschrift 991 491 verglichen. Der für die Anwesenheit von Indolkernen. in der vegetabilischen Fraktion sprechende^Vosa Fleck entspricht dem violetten Fleck der Nierenfraktion· Die beiden Extrakte zeigen ähnliche Flecke, was die Desoxyriboside betrifft. Die Nieren* fraktion enthält dagegen reduzierende Zucker, Disulfide in

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geringer Menge und keine Thiole.

Der erfindungsgemäße Pflanzenextrakt wurde pharmakologisch untersucht und erwies sich als ahtihypertensiv wirksames Mittel.

Dabei wurde die Technik nach Page-Patton-Ogden angewandt, bei der eine herausgenommene bzw. vorverlagerte Niere mit Kollodium Überpinselt und die gegenüberliegende Niere 1 bis 4 Wochen danach entnommen wird. Diese Technik führt theoretisch zu chronischen Hypertensionen bei zwei Dritteln der so behandelten Tiere.

Tiermaterial;

Wistar-Hatten mit einem mittleren Gewicht von 2JO g während des ersten Eingriffs.

Druckmeßgerät;

Es wurde ein Oszillometer von Giono-Chevillard-Krauthamer verwendet, das die indirekte Messung des arteriellen Druckes am rückfließenden Blutstrom in der Distalpartie eines Organs, im vorliegenden Falle der Basis des Rattenschwanzes, während der langsamen Dekompression der Manschette ermöglicht.

Das Tier wird zur Erzielung einer Vasodilatation JX)

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Minuten lang bei einer Temperatur in der Gegend von gehalten, wobei die Oszillometermanschette von Anfang an an Ort und Stelle ist. Für die Messung muß das Tier absolut bewegungslos sein, was bisweilen sehr lange Wartezeiten erfordert. Man verwendet mit Vorteil einen zusätzlichen Käfig, in dem mehrere Ratten bei 30 C gehalten werden können und gewinnt so beträchtlich an Zeit, I

Arbeitsweise:

Die Ratten wurden mit Äther anästhesiert. Nach Durchschneiden von Haut und Muskelschicht wurde die Niere herausgenommen bzw. vorverlagert und dann, ohne das Parenchym zu verletzen, vorsichtig die Bindegewebskapsel entfernt. Nach einem linden Austrocknen der Niere wurde auf die gesamte Oberfläche eine Kollodiumschicht aufgetragen, wobei die Niere an einem Faden aufgehängt war. Es wurden nacheinander λ mehrere Schichten aufgetragen und der Faden dann in Höhe des Parenchyms abgeschnitten. Nach dem Eingriff und am folgenden Tage wurden 10.000 E und 3.000 E Penicillin injiziert. 10 bis 15 Tage später erfolgte die Nephrektomie der nicht behandelten Niere.

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Ergebnisse;

Es wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt, und. zwar die eine mit einer Dosis von 1 ml/kg einer wässrigen Lösung mit 50 g/l des erfindungsgemäßen Pflanzenextraktes und die andere mit einer wässrigen Lesung mit 100 g/l des erfindungsgemäßen Extraktes. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mit solchen verglichen, die bei Versuchen an Vergleichstieren erhalten wurden, die in der gleichen Weise wie oben angegeben wurde, in experimentelle Hypertension versetzt worden waren, jedoch nur identische Mengen von physiologischer Lösung erhielten.

Es wurde eine deutliche Senkung des arteriellen Druckes (TA) von 1 bis 3 Einheiten beim systolischen Druck (Tm) und von 2 bis 4 Einheiten beim diastolischen Druck (TM) beobachtet. Diese in der fünften Stunde festgestellte Drucksenkung hält mehrere Tage nach der letzten Injektion an. Die in den nachfolgenden Tabellen angegebenen Versuchsergebnisse lassen auf eine antihypertensive Wirkung bei unter experimentelle Hypertension versetzten Tieren (renale Hypertension) · schließen.

