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Verfahren zur Gewinnung von therapeutisch wirksamen Extrakten aus
Pilzen Die Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung von chemotherapeutischen Substanzen,
die die Fähigkeit haben, das Tumorwachstum bei Tieren zu verhindern.
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Die Substanzen mit Antitumoraktivität werden m dem Pilz Calvatia maxima
gefunden.
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In den vergangenen Jahren wurden mehrere Tausend Substanzen auf ihre
Antitumoraktivität untersucht. Es handelte sich bei den geprüften Stoffen vielfach
um svnthetische reaktionsfähige Chemikalien, wie Stickstoffsenföle, Athylenimine,
Epoxyde, Steroidhormone, Carbamate und Ester von Sulfonsäuren. Ferner wurden auch
viele synthetische, chemische Antistoffwechselsubstanzen. wie die folinsäureanalogen,
Purine, Pyrimidine, Formamide, Pyridoxinanalogen, Riboflavinanalogen, Amino säureanalogen
und verschiedene Vitaminantagonisten untersucht. AuBer den synthetischen Chemikalien
wurde eine große Anzahl von Stoffen aus tierischer Quelle auf ihre Antitumoraktivität
geprüft. Beispiele solcher Stoffe sind die Milzpräparate einschließlich dem antiretikularen
cytaxischen Serum (ACS), verschiedene Enzyme tierischer Herkunft, z. B. Arginase,.
Desoxyribonuclease und Ribonuclease. Es wurden auch verschiedene Substanzen aus
dem Pflanzenleben und Mikroorganismen untersucht.
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Solche Stoffe sind Colchizin und. Podophyllin, die aus höheren Pflanzen
stammen, und viele der bakteriellen Polysaccharide und Antibiotika, die von Mikroorganismen
erzeugt werden. Viele andere Stoffe können in der Literatur über die Chemotherapie
des Tumonvachstums gefunden werden. Unter diesen Stoffen wurden einige mit spezifischer
Anwendbarkeit gefunden, während viele andere wegen ihres vemachlässigbar geringen
Effektes oder ihrer ausgesprochen unerwünschten Nebenwirkungen als von geringerem
Wert anzrssehen sind.
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Gegenstand der Erfindung ist daher die gewinnung eines Stoffes, der
eine bedeutende Antitumoraktivität mit einem Minimum an unerwünschten. Nebenwirkungen
vereirrigt.
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Es wurden verschiedene Prüfverfahren angeævendet, um die Aktivität
der genannten chemotherapeutischen Substanzen auszuwerten. Einige Testverfahren,
die auf viele der obengenannten Substanzen angewendet wurden, werden in einem Artikel
von C. Chester S tockin »Adevaces in Cancer Research«, Bd. 11 (1954), S. 425 bis
492, diskutiert. Unter diesen Testversuchen wurden im gros3-ten Umfange solche ausgeführt,
bei denen feste Tumoren in vivo-zur Anwendung kommen. Die solchen Testen unternvorfenen
antitumor-oder chemotherapeutisch wirksamen Stoffe wurden hinsichtlich ihrer Inhibition
von Tumorwachstum, ihrer Fähigkeit, zu bewirken, daß implantierte Tumoren nicht
wachsen, der Geschwindigkeit des Rückganges von gemessenen Tumoren, der Wirkung
auf die spätere Lebenszeit des Gasttieres oder verschiedener cytologischer Kriterien,
ausgewertet..
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Teste-mit Mdusesarkoin 180 sind besonders.zweckmäßig
zur Auswertung
der Antitumoraktivität. Der Sarkom 180 hat ein schnelles Wachstum, nahzu 1000/oigne
Transplantabilität und eine geringe Rückgangsgeschwindigkeit.
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Die Verfahren und die Bedeutung des Sarkom-180-Tests und ver vandter
Teste sind in weitgehenden Einzelheiten in Report Nr. 3 bis 55, August 1955, Studies
in Experimental Cancer Chemotherapy. , von C. Chester Stock in « Current Rcsearch
in Cancer Chemotherapy. ; besehneben.