In den Tabellen Ia und Ib werden die Ergebnisse wiedergegeben, die bei 2 Gruppen von Vergleichstieren gefunden I wurden, die eine Dosis von 1 ml/kg physiologischer Lösung

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-limit 5 Gew.-Ji erhielten und In den Tabellen IHa und IHb die Ergebnisse von Vergleichsgruppen, die 1 ml/kg physiologischer Lösung mit 10 Gew.-Ji erhielten.

Die mit dem erfindungsgemXßen Extrakt behandelten Tiere wurden In 6 Gruppen eingeteilt. 3 Gruppen erhielten 1 ml/kg Anacardium ocoidentale L-Extrakt in wässriger Lösung mit einer Konzentration Von 50 g/l (Tabellen IXa₄ Hb und lic)« die drei anderen Gruppen erhielten 1 ml/kg erfindungsgemäßen Anaoardium-Extrakt in wässriger Lösung mit 100 g/l (Tabellen IVa, IVb und IVc).

Verglichen mit Ergebnissen, die mit Reserpin in einer Dosis von 1 ml/kg (subkutan)* mit Ci -Hethyldopa (alpha methyl dopa) in einer Dosis von 200 mg/kg und mit Guanethidinismelin (guanethldlne-lsmeline) in einer Dosis von 50 mg/kg erhalten wurden» scheint die antihypertensive Wirkung im Falle der antihypertensiv wirksamen Pflansenfraktion anhaltender zu sein als bei den drei genannten Substanzen, die über das sympathische Nervensystem einwirken.

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	1	T.A. vor der Injektion	5	TM	Tabelle	Ia	Ib	TM	Δ Tm	Wirkung	TM
	2	Tm	5	14		14	- 0,	ι ά	0
	5	12	4	.16	T.A. 4 bis 5 Std.. nach der Injektion	16	0	5	0
Ratte	4	12		13i	Tm	13,5	0		0
Ratte		10,	15	11,5	15	- 0,		0
Ratte		11,	14,	12	14,6	- 0,	5	0
Ratte		11,		10,5			25
Mittel				11
				11,2
				Tabelle
,6

T.A. vor der T.A. 4 bis 5 Std. Injektion nach der Injektion

Wirkung

	1	Tm	5	TM	5	Tm	5	TM	5	ATm	Δ TM
Ratte	2	11		14		10		15		- 1	- 1
Ratte	3	11		15		10,		15,	5	- 0,5	- 1,5
Ratte	4	11,		14	9	11		14		- 0,5	0
Ratte	5	9	7	U,	9		11,		0	0
Ratte	6	13	17	13	4	17	5	0	0
Ratte		9	12	9	12	0	0
Mittel	10,	13,	10,	15,	- o,5	- 0,4

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	1	T.A.	Tabelle	Ila	T.A. nach	4 bis 5 Std. der Injektion	Wirkung	ΔΤΜ
	2	Tm	vor der Injek tion	T.A. naoh		TM	ATm	- 2
	3	14	TM	Tm	17	- 1	- 1
Ratte	4	13	19	13	16	- 1	- 3
Ratte	5	15	17	12	16	- 3	.--..■-■ - !
Ratte		14	19	12	16	- 2,	- 3
Ratte		15	17 .	12	17	- 2	,8 - 2
Ratte		14,	20	13	4 16,4	- I1
Mittel			2 18,4	12,			Wirkung
	T.A.	Tabelle lib	4 bis 5 Std. der Injektion
	vor der Injek tion

TM

Tm

TM

ΔΤΜ

Ratte 1	14	19,	5	12	17	-2	- 2,5
Ratte 2	13	17		12	15	- 1	- 2
Ratte 3	15	19		11	15	-4	- 4
Ratte 4	15	19		13	16	-2	- 3
Ratte 5	18	23		14	18	- 4	-, 5
Mittel	15	19*	5	12,4	16,2	-2,6	- 3,3