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Der Test ist ferner in einem Artiket von-C. C. Stock und C. P. Roads
»Evalnation of Chemotherapeutfc Agents, S. 18 bis 190 (1949), Columbia University
Press, New York, N. y., beschrieben. Bei diesem Test werden Muse, die etwa 20 g
wiegen, zu Beginn und Ende des Versuches gewogen. Ein Tumor wird durch die Injektion
von Tumorburuchstücken oder -würfeln von etwa 1 bis 2 mm
Durchmesser
subcutan in die Achselgegend eingeführt.
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Das zu prüfende Chemotherapeutikum wird zweimal täglich 7 T. ige fang,
beginnend 24 Stunden nach der Transplantation des Tumors, intraperitoneal injiziert.
Am 8. Tage nach den Injektionen werden die Tumoren erneut gemessen und mit ihrer
ursprünglichen Größe verglichen.
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Ein Mittel, welches das Tumorwachstum nicht auf weniger als drui Viertel
des durchschnittlichen Durchmessers der Kontrollstücl : e hält, wird als solches
mit negativem Testergebnis (-) angeschen. Eine maximale Schätzung (+) bedeutet,
daß das Wachstum des Tumors bei dem Test auf weniger als ein Viertel des Wachstums
des Kontrollstückes beschränkt wurde. Andere dazwischenliegende Schätzungen werden
im folgenden beim Bericht der Testergebnisse angegeben.
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Eine Antitumoraktivität wurde in Calvatia maxima, dem Riesenbovist,
gefunden. Der aktive Bestandteil mit dieser Antitumoraktivität wird aus Calvatia
maxima extrahiert. Es wurde gefunden, daß er vorzugsweise mit Wasser aus dem frischen
Fruchtfleisch extrahiert werden kann. Der aktive Bestandteil kann ebenfalls mit
Alkoholen, wie Äthanol, und mit Aceton und anderen mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln
oder mit ihren wäßrigen Verdünnungen extrahiert werden.
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Ein aktiver Bestandteil wird aus dem wäßrigen Extrakt durch Zusatz
von Äthanol. Aceton oder einem anderen wassermischbaren Lösungsmittel gefällt. Wenn
sie wieder in Wasser gelöst wird, behält die Fällung ihre Antitumoraktivität. Die
über dieser Fällung stehende Lösung enthält ebenfalls einen aktiven Bestandteil.
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Ein nicht dialysierbarer aktiver Bestandteil kann dadurch erhalten
werden, daß zunächst eine Fällung aus einer wäßrigen Lösung durch Zusatz von Aceton
oder Äthanol unter Bildung einer etwa 30volumprozentigen Konzentration an diesem
Lösungsmittel erzeugt wird, diese Fällung entfernt wird und die Aceton- oder Äthanolkonzentration
auf etwa 70% in der darüberstehenden Lösung erhöht wird, so daß eine zweite Fällung
erfolgt. Diese zweite Fällung besitzt Antitumoraktivität und ist nicht dialysierbar.
Die überstehende Lösung der zweiten
Fällung enthält ebenfalls einen aktivf-n Bestandteil.
Dieser aktive Bestandteil kann durch Abdampfen der Lösungsmittel und Auflösung des
Rückstandes in Wasser erhalten werden.
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Die Gattung Calvatia maxima ist unter verschiedenen Bezeichnungen
bekannt, wie als Calvatia gigantea Pers., Lloyd, Bovista gigantea Nees, Langermannia
gigantea Rostk. In der vorliegenden Beschreibung sind in dem Ausdruck Calvatia maxima
alle diese verschiedenen Bezeichnungen inbegriffen.