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Tabelle ZIo

	1	T.A.	vor der tion	InJek-	T.A. 4 bis 5 Std. nach der Injektion	TM	Wirkung	Λ TM	4
	2	Tm		TM	Tm	15	Δ Tm	- 2	1
Ratte	3	13		17	12	14	- 1	- 2	9
Ratte	4	13		17	12	16	. - 1	- 3,
Ratte		15	,1	19,4	14	16	-1,1	- 3,
Ratte		14		19,1	p	15,2	- 1	- 2,
Mittel	13	,5	18,1	12,5		- 1
			Tabelle IHa

T.A. vor der Injek- T.A. 4 bis 5 Std. Wirkung

tion nach der Injektion

	Tm	TM	Tm	TM	Δ Tm	ΔΤΜ	- 1
Ratte 1	14	17	14	17	O	O	O
Ratte 2	14	18	14	19	O	O
Ratte 3	15	19	15	19	O	- 1
Ratte 4	15	20	15	20	O	- 0,4
Ratte 5	14	18	14	19	O
Mittel	14,4	18,4	14,4	18,8	O

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	T.A. vor der tion	Tabelle IHb	TJU 4 bis 5 Std· nach der Injektion	TM	TM	Wirkung	Δ TM	1	• 5
	Tm	Injek-	Tm	1*	16 -	ATm	0	0	• 2
	IO	TM	10	13	16	O	0	1	- 1
Ratte 1	IO	l4	10	14	15	0	0,4	■ 3
Ratte 2	n,5	13	11.5	14	i4	0 -		- 3
Ratte 5	10	15	10	12	14	0		• 2,4
Ratte 4	9*5	14	9	13.4	15,4	-0,5 -	ATm Atm
Ratte 5	10,2	15	10,1			- 0,1 -	- 2 .
Mittel		13.8	IVa	T.A. 4 bis 5 Sfcd· naeh der Injektion		- 3 ·
	T.A. vor der tion	Tabelle	Tm	Wirkung	- 2
	Tm	Injeic-	14		- 2
	16	TM	11		-2
Ratte 1	I*	21	11	- 2,5
Ratte 2	15'	18	11
Ratte 5	15	16	11 .
Ratte 4	15	17	11,5
Ratte 5	15,8	17 -.
Mittel	17,8

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Tabelle IVb

T.A. vor der Injek» tion

Tm

TM

T.A. 4 bis 5 Std. nach der Injektion

Tm

TM

Wirkung

Atm

Ratte	1	33	18	12	T.A. nach	35	- 1 " -	3
Ratte	2	14	19	12	37	.- 2	2
Ratte	3	14	19	3 3	37	- 1 - -	2
Ratte	4	14	18	11	14.	- 3	4
Ratte	UI	35	20	14	17	- 1	3
Ratte	6	33	16	11	14	- 2 - -	2
Mittel		13,	8 18,6	32,	3 15,6 e	-3,7 -	VjJ
			Tabelle IVc
		T.A.	vor der Injek tion	4 bis 5 Std. der Injektion	Wirkung

Tm

TM

Tm

TM

Δτι

Δ TM

Ratte	1	14	18	5	12	5	14	5 '	- 2	_ 4	UI
Ratte	2	11,5	14,		10	5	12	7"	- 1,5	- 2,
Ratte	3	12	15·	Ul	10	12	- 2	- 3	VJl
Ratte		9,5	33,		8	11	- 1,5	- 2,	5
Ratte	5	14	17.	6-	12,	i4.	- 3,5	C= P	9
Mittel		12*2	15,	IQ,	12,	- 1,7	- 2,

Claims (4)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines antihypertensiv wirksamen Extraktes der Anacardium occidentale-L-Rinde, dadurch gekennzeichnet, daß man frische pulverisierte Rinde unter Lichtabschluß einer

wässrigen Mazeration bei einer Temperatur zwischen 0 und g

5°C unterwirft.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 20 bis 50 g Rinde pro Liter destilliertes Wasser mazeriert.

5. Antihypertensiv wirksamer Anacardium occidentale L-Extrakt hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2.

4. Verwendung des nach Anspruch 1 oder 2 erhaltenen Ex- λ

traktes zusammen mit physiologisch akzeptablen Trägern für pharmazeutische Mittel.

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