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Ausführungsbeispiele Ein Präparat wurde durch Mischen von einem Teil
von frischem Gewebe eines Fruchtkörpers einer frisch gesammelten Probe von Calvatia
maxima mit 2 Teilen kaltem Wasser und Abtrennen des Ungelösten vom wirkstoffhaltigen
Extrakt hergestellt. Dieser Extrakt erwies sich bei dem Sarkom-180-Test als aktiv
; in einer Verdünnung von 1 : 100 verringerte das Präparat (Nr. 9429) die Tumorgröße
der Vergleichsprobe von 0, 87 cm Durchmesser auf 0, 49 cm Durchmesser, wenn es bei
dem üblichen Testverfahren intraperitoneal injiziert wurde. Die Bestimmung der Aktivität
war lentsprechend dem Sloan-Kettering-Code und wird im folgenden beschrieben. Dieser
wäßrige Extrakt wurde mit 1 Volumen Äthanol gefällt und die Fällung nach Abtrennung
durch Zentrifugieren in Wasser gelöst und auf das ursprüngliche Volumen gebracht.
Bei einem Testversuch in einer Verdünnung von 1 : 20 hielt dieses Präparat (Nr.
9430) die Tumorgröße auf 0, 22 cm gegenüber 1, 45 cm der Vergleichsprobe ; die Inhibitoraktivität
wurde mit + bezeichnet. Eine aliquote Menge des wäßrigen Extraktes wurde 42 Tage
aufbewahrt und dann auf 100° C erhitzt ; beim Erhitzen verringert sich das ursprüngliche
Volumen von 80 auf 68 ml, aber der Unterschied wurde durch Zusatz von Wasser ausgeglichen.
Die Injektion dieses Präparates (Nr. 9509) führte zu einer Tumorgröße von 0, 51
cm gegenüber 0, 89 cm der Vergleichsprobe (-). Diese Ergebnisse sind in Tabelle
1 zusammengefaßt.
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Tabelle 1 Wirkung der parenteralen Injektion von Extrakten von Calvatia
maxima auf das Wachstum von Mäusesarkom 180*)
| Tumor-Gewichts- |
| durchmesser änderung in |
| Nr. des Versuchs-Nr. Dosis: ccm in g/Gewichts- |
| Mäusetoxizität Wirkung**) Todesfälle |
| Präparates S. K. I. 2mal täglich cm/Durchmesser änderung der |
| des Ver- Vergleichs- |
| gleichstumors probe |
| 9429 C 2437 0, 5 (Verdün- 0, 6 (Verdiin-0, 49/0, 87-2, 0/+1,
0- |
| nungl : 10) nung 1 : 100) |
| 9430 C 2438 0, 5 (Verdün- 0, 5 (Verdün-+ 0, 2211, 45-3, 0/-0,
5 2 |
| nung 1 : 10) nung 1 : 20) |
| 9509 C 2517 0, 5 C, 6 0, 51/0, 89-1, 0/-0, 5 2 |
| -0, 3 (Verdün- |
| nung 1 : 10) |
*) Aktivitätauswertungsteste, durchgeführt in der Division for Experimental Chemotherapy,
Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York, N. Y.
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**) + Tumordurchmesser 25% oder weniger der Vergleichsprobe. i + Tumordurchmesser
25 bis 50 °/, der Vergleichsprobe.
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+Tumordurchmesser 50 bis 75 der Vergleichsprobe.
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Weitere Testversuche wurden mit Extrakten von frischen Pilzen durchgeführt,
die in dieser Zeit gesammelt
waren. Sie vertreten die gleiche Gattung ; es wird jedoch
angenommen, daß sie von verschiedenen Arten stammen.
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Sie wurden an weit voneinander getrennten Stellen gesammelt. Alle
Arten zeigten bei der Prüfung der Kaltwasserextrakte des frischen FruchtHeisches
eine mit der vorher angefiihrten vergleichbare Aktivitat gegenüber Sarkom 180. Die
Extraktion der frischen Sporophore mit kochendem Wasser in 10 Minuten ergab inaktive
Praparate. Eine Fällung mit I Volumen Äthanol führte zu einem Alaterial, das in
Wasssr gelöst und gepriift, eine ähnliche, jedoch nicht identische Tumorretardation
ergab.
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Es zeigte sich, daß einige Arten eine größere Antitumoraktivität entwickelten
als die anderen.
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Um die Art der Aktivität zu prüfen, wurde der folgende Versuch unter
Anwendung von gefrorenem Material der Sporophoren von Calvatia maxima durchgeführt.
Ein Teil des Fungus wurde mit 2 Teilen kaltem Wasser gemischt. Eine aliquote Menge
dieses Extraktes wurde mit l Teilen Äthanol gefällt ; die Fällung wurde in Wasser
gelöst und mit Wasser auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt. Der Äthylalkohol
der überstehenden Flüssigkeit wurde abgedampft und die entstehende Lösung auf das
gleiche Volumen gebracht. Sowohl die wäßrige, aus der Fällung hergestellte Lösung
als auch die wäßrige Lösung aus dem NIaterial in dem Filtrat zeigten deutliche Antitumoraktivität.
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Da diese Fraktionierung darauf hinwies, daß mehr als
ein Tumorinhibitor
in dem pflanzlichen Vlaterial vorliee, t, wurden die folgenden Praparate hergestellt
: Sporophorcnmaterial wurde mit Wasser, wie vorher beschrieben, extrahiert und so
viel Äthanol zugesetzt, daß es 30°/0 des Gesamtvolumens ausmachte. Die Fällung wurde
abzentrifugiert und in Wasser gelöst (Prãparat Nr. 9896).
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Die überstehende Flüssigkeit wurde dadurch einer weiteren Äthanolfwllung
unterworfen, dax der Äthanolgenhalt auf 70°/0 des Gesamtvolumens gebracht wurde.
Die in Wasser gelöste Fällung ergab das Präparat Nr. 9897. Das überstehende Äthanol
wurde abgedampft und das Volumen auf die Hälfte des ursprünglichen Wasserextraktes
(Präparat Nr. 9898) wie bei den Präparaten Nr. 9896 und Nr. 9897 eingestellt. Ferner
wurde ein Testversuch mit einem Präparat (Präparat Nr. 9894) durchgeführt, das durch
Extraktion der frischen oder getrockneten Sporophoren mit absolutem Äthanol, Abdampfen
des Alkohols und Einstellung mit Wasser auf das ursprüngliche Volumen hergestellt
wurde. Die Aktivität eines wäßrigen Extraktes des Rückstandes der Äthanolextraktion
wird bei dem Testversuch des Präparates Nr. 9895 angegeben.
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Die Antitumoraktivität in dem wäßrigen Extrakt war hier größer als
die in dem zunächst mit absolutem Äthanol hergestellten Extrakt. Die Ergebnisse
dieser Vergleichsversuche sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
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Tabelle 2 Antitumoraktivitäten von Calvatia maxima bei weiterer Fraktionierung
von Sporophorextrakten, geprüft am Sarkom 180*)
| Tumor-Gewichts- |
| durchmesser Änderung in |
| Nr. des Versuchs-Nr. Mäuse- Dosis: ccm in cm/Durch- g/Gewichts- |
| Wirkung**) |
| Präparates S. K. I. toxizität 2mal täglich messer des änderung |
| Vergleichs-der Ver- |
| tumors gleichsprobe |
| 9894 C 2904 0, 5 0, 5 (Verdiin-t-+-0, 50/1, 15-4, 0/-1, 5 |
| nung 1 : 10) |
| 9895 C 2905 1, 0 0, 5 (Verdün-+ + 0, 22/0, 57-2, 0/+0, 5 |
| nung 1 : 50) |
| 9896 C 2906 3, 0 0, 5 (Verdiin-- 0, 17/0, 72-3, 0/-1, 5 |
| nung 1 : 10) |
| 9897 C 2907 3, 0 0, 5 (Verdün- + 0, 44/0, 93-2, 0/-1, 5 |
| nung 1 : 5) |
| 9898-3, 0 0, 5 (Verdiin- + 0, 43/0, 95-0, 5/-2, 0 |
| nung 1 : 100) |
*) Testversuche, durchgefuhrt bei der Division for Experimental Chemotherapy, Sloan-Kettering
Institute for Cancer Research New York, N. Y.
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**) + Tumordurchmesser 25'/, oder weniger der Vergleichsprobe.
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1 + Tumordurchmesser 25 bis 50% der Vergleichsprobe. t-Tumordurchmesser
50 bis 75% der Vergleichsprobe.
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Es wurden weitere Testversuche gemacht, um festzustellen, ob der
aktive Bestandteil oder ein Teil davon dialysierbar war oder nicht. Das Präparat
Nr. 9906 war eine wäßrige Lösung des Niederschlages, der bei einer Fällung mit Aceton
entstand, bei dem nur das Material berücksichtigt wurde, das durch Erhöhung der
Acetonkonzentration von 30 auf 70 °/0 des endgültigen Volumens ausgefällt wurde.
Diese wäßrige Lösung enthielt keinen dialysierbaren Wirkstoff. Das Präparat 9907
war die iiberstehende Flüssigkeit des obigen Präparats, aus der die Fällung entfernt
und das Aceton ausgetrieben war.
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Es enthielt einen dialysierbaren Bestandteil mit tumorinhibierenden
Eigenschaften. Die Dialyse wurde bei Zimmertemperatur gegen destilliertes Wasser
durchgeftihrt, das von Zeit zu Zeit ersetzt wurde. Als Dialysiermembran wurde ein
Schlauch aus Zellulosehydratfolie von 8, 0 cm Innendurchmesser verwendet, der von
der Firma Central Scientific Comp. hergestellt und der mit der Nummer 70, 160-B
(B 57) bezeichnet war. Das Volumen an Wasser war das gleiche wie das der Flüssigkeit
innerhalb der Membran. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.
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Tabelle 3 Verteilung der tumorinhibierenden Bestandteile in Fraktionen,
die durch Dialyse eines Präparates von Calvatia maxima erhalten wurden (Testtumor
: Sarkom 180) *)
| Tumor-Gewichts- |
| durchmesser |
| Nr. des Versuchs- Mäuse- Dosis: ccm in cm/ änderung |
| Wirkung**) in g/Gewichts- Todesfwlle Bemerkungen |
| Präparats Nr. S.K.I. toxiität 2mal täglich Durchmesser änderung
der |
| des Kontroll- Vergleichsprobe |
| tumors |
| 9907 C 2917 3,0 0,5 (Verdün- # + 0,40/0,95 -3,0/-2,0 1 Präparat |
| nung 1 : 4) vor Dialyse |
| 9910 C 2920 5, 0 0, 6 # + 0,55/1,13 -1,5/-1, 0 1 Dialyse |
| 2 Stunden |
| 9911 C 2921 5, 0 0, 6 # - 0, 62/1, 13-3, 0/-1, 0 1 Dialyse |
| 4t/2 Stunden |
| 9912 C 2922 5, 0 0, 6-0, 88/1, 13-1, 0/ *-1, 0 Dialyse |
| 61/2 Stunden |
| 9913 C 2923 3, 0 0, 5 (Verdün- # - 0,45/0,74 -4,5/+1, 0 Flüssigkeit |
| nung 1 : 5) innerhalb der |
| Dialysier- |
| membran nach |
| 18l/2 Stunden |
*) Teste, durchgeführtbei der Division for Experimental Chemotherapy, Sloan-Kettering
Institute for Cancer Research, New York, N. Y-*) + Tumordurchmesser 25 0/. oder
weniger der Vergleichsprobe.
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+ + Tumordurchmesser 25 bis 50 °/0 der Vergleichsprobe.
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Tumordurchmesser 50 bis 75 °/, der Vergleichsprobe.
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Die Tabelle zeigt einen gut dialysierbaren Tumorinhibitor, der in
den ersten 4 Stunden der Dialyse durch die Membran hindurchgeht. Eine nicht dialysierbare
Substanz, die tumorretardieren wirkt, liegt ebenfalls vor.
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Um die biologischen Eigenschaften der tumorinhi-
bierenden Substanzen,
die in Calvartia maxima enthalten sind, ferner zu kennzeichnen, wurden mit verschiedenen
der vorher erwähnten Präparate Verdünnungsteste durchgeführt. Die Inhibitoraktivität
nahm im allgemeinen mit wachsender Verdünnung ab. Einige kennzeichnende Daten sind
in Tabelle 4 zusammengefaßt, Tabelle 4 Tumorinhibition von verdünnten Calvatia-maxima-Extrakten
(Testtumor : Sarkom 180) *)
| Tumordurchmesser i Gewichtsänderung in |
| Nr. des Dosis: ccm wirkung**) cm/Durchmesser des g/Gewichtsänderung
der Todesfälle |
| Präparates 2mal täglich Vergleichstumors Vergleichsprobe |
| 9895 0, 5 (Verd2nnung 1 : 50) # - 0,66/1,22 -3,0/-2, 0 |
| 0, 5 (Verdünnung 1 : 100) # - 0,66/1,22 -1,5/-2, 0 |
| 0, 5 (Verdünnung 1 : 200) # - 0,76/1,22 -2,0/-2, 0 |
| 0,5 (Verdünnung 1 : 400) # - 0,85/1,22 -1,5/-2,0 |
| 0,5 (Verdünnung 1 : 800) - 1,21/1,22 -0,5/-2,0 |
| 9898 0, 5 (Verdünnung 1 : 100) # + 0,43/0,95 -3,5/2, 5 1 |
| 0, 5 (Verdünnung 1 : 200) 0, 67/0, 95-1, 01-2, 5 |
| 0, 5 (Verdïnnung 1 : 400) # - 0,56/0,95 -1,0/-2, 5 |
| 0, 5 (Verdünnung 1 : 800) - 0,77/0,95 -1,0/-2, 5 |
| 9906 0,5 (Verdünnung 1 : 10) # + 0,43/1,02 -4,5/-1,0 |
| 0, 5 (Verdünnung 1 : 20) # - 0,58/1,02 -2,5/-1, 0 1 |
| 0, 5 (Verdünnung 1 : 40) # - 0,55/1,02 -1,0/-1, 0 |
| 0, 5 (Verdünnung 1 : 80) 0, 77/1, 02 +0, 51-1, 0 |
| 9907 0,5 (Verdünnung 1 : 5) # + 0,47/1,02 -2,5/-1,0 |
| 0,5 (Verdünnung 1 : 10) #+ 0,50/1,02 -2,0/-1,0 |
| 0,5 (Verd2nnung 1 : 20) # - 0,64/1,02 -1,0/-1,0 |
| 0,5 (Verdünnung 1 : 40) # - 0,73/1,02 -1,5/-1,0 |
*) Teste, durchgefiihrt bei der Division for Experimental Chemotherapy, Sloan-Kettering
Institute for Cancer Research, New York, N. Y.
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**) + Tumordurchmesser 25 % oder weniger der Vergleichsprobe.
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# + Tumordurchmesser 25 bis 50% der Vergleichsprobe.
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# - Tumordurchmesser 59 bis 75% der Vergleichsprobe.
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Es wurde gefunden, daß eine beträchtliche Antitumoralitixität in
einem wäßrigen Extrakt von Calvatia maxima verhleibt. wenn der Extrakt mit verschiedenen
synthetischen ionenaustauschenden Harzen in Berührung gebracht wurde.
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In der vorangegangenen Beschreibung wurden beispielsweise einige
spezielle Ausführungsformen der Erfindung zur Erläuterung im einzelnen angegeben.
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P. \TENT. NSI} HCCHE 1. Verfahren zur Gewinnung von therapeutisch
wirksamen Extrakten aus Pilzen, dadurch gekennzeichnet, daß der Pilz Calvatia maxima
mit Wasser oder einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bzw. mit einer Mischung
beider extrahiert und der Extrakt nach Abtrennung des Ungelösten gegebenenfalls
weiter aufgearbeitet wird